Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería

Campus Guanajuato

Ingeniería Biotecnológica

Laboratorio de bioconversiones

Practica 4

Producción de amilasas usando aspergillus niger mediante

fermentación en estado sólido

4BV1

Profesora:
Guadalupe Hortencia Luevano

Integrantes del Equipo:

Marisol Estefanía Jasso Castro.

Genesis Abigail Martinez Medina.
Eduardo Moran Rangel
​Luis Antonio Mendoza Soto.
Objetivo general:
Aprender a usar la técnica de FES (fermentación en estado sólido) y realizarla
mediante la producción de amilasas usando aspergillus niger ​para su posterior
inmovilización y determinación de actividad enzimática.

Objetivos especificos:
● Producir amilasas usando aspergillus niger, mediante FES como biocatalizador.
● Purificar las enzimas generadas(amilasas).

Introduccion:
Medio PDA:
El Agar Papa Dextrosa (Potato Dextrose Agar, PDA, por sus siglas en inglés) es un
medio de propósito general para levaduras y mohos que puede ser suplementado con
ácidos o antibióticos para inhibir el crecimiento bacteriano. El Agar Papa Dextrosa
(PDA) puede ser usado para el cultivo de levaduras y mohos clínicamente
significativos. La base (infusión de papa) nutricionalmente rica, estimula la
esporulación de los mohos y la producción de pigmentos en algunos dermatofitos.
El Agar Papa Dextrosa está compuesto por Infusión de Papa deshidratada y Dextrosa
que fomentan el crecimiento exuberante de los hongos. El agar es adicionado como
agente solidificante. Muchos procedimientos estándares usan una cantidad específica
de ácido tartárico estéril (10%) para reducir el pH de este medio a 3,5 0.1, y así inhibir
el crecimiento bacteriano. No recalentar el medio acidificado, el calentamiento en
estado ácido hidrolizará el agar.

Procedimiento​:
1. Adicione 1 mL de la muestra de la muestra en una placa de petri estéril.
2. Adicione la cantidad especificada (10 o 20 mL) del agar estéril derretido (enfriado a
45–50°C) y revuélvalo gentilmente para mezclarlo completamente. Permita que se
solidifique.
3. Incube a 22–25°C o 30–32°C (dependiendo del método seguido) durante 2–7 días o
por más tiempo.
Resultados Las levaduras crecerán como colonias desde un color crema a un color
blanco. Los mohos crecerán como colonias filamentosas de variados colores. Cuente el
número de colonias y considere el factor de dilución (si la muestra fue diluida) al
determinar el conteo de levaduras y/o mohos por cada gramo o mililitro de material.
Fermentación en Estado Sólido:

Como antecedentes de la Fermentación en Estado Sólido (FES), se anota que es un

proceso muy antiguo que ha sido muy utilizado especialmente en la obtención de
productos alimentarios (panes y quesos) y otros productos como el kojí, el shoyu y el
miso y bebidas como el Sake. Además Pastrana (1996), cita a (Kumar y Losane, 1989)
quienes reportan aplicaciones industriales de los cultivos en estado sólido entre las que
se encuentran la producción de enzimas, ácidos orgánicos, Single Cell Protein (SCP),
toxinas, antibióticos y otros metabolitos de interés. Ajila, et al. (2012). (R.Borras )
En general, se distinguen Dos clases de cultivos en estado sólido: la primera se refiere
a aquellos cultivos en los que el material sólido, insoluble en agua y humedecido actúa
al tiempo como principal fuente de nutrientes y como soporte físico para un
microorganismo.En ocasiones, a de, el la producción(KUMAR Y LONSANE, 1989; RAO
et al., 1993).En la segunda clase consideran los cultivos en los que el soporte es un
sólido nutricionalmente inerte que actúa únicamente como lugar de anclaje del
microorganismo, y qué, que para, se embebe en una solución nutritiva.

Tabla 1.​ Ventajas y desventajas de la fermentación en estado sólido

VENTAJAS DESVENTAJAS

Simplicidad ya que un único Pretratamieto de los sustratos

medio de cultivo proporciona casi (molienda, pre hidrolisis parciales).
todos los nutrientes necesarios.

Los sustratos se utilizan mas Dificultad para mantener los niveles

concentrados y no se utilizan óptimos de humedad durante la
grandes volúmenes de agua fermentación.

Mayor simplicidad en el diseño de Ausencia de métodos analíticos

los fermentadores y de los simples para determinar el
sistemas de control crecimiento microbiano.

Mayor facilidad en la obtención y Dificultad y de control y regulación

aplicación del inoculo, pudiendo de variables de cultivo como
utilizarse las esporas temperatura, pH, humedad y
directamente en la mayor parte de oxigeno libre durante el proceso.
las situaciones.
 Reducida necesidad de Dificultad para agitación en los
disolventes para la extracción de procesos que así lo requieran.
los productos.

Rendimientos comparables y Necesidad de inoculo voluminoso.

superiores a los de cultivo
sumergido

Menor riesgo de contaminación Escases de diseños y desarrollos

bacteriana. Posibilidad de de ingeniería para la construcción
trabajar, en ocasiones, en de los fermentadores y para ciertas
condiciones no asépticas. operaciones como inoculación y
extracción de productos.

Elevada aireación del sistema

adecuada para procesos que
impliquen un metabolismo
oxidativo intenso.

Bajos requerimientos energéticos.

Ambiente similar a los hábitats

naturales de los microorganismos.

Reducido volumen de efluentes.

Selección del microorganismo

Las principales limitaciones son consecuencia de los requerimientos de actividad de

agua de los diversos tipos de microorganismos y de su capacidad de anclaje y/o la
penetración en matrices más o menos porosas.
Desde el punto de vista de la fermentación en estado sólido los microorganismos más
utilizados son los micros hongos ya que crecen de forma natural sobre materiales
sólidos por dos motivos principales:
1. Facultad para utilizar mezclas de varios polisacáridos. Los hongos poseen
sistemas enzimáticos completos que les permiten utilizar varias fuentes de
carbono.
2. Capacidad de adherencia y penetración en las partículas del sustrato. La
estructura miceliar de los hongos filamentosos les da ventaja frente a otros
microorganismos. (Pastrana, 1996)
Características del sustrato
Los sustratos deben poseer las siguientes características:
● Insoluble en agua o en la solución de humectación con el fin de garantizar las
condiciones de la FES.
● Elevado contenido de carbohidratos y/o proteínas ya que ya que esta modalidad
de cultivo permite la utilización de elevadas concentraciones de sustrato.
● Estructura granular que posibilite la adhesión y penetración del microorganismo
o, en caso contrario, facilidad de rotura para conseguir granulometrías
adecuadas.
● Fermentable por un solo microorganismo.
● Baja tendencia a la aglomeración con el micelio y a la formación de masas
compactas durante la incubación, a fin de evitar restricciones difusionales de los
gases.

Variables que condicionan los cultivos en estado sólido

1. Contenido en humedad del sustrato. ​El nivel adecuado es función de la naturaleza
del sustrato, el tipo de producto final y los requerimientos del microorganismo. Se
encuentra relacionado con la actividad del agua (aw) cuya influencia está ampliamente
documentada.
Así un alto contenido en humedad del sustrato provoca en numerosas ocasiones
descensos de la porosidad y de la difusión de oxígeno, aumenta el riesgo de la
contaminación bacteriana e incrementa la formación de micelio aéreo.
Un fenómeno igualmente indeseable es una reducida actividad del agua, ya que
cuando esta desciende por debajo de los límites de crecimiento del microorganismo se
produce la esporulación del microorganismo.
Los efectos de la actividad del agua sobre el crecimiento y la producción de metabolitos
son consecuencia de la acción que esta variable ejerce sobre la estabilidad, actividad y
especificidad de las enzimas tanto intra como extra celulares. Así, mientras que la
estabilidad frente a la desnaturalización térmica se ve incrementada a bajos niveles de
aw, la especificidad y la actividad enzimática pueden verse deterioradas al dificultarse
el contacto de la enzima con el sustrato.
Generalmente el contenido inicial de humedad del sustrato oscila entre el 30 y el 75%.
Durante el curso de las fermentaciones se ocasionan reducciones de este nivel debidas
tanto a pérdidas por evaporación como a la propia actividad metabólica de los
microorganismos. (Pastrana, 1996)
Figura 1.​ Requerimientos de actividad de agua para diversos tipos de microorganismos

2. Temperatura: ​Como consecuencia de la actividad metabólica de los

microorganismos se produce una elevación de la temperatura en los fermentadores,
especialmente en las zonas internas del sustrato. Este incremento térmico afecta
directamente al crecimiento, germinación de esporas o a la formación del producto.
En algunos casos los cultivos poseen alta porosidad, pequeño espesor de la capa de
sustrato y partículas de granulometría adecuada para no provocar compactaciones
elevadas. En estas condiciones el calor generado durante la fermentación se disipa sin
dificultad, siendo necesario, por el contrario, un aporte externo de energía para
mantener una temperatura adecuada en los cultivos.

3. Aireación y agitación: Mediante estos sistemas se pretende favorecer los procesos

de transferencia de masa tanto a nivel interparticular como intraparticular. A nivel
interparticular el proceso más importante de la transferencia de masa es la difusión de
gases, en especial la transferencia de oxígeno y depende de la proporción de espacios
huecos en la masa de fermentación y de la aireación. La proporción de espacios
huecos es a su vez función de la geometría de las partículas del sustrato, del contenido
de humedad y de la naturaleza química del sustrato, y debe representar al menos el
30% del volumen total de la masa de fermentación.

4. pH: Los sistemas de fermentación en estado sólido suele tener estabilidad frente al
pH debido a la alta capacidad tampón de los sustratos usuales, por lo que mediante el
ajuste inicial del pH del sustrato es posible eliminar la necesidad de su control
reduciendo la incidencia real de esta variable. En ocasiones resulta conveniente
realizar la humectación de los sustratos con soluciones tampón para evitar cambios de
pH en áreas localizadas. Esta estrategia es adecuada en los casos en los que los
cultivos no se someten a agitación y la fuente de nitrógeno se suministra como sales de
amonio, circunstancias que promueven bruscos descensos de pH. (Pastrana, 1996)

Figura 2. ​Esquema a microescala del proceso que ocurre durante la FES (Holker y
Lenz, 2005)
Tabla 2.​ Aplicaciones de la FES

Características de crecimiento de aspergillus niger:

Colonias de crecimiento rápido, maduran en 3 días, son de color blanco-amarillento y
con abundantes puntos negros. El reverso suele ser incoloro, blanco o crema. (Larone,
2011. Arenas, 2011)
 Figura 3. ​Agar Sabouraud. Colonias de inicio blanco algodonosas, que presentan
abundantes puntos negros con el tiempo (Tangarife, 2011)

Características Microscópicas:

Micelio macrosifonado, septado, hialino, presenta cabezas aspergilares subesféricas de

25 a 100µm, con dos series de fiálides, en un ángulo de 360°, con conidios redondos
equinulados y negros. El conidióforo es largo llega a medir hasta 3 mm. (Arenas, 2011.
Bonifaz, 2012. Larone, 2011)

Figura 4.- ​Cabezas aspergilares de A. niger, en donde se observa la doble serie de

fiálides, con conidias negras esféricas(Tangarife, 2011)
Aspergillus niger
Aspergillus es un género mitospórico que se caracteriza por la producción de hifas
especializadas, denominadas conidióforos, sobre los que se encuentran las células
conidiógenas que originarán las esporas asexuales o conidios (Figura 1). El conidióforo
característico de Aspergillus, aunque es una estructura unicelular posee tres partes
bien diferenciadas: vesícula (extremo apical hinchado), estipe (sección cilíndrica
situada debajo de la vesícula) y célula pie (sección final, a veces separada por un
septo, que une el conidióforo con el micelio). Sobre la vesícula se disponen las células
conidiógenas, denominadas habitualmente fiálides. En muchas especies, entre la
vesícula y las fiálides se encuentran otras células denominadas métulas. Las cabezas
conidiales que sólo presentan fiálides se denominan uniseriadas, y las que presentan
fiálides y métulas, biseriadas.

Figura 5. ​Morfología y división taxonómica de ​A. niger

Su micelio produce esporas negras. Es muy utilizado en la producción de amilasas y

ácido cítrico. El ciclo biológico de ​Aspergillus comprende la germinación partir de
esporas, el crecimiento micelial y la esporulación en donde lo conidióforos se
desprenden de los racimos. Muchas de las enzimas producidas por ​Aspergillus están
relacionadas con la producción del micelio durante la fase vegetativa (Viniegra, 2003).

Precipitación por salado salting-out:

Una descripción simplificada del mecanismo de insolubilización por salado está basada
en el hecho de que la adición de las sales elimina el agua de la proteína hidratada
dejando las regiones hidrofóbicas en libertad de combinarse intermolecularmente
(Glatz,1990).
Figura 6.- ​Imagen Efecto de la concentración de sal en la solubilidad de proteínas:
Regiones de solubilización por salado e Insolubilización por salado.

Aquellas proteínas que presentan mayor número de regiones hidrofóbicas sobre su

superficie precipitan más rápidamente que aquellas que presentan poca a regiones
hidrofóbicas.Debido a esta propiedad hay proteínas que pueden permanecer en
solución a altas concentraciones de sal.

Figura 7: ​Ordenamiento de las moléculas de agua frente a las regiones hidrofóbicas de

la molecula de proteina
Cuando las moléculas de proteína están en solución las moléculas de agua presentan
un ordenamiento, este lo produce el contacto entre regiones hidrofóbicas de la proteína
con la solución acuosa. Este ordenamiento es inestable termodinámicamente
comparado con él que presentan las proteínas sin solvatar conjuntamente con las
moléculas de agua libre. (Scopes 1994)

Figura 8:​ Esquema de precipitacion de proteinas por insolubilización por salado

Metodologia implementada:
Preparación del soporte/sustrato papa

Desarrollo de la FES

Purificación de enzima
RESULTADOS

Parte 1: Crecimiento de A. Niger sobre PDA (Potato Dextrose Agar)

Figura 9. ​Cultivos de muestras probables de A niger PDA

Parte 2: Fermentación en estado sólido (FES)

Figura 10. ​Crecimiento de A. niger al terminar la FES

Parte 3: Cuantificación DNS y BRADFORD
Para llevar a cabo el conteo de azúcares reductores y la cuantificación de la proteína
contenida en el tiempo final de la FES se tomaron 722 mg de muestra de aspergillus
niger, la cual fue disuelta en 5 ml de agua destilada, para posteriormente tomar una
muestra y realizar las mediciones en espectrofotómetro.

Tabla 3.​ Absorbancia obtenidas para Cuantificación de proteína del tiempo inicial y final
de la FES

BRADFORD ABSORBANCIAS
Muestra 1 Duplicado
Blanco -0.001 -0.001
Tiempo inicial (t0) 0.039 0.018
Tiempo final (tf) 0.959 0.881

Tabla 4.​ Concentración de proteínas durante la FES

Prueba Concentración t​0​ (µg/ml) Concentración t​f
(µg/ml)

Bradford 23.43 411.04

Tabla 5. ​Absorbancias obtenidas para cuantificación de azúcares reductores del tiempo

inicial y final de la FES

DNS ABSORBANCIAS
Muestra 1 Duplicado
Blanco 0.000 0.000
Tiempo inicial (t0) 0.003 0.008
Tiempo final (tf) 0.992 0.721
Tabla 6.​ Concentración de azúcares reductores durante la FES
Prueba Concentración t​0​ (µg/ml) Concentración t​f
(µg/ml)

DNS 7.2 524

Parte 4: Purificación de la enzima

Parte 4.1: Cuantificación DNS y BRADFORD

Tabla 7. ​Cuantificación de azúcares reductores y proteínas de sobrenadante (primera

centrifugación)

Muestra Absorbancia Muestra Absorbancia

DNS 1A(blanco) .124 2A -0.029

1B(blanco) .017 2B -0.477

Bradford 1A(blanco) -0.001 2A 0.247

1B(blanco) -0.000 2B 0.228

​Tomando un cuenta un factor de dilución de 1:10 se obtuvo la siguiente concentración
de proteínas.

Tabla 8.​ cuantificación de proteínas durante la purificación considerando un factor de

dilución 1 a 10.
Muestra Concentración (µg/ml)

Sobrenadante 1 11430.43
Parte 4.2: Precipitacion por salado “Salting Out”

Figura 11. ​Sistema empleado para la precipitación.

Tabla 9. ​Concentración de proteína total en pastilla suspendida en buffer para diálisis

considerando un factor de dilución de 1 a 10
 Muestra Concentración (µg/ml)

Pastilla suspendida en 46343.74

buffer

Tabla 10. ​Concentración de proteína total en pastilla suspendida en buffer después de

la diálisis considerando un factor de dilución de 1 a 10
Muestra Concentración (µg/ml)

Pastilla al final de la diálisis 6321.73

Discusion
Parte 1: Crecimiento de A Niger sobre PDA
De las muestras proporcionadas por nuestro compañero Luis fueron tomadas las
colonias negras que se elevaban sobre el sólido en este caso una tortilla dura, para así
sembrarlas en la placa de PDA.
Esperando el crecimiento de ​A. niger se dejó crecer por 2 dias y medio a 37 °C.
Después del crecimiento revisamos la caja y el resultado no fue alentador pues ninguno
de los hongos que crecieron en la caja petri reunia las caracteristicas que segun
Tangarife et 2011 ​son de color blanco-amarillento y con abundantes puntos negros, y
nuestra caja petri no presentaba ninguna de las ya mencionadas por lo cual la maestra
nos indicó que podíamos tomar microorganismo de un cultivo previamente aislado que
estaba en el laboratorio.

Parte 2: Fermentación en estado sólido (FES)

En esta parte el sustrato que utilizamos fue papa, por ser un sustrato rico en almidón y
ser de fácil manipulación además de contar con las cualidades que Segun M.Moyano
2014 Los sustratos para la fermentación en estado sólido deben poseer,
preferentemente la característica de ser insoluble en agua; tener elevado contenido en
carbohidratos y proteínas; estructura granular que posibilite la adhesión y penetración
del microorganismo” por lo cual cortamos la papa en cubos de aproximadamente 1 cm​2
esto con la finalidad de dejar espacio entre los cubos de sustrato y que el hongo
pudiese entrar en todos esos espacios para que éste no sólo creciera en la cara
superior de la papa si no también en las caras laterales e inferiores produciéndose así
más actividad del microorganismo y así tener mejores resultados en la producción de
la enzima que buscamos en este caso amilasa.

Si bien la bibliografía nos indicaba agregar 10ml de agua decidimos agregar 5mL,
tomando en cuenta que la mayoría de los sustratos provenientes de la papa contienen
del 30% al 75% en agua y según M.Moyano 2014 “un alto contenido en humedad
provoca en numerosas situaciones descensos de la porosidad y por consiguiente de la
difusión del oxígeno, aumenta el riesgo de contaminación bacteriana e incrementa la
formación de micelio aéreo y un fenómeno igualmente indeseable se observa en
cultivos con una reducida actividad de agua ya que cuando ésta desciende por debajo
del límite de crecimiento, se puede producir la esporulación del microorganismo”, es
decir, la cantidad de agua que los microhongos necesitan para crecer es ligeramente
menor a la que necesitan para metabolizar el sustrato, independientemente de las
adversidades ya citadas sobre el exceso de agua en nuestra FES.

Otro punto muy importante es la aireación, ya que a nivel interparticular el proceso de

transferencia de masa más importante es la difusión de gases, en especial la
transferencia de oxígeno y depende esencialmente de la proporción de espacios
huecos en la masa de fermentación y de la aireación. La proporción de espacios
huecos, es una función de la geometría de las partículas del sustrato, del contenido en
humedad y de la naturaleza química del sustrato, y debe representar al menos un 30%
del volumen total de la masa de fermentación (Pastrana, 1996).

El corte del sustrato ayudó bastante en este aspecto ya que hubo un crecimiento
uniforme en la fermentación. Decidimos omitir la agitación ya que se pueden presentar
lesiones en el micelio del hongo aunque para algunos autores es muy importante pues
esta ayuda a eliminar el CO​2 ​producido y también ayuda a disipar el calor metabólico,
pero nos basamos en la primera premisa esperando resultados.
El sistema completo que consistió en un matraz erlenmeyer el cual contenía nuestra
fermentación, se dejó incubar por 7 días a 37°C esto con la finalidad de tener enzima
sobre el sustrato, si bien sabemos que la amilasa es una enzima extracelular nos
interesó que esta estuviese presente en la mezcla producto de ​A.Niger lista para ser
retirada junto con toda la biomasa para realizar su purificación.

​Parte 3: Centrifugación y cuantificación DNS y BRADFORD

La centrifugación se realizó a una muestra tomada de nuestro microorganismo
producido en la FES el cual fue centrifugado a 12 mil rpm por 15 minutos las lecturas
mostraron una alta concentración tanto de proteínas y azúcares reductores con
respecto a la muestra de nuestro tiempo inicial (t0), producto del metabolismo del ​A.
niger​.

Parte 4: Purificación de la enzima

Para extraer la enzima se agregaron 100 mL de agua destilada al matraz con el
crecimiento de ​A. niger y se agitó manualmente buscando remover del sustrato toda la
enzima presente, aunque con ella también tuvimos pérdida de biomasa. El lavado del
sustrato fue relativamente sencillo ya que no encontramos mucho del mismo. Así pues
mezclamos bien y obtuvimos un líquido denso color negro debido a toda la biomasa.
Posteriormente recurrimos a hacer una filtración por medio de un embudo butcher,
matraz kitasato, papel filtro y una bomba de vacío.
Esta filtración se realizó principalmente para eliminar la biomasa la cual se quedó
atrapada en el papel filtro dejando pasar las moléculas más pequeñas entre ellas la
enzima de interés. El sistema consistió de un matraz kitazato conectado a una bomba
de vacío con el motivo de agilizar la filtración debido a que nuestra mezcla quedó muy
densa. La boquilla del matraz kitazato estaba recubierta de papel cera para sellar, pero
al momento de la filtración no selló del todo por lo que improvisamos con un guante de
nitrilo el cual selló mejor y así logramos separar la biomasa.

Parte 4.1: Cuantificación DNS y BRADFORD

En esta etapa más que azúcares en nuestra mezcla buscamos proteínas en específico
la amilasa por el método de bradford, esto debido a que la mezcla no tiene casi nada
de azúcares, más bien contiene metabolitos de la metabolización del sustrato y la
enzima responsable junto con biomasa que alcanzó a penetrar el papel filtro. Esta
medición es alentadora pues tenemos una concentración bastante buena de partículas
proteicas.
Obtuvimos una concentración de proteínas mucho mayor comparado con las obtenidas
usando Saccharomyces cerevisiae en las prácticas 2 y 3

Tabla 11. ​Comparación de concentración de proteínas en relación a la práctica 2-3.

Microorganismo Concentración (µg/ml)

S. cerevisiae 245.83

A. niger 11430.43
Obteniendo una concentración 46.49 veces superior con ​A. niger

Parte 4.2: Precipitacion por salado “Salting Out”

Recurrimos a una centrifugación a 8000 rpm por 20 min a 4 °C para sedimentar los
restos de biomasa presentes, de esta obtuvimos un sistema de dos fases de la cual
decantamos la fase líquida, que es la fase de interés, y la pastilla de biomasa se
esterilizó con el resto del equipo usado. De esta prueba obtuvimos un peso total de
sobrenadante de 94.28 g ya retirada la pastilla. En esta parte aplicamos una
precipitación por salado salting-out a la solución que recuperamos del filtrado esto para
eliminar la biomasa filtrada y así extraer la enzima, ya que según A.Tejeda, R.M.
Montesinos, R. Guzamas 1995, “Aquellas proteínas que presentan mayor número de
regiones hidrofóbicas sobre su superficie precipitan más rápidamente que aquellas que
presentan pocas regiones hidrofóbicas”, según los artículos consultados el rango de
concentración del sulfato de amonio varía desde un 40% a un 70% en peso, por lo cual
decidimos implementar un 60% en peso del material a precipitar debido a que fue la
concentración que mayormente se mencionaba en nuestros artículos consultados. En
la siguiente tabla se muestra la comparación de las distintas condiciones de
precipitación que se consideraron como óptimas para la precipitación de la enzima alfa
amilasa. También basados en este cuadro compartivo optamos por elegir el buffer de
pH 6.5, aunque el equipo que lo preparó para todo el salon hizo poco buffer por lo que
recurrimos a guardar la enzima en un buffer pH 7

Tabla 12. ​Cuadro comparativo sobre condiciones de precipitación

Autor/Año Microorganis % Temperat Buffer y pH

mo saturaci ura (°C)
ón

Khoo, 1994 A. flavus 50-90 4 Fosfato, pH 6.5

Ramashes, A. niger 90 ----- -----

1982

El-Safey, 2004 A. flavus 60 5 Fosfato, pH 6.2

Minoda, 1967 Black 40-70 ----- Fosfato, pH 6.5
Aspergillus

Suresh, 1999 A. niger 60-70 ----- Acetato, pH 4.3

Sodhi, 2003 Bacillus sp. 60 4 Fosfato, pH 6.5,

10mM

Ramachandran A. oryzae 40-70 4 Acetato, pH 5, 0.1

, 2004 M

Cálculo para sales de amonio:

M sulfato de amonio=(97.5 ml)(0.39 g/ml)= 38.025 g

El cual nos dio un resultado de 38.025 gr de sales de amonio las cuales fueron
agregadas a nuestro sistema poco a poco para que se fueron disolviendo. Nuestro
sistema constó de un vaso con hielo y dentro de este otro vaso con la muestra, todo
esto sobre una parrilla de agitación. Esto con el fin de disolver toda la sal que se
agregó paulatinamente. Cabe mencionar que la agitación fue muy baja ya que se
pretende evitar la formación de burbujas en la muestra ya que estas son dañinas para
la enzima.
Figura 12.​ Proceso de precipitación con sales.

Se centrifugó a 12000 por 20 min a 4 °C para obtener la pastilla de contenido

enzimático la cual se almaceno en buffer pH 7.

En esta etapa de la purificación se obtuvo una concentración de 46343.74 µg/ml

mostrando que conforme avanzaba la purificación mayor era la concentración de
proteínas.

Segun Villeda 2011 en la pastilla deberá haber mayor concentración de proteínas

asociadas a la membrana y en el sobrenadante una menor de proteínas solubles.

4.3 Diálisis
Para dar por terminada la purificación de enzimas se llevó a cabo una diálisis
colocando la pastilla suspendida en buffer en una bolsa de celofan e introduciendola en
un vaso de precipitado con agua destilada. Segun Amorós 2013 La diálisis se emplea
rutinariamente para cambiar el disolvente en el que se encuentran disueltas las
macromoléculas. Una disolución macromolecular se introduce en el saco de diálisis,
que se sumerge en un volumen relativamente grande de disolvente nuevo. Las
moléculas pequeñas pasan a través de la membrana al fluido externo hasta que se
alcanza el equilibrio, las macromoléculas permanecerán en el interior de saco de
diálisis. El proceso puede repetirse varias veces a fin de sustituir completamente un
sistema disolvente por otro.

Figura 13​. Fundamento de la diálisis.

En este proceso se obtuvo una concentración de proteína total de 6321.73 µg/ml la cual
es mucho menor a la concentración obtenida antes de la diálisis. Esto pudo deberse a
que alguien del personal del laboratorio movió nuestro sistema y lo dejó con una menor
cantidad de agua destilada, motivo por el cual no se cubría completamente todo el saco
y de acuerdo a Amorós 2013 “durante la diálisis penetra agua en el saco por ósmosis,
por lo tanto el tubo debe llenarse completamente con el fin de evitar la dilución del
contenido”.

En comparación de la obtención de enzima final para los microorganismos ​A. niger y ​S.
cerevisiae​ se obtuvo lo siguiente:

Tabla 13.​ Concentración de proteína total para cada microorganismo.

Microorganismo Concentración (µg/ml)

S. cerevisiae 183.22

A.niger 6321.73

Como se puede observar en la Tabla 10 se obtuvo una concentración de enzima

mucho mayor con ​A. níger. ​Algunos factores que según Pastrana 1996 pudieron influir
en este resultado son:
● Rendimientos comparables o superiores a los correspondientes procesos en
cultivos sumergidos.
 ● La elevada aireación del sistema.
● Bajos requerimientos energéticos

Otro factor que influyó en la baja concentración de proteína por S. cerevisiae fue que se
tuvieron varios inconvenientes y fallas experimentales al momento de llevar a cabo la
separación y purificación.

De acuerdo a Abu et al. (2005) la papa como sustrato para ​Aspergillus niger produce
enzimas con buena actividad enzimática para la degradación del almidón.

Tabla 14.​ Digestibilidad de almidón crudo con enzimas crudas.

MoCW → ​A. niger ​con suplemento nutricional

MoCN → ​A. niger​ sin suplementos nutricionales

CONCLUSIÓN
● Se logró producir amilasa usando aspergillus niger mediante FES como también
se logro comprender bien el fundamento y la utilización de este.
● Se obtuvo una concentración de 6321.73 de α-amilasa, producida por
Aspergillus niger ​gracias a una fermentación en estado sólido.
● Se comparó la cantidad de α-amilasa obtenida por la fermentación en estado
líquido utilizando en microorganismo saccharomyce cerevisiae contra la
fermentación en estado sólido empleando aspergillus niger. Obteniéndose una
mayor producción con la FES.

CUESTIONARIO POST-LABORATORIO

1. ¿Qué efecto tiene la falta de control de las condiciones ambientales en el

adecuado desarrollo de la FES?
Limitación de microorganismos:Su aplicación se limita a microorganismos que crecen
en bajos contenidos de humedad.

Problemas de medición de parámetros:

● La actividad del agua no sólo va a afectar el crecimiento del microorganismo
que en el sistema se desarrolle, sino también los productos de interés
obtenidos a partir del metabolismo de dicho microorganismo.
● El pH es otra variable que afecta el desarrollo de los procesos de fermentación
en estado sólido. Este se puede ver afectado por la secreción de ácidos, o
algunos otros metabolitos durante el proceso. Hablando de la fermentación en
medio sólido, el control es algo complicado más no imposible; la complejidad es
debida a la ausencia de instrumentos capaces de medir el pH en la capa de
líquido que rodea el sólido.
● La temperatura es un factor que puede ser considerado como una variable
crítica, debido a la alta concentración de sustrato por unidad de volumen y a la
baja conductividad térmica del sistema heterogéneo sólido-líquido-gas, lo que
favorece la acumulación del calor metabólico en el sistema y un aumento de la
temperatura del cultivo.
● Con el aumento de la temperatura se van a favorecer tres inconvenientes: la
actividad microbiana se desacelera o se detiene; se deshidrata el medio sólido,
y el metabolismo se desvía como un mecanismo de defensa ante el calor o
ante la deshidratación.
(Chávez et al; 2009).
​2.¿Cómo cambiarían los resultados obtenidos si el proceso de producción se
hubiera llevado a cabo en un biorreactor?
​El biorreactor más adecuado para la FES es el de columna empacada ya que es más
sencillo controlar las variables ambientales para mantenerlas en sus valores óptimos.
La aireación forzada es aplicada con alta humedad; La temperatura puede mantenerse
constante al colocar las columnas en baños de agua con regulación de temperatura
(Vázquez, 2008). Por lo tanto al mantener sus condiciones óptimas se puede tener una
mayor producción de amilasas.

3.Teóricamente, ¿qué diferencias existen entre los extractos enzimáticos

obtenidos con células libres y mediante FES?
​La actividad enzimática es diferente debido al control de los factores ambientales que
varían en ambos métodos.
Al ser un método más específico el extracto de células libres puede ser más efectivo
que la FES.
4.Teóricamente, ¿la actividad enzimática es diferente entre los dos extractos, por
qué?
​
Si porque al controlar mejor las condiciones óptimas con el método de células libres se
puede tener una mayor actividad enzimática como se muestra en (Sarmiento et al,
2003). que en el extracto obtenido con una FES cuyas condiciones ambientales son
más complicados de controlar.

5. Plantee un diseño experimental que permita conocer las condiciones óptimas

de producción de amilasa mediante FES.
​Se pueden tomar 5 temperaturas distintas alrededor del rango óptimo de crecimiento
de ​A. niger (50°C);Variar la humedad en los 5 distintos biorreactores; Suministrar en el
medio base 5 nutrientes distintos con 5 biorreactores de columnas empacadas. La tasa
de crecimiento de ​A. niger puede evaluarse en función de CO2 producido, por
cromatografía de gases. Mediante determinación de proteína se puede estimar la
cantidad de amilasa que se produce. Con base en los resultados, elegir el biorreactor
con las condiciones más favorables para la producción de amilasa (Vázquez, 2008).

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