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Directores:
Jorge Alonso Leyva Rojas Dr.rer.nat
Josué Anselmo García Ortiz MSc.
Codirector:
Mario Sánchez Rodríguez PhD.
I
Nota de Aceptación
Jurado
Jurado
II
Dedicatoria
III
AGRADECIMIENTOS
IV
CONTENIDO Pág.
Lista de tablas X
Lista de Figuras XI
Lista de Gráficas XIII
Lista de Anexos XIV
Abreviaturas XV
Glosario XVI
1. RESUMEN 1
2. INTRODUCCIÓN 2
3 OBJETIVOS 2
3.1 Objetivos general 2
3.2 Objetivos específicos 3
4. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN 3
4.1. Definición del problema 3
4.2. Reseña histórica 4
4.3 Alternativas para el control del LDPE 5
4.3.1 Enterramiento en rellenos sanitarios del LDPE 5
4.3.2 La incineración del LDPE 5
4.3.3 La Pirólisis del LDPE 6
4.4. Políticas de reciclaje 6
4.4.1 Problema ambiental causado por el LDPE 7
5 MARCO TEÓRICO 7
5.1 Polímeros 8
5.1.1 Plásticos 8
5.1.2 Poli olefinas 8
5.1.2.1.1 El polietileno (PE) 8
5.1.2.1.2 Clasificación del PE 8
5.1.2.1.2.1 Polietileno de baja densidad (LDPE) 9
5.1.2.1.2.2 Polietileno lineal de baja densidad o (LLDPE) 9
5.1.2.1.2.3 Polietileno de alta densidad (HDPE) 9
5.1.2.1.2.4 Causas de la Inercia química del polietileno 10
5.2 Biopolímeros sustitutos del LDPE 10
5.2.1 Biopolímeros naturales 10
5.2.2 Biopolímeros sintéticos 10
5.2.3 Bioplásticos 11
5.2.3.1 Bioplásticos totalmente biodegradables 11
5.2.3.2 Bioplásticos biofragmentables 11
5.3 Biorremediación 11
5.3.1 Biodegradación de polietileno de baja densidad 11
(LDPE)
5.3.1.1 Biodeterioración 12
5.3.1.2 Asimilación 12
V
5.3.2 Factores a tener en cuenta en la biodegradación 12
del LDPE
5.3.2.1 Ruta de la biodegradación del LDPE 13
5.3.2.2 Iniciadores y aceleradores del proceso de 15
biodegradación, degradación abiótica
5.3.2.2.1 Fotólisis 15
5.3.2.2.2 Oxidación térmica 16
5.3.2.2.3 Oxidación mecano química 16
5.3.2.2.4 Mecanismos de despolimerización 16
5.3.2.2.4.1 Iniciación 16
5.3.2.2.4.2 Propagación 17
5.3.2.2.4.3 Terminación 17
5.3.3 Microorganismos reportados que degradan el 17
polietileno
5.3.3.1 Hongos como agentes degradadores de LDPE 21
5.3.3.2 Bacterias como agentes degradadores de LDPE 21
5.3.3.3 Consorcios microbianos 21
5.3.3.4 Enzimas reportadas 22
5.3.3.5 Biodegradación aerobia y anaerobia 23
5.3.3.5.1 Reacción básica de biodegradación de tipo 23
aeróbico
5.3.3.5.2 Reacción básica de biodegradación de tipo 23
anaeróbico
5.3.3.6 Efecto en la biodegradación en la humedad del 23
medio
5.3.3.7 Efecto del pH en el medio 24
5.3.3.8 Efecto de la temperatura 24
5.3.4 Aditivos utilizados para potenciar la degradación 25
del LDPE
5.3.4.1 El polietileno de baja densidad LDPE con almidón 25
5.3.4.2 Aditivos pro-oxidantes 26
5.3.4.3 Aditivos comerciales 29
5.3.4.4 Biosurfactantes vinculados en la biodegradación 33
del LDPE
5.3.4.5 Sustitutos biodegradables del LDPE 34
VI
5.4.1.1.1 Microscopia electrónica de barrido SEM 41
5.4.1.1.2 Microscopia de fuerza atómica 41
5.4.1.1.3 Espectroscopia UV – visible 41
VII
5.4.2.3.3 Medios líquidos 53
5.4.2.3.4 Medios sólidos 54
5.4.2.4 Pretratamientos del LDPE 54
5.4.2.4.1 Aclimatación natural 55
5.4.2.4.2 Aclimatación artificial / pruebas de laboratorio 55
5.4.2.4.2.1 Ruptura por hidrólisis 55
5.4.2.4.2.2 Oxidación térmica 55
5.4.2.4.2.3 Procedimiento de foto degradación 55
5.4.2.4.2.4 Procedimiento de termo degradación 55
5.4.2.5 Pruebas de biodegradación 55
5.4.2.5.1 Prueba de enterramiento en suelo 55
5.4.2.5.2 Prueba de compostaje 56
5.4.2.5.3 Prueba de biodegradación en cajas Petri 56
5.4.2.5.3.1 Formación de zonas claras 56
5.4.2.5.4 Prueba de platos con hongos 56
5.4.2.5.4.1 Método de inoculación 56
5.4.2.5.5 Prueba de biodegradación In-vitro 57
5.4.2.5.5.1 Prueba de cultivo líquido 57
5.4.2.5.5.2 Prueba de toxicidad 57
5.4.2.5.6 Pruebas de hidrofobicidad 57
5.4.2.5.6.1 La prueba BATH (Bacterial Adhesion to 57
Hidrocarbons)
5.4.2.5.6.2 Prueba de salado SOT (por sus siglas en inglés: 58
salting out test)
5.4.2.5.6.3 Estudios de absorción de agua 58
5.4.2.5.6.1 Prueba del ángulo de contacto con agua 58
5.4.2.5.7 Pruebas de enzimas 58
5.4.2.5.8 Pruebas de evolución de gas (CO2 or CH4) 58
5.4.2.5.8.1 La prueba Sturm 59
5.4.2.5.8.2 Radiomarcación 59
5.4.2.5.8.3 Prueba de respiración 59
5.4.2.5.9 Prueba de la pérdida de masa 59
5.4.2.5.9.1 Porcentajes de degradación del LDPE reportados 60
por algunos estudios
5.4.2.5.10 Pruebas físicas de la biodegradación 61
5.4.2.5.10. Índice de fluidez 61
1
5.4.2.6 Pruebas de identificación microbiana 62
VIII
5.4.2.6.1 Viabilidad del biofilm microbiano 62
5.4.2.6.2 Pruebas de caracterización preliminar 62
5.4.2.6.3 Pruebas de identificación especifica 62
5.4.2.7 Productos de la biodegradación 62
5.5 Metodología propuesta 63
5.5.1 Test de viabilidad cuenta de microorganismos 64
viables por dilución en placa
5.5.1.1 Obtención de muestra y selección de los 65
microorganismos degradadores de LDPE en medio
líquido SM
IX
LISTA DE TABLAS
No Pág.
Tabla 1 Microorganismos biodegradadores de LDPE 18
Tabla 2 Enzimas involucradas en la biodegradación del 22
polietileno
Tabla 3 Clasificación esquemática de los diferentes medios 24
ambientes en que ocurre la biodegradación del
LDPE
Tabla 4 Estudio sobre la biodegradación del LDPE con 26
prooxidantes
Tabla 5 Aditivos del polietileno de baja densidad (LDPE) 26
Tabla 6 Algunos aditivos comerciales reportados 29
Tabla 7 Susceptibilidad del polietileno modificado con 32
bionolle
Tabla 8 Biosurfactantes producidos por distintos 33
microorganismos
Tabla 9 Sustitutos del Polietileno de baja densidad (LDPE) 35
Tabla 10 Técnicas utilizadas para estudiar la degradación del 38
Polietileno de baja densidad (LDPE)
Tabla 11 Principales técnicas de análisis térmico 48
Tabla 12. Test y métodos de cultivo usados para evaluar la 49
biodegradación del LDPE
Tabla 13 Revisión de los métodos para el estudio de la 54
degradación del LDPE
Tabla 14 Posibles residuos de la biodegradación 62
Tabla 15 Resultados en cifras de los elementos estudiados 73
Tabla 16 Reactivos requeridos con sus respectvas 105
concentraciones
Tabla 17 Listado de sustancias para los medios y pruebas 111
Tabla 18 Procedimientos sugeridos para la siembra 114
Tabla 19 Relación entre género y resultados obtenidos en las 115
pruebas bioquímicas
Tabla 20 Algunas características preliminares bacterianas 116
X
LISTA DE FIGURAS
Pag.
XI
Figura 16 Procedimiento para aislar los microorganismos 102
degradadores de LDPE y su posterior propagación
para realizar la extracción del DNA
Figura 17 Ensayo de biodegradación in vitro 103
XII
LISTA DE GRÁFICAS Pág.
XIII
LISTA DE ANEXOS Pág.
XIV
ABREVIATURAS
XV
GLOSARIO
XVI
FOTOLISIS: ruptura de un enlace mediante la energía transferida por
fotones (luz) altamente energética, ejemplo UV.
FUENTE DE CARBONO: es el material o sustancia que provee a los
microorganismos de carbono, ejemplo: el polietileno.
METABOLITO: producto bioquímico generado en el metabolismo celular.
MINERALIZACIÓN: acción natural de transformación de compuestos
químicamente complejos a otros de poca o ninguna complejidad.
MONÓMERO: una estructura mínima o básica que se puede unir para formar
una cadena o macro estructura.
OLEFINA: compuestos químicos a base de carbono y que poseen enlaces
dobles.
POLÍMERO: es una macromolécula o aglomeración de muchos monómeros
los cuales están unidos por enlace covalente.
PROOXIDANTES: sustancias químicas que en virtud de su naturaleza
química generan reacciones de oxidación.
RADICALES LIBRES: son especies que contienen electrones de valencia
desapareados los cuales son bastante reactivos.
RELAJACIÓN: procesos de pérdida de viscoelasticidad, son fenómenos
cinéticos, también denominado dispersiones. Cuando un material polímero
se desplaza de su equilibrio por efecto de solicitaciones externas, el sistema
tiende a volver a su estado inicial al cesar éstas.
TERMOPLÁSTICOS: son plásticos que son reformables o remoldeables
cuando se les aplica una temperatura y presión.
TRANSICIÓN VÍTREA: se define como la temperatura a la cual un polímero
amorfo (o la región amorfa de un polímero parcialmente cristalino) cambia de
una situación de ser duro y relativamente quebradizo a una condición
viscosa y gomosa.
VISCOELASTICIDAD: cuando los materiales poliméricos disipan
(calentándose o deformándose) una parte de la energía con que se les
excita.
XENOBIÓTICO: sustancia de origen antropogénico y que puede afectar
negativamente a los seres vivos.
XVII
1. RESUMEN
Palabras clave:
ABSTRACT
Irrational use and resistance to environmental degradation are the causes of
Low Density Polyethylene (LDPE) accumulating, which generates a serious
environmental problem [3], due to this research has been done in the search for
solutions to the problem, the most important being to completely replace the
LDPE or accelerate its biodegradation process.
The present work is a bibliographical study in which the most relevant aspects
reported on the biodegradation of low density polyethylene (LDPE) are
collected, compared and organized in a broad and systematic way, including:
microorganisms capable of being used as a source of carbon ; The enzymes
used and the comparison of their efficiencies from the loss of mass, considering
the conditions under which the tests were performed; All available analytical
techniques, existing additives or substitutes; Finally, a methodological strategy
for the identification of microorganisms and the quantification of biodegradation
that is adequate for their local implementation is proposed.
Keywords:
Low density polyethylene, biodegradation, microorganisms, spectroscopic and
microscopic proofs.
1
2 INTRODUCCIÓN
3 OBJETIVOS
2
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
4 ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN
3
plásticos, de éstos la mayor cantidad correspondía al polietileno de alta
densidad HDPE (por sus siglas en ingles High density polyethylene) [5, 21] y
para el año 2011 entre los residuos sólidos residenciales el polietileno
correspondía al 62% [5].
Gráfica 1 a Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2010, tomada
de [22]; 1. b Variación de la producción de mundial de plásticos desde 1950 hasta 2013. Basada
en los datos de PlasticsEurope del 2010 y 2013 [23, 14].
4
polietileno puro o con aditivos, como almidón, pro oxidantes, también se
descubrió que eran enzimas degradadoras de lignocelulosa [26] [27].
En 1998 Iiyoshi y colaboradores [28] demuestran la biodegradación del PE
por los enzimas lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y la fenol oxidasa o
lacasa, basados en varios estudios hechos sobre biodegradación de lignina
entre los cuales se podrían nombrar los hechos por Kirk TK, Farrell RL en 1987
[29].
Los bioplásticos no son nada nuevo, los primeros producidos datan de 1845,
cuando se produjo por primera vez el ácido poli láctico (PLA), un poliéster
termoplástico, hecho a partir de la fermentación de productos agrícolas como
almidón de maíz, La Dow químicos revivió la producción de PLA en 1950, pero
los altos costos de producción detuvieron su uso masificado [30].
En 1980, la British chemical industries (ICI) desarrolló Biopol, un bioplástico a
partir de los polímeros poli hidroxialcanoatos PHA que son producidos por
muchas especies de bacterias a partir de azucares de plantas o aceites, pero
una vez más, la ICI fue incapaz de producir biopol de forma económica como
para competir con plásticos convencionales [30]. Monsanto compró Biopol a ICI
en 1996 [30]. En 1998. Monsanto descontinuo la operación de producción de
bioplasticos debido a los altos costos y las limitadas oportunidades comerciales
[30]. Monsanto vendió sus acciones a la U.S. bioscience company, Metabolix
que inició investigaciones y desarrollo de procesos de manufactura de plásticos
a base de PHB a bajos costos [30]. En el 2006, metabolix se unió a la gigante
agricultora Archer Daniels Midland para comercializar un bioplásticos
denominado Mirel compañía que lidera la producción y venta de bioplásticos
para productos de uso diario, tanto de larga vida como desechables [30], claro
está, a precios más caros que los producidos con plásticos a partir de materias
petroquímicas. Por otro lado otros autores afirman que los siguientes PHA el
Poli (butileno Succinato) (PBS), poli (etileno Succinato) (PESu), o el copolímero
poli (butileno Succinato -co-butilen adipato (PBSA), son miembros de un grupo
denominado comercialmente como ‘Bionolle’ inventados por Showa Denko
(Japón) in 1990. [31, 32, 33, 34, 35, 36]. Durante el presente siglo veintiuno, ha
habido toda una explosión de investigaciones en torno a éste tipo de materiales,
de los cuales se ha basado parte de esta investigación.
5
cáncer de pulmón, ataques cardiacos y desordenes respiratorios como el asma.
[40, 41, 42], Los productos finales de la incineración son cenizas y gases. Se
estima que la huella de carbono del LDPE o polietileno es cercana a 6 kg CO 2
por kg de plástico [43].
6
4.4 Problema ambiental causado por el LDPE
Se ha informado la muerte de animales terrestres y acuáticos debido al
consumo o atrapamiento en bolsas de polietileno [32]. El polietileno bloquea su
tracto digestivo, también se sabe que los restos del polietileno no digerido
después de la muerte de los animales son de nuevo ingeridos por algún otro
animal lo que le ocasiona la muerte, y el ciclo continúa [47]. El polietileno no
digerido es responsable de varios problemas en animales entre los que se
podría mencionar:
Dificulta el proceso digestivo, el proceso de fermentación y el correcto
mezclado de los alimentos en el estómago [47].
El polietileno ingerido bloquea la apertura entre el omaso y retículo que
llevan a la muerte del animal si el polietileno no se retira [47].
La impacción: debido a la acumulación de una gran cantidad de rumen
las bolsas de polietileno conducen a una ruminotomía [47].
El timpanismo: debido al bloqueo del retículo y omaso con el polietileno,
la acumulación de gases del rumen llevan a la muerte del animal si no se
quita apropiadamente [47].
La inmunosupresión: la acumulación de polietileno en el estómago de los
animales (la vaca) lleva a una sensibilidad aumentada a las infecciones
como el septicemia hemorrágica [47].
5 MARCO TEORICO
7
5.1 Polímeros
Son sustancias macromoleculares, lo que significa que tienen un alto peso
molecular y que se forman por la unión de unidades moleculares discretas
denominadas monómeros, las cuales están unidos entre sí mediante enlace
covalente.
5.1.1 Plásticos
Son polímeros sintéticos generalmente de naturaleza química hidrófoba, que
normalmente poseen una alta durabilidad y resistencia, suelen no tener un
punto de fusión fijo y poseen en determinado intervalo de temperaturas
características flexibles y moldeables. Se calcula que pueden tardar entre 100 y
1000 años para degradarse dependiendo del tipo de plástico [42, 40, 50]. La
american Society for testing materials (ASTM) define plástico como:
“Cualquier material de un extenso y variado grupo que contiene como elemento
esencial una sustancia orgánica de gran peso molecular, siendo sólida en su
estado final; ha tenido o puede haber tenido en alguna etapa de su manufactura
(fundido, cilindrado, prensado, estirado moldeado, etc.) diferentes formas de
fluidificación, junta o separada, de presión o calor”.
8
5.1.2.1.2.1 Polietileno de baja densidad LDPE
Su estructura es muy ramificada (en cerca de 2% de los átomos de carbón)
[51]. Su peso molecular es de 100.000-300.000 [g/gmol] y su densidad es de
0,90-0,91 [gr/cm3] siendo el de menor densidad y esto se ve reflejado en sus
cualidades reológicas, se usa en la fabricación de bolsas desechables.
a)
1000
b)
c)
4000
1000
Figura 1 estructuras del polietileno, a) polietileno lineal de baja densidad
(LLDPE); b) polietileno de baja densidad (LDPE);c) pol ietileno de alta densidad
HDPE.
9
5.1.2.1.2.4 Causas de la Inercia química del polietileno
De acuerdo a Arutchelvi [53], el polietileno pero también las poliolefinas en
general son materiales inertes no susceptibles a la biodegradación por las
siguientes razones:
10
5.2.3 Bioplásticos
Son materiales plásticos sintéticos, semisintéticos o naturales con
características similares a los plásticos tradicionales, pero con la ventaja de ser
degradables, pueden ser mezclas de polímeros sintéticos con naturales, o
pueden ser plásticos totalmente sintéticos, pero degradables, por ejemplo
están: el polietileno de baja densidad y el almidón termo plástico LDPE + TS
(del inglés: thermoplastic starch) o el poliácido glicólico (PGA) (del inglés poly
glycolic acid), el poliácido láctico PLA (del inglés poly lactic acid) y el
polihidroxibutirato PHB, los tres últimos mencionados son poliésteres y por lo
tanto son susceptibles a la hidrólisis de sus enlaces éster, de acuerdo a su
composición y velocidad de degradación pueden ser agrupados en dos grandes
clases [56].
5.3 Biorremediación
Comprende la aplicación de agentes biológicos, principalmente
microorganismos como catalizadores biológicos para degradar, desintoxicar o
acumular productos químicos contaminantes.
11
para los científicos de polímeros, la degradación significa la perdida de las
propiedades físicas, mientras que para los microbiólogos es la completa
mineralización del material [55]. De acuerdo a una nueva definición el término
biodegradación incluye los factores bióticos y abióticos los cuales actúan
sinérgicamente para descomponerlo en materia orgánica [31].
5.3.1.1 Biodeterioración
Es una etapa extracelular, caracterizada por la acción en conjunto de los
microorganismos y los factores abióticos que en conjunto dan como resultado
una fragmentación del LDPE en oligómeros y en el cambio químico del
polímero (oxidación) [31]. (Ver mecanismos de despolimerización.)
5.3.1.2 Asimilación
Posteriormente cuando estos oligómeros tienen el tamaño suficiente para ser
trasportados al citoplasma, los microorganismos los integran a las rutas
metabólicas donde son mineralizados [31].
12
Figura 2 Factores que afectan la biodegradación del LDPE adaptada de [60, 61]
Figura 3 Rutas
hipotéticas de
transformación del
polietileno hasta su
total mineralización
basada en los
artículos de [63, 45,
68].
14
5.3.2.2 Iniciadores y aceleradores del proceso de biodegradación, la
degradación abiótica
La mineralización del polietileno inicia con una degradación abiótica u
oxidación (ver Figura 5 ), que es causada por el medio ambiente,
principalmente por la luz y las condiciones del entorno, tales como el pH, la
salinidad, la disponibilidad de oxígeno, el estrés físico, la humedad, la
temperatura, etc [42]. Facilitando el posterior ataque microbiano, a continuación
se mencionara brevemente los más importantes.
5.3.2.2.1 Fotólisis
El LDPE es un polímero de baja degradabilidad porque esta principalmente
compuesto de enlaces C–C and C–H (𝜎 enlaces) cuya energía de enlace es del
orden de 300–600 kJ/mol [66].
El principio de degradación establece que la cantidad de energía absorbida por
una molécula debe exceder la energía de enlace.
La energía de la radiación UV-A no es suficiente para romper los enlaces
químicos del LDPE y causar la degradación del polímero [66]. La radiación UV-
B (320-280) es particularmente eficiente en causar foto daño al LDPE y
polímeros sintéticos [66]. La radiación UV-C tiene energía suficiente para
romper los enlaces 𝜎, pero la que es emitida por el sol es absorbida por la
atmosfera y no alcanza la Superficie de la tierra [67].
De acuerdo a Baljit Singh, Nisha Sharma, la radiación UV-B cercana de la luz
solar (290nm) posee la energía suficiente para romper los enlaces C-C 375
kJ/mol y C-H 420 kJ/mol del LDPE los cuales son equivalentes a una radiación
UV-B de 320nm y 290nm respectivamente, el proceso conduce a la formación
de radicales libres [68]. (Ver Figura 6).
15
5.3.2.2.2 Oxidación térmica
Al igual que en la fotólisis, la termo degradación produce radicales libres que
atacan el polímero, pero en la oxidación térmica el ataque ocurre al azar y no
en los extremos terminales tal como ocurre durante la fotólisis, por ello la termo
degradación puede empezar tanto en el interior como en la superficie, haciendo
que el proceso sea más rápido [68], debido a que el LDPE es un polímero de
adición (por radicales libres), el mecanismo de despolimerización corresponde
al inverso de la polimerización y ocurre rápidamente a temperaturas de 200°C o
mayores.
16
5.3.2.2.4.2 Propagación
El proceso se propaga cuando los radicales C* reaccionan con oxígeno
formando el radical peróxido, el cual a su vez ataca cualquier compuesto que
ofrezca electrones y posiblemente protones formándose un ácido o un éster en
el proceso y un nuevo radical. (Como se muestra en la Figura 8).
5.3.2.2.4.3 Terminación
Los grupos carbonilo actúan como cromóforos que permiten una iniciación de
más radicales debido a que absorben en el UV cercano [68]. Posteriormente
ocurre una ruptura de las cadenas por medio de las reacciones tipo Norrish 1 y
2 (Ver Figura 9a), finalmente terminan con la formación de fragmentos que
contienen grupos funcionales como alquenos, alcoholes, esteres y ácidos
carboxílicos, estos son utilizados por enzimas microbianas para su
metabolización y final mineralización.
Figura 9a.
Mecanismos de
oxidación,
reacciones
Norrish tipo 1 y
2, imagen
basada de [68];
6 b. Oxidación
para la
formación de
ácidos grasos o
esteres,
adaptado de
[96]
17
sobre biodegradación del polietileno, a continuación se presenta una
recopilación de todos los microorganismos reportados o/y utilizados en los
estudios de biodegradación del LDPE:
Tabla 1 microorganismos capaces de degradar el LDPE reportados en la literatura. Tabla
adaptada de [19, 71, 53, 42, 29, 63]
Dominio Genero Especie Referencias
1 bacteria Acinetobacter baumannii [72, 73, 74]
ursingii [75]
sp [76]
2 Bacteria Acanthopleurob pedís [77]
acter
3 Fungi Acremonium kiliense [78, 79]
4 Bacteria Achromobacter denitrificans [80]
5 Fungi Alternaria alternata [81, 82]
6 Bacteria Arthrobacter, sp [83, 84]
paraffineus [65, 85]
defluvii [86]
viscosus [72]
koreensis [32]
7 Fungi Aspergillus: versicolor [78, 40, 79, 87, 88]
brasiliensis [89]
sp [90, 87, 67, 91, 50, 92, 93, 51]
flavus [76, 11, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 40]
[101, 89, 102]
fumigatus 0 [99, 103, 89]
glaucus [11, 104, 76, 105]
niger [76, 106, 11, 107, 104, 108, 95, 109, 110, 111]
[112, 97, 99, 105, 100, 101, 89, 102, 31, 113]
[91, 114, 115, 116, 33]
nidulance [76, 11, 50]
terreus [103, 101, 102, 31, 88, 41, 115]
cremeus [11]
candidus [11]
ornatus [89, 11]
japonicus [97, 101, 102]
awamori [72]
tamarii [101]
oryzae [117, 95, 94]
8 Fungi Aureobasidium pullulans [31, 115, 118]
9 Bacteria Bacillus sp [11, 93, 89, 16, 119]
aerius [77]
pumilus [120, 72, 84]
brevies [121]
cereus [122, 123, 84, 71, 124, 99, 125, 105, 77]
circulans [126, 121]
halodenitrific [120]
ans
amyloliquefai [72, 127, 128, 129, 130]
ens
amylolyticus [86]
megaterium [122]
mycoides [72, 131, 132]
sphaericus [71]
licheniformis [133]
subtilis [122, 76, 107, 86, 99, 134, 132]
thuringiensis [72]
18
weihensteph [135]
anensis
10 Bacteria Bacterium te68R [77]
11 Bacteria Brevibacillus borstelensis [122, 126, 136]
parabrevis [73]
sp [137, 138]
12 Bacteria Burkholderia cepacia [135]
13 Fungi Candida sp [99]
14 Fungi Cephalosporiu sp [100]
m
15 Fungi Chaetomiu globosum, [124, 106]
m sp [98]
16 Fungi Cladosporium cladosporioid [47, 139, 96]
es
cladosporioid [47, 96, 140]
es
17 Fungi Curvularia sp [141]
senegalensis [118]
lunata [82]
18 Bacteria Delftia acidovorans [142]
19 Bacteria Desulfotomacul nigrificans [48]
um
20 Bacteria Diplococcus sp [11, 89]
21 Bacteria Escherichia coli BL21 [32, 135, 134, 136]
22 Bacteria Enterobacter asburiae [119]
23 Bacteria Flavobacterium sp [142]
24 Fungi Fusarium sp [100, 97, 90, 99, 143, 91, 82]
solani [103, 118]
25 Fungi Geotrichum sp
26 Fungi Glioclodium virens [111, 72, 106]
27 Fungi Helminthospori sp [100]
um
28 Fungi Humicola sp. [144]
29 Fungi Hyalodendron sp [145]
30 Bacteria Listeria sp [16]
31 Bacteria Lysinibacillus. sp [92]
32 Bacteria Microbacterium paraoxydans [146]
MK3 (DQ31 [147]
8884),
sp [147, 77]
33 Bacteria Micrococcus luteus [76, 72]
sp [16, 11, 99]
lylae B-429 [72, 105]
34 Fungi Moraxella sp [11, 104, 89]
35 Fungi Mortierella alpina [96]
subtilissima [72]
36 Fungi Mucor ruxii [94]
sp. [97, 99, 102]
circinelloides [40]
37 Fungi Nigrospora sp [100]
38 Fungi Nocardia steroids GK [47]
911
asteroides [47, 96, 139]
39 Fungi Paecilomyces variotti [112, 31, 148, 115]
40 Bacteria Paenibacillus macerans [72]
41 Fungi Penicillium sp [97, 67, 99, 76, 100, 93, 144]
simplicimus [69, 149, 82]
frequentans [131]
19
pinophilum [109, 111]
ochrochloron [31, 115]
funiculosum [112, 106, 31, 115, 33]
implicatum [100]
42 Fungi Phanerochaete chrysosp [150, 13, 151, 13, 111, 152, 105, 153, 154]
orium
chrysosporium ME- [28]
446
43 Fungi Pleurotus ostretus IZU-15413 [155, 105]
44 Bacteria Proteus vulgaris [76]
45 Bacteria Pseudomonas: aeruginosa [107, 142, 146, 99, 156, 105, 128, 157]
[147, 77, 75]
20
60 Fungi Trametes versicolor IFO7043 [28]
versicolor ISU15413 [28]
61 Fungi Trichoderma viride [178, 31, 115]
hamatum [130]
62 Fungi Verticilium lecanii [78, 79]
63 bacteria Vibrio sp [16, 179]
21
Algunos autores definen las comunidades microbianas o consorcios como
asociaciones de múltiples especies que coexisten en un mismo nicho. En los
consorcios microbianos los microrganismos trabajan en forma multidisciplinar
sobre el LDPE degradandolo en sus monómeros. De aquí que la actividad de
los consorcios permite incrementar la degradación del polietileno [82].
Todas son exoenzimas, algunas usan oxígeno o peróxido para generar grupos
carbonilo o hidroxilo en la superficie del material, otras hidrolizan los
copolímeros almidón polietileno y otras rompen enlaces C-C, o C-C=O.
22
Cabe mencionar que hasta la fecha ningún trabajo ha realizado un estudio
enfocado y detallado sobre las enzimas, su clasificación, la identificación de las
estructuras primarias, secundarias y terciarias, formas de interacción con el
sustrato, tiempo de acción, condiciones de acción, genes codificadores, etc.,
por lo que aún hay importantes vacíos por llenar..
23
de forma más intensa en el sustrato compuesto por 67% de polímero y 33% de
sorgo a 22°C [189], que era el de mayor humedad.
Tabla 3 clasificación esquemática de los diferentes medios ambientes en que ocurre la
biodegradación del LDPE, tomada de [59]
Acuático Seco
Aeróbico Plantas aeróbicas de tratamiento Suelos de superficie
de aguas residuales. Residuos orgánicos en platas de
Aguas de superficie : ríos y lagos, compostaje
ambientes marinos Residuos en botaderos a cielo abierto
Anaeróbico Plantas anaerobias de Sedimentos en lo profundo del océano
tratamiento de aguas residuales Rellenos sanitarios
Rumen de herbívoros Biogasificacion
Digestión anaeróbica
Lodos anaerobios
24
en varios artículos revisados las temperaturas óptimas correspondieron a
valores desde los 28 a 55°C.
Las bacterias termófilas Streptomyces coelicoflavus NBRC 15299 soportan
variaciones de temperatura desde los 12°a los 42°C, sin embargo su
temperatura para la degradación óptima fue de 28±2°C [177].
Para las bacterias Pseudomonas putida S3A se encontró que la temperatura
óptima estaba en 37°C [162].
En un estudio en el que se usó el hongo Pycnoporus sanguineus para degradar
LDPE el crecimiento se midió por porcentaje de invasión del sustrato,
encontrando que a 22°C, el porcentaje de invasión superó el 90% en un lapso
de 21 días, mientras que cuando la temperatura de crecimiento fue de 10°C, el
máximo crecimiento llegó apenas a un 32% [189]. En un estudio con tres
muestras de hojuelas de LDPE pre tratadas con radiación ultravioleta durante
68h, fueron incubadas por separado a 37°C, 46°C y 55ºC durante un mes, en
presencia de Bacillus borstelensis, la temperatura en la que se presentó el
mayor grado de biodegradación (14,2%) fue a 55°C [136].
5.3.4 Aditivos utilizados para potenciar la degradación del LDPE
Existen múltiples productos variantes del PE que contienen pro-oxidantes o
aditivos biodegradables a continuación se mencionaran algunos.
25
debido a la pobre adherencia a la matriz del aditivo y la aglomeración de sus
partículas.
Tabla 4 estudio sobre la biodegradación del LDPE con prooxidantes, adaptado de [117]
26
carbono que es
biodegradable bajo ambas
condiciones aeróbica y
anaeróbica
Policaprolactona Policaprolactona y alta biodegradabilidad Ninguna [64, 193]
LDPE Su estructura cristalina es
similar a la del polietileno.
Oxido de OP/ PHB Por su baja resistencia al Homopolímero [199, 200]
polietileno- poli impacto se mezcla y de puro es muy
hidroxibutirato esa manera se potencia quebradizo tiene
sus cualidades y además pobres
potencia la biodegradación propiedades
mecánicas y es
Costoso
PHBV LDPE/PHBV Polímero Natural puro es muy [148, 193]
( p o l i ( 3 - h id r biodegradable quebradizo pero
oxibutirato (Producido por menos que el
- c o- microrganismos) es menos PHB tiene
hidroxivalerato) quebradizo que su pobres
homopolímero el PHB y propiedades
sus propiedades físicas y mecánicas y es
térmicas dependen el Costoso
grado de contenido de HV
Colágeno El colágeno En un porcentaje del 20- Porcentajes [57]
hidrolizado hidrolizado y el 30% permite obtener mayores tienen
polietileno de baja laminas transparentes, efectos
densidad cohesivas y flexibles que adversos a las
son caracterizadas por cualidades
tener respuestas térmicas reológicas del
y mecánicas satisfactorias material, la
extracción de la
sal es compleja
y afecta la
mezcla PE-HC
Trazas esteara Los cuales El tipo de [112, 201, 65, 85, 122, 117, 202, 170, 155, 133]
de tos de pueden metal y su [157, 203]
metale Fe3+, Aumentar la concentració
s de Mn2+ velocidad de n puede
transic esteara oxidación por el variar de
ión : to de oxígeno del aire y acuerdo al
Fe, Co2+ la escisión de las proveedor
Mn, acetilac cadenas de PE comercial,
Co, Ti etonato bajo la influencia requiere
de de la luz y / o exposición
Co2+, calor. Partículas lumínica,
11-9Z, de Titanio foto efectos de
12Z- catalíticas. toxicidad
Octade para los
ca-9, microbios
12- (Partículas
dihidrox de Titanio).
i-10,13 [157]
dihidrox
iactade
caneat
o
Cobalto
(II)
nano-
TiO2
foto
27
cataliza
dor
Aditivos Fe, Co, Ni, Contiene múltiples grupos Experimental [197]
multifuncionales contiene grupos: funcionales que hacen que
o en inglés alcohol, alcano, sea fotosensible, posee
(Multi functional enlaces dobles, efectos lubricantes y
aditives) ácido carboxílico. plastificantes, potencia la
biodegradación sin afectar
los parámetros de
procesabilidad.
Almidón Las Aceleració Baja: resistencia [204, 94, 8, 65, 191, 13, 205, 206, 207, 153]
termopl proporcion n de la a la humedad, y [106, 176, 137, 188, 190, 208, 209, 115, 116]
ástico es pueden biodegrada Procesabilidad,
TPS (del variar pero ción, incompatibilidad
ingles por lo Mejora de con el PE
Thermo general se alguna de Hidrofóbicos.
plastic encuentran sus
Starch) en un 12% propiedade
de almidón s
y 88% de mecánicas.
LDPE
Aceite mineral LDPE + aceite Se obtiene una A [106]
mineral. colonización más la concentraciones
pérdida de peso a una mayores a 0,05
concentración de 0,05%. tiene un menor
efecto en la
degradación del
rápida
incrementa en
un 50% PE.
Aceite vegetal Triacil Gliceroles Los Triglicéridos contienen [179]
ácidos insaturados que son
más susceptibles a la
autoxidación.
Celulosa LDPE/celulosa Potencia la biodegradación No presenta las [210] [194]
Se usó Yute, por facilitar el ataque de mismas
madera celulasas. cualidades
reológicas.
Glicerol El glicerol/LDPE/ Facilita la biodegradación y Costo [211, 208, 115, 179]
Almidón. cumple la función de
plastificante.
Maleato o Maleato/LDPE/ Se usa como Aumenta [190, 211, 208, 198]
MAPE biopolímero compatibilizante. los costos
PP PP/HDPE Los dos son muy Bajo [201]
Mezcla de resistentes al ataque condiciones de
polipropileno y po bacteriano por lo que no enterramiento
Ietileno de alta potencia la se alteran las
densidad biodegradación. propiedades
mecánicas.
poliol- modificación Es mucho más compatible Aumenta los [8]
glucósidos química del con el LDPE y favorece la costlas s
almidón por biodegradación.
glucosilación y
posterior
transesterificación
con el
aceite de
higuerilla
Cera de abeja, PE/Cera de abeja Es natural, hidrofóbica, y Genera [79, 211, 198]
Cera La cera de abeja biodegradable. problemas en
28
es 14% grandes
hidrocarburos, cantidades
35% mono (10%) cuando
ésteres, 3% di se realiza la
esteres, y 12% plastificación por
ácidos grasos su bajo punto de
libres. fusión
Parafina PE/parafina Proporciona Gran Pierde parte de [211]
Parafina estabilidad térmica y sus buenas
comercial. potencia la hidrofobicidad. cualidades
Mezcla de reológicas y
alcanos entre los fisicoquímicas.
20 a 40 carbonos
Pectina Pectina/PE [208]
HP Polietileno e Biodegradación de 35% Biodegradación [94]
hidrolizado de con una aceptable de 50% con una
proteína PE/HP resistencia a la tensión pobre
20% y 40%. resistencia a la
tensión
Ricinoleico LDPE/RLCD Acelera la biodegradación No son [133]
linoleato de de LDPE conocidas las
Cobalto cantidades
exactas que se
obtuvieron para
las pruebas.
Ácido poli LDPE/PLA Potencia la biodegradación Solo se han [12]
láctico hecho estudios
en escala de
laboratorio y
probablemente
aumente los
costos.
29
TDPATM. Metal estearatos (Fe, Ce, Han demostrado Requiere [212]
TDPA®. Co) Y ácido cítrico biodegradarse en que el [47, 213, 139,
(típicamente Co) y almidón materiales no material 202, 196, 203]
la degradación ocurre tóxicos en un rango reciba luz
debido a la reacción del de tiempo solar para
plástico con el oxígeno del comprendido desde poder ocurrir
aire (oxodegradación), unos pocos meses el proceso
también se inicia por a algunos años, de
exposición a los rayos dependiendo de la degradación.
ultravioleta (UV formulación del
degradable), altas aditivo
temperaturas y/o esfuerzos En 2 años será
mecánicos. degradado
Fabricante: EPI
30
debido a compuestos requiere el material
bioactivos que atraen a condiciones reciba luz
colonias de anaerobias solar para
microorganismos poder ocurrir
el proceso
de
degradación,
EcoSafe plásticos oxodegradables y Paquete de aditivos Elevan el [218]
biodegradables de que activan la oxo- costo de
composición no disponible degradación del producción y
polietileno luego de venta y
un periodo de requiere
tiempo condiciones
preseleccionado. aerobias
Ecoflex Aliphatic/aromatic 5-95% Elevan el [53]
polyester completamente costo de
biodegradable producción y
venta
Mater-Bi PCL/Starch (60:40w/w) La biodegradación Elevan el
con Mater-Bi fue costo de
del 75-88% en producción y
todas las pruebas. venta
Master 20% de MB La degradación fue Es una [188]
Batch de 26% después de velocidad de
20 meses degradación
poco
satisfactoria
aun.
Actimais PE+ aditivos prooxidantes Acelera la Elevan el
(SMS Trioplast) biodegradación costo de
producción y
venta y
requiere
condiciones
aerobias
ECM Biofilms Composición no disponible Permiten a los Aumenta los [219]
microorganismos costos de
producir las producción y
enzimas y ácidos venta
que atacan las
moléculas de
hidrocarburos de
cadena larga y los
mineralizan.
POLYCLEAN Masterbatch y contiene Acelera la Elevan el [176, 151]
6% almidón, (Fe, Zn, Ni, biodegradación costo de
y/o Mn), aceite de soya y producción y
maíz. venta
DPE Polietilenos degradables degradable por UV su
Estearatos de metales de y oxidación, biodegradaci [220]
transición fabricante PDQTM6, ón
Willow Ridge Plastics, posiblement
USA) e no ocurre
en
condiciones
anaerobias
Oxobiodegradab LDPE y BPE 10 (10 % Cambia su fuerza su [123][131, 221]
le aditive aditivo oxobiodegradable tensil en un biodegradaci
) fabricados por KK 17.036% y ón
Polycolor India Ltd, reducción en el posiblement
31
Ángulo de e no ocurre
Contacto. 17.4º en
condiciones
anaerobias
biodegradable Composición desconocida PE-OXO no sufre [66]
polyethylene Probablemente contenga, reacciones de
(PE-BIO), metales de transición y fotoxidación durante
oxodegradable algunos compuestos los primeros 30 días
polyethylene orgánicos pros oxidantes. de exposición al
(PE-OXO) UV-B, debido al
contenido de
agentes pro
oxidantes, metales
de transición, los
cuales causan
Inhibición de la
descomposición de
los hidroperóxidos
bajo el efecto de
radiación UV-B.
[Tween 60, Polysorbato Permite una mejor No tiene un [106, 136]
80 or 85 interacción entre efecto
(Sigma) los biodegradad
microorganismos y or si no se
sus enzimas y el dan las
material condiciones
L0235 Desconocido UV Elevan el [126]
fotosensibilizador costo de
producción y
venta
Bionolle Poli (butileno Succinato) Son totalmente Elevan el [31, 32, 33]
(PBS), poli (etileno biodegradables costo de
Succinato) (PESu), o el compatibles con el producción y
copolímero poli (butileno PE y PP venta
Succinato -co-butilen posiblemente no
adipato (PBSA) requiere
condiciones
anaerobias ni luz
Scott–Gilead Metal ditiodicarbamato De acuerdo a un Elevan el [214]
Technology estudio su costo de
biodegradación producción y
posiblemente no venta
requiere
condiciones
anaerobias ni luz
Muchos de estos aditivos se han puesto a prueba en trabajos como los que
realizaron S. Łabużek, B. Nowak, J. Pająk [33], sobre la adición de Bionolle a
las láminas de polietileno, las cuales fueron preparadas con 60% (wt/wt) de
Bionolle grado 3001 [33], reportando los siguientes resultados:
32
Susceptibility de polietileno LDPE LDPE LDPE LDPE [33]
of Polyethylene fueron modificado modificado
Modified with preparada con 0.33 0 1.04 0 6.08
Bionolle to
60% (wt/wt) de 0.66 0.09 1.14 0.13 30.28
Biodegradation
by Filamentous Bionolle grado 1 0.14 2.26 0.14 49.22
Fungi 3001. 1.33 0.29 3.49 0.23 75.06
2 0.33 6.12 0.27 93.44
3 0.81 7.53 0.35 100
33
Artrofactina, Ptisolvina, viscosinamida, etc. Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Bacillus
brevis, Bacillus polymixa.
Acidos grasos, fosfolípidos, lípidos Corynebacterium lepus, Nocardia erythropolis,
Neutros Thiobacillus thiooxidans
Surfactantes poliméricos Acinetobacter calcoaceticus, Candida tropicalis,
Candida lipolytica, Pseudomonas fluorescens,
Pseudomona aeuroginosa
Surfactante Particulado Acinetobacter calcoaceticus.
34
5.3.4.5.2 Almidón termoplástico
El almidón puro posee un punto de fusión superior a su punto de
descomposición por lo que no se puede moldear, pero cuando se mezcla con
un plastificante como el glicerol o los polioles, puede ser procesado bajo alta
presión y temperatura, y este se denomina almidón termoplástico (TPS) [208],
pero la cantidad de plastificante es importante, la interacción es débil cuando
está en un porcentaje inferior al 10% por lo que se torna frágil pero cuando es
superior al 20% se mejora su flexibilidad y elongación. Cuando es expuesto a
bajas temperaturas o a plastificantes poliólicos sufre retrogradación que es la
restructuración de los enlaces. Se ha utilizado almidón de muchas fuentes
entre las cuales están: papa, frijol mung, cascara de maní, tapioca, maíz etc.
[190, 208, 116, 115, 198, 182].
A continuación se presenta como resultado de esta revisión un listado de los
posibles sustitutos que han sido probados en múltiples estudios sobre
biomateriales y su biodegradación.
35
elastómerico termodegradación a
temperaturas cercanas
al punto de fusión
Poli Copolimero, pf: 108°C, Altamente El copolímero puro es [193]
hidroxibuti tv: -5°C a 20°C cristalino quebradizo pero
rato co menos que PHB
valerato
(PHBV)
Plastarch Almidón, los enlaces Biodegradable Inferiores cualidades [53,
thermopla glucosídicos rompen a resistente al mecánicas, 211,
stic starch 150°C y a 250°C los calor, barato quebradizo, 208,
(TPS) gránulos colapsan higroscópico, amorfo 193]
Poli(Butile Poliéster de ácido Características Los microorganismos [53,
no succínico y etilenglicol, mecánicas que lo degradan tienen 229]
Succinato) PF:(90-120)°C, tv:- comparables a una distribución
(PBS) 45°C a -10°C entre el las del limitada, depende
Poli PE y PP, porcentaje polipropileno PP fuertemente de los
(Etileno de elongación 330%, el polietileno baja factores ambientales,
Succinato) Resistencia a la densidad LDPE, insuficiente
2
(PES) tensión de 330kg/cm buena biocompatibiliad y
procesabilidad bioactividad.
mejor que PLA y
PGA
Poli (p- Poliéster de p- Buenas Es más caro que el [193]
dioxanona dioxanona (tv): propiedades PBS
)(PPDO) -10°C-0°C mecánicas,
muchos
microorganismo
lo degradan.
Si bien el polietileno puro es muy buen material y sus cualidades son difíciles de
igualar, en la actualidad existen cuantiosas opciones de aditivos comerciales y
no comerciales, todas novedosas y que poco alteran sus cualidades originales,
acelerando su proceso de biodegradación, siendo positivo para el ambiente y la
economía de las empresas basadas en estas poli olefinas, además es posible
encontrar una gran cantidad de muy buenos sustitutos altamente
biodegradables y biocompatibles, pero existen aún los siguientes
inconvenientes:
Casi todos los aditivos del polietileno de baja densidad LDPE y los biopolímeros
alternativos en desarrollo son de 2.5 a 10 veces más caros, lo que implica que
los esfuerzos se dirijan a la búsqueda de sustratos de menor costo [6, 67].
Las propiedades físico químicas de los biopolímeros alternativos
frecuentemente restringen su uso [67], siendo necesario una mejora aún en
éstos.
37
para conocer: los microorganismos que pueden utilizar el polietileno de baja
densidad (LDPE) como fuente de carbono y de energía, también los cambios
que ocurren en las poblaciones microbianas a través del tiempo, por ejemplo:
las enzimas liberadas, los metabolitos producidos, los cambios en la biomasa a
través de todas las etapas de crecimiento, etc.
5.4.1 Técnicas instrumentales utilizadas para estudiar la biodegradación
del (LDPE)
En la siguiente tabla se enlistan muchas de las técnicas que se han utilizado en
el estudio de la biodegradación del polietileno de baja densidad LDPE y las
otras variantes del polietileno.
Tabla 10 Técnicas utilizadas para estudiar la biodegradación del Polietileno de baja densidad LDPE
Técnica Nombre permite obtener Referencia
38
[95, 149, 139, 135, 93, 145, 166, 237, 92, 202]
[124, 132, 31, 196, 238, 84, 189, 155, 69, 211]
[41, 119, 11, 158, 123, 133, 148, 221, 197, 116]
[198, 66, 173, 82, 162, 57, 74, 179, 157, 33]
GCMS Cromatografía de gases CO2 evolución y [65, 131, 143, 90, 87, 65, 111, 109, 236, 47]
acoplada a espectroscopia Caracterización [79, 165, 51, 156, 122, 28, 131, 93, 80, 41]
de masas de los [74]
(Gas Chromatography subproductos de
coupled with mass la biodegradación.
spectroscopy) Y también la
degradación
Tanto térmica
como foto lítica.
HT-GPC o SEC Cromatografía de Distribución del Peso molecular Densidad, ángulo
HT-SEC permeación en gel (gel de contacto, viscosidad, distribución del peso
permeation chromatography, molecular.
size exclusion [67, 176, 85, 65, 69, 47, 239, 169, 112, 154]
chromatography) [149, 79, 96, 153, 170, 196, 119]
[104, 149, 151, 69]
HPLC Cromatografía líquida de alto Peso molecular y poli [196, 155]
desempeño (High dispersidad, metabolitos como
performance liquid lípidos
chromatography)
Instron universal Tensiómetro, cambios mecánicos, elongación tensión
test machine u otro Extensómetro [163, 67, 176, 71, 72, 160, 13, 240, 191, 155]
[205, 232, 233, 206, 207, 94, 125, 188, 156, 151]
[117, 11, 123, 28, 95, 190, 92, 62, 31, 196]
[197, 116, 198, 57, 179, 33]
ICP-OES Espectroscopia de emisión Para determinar la existencia [67]
dual de plasma y óptica de otros elementos traza
(inductively coupled plasma- como metales.
optical emission
spectroscopy)
MALDI-TOF MS Espectroscopia de masas Técnica de espectroscopia de [65]
con Matriz asistida por masas que permite
desorción laser con tiempo identificar Metabolitos
de vuelo (Matrix assisted generados y las proteínas
Laser Desorption time of para la identificación
flight) microbiológica
OM Microscopia Visualización de los [154, 131, 102, 87, 132, 241, 91, 148, 81, 33]
óptica microorganismos
para una
identificación
preliminar
NMR Resonancia magnética Determina los aditivos [170, 96, 196,
Nuclear 80]
PCR Reacción en Cadena de la Clonación de los genes [32, 84, 80, 155, 242, 158, 123, 128, 130]
polimerasa (Polimerase vinculados con la
chain reaction) biodegradación,
ejemplo: alcano
hydroxylase gene alkb
SEM Microscpia electronica de Erosión superficial(morfología)
escaneo Scanning electron [32, 106, 40, 117, 174, 67, 90, 147, 65, 109]
microscopy [47, 239, 111, 96, 143, 155, 112, 65, 191, 167]
[205, 139, 232, 233, 206, 234, 125, 188, 51, 156]
[168, 127, 93, 101, 166, 237, 92, 102, 202, 124]
[31, 196, 238, 170, 211, 208, 41, 119, 158, 123]
[133, 148, 81, 209, 77, 116, 129, 82, 57, 179]
[157, 33]
TGA Análisis Temperatura de [106, 168, 196, 238, 84, 80, 211, 208, 119, 158]
39
Termo fusión y de [197, 57]
gravimétrico Transición vítrea,
también de
descomposición
térmica o
degradación.
TLC Cromatografía de capa fina Caracterización de los [65, 105]
(Thin lawyer subproductos de la
chromatography) degradación.
UVS Espectroscopia de Determinación de la [117, 65, 160, 134, 124, 126, 238, 231, 73, 163]
ultravioleta y concentración de [128, 197, 127, 129, 75, 82]
visible (UV-visible biomasa o de la
spectrophotometry actividad de una
) enzima y la pureza
del DNA
XRD Difracción de rayos x(X- Ray difracción) [111, 152, 109, 65, 92, 80, 155, 179, 157]
XSP (Estructura cristalina y amorfa) del polímero y [119]
WAXS sus aditivos
SAXS X- RAY Photoelectron Spectroscopy [65]
(EDXA) Wide angle X-ray scattering [65]
(EDXMA) Espectroscopia de rayos x en ángulo pequeño [93]
(EDAX) Small angle X-ray spectroscopy9+
energy dispersive X-ray analysis (or energy
dispersive X-ray microanalysis)
XRF Fluorescencia de Rayos X, es un analizador de elementos para [170]
determinar aditivos
40
5.4.1.1.1 Microscopia electrónica de barrido (SEM)
El microscopio electrónico de barrido, conocido por sus siglas en ingles SEM,
utiliza electrones en lugar de luz para formar una imagen. Para lograrlo, el
quipo cuenta con un dispositivo (filamento) que genera un haz de electrones
para iluminar la muestra, después los electrones que interactuan con la
superficie de la misma se capturan con detectores que transforman esas
señales en información valiosa como las formas, textura y composición química
de sus constituyentes [243].
La microscopia electrónica de barrido (SEM) tiene diversas aplicaciones en los
estudios de la biodegradación del polietileno de baja densidad. Porque permite
apreciar la morfología superficial de las capas del polímero, de esa manera se
pueden ver los pequeños cambios superficiales y la colonización microbiana,
las pequeñas imperfecciones estructurales, las separaciones entre diferentes
polímeros, etc. Las muestras son generalmente cubiertas con polvo de oro o
algunos iones metálicos antes de la examinación con SEM. La técnica de
presión variable SEM es útil en la observación directa sin ningún tipo de
metalización de la superficie a una adecuada magnificación [244].
5.4.1.1.2 Microscopia de fuerza atómica
La microscopía de fuerza atómica o AFM es un método para ver una superficie
en su integridad. El método se aplica a materiales sintéticos, suaves y duros
también a estructuras biológicas (tejidos, células, biomoléculas) [245].
41
5.4.1.1.4 Espectroscopia Infrarroja con transformada de Fourier (FTIR)
La espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR) utiliza el hecho
de que las moléculas orgánicas absorben determinadas frecuencias en el
infrarrojo que son características de su estructura. Dichas absorciones son
frecuencias de resonancia, es decir, la frecuencia de la radiación absorbida
coincide con la frecuencia del enlace o del grupo que vibra.
La espectroscopia infrarroja con transformada de fourier FTIR permite
incontables aplicaciones entre las que están: La elucidación de estructuras
químicas y físicas, la observación de puentes de hidrógeno, la detección de
grupos terminales, el análisis de las reacciones de degradación, el análisis del
comportamiento de entrecruzamiento de las moléculas y el análisis de la
composición de copolímeros en forma líquida y sólida etc [244].
5.4.1.1.5 Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR)
El fenómeno de la resonancia magnética es consecuencia de que existen
sistemas físicos (átomos, iones, núcleos, etc.) que poseen momento
magnético permanente. En presencia de un campo magnético, ese momento
interactúa con el campo y se produce desdoblamiento en los niveles
energéticos del sistema (efecto zeeman) [246].
La NMR Permite determinar la fracción soluble, la fuerza de tensión y los
cambios en el peso molecular, es un método indirecto de evaluación porque no
da ninguna idea de los cambios químicos del polímero. La espectroscopia NMR
(1H and 13C NMR) es el método más versátil que se puede usar como
herramienta analítica para muchos estudios de biodegradación del polietileno
de baja densidad LDPE [184, 244].
5.4.1.1.6 Desorción láser asistida por la matriz con detección de masas por
tiempo de vuelo MALDI-TOF MS
En la técnica de análisis (MALDI) (matrix-assisted laser desorption/ionization), el
analíto es primero cristalizado en una matriz con un gran exceso de un
compuesto, usualmente un ácido orgánico débil absorbente de ultravioleta (UV),
después del cual se le dispara radiación laser a la mezcla analíto matriz,
resultando en la vaporización de la matriz la cual porta el analíto.
Subsecuentemente la matriz absorbe la energía del láser y ioniza la muestra
puesto que le quita o dona electrones, por lo que la ionización es indirecta [247],
el analizador es de tipo de tiempo de vuelo o TOF (del inglés time of flight).
La MALDI permite una vaporización no destructiva y una ionización de
pequeñas y grandes biomoléculas, proporcionando una caracterización del
peso molecular y la distribución de las masas moleculares de los distintos
productos de la degradación del polietileno.
42
Permite la identificación de microorganismos biodegradadores de LDPE,
mediante el análisis de proteínas, principalmente ribosomales, a partir de
colonias o directamente de muestras a través de la creación de un espectro de
masas el que es específico para cada especie [248]. La implementación de
MALDI-TOF MS es sencilla, necesitando sólo un par de días para la
capacitación del personal, la identificación es rápida y el costo por cada muestra
es inferior al costo de otros métodos diagnósticos [248]. Esta tecnología ha
demostrado ser confiable, específica y rápida para la identificación de distintas
bacterias aeróbicas y anaeróbicas [248].
5.4.1.1.7 Espectrometría con Plasma Inductivamente acoplada a Emisión
Óptica ICP-OES
La espectroscopia con plasma inductivamente acoplada (ICP/OES) es una
herramienta poderosa para la determinación de metales en una variedad de
diferentes matrices de muestras [249]. La técnica se basa en la emisión
espontanea de fotones de los átomos y iones que han sido excitados en una
descarga de radiofrecuencia RF [249]. Presenta la mayor sensibilidad al
detectar hasta ultra trazas (ppq-ppb) [250].
En esta técnica una muestra liquida es inyectada bajo una fuente de plasma de
argón inducido por radiofrecuencia, usando una variedad de nebulizadores o
alguna técnica de introducción de muestras [249].
La ICP/OES puede ser acoplada a la cromatografía de gases (GC) o a la
cromatografía liquida de alto-desempeño (HPLC), lo que potencia el
desempeño de las técnicas cromatográficas y aumenta su sensibilidad, por lo
tanto es útil para la determinación de los metales presentes en el polietileno,
pertenecientes a impurezas, aditivos o catalizadores [249].
5.4.1.1.8 Espectroscopia de difracción de rayos x, XRD
La espectroscopia de difracción de rayos x (XRD) se fundamenta en que
cuando un haz monocromático de rayos x se enfoca en un cristal, éste forma
patrones de difracción y estos patrones reflejan las características
fisicoquímicas de las estructuras del cristal [251].
La espectroscopia de difracción de rayos x permite identificar, la
microestructura, el tamaño de los cristales y la orientación de las cadenas de
polietileno, también permite cuantificar el grado de cristalinidad del polietileno,
pues ningún polietileno es 100% cristalino (polimorfismo), siendo esto
importante porque la biodegradación se facilita en las regiones amorfas, y
también la cristalinidad misma varia en virtud del proceso de deterioro, de esta
manera se siguen los pasos del proceso de biodegradación [252].
43
5.4.1.1.9 Espectrometría Fluorescencia de rayos X, XRF
La microscopia de fluorescencia se involucra la emisión de un fotón de rayos X
después de la ionización del átomo por un haz primario de rayos X, el fotón de
rayos X del tubo impacta la muestra donde interactuara con un electrón de las
capas internas del átomo, sacando el electrón del orbital, este espacio vacío se
llena prontamente por un electrón de las capa superior, este electrón tiene una
mayor energía que el electrón que lo remplaza, esta energía en exceso se
expulsa en forma de rayos x con una longitud de onda específica para el átomo
[250].
La técnica XRF permite encontrar elementos que van desde el Sodio al Uranio,
en estado sólido o líquido, en forma de capas delgadas o bulbosas, con un
amplio y dinámico porcentaje, requiere mínima preparación, es no destructiva,
permite un análisis rápido y multi elemento, es transportable a el campo de
análisis, bajos costos de mantenimiento y operación. Permite el estudio de
metales traza en el polietileno de baja densidad LDPE con muy buena
sensibilidad y un costo relativamente bajo [250].
5.4.1.1.10 Espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica
EPR
La espectroscopia paramagnética electrónica EPR es una forma de
espectroscopia de absorción de microondas, en la cual las transiciones se
inducen entre los niveles de energía de zeeman de electrones no apareados
[253].
Mientras que la NMR es una técnica espectroscópica estándar para la
determinación estructural de las moléculas, la estrechamente relacionada
espectroscopia EPR es aun escasamente conocida por muchos científicos
[254].
Esta discrepancia es originada por la carencia de sistemas naturales
paramagnéticos debido a el hecho de que la formación de enlaces químicos es
inherentemente acoplado al emparejamiento de dos electrones y como
resultado general un espín electrónico de cero, S= 0 [254].
El método está restringido a unos pocos sistemas paramagnéticos como son,
los complejos de metales de transición y los radicales libres, únicos que
poseen un electrón residual, siendo esto ventajoso por la selectividad que
presenta [254].
Cuando hay una ruptura de los enlaces covalentes en una molécula de
polietileno de baja densidad LDPE, se forman radicales libres inestables cuyo
carácter paramagnético los hace fácil de detectar e identificar con la EPR,
siempre y cuando la concentración de radicales este en los límites de
sensibilidad (̴1012 radicales) [253].
44
5.4.1.1.11 La espectroscopia de absorción atómica (AAS)
La espectroscopia de absorción atómica AAS por sus siglas en inglés Atomic
absortion spectroscopy, es una técnica analítica que mide la concentración de
los elementos. La absorción atómica es tan sensible que puede medir valores
menores a partes por mil millones de gramo (µg dm-3) en una muestra. La
técnica utiliza las longitudes de onda de luz absorbidas específicamente
absorbidas por un elemento. Las que corresponden a las energías necesitadas
para promover electrones de un nivel de energía a otro de mayor energía [255].
Se aplica en el análisis de los elementos traza presentes en el polímero.
5.4.1.2 Técnicas cromatográficas para el estudio de la degradación del
polietileno de baja densidad LDPE
La definición de la IUPAC (unión internacional de química pura y aplicada) de
cromatografía es:
“Un método físico de separación, en el que los componentes a separar se
distribuyen en dos fases, una estacionaria y otra que se mueve en una dirección
definida” [256].
Estos compuestos químicos, pueden ser compuestos orgánicos de moderada
masa molecular tales como ácidos grasos y muchos otros metabolitos, también
polímeros tales como ácidos nucleicos, proteínas o cadenas
macromoleculares, como las que componen el polietileno de baja densidad, por
lo tanto son muy utilizadas en los estudios sobre la degradación del polietileno
de baja densidad LDPE, porque permiten estudiar el cambio en la longitud de
las cadenas del polietileno de baja densidad LDPE, identificar microorganismos
solamente observando su perfil de ácidos grasos, analizar sus enzimas y el
material genético y hasta cuantificar la mineralización del polietileno, la
cromatografía se clasifica en cromatografía de partición y adsorción, siendo la
de partición en fase estacionaria líquida y la de adsorción en fase estacionara
sólida, aunque este trabajo no pretende un estudio de tallado de estas técnicas,
se mencionaran brevemente algunas de estas.
5.4.1.2.1 Cromatografía de gases acoplada a masas GCMS
La cromatografía de gases GC es un método cromatográfico común que se
basa en las diferencias en comportamiento de partición entre un flujo de fase
móvil y una fase estacionaria en orden de separar compuestos orgánicos o
inorgánicos volátiles o semivolatiles [244]. Es una de las técnicas más versátiles
y ubicuas en los laboratorios por ser sencilla, rápida, eficiente y sin lugar a duda
su aporte en el estudio de la biodegradación del LDPE es excepcional, por que
con esta técnica se pueden separar mezclas muy complejas, [257].
La GC técnica se usa para la identificación y cuantificación de monómeros o
solventes residuales en el LDPE, para el análisis de componentes volátiles o
impurezas, para la verificación de los niveles de aditivos en el LDPE, para la
45
cuantificación de contaminantes traza, para el análisis de los productos finales
de la biodegradación como el CO2, CH4, para el análisis de otros metabolitos
generados por los microorganismos, etc., un numero de detectores
especializados están disponibles, incluyendo ionización en flama FID (del inglés
flame ionization), emisión atómica AED (del inglés atomic emission), flama
fotométrica FPD (del inglés flame photometric) y conductividad térmica TCD (del
inglés thermal conductivity). Adicionalmente está disponible la espectrometría
de masas (MS), que permite una gran flexibilidad en evaluaciones cualitativas y
cuantitativas del polietileno [258], cuando se acopla con la espectroscopia de
masas como sistema de detección, es posible la identificación de virtualmente
todos los eluados con una muy alta sensibilidad, creando un sistema analítico
muy poderoso [257].
5.4.1.2.2 Cromatografía de líquidos de alta eficiencia HPLC
La técnica HPLC es el análogo de la cromatografía de gases pero, en fase
liquida, el secreto de su éxito son las partículas pequeñas y uniformes que
producen poca difusión arremolinante y su máxima transferencia de masa,
además permite analizar compuestos poco volátiles o estables [257].
La cromatografía liquida de alta presión (HPLC) es ampliamente usada para
separar moléculas en base a su tamaño. El principio de la técnica es que las
moléculas mayores eluirán primero, a medida que estas pasan a través de los
espacios en la columna, mientras más pequeñas sean estas eluiran
posteriormente porque estas tomaran mayor tiempo en pasar atravesar los
poros in el gel. La HPLC se usa para analizar los productos de la degradación
metabólica de los xenobióticos. Pudiéndose observar los productos de
biotransformación como son: el estireno, epoxistireno, fenilacetaldehido, y 2-
feniletanol etc. Los cuales fueron detectados por la cromatografía líquida de
alta presión en fase reversa [244].
5.4.1.2.3 Cromatografía de exclusión por tamaño o de permeación en gel
Es un método en el que la fase estacionaria es una malla o criba molecular, se
usa en columnas abiertas con alimentación por gravedad para separaciones
de preparación, y para separaciones de alta eficiencia [257]. Estas mallas son
carbohidratos poliméricos y acrilamidas que tienen una red abierta formada por
el entrecruzamiento de cadenas poliméricas, son hidrófilas, por lo que son
capaces de absorber agua e hincharse, causando la abertura de su estructura
[257]. El grado de entrecruzamiento determina el tamaño de los poros [257].
Las moléculas más grandes no penetraran en los poros por lo que eluirán más
rápido, y solo las más pequeñas quedaran atrapadas en los poros
permaneciendo en la malla.
La cromatografía de permeación en Gel (GPC) o cromatografía exclusión por
tamaño (SEC) se usa en la determinación de la distribución de las masas
46
moleculares del polietileno de baja densidad para determinar los cambios en el
peso molecular después de la biodegradación [244].
5.4.1.3 Técnicas de análisis de sus propiedades mecánicas: Pruebas de
tensión tensile test
También conocida como test de tensión, son probablemente los tipos de
pruebas más fundamentales que se pueden realizar en cualquier material, las
pruebas de tensión son simples, relativamente baratas, y completamente
estandarizadas, mediante la tensión a cualquier material se puede determinar
como el material reacciona ante las fuerzas aplicadas, se analiza la resistencia
a la tensión, conociendo que tanto se estira [30]. Las propiedades mecánicas
son medidas con el módulo de elasticidad, la resistencia a la tensión y la
elongación del material, obtenidas a partir de los ensayos de tracción en la
maquina universal de ensayos Instron. La cual ha sido estandarizada en la
norma ASTM D638 “método test estándar para las propiedades de los
plásticos”. El deterioro del polietileno de baja densidad LDPE se puede evaluar
por el cambio en sus propiedades reológicas, estas propiedades dependen
directamente en el peso molecular del polímero, su cristalinidad y la presencia
de las ramificaciones y los efectos de cruzamiento, etc., [259].
Todas las técnicas de análisis térmico son usadas para caracterizar una amplia
variedad de materiales, entre los que se encuentran los polímeros
termoplásticos como el LDPE.
5.4.1.4.1 Calorimetría diferencial de barrido DSC
La calorimetría diferencial de barrido DSC (del inglés Diferential Scanning
Calorimetry) permite el estudio de aquellos procesos en los que se produce una
variación de entalpia, por ejemplo determinación de calores específicos, puntos
de ebullición y de fusión, pureza de compuestos cristalinos, entalpías de
reacción y determinación de otras transiciones de primer y segundo orden [261].
La DSC puede trabajar desde la temperatura del nitrógeno líquido hasta unos
600°C [261].
El polietileno presenta precisamente todas sus transiciones térmicas en ese
intervalo. Por esta razón se emplea en la caracterización del LDPE, para
estudiar: la temperatura de transición vítrea Tg, la temperatura de fusión, las
reacciones de polimerización, los procesos de curado, el análisis de
polimorfismos, la cinéticas de reacción, el tiempo e inducción a la oxidación y
descomposición, también se pueden hacer estudios de compatibilidad de
mezclas del LDPE con otros polímeros [261].
5.4.1.4.2 Análisis térmico mecánico y dinámico DMTA
Es una técnica empleada en el estudio de las propiedades viscoelasticas de un
material, basada en la aplicación de energía mecánica mediante perturbaciones
sinusoidales en la zona elástico lineal de los ensayos esfuerzo- deformación
con el fin de determinar sus propiedades dinámicas [262].
El análisis térmico mecánico dinámico DMTA (del inglés Dynamic Mechanical
Analysis), permite estudiar la respuesta del polímero a las solicitaciones
48
exteriores en un amplio intervalo de tiempos y temperaturas, y también permite
observar propiedades como: la transición vítrea, relajaciones secundarias,
copolímeros, compatibilidad de mezclas, orientación, resistencia al impacto,
presencia de agua, polímeros naturales, peso molecular, irradiación, reacciones
de curado, envejecimiento físico, adhesión y fricción, aislamiento acústico,
fluorescencia [262].
5.4.1.4.2.1 Análisis Termo Gravimétrico TGA
El análisis termo gravimétrico TGA (del inglés Thermogravimetric analysis)
provee una información de caracterización complementaria y suplementaria
para la técnica térmica más comúnmente usada, la DSC [263].
La TGA mide la cantidad y tasa (velocidad) de cambio en la masa de una
muestra de polietileno como una función de la temperatura o el tiempo en una
atmosfera controlada [263].
Las medidas son usadas primeramente para determinar las estabilidades
térmicas y/o oxidativas del material (polietileno de baja densidad), también sus
propiedades composicionales. La técnica puede analizar muestras de
polietileno de baja densidad LDPE que exhiban tanto pérdida de masa como
ganancia debido a la descomposición, oxidación o pérdida de compuestos
volátiles (tal como la humedad). La técnica permite distinguir sutiles pero
importantes diferencias entre varias muestras de polietilenos como: la cantidad
de aditivos, grado de cristalinidad, el análisis composicional de mezclas de
polietilenos, cinética de la descomposición, bajos niveles de volatiles etc [263].
5.4.2 Métodos y pruebas utilizados en los estudios de biodegradación del
polietileno de baja densidad LDPE
Existen muchos métodos que permiten estudiar la biodegradación del
polietileno, algunos han sido diseñados y estandarizados por organizaciones
como la: organización internacional de estándares o ISO (del inglés
International Standard Organization) y la sociedad americana de pruebas y
materiales o ASTM (del inglés American Society for Testing and Materials), los
métodos tienen múltiples propósitos, pueden interesarse en las condiciones de
la biodegradación, en los productos, en los microorganismos, etc.
A continuación se presentaran todos los métodos que se encontraron en los
artículos publicados sobre biodegradación de polietileno de baja densidad.
Tabla 12 Test y métodos de cultivo usados para evaluar la biodegradación del LDPE.
Adaptado de [264]
49
respirometrica M3100-1:2002;MOD ISO
Stürm (del inglés 14855:1999, prEN
respirometric 14046) o variantes para obtener
biodegradation la evolución de CO2.
tests.)
Prueba de adherencia a Adhesión bacteriana a hidrocarburos, para la [160, 237, 126, 73, 106,
hidrocarburos BATH (por evaluación de la hidrofobicidad de la superficie 127, 129]
sus sigla en inglés celular bacteriana.
bacterial adhesion to
hidrocarbons)
Prueba de salado SAT El Test de agregación de sal para medir la [106]
(por sus siglas en inglés: hidrofobicidad de la superficie celular.
salting out test)
Demanda biológica de Test sobre la demanda de oxígeno en medio [238, 73, 163, 158, 128]
oxigeno BOD (del inglés líquido o
Biological oxigen en medio solido es (ISO 14851) recomendado
demand) por 117 días
Prueba de composta CP Test Compost bajo condiciones de laboratorio [104, 67, 92, 202, 11,
(del inglés Compost (ISO/DIS 20200, EN 261085, ISO 14855 y 239, 194, 133, 197]
test) ASTM D5958, ASTM 5338-98. ) recomendado
por 50 días
Condiciones Anaeróbico (ASTM D5210) por 58 días pruebas [214]
anaeróbicas
Prueba de En un Erlenmeyer cerrado a 25°C [96, 237, 88, 238, 161, 84, 117, 41, 119, 128]
degradación (OCDE 301D, ASTM D5988-96 o [162, 74, 179]
Headsp 25°C modificado 30°C o 37°C )
(Biodegradatio recomendado por 48 días
n Assays).
Prueba de degradación En un Erlenmeyer cerrada a 50°C (OCDE [48, 104, 126, 158]
(Headsp 50°C) 301D, ASTM D5988-96 modificado)
recomendado por 48 días
Compost a escala piloto Test Piloto de compost (EN 14045) o KS [104, 67, 92, 202, 99,
método estandar para determinar 135, 196, 32, 214, 194]
biodegradación aeróbica bajo condiciones [209]
compostaje controladas ASTM D
M3100-1:2002; MOD ISO 14855:1999. por 84
días
Prueba de Test en suelo reconstruido en [15, 190, 92, 62, 202, 265, 201, 113, 9, 196]
enterramiento en el laboratorio (DIN 53739) [164, 78, 72, 194, 133, 209, 115, 179]
suelo SOT (del ISO 846/2000, ASTM D 5988
inglés Soil burial (ASTM D 5988-09) ASTM D
test ) (lab) 5338-98. En un suelo de jardín
ASTM D 5247–92.
Prueba de suelo de Test de muestra enterrada en suelo real [16, 104, 132, 208]
Agricultura (en inglés para agricultura
agriculture soil test)
Prueba de zona de color La eficiencia se determina por el color de la [75, 144]
o clara(en inglés Color zona formada en los platos solidos
zone assay) o clear zone emulsificados con LDPE-. Indicador Purpura
test de Bromocresol para detectar algún cambio en
el pH of el medio.
Pruebas de enzimas (en Test Enzima, lacasa test con laccase [134, 124, 174, 155, 16, 82]
inglés Enzime test) screening médium, LSM.
Estudio de absorción de De acuerdo a las normas ASTM D1037 - [190, 211, 208, 116, 179]
agua (WAS del inglés 99, ASTM D-570.immersion de una
Water Absorption muestra15xl5x3mm en agua destilada a
Study) temperatura ambiente se mide el peso
ganado. Para biopolímeros hidrófilos
como el almidón plastificado.
Valoración cuantitativa De acuerdo a la norma ASTM G21-90 se [198]
50
del crecimiento de cuantifica el crecimiento de biocapas de
hongos( en inglés hongos en cajas petri sobre el polietileno
Quantitative assessment)
Prueba de Número más probable en orden [62, 92, 156, 132, 238, 84, 163, 16, 119, 242]
viabilidad de examinar el cambio de la [209, 77, 116, 127, 157]
metodo de actividad de las bacterias en el
conteo de suelo durante la prueba, conteo
platos microbiano por el estudio de las
(viability tests) UFC, también las Pruebas Redox,
(plate counting CTC- Fluorescente y TTC (2, 3,
method or 5- cloruro trifeniltetrazólio) como
others ) indicadores de viabilidad.
Prueba de cultivo liquido La degradación se cuantifica por la estimación [144]
(Liquid culture test) de carbón orgánico total soluble en agua
(TOC) y pH de los medios de cultivo
Condiciones de Se sumerge a 3 m conectados a un flotador, y [188, 231, 240, 266]
exposición marina se deja desde varios meses a un año, se
(Marine exposure analiza las condiciones del mar, pH, OD,
conditions) salinidad, etc.
Índice de flujo fundido De acuerdo a la norma ASTM D1238, ASTM [208, 221, 198, 179]
MFI (del inglés Melt flow D3418. Con probador MFI para el análisis de
index, la temperatura de fusión del polímero.
Cultivo en cajas Se siembra en medios [32, 161, 80, 16, 119, 123, 69, 91, 128, 114]
Petri con PE (en selectivos con PE como fuente [51, 116, 82, 179, 175, 157, 144]
inglés polymer de carbón Método de conteo
containing agar de plato, método de zona
(MSM) plates) clara, ASTM G21.
Pruebas de tinción Características, [76, 134, 237, 145, 135, 48, 124, 132, 99, 267]
pruebas bioquímicas y Identificación y [73, 16, 11, 123, 241, 91, 128, 75, 175, 157]
microscópicas (en inglés Caracterización de
Gram staining los Microorganismo
Biochemical test
Macroscopic test)
Quimioluminiscencia de La Quimioluminiscencia de ATP permite el [96, 122, 84]
ATP estudio de la Biomasa.(actividad metabólica
de la célula)
Secuenciación Secuenciación del 16s [122, 168, 95, 126, 32, 73, 106, 84, 80, 63]
molecular o en rRNA o 28S rRNA que [41, 119, 242, 158, 123, 128, 81, 127, 129, 130]
inglés (Molecular Permite identificar las [157]
level (16S rRNA, especies de hongos o
or 18S rRNA bacterias que degradan el
gene sequencing) LDPE.
test
Análisis de PCR (en Random Amplified Polymorphic DNA [242]
inglés (RAPD)-PCR para realizar un perfil del DNA
Analysis)
Viscosidad y peso Viscosidad y Peso Molecular promedio es la [126]
molecular V MW (del correlación entre la viscosidad intrínseca del
inglés viscosity polietileno y su peso molecular fue usado para
molecular weight) estimar la reducción en el número promedio
del peso molecular (Mn)
Actividad Análisis de Biomasa. (actividad [96, 106, 160, 126, 170, 123, 241, 127, 129, 82]
metabólica, metabólica de la célula)
cuantificaci Fluoresceína di acetato FDA, TTC
ón de reducción test, ATP test, método
proteína Lowry para cuantificar la proteína
celular total.
Prueba de acidos grasos Análisis de los productos de la degradación e [80]
FAME (del inglés Fatty identificación de los microorganismos
acid methyl ester
51
analysis test
Pérdida de peso WL (del Disminución del peso del LDPE, el cual esta estandarizado de
inglés Weight loss test) acuerdo a la norma ASTMD 5338 en un periodo de 90 días.
[161, 126, 76, 125, 156, 16, 117, 83, 11, 90]
[167, 71, 160, 231, 137, 99, 191, 234, 131]
[207, 153, 106, 168, 16, 178, 172, 107, 94, 104]
[50, 105, 127, 190, 138, 145, 166, 134, 89, 237]
[202, 48, 124, 88, 238, 80, 158, 194, 241, 128] [114, 115, 82, 179]
Prueba Estandarizados por las [117, 119, 123, 197, 116, 115, 208, 198, 57, 74]
mecánicas normas ASTM D882 ASTM
Mechanical tests D638, ASTM D638-99, ASTM
A370. Se mide la resistencia a
la tensión y % de elongación.
Aclimatación natural en De acuerdo a la norma ASTM D 1435-99 [179]
ingles Natural se monta el PE en una plataforma
weathering
Prueba de Angulo de Angulo de Contacto con agua y Energía [120, 71, 266, 231, 119, 123]
contacto del agua WCA superficial, deposición de la gota. Grado
(del inglés water contact de oxidación de la superficie del material
angle test)
Prueba de dureza HT De acuerdo a la norma ASTM D2240 en [116]
(del inglés Hardness modelo Durometer
Test)
52
5.4.2.2 Medios para la realización de las pruebas
De acuerdo al sitio o lugar que proporciona el tipo de medio de cultivo se puede
dividir en tres modalidades básicas:
53
5.4.2.3.5 Medios sólidos
Con una concentración de 1,5 al 2 % de agar, son útiles porque permiten hacer
los análisis preliminares y no generan competencia por los recursos entre los
microorganismos, excepto por la fuente de carbono que es la que genera la
selectividad, por lo que sirven para identificar las colonias una vez estas sean
pre seleccionadas para degradar LDPE.
55
una profundidad específica en el suelo, por diferentes intervalos de tiempo
[269, 179].
56
contiene la fuente de carbono (el LDPE), la cual se requiere para que ocurra el
crecimiento estos [148].
Al polímero se le realiza un análisis por FTIR, se pesa y esteriliza con
radiación UV por 15 minutos, se ubica en la superficie de un medio sólido en
cajas petri, y entonces se esparcen 0.1 ml de las suspensión de esporas.
Después de estos procedimientos, las placas se incuban en una incubadora
bacteriológica (SOLAB) a una temperatura de 28 °C [148].
5.4.2.5.5 Prueba de biodegradación In-vitro
La habilidad de las bacterias aisladas para degradar LDPE se estudia con la
prueba de biodegradabilidad in vitro. Las bacterias aisladas se mantienen en
caldos nutritivos o agar medio nutritivo. Los cultivos líquidos de 50 ml se
incuban en erlenmeyer de (250 ml) con un agitador rotatorio (150 rpm) a 30° C
por 30 días [237].
57
afinidad por el hidrocarburo, resultando en la transferencia de las células de la
suspensión acuosa a la fase orgánica y una consecuente reducción de la
turbidez del cultivo [237].
5.4.2.5.6.2 Prueba de salado (SOT) (por sus siglas en inglés: salting out test)
El Test de agregación de sal consiste en que a mayor es la hidrofobicidad
de la superficie celular es más baja la concentración de sal requerida para
inducir agregación celular y precipitación.
58
medios, inoculo, la forma de los sustratos que son introducidos, en la técnica
para medir la evolución de gas [59].
5.4.2.5.8.1 La prueba Sturm
Consiste en la cuantificación de la evolución de dióxido de carbono (CO 2), la
cual es una indicadora de la velocidad de crecimiento celular y el consumo del
material durante la biodegradación, la prueba se basa en la captura del CO2 en
una solución de hidróxido de potasio (KOH) 1M para formar HCO 3⁻
posteriormente titularlo con cloruro de bario (BaCl) [51].
5.4.2.5.8.2 Radiomarcación
En contraste al análisis de residuos, la medida simple de la evolución total de
CO2 y 14CO2, es no destructiva y puede medir la biodegradación final. Si
apropiadamente la prueba de material 14C está disponible, la medida y sus
interpretaciones son relativamente directas. Los materiales que contienen una
distribución aleatoria del marcador 14C el cual se expone a un ambiente
microbiano seleccionado. La cantidad de carbono 14C en el dióxido
evolucionado se estima usando un contador de cintilaciones [184].
5.4.2.5.8.3 Prueba de Respiración
La actividad aeróbica microbiana se caracteriza por utilizar oxígeno, la
biodegradación aeróbica requiere de oxígeno para la oxidación de sus
compuestos a sus minerales constituyentes tales como CO 2, H2O, SO2, P2O5,
etc. El oxígeno utilizado durante la incubación se llama (demanda de oxigeno
bioquímico o biológico) (BOD del ingles biological oxigen demand), es por lo
tanto una medida del grado de la biodegradación. Varios métodos se basan en
la medición del BOD, frecuentemente expresados como un porcentaje de la
demanda teórica de oxígeno (TOD) de los compuestos. El TOD, el cual es la
cantidad teórico de oxigeno necesaria para la oxidación completa del sustrato
en sus constituyentes minerales, puede ser calculada considerando las
composiciones elementales y la estequiometria de la oxidación o basada en
determinaciones experimentales de la demanda química de oxígeno (COD del
ingles chemical oxigen demand) [59].
5.4.2.5.9 Prueba de la Pérdida de masa
Como su nombre lo indica esta prueba determina la variación directa de la
masa del polietileno de baja densidad que ha sido expuesto a las condiciones
de biodegradación. El principio básico de la perdida de la masa es la
adherencia y biodegradación de los microorganismos al LDPE, los cuales se
han preseleccionado por su capacidad de utilizarlo como fuente de carbono. Su
procedimiento consiste en pesar con un micro balanza el material antes y
después de realizar una prueba de cultivo.
59
5.4.2.5.9.1 Porcentajes de degradación del LDPE reportados
Se ha escogido esta prueba por ser fácil de realizar, entender, fácil de replicar y
relativamente confiable, además de ser la prueba más directa indicadora de la
biodegradación, por tanto a continuación se presenta una recopilación de los
resultados reportados por algunos de los trabajos en los que se realizó esta
prueba, considerando las condiciones de su realización y unificando la unidad
de medida temporal a meses con el objetivo de entender a mayor profundidad
tales resultados y hacer más fácil su comparación.
En estos estudios teniendo en cuenta los resultados se puede conocer
quiénes son mejores degradadores de polietileno los hongos o las bacterias, o
específicamente cuales especies son mejores
61
5.4.2.6 Pruebas de identificación microbiana
Las pruebas de dentificación microbiana son el proceso inicial y clave para
conocer cuales microorganismos degradan el LDPE y que potencialidades
presentan para usos biotecnológicos.
Tabla 14 Posibles residuos de la biodegradación, tomados de [156, 29, 41, 80, 74]
Compuestos Compuestos
Benceno Ácido undecanóico
Metilo benceno Ácido docosanóico
Docosanoato de metilo propilo 1,3-dimetiloctadecano
Di-tert-butil-1-oxaspiro(4,5)deca-6,9-dieno 2,6,10,16 tetrametil heptadecano
Ácido hexadecanóico 2,3,6 trimetil decano
Hexadecanoáto de etilo 2,6,7 trimetil decano
62
Diisoostilo eicosano 6-etil ,2-metil decano
Ácido octadecanóico Dodecanol
Undecano Dodecanal
Octano Heneicosano
Eicosanol Heptacano
Docosano Heptacosano
Acido 3-cloropropiónico Heptadecano
7,9-Di-tert-butil-1-oxaspiro(4,5) deca-6,9-dieno-2,8-diona 2,6,10,14 tetrametil heptadecano
Octadecanoato de butilo 2,3,5,8 tetrametil decano
1- Nonadeceno 9 Hexil heptadecano
Tetracosano Hexadecano
Pentacosano 5-butil hexadecano
Acido 1,2-Benceno di carboxílico 2-fenil,etil,hexanoato
Ácido Oxano dodecanóico 3-metil,5-(2-teilbutil) octadecano
Hexacosano 3-etil (2-etilbutil) octadecano
Ciclo propano 6-metil octadecano
2-buteno,2-metil- tricloro eteno
Acetona Hexanal
Eteno, 1,2-dicloro-, Eteno 1,1-dicloro
Dicloro Metano Acetato de etilo
Ácido butanóico Ácido oleico
1- Tetradeceno Acido oxálico
Ácido acético Ácido octadecatrienóico
Tricosano Pentadecano
Ácido tetradecanóico Acido ftálico
Ergosta-5,22-dien-3-ol, acetato(3,22E) Acetato de Betametasona
1-Monanalinoeoglicerol trimetil silil éter Azafrin
2,3-bis [(trimetilsilil oxi] propil ester ácido 9,10,15-octadecatrienóico
63
El autor es consiente lo dispendioso y costoso que puede resultar hacer tantas
pruebas, tanto las de identificación preliminar junto a la identificación especifica
podrían durar meses enteros o quizá años.
La estructura metodológica básica será la siguiente:
64
5.5.1.1 Obtención de muestra y selección de los microorganismos
degradadores de LDPE en medio líquido SM
Se propone la realización de un medio líquido SM selectivo por ser ideal para el
desarrollo de los microorganismos biodegradadores de LDPE, además ha sido
probado en múltiples estudios de biodegradación, lo cual genera confiabilidad.
Recolección de la muestra
Pre tratamiento de la muestra
Adición al medio de cultivo líquido
Incubación (ver ANEXO A 2).
m. Moeller n. Descarboxilación de
aminoácidos
65
Figura 12 Métodos preliminares de
identificación metabólica
66
5.5.1.4 Ensayo de biodegradación in vitro
Se debe cultivar las bacterias y hongos aislados en medio agar nutritivo
67
Las alícuotas del gen amplificado que resultan de la PCR con estos primers
universales pueden ser secuenciadas económicamente en los laboratorios
comerciales o en muchos casos en laboratorios universitarios. Una vez se conoce
la secuencia del gen rRNA, se pueden usar para identificar los microorganismos
originales al nivel de género y especie [271].
Se han computarizado en bases de datos las secuencias de un vasto número de
especies bacterianas [271]. Esto permite la comparación de una secuencia
desconocida de rRNA con una secuencia bacteriana conocida [271].
Muchos programas de análisis de secuencias están disponibles para ayudar a
identificar las secuencias. Uno de tales bases de datos es la BLAST (son las siglas
en ingles de Basic local alignment search tool) que significa herramienta de
búsqueda de alineaciones básicas locales, la cual la provee la (NCBI) National
center for biotechnology information que está disponible en la web [271].
Primers universales 16S rRNA tomados de [271].
8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R TACGGY*TACCTTGTTACGACTT
*Y puede ser C o T una posición de base degenerada.
68
5.5.3.1 Técnica longitud de polimorfismos de los fragmentos de restricción
(RFLP)
También se propone realizar la prueba de identificación de microorganismos
amplificando regiones que se conservan entre especies (genes), longitud de
polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLP del ingles Restriction
Fragment Lenght Polymorphisms) donde se amplifican regiones específicas y se
cortan con endonucleasas para observar el patrón de bandas en una gel, por lo
que se podría utilizar el gen 16S rRNA o 5,8S rRNA (para hongos) amplificado
para correrlo en una electroforesis. Para conocer la metodología a seguir (ver
ANEXO F).
69
5.5.4.1.1.2 FT-IR Reflectancia Difusa (DRIFT)
Ha sido utilizada ampliamente en el pasado para el estudio de polímeros y
permanece como una técnica muy útil en casos donde la muestra es muy grande
para ser medida con ATR [272].
El Polietileno tiene una estructura molecular simple, semicristalina y alto peso
molecular pero no se degrada por que no absorbe radiación UV [66, 55]; sin
embargo, la presencia de impurezas como catalizadores remanentes,
plastificantes, y antioxidantes induce la absorción radiación UV-B [66].
𝐼1715
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝐶𝑒𝑡𝑜 − 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑖𝑙 (𝐾𝐶𝐵𝐼) =
𝐼1465
𝐼1740
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑒𝑟 − 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛𝑖𝑙 (𝐸𝐶𝐵𝐼) =
𝐼1465
𝐼909
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑣𝑖𝑛𝑖𝑙𝑜 (𝐼𝑉) =
𝐼2020
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑡𝑒𝑟𝑚𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒 (𝑇𝐷𝐵𝐼)
𝐼1650
=
𝐼1465
𝑖𝑛𝑑𝑖𝑐𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑛𝑜 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒 (𝐼𝐷𝐵𝐼)
𝐼908
=
𝐼1465.
70
𝐼𝑎
(1.233𝐼 ) 𝐼𝑎
𝑏
𝑎 100 − [{1 − + ( )} × 100]
1 𝐼𝑏
Dónde:
%CO2 = área del pico de CO2 en porcentaje.
P = presión atmosférica (atm).
V = volumen de la atmósfera de los sistemas a medir (L).
R = constante de los gases (0.082205 L * atm / mol * K).
T = temperatura del sistema (° K).
g pe. = gramos de PE.
La gráfica de CO2 vs el tiempo deberá construirse de forma acumulativa
(Sumando las producciones de CO2). Para conocer la metodología (ver ANEXO
L).
71
Nota: Con este mismo método o cuantificación se puede determinar al mismo
tiempo el O2 y N2 del sistema. Esto permite conocer la cantidad de oxígeno
consumido en los sistemas, dato que se utiliza para calcular su coeficiente
respiratorio (QR). Este parámetro biológico determina la actividad biológica
(estado fisiológico) que ocurre en un sistema y refleja la relación entre el CO2
producido y el O2 consumido [273].
6 ANÁLISIS
72
En ciertas condiciones extremas y propicias ”óptimas”, un elevado número de
géneros de microrganismos puede lograr degradar el polietileno de baja densidad,
por las características antes mensionadas, sin embargo el interés está en conocer
cuáles de éstas biológicamente han logrado obtener los mejores atributos para
realizar el proceso al máximo ritmo posible, se encontró que las bacterias que
presentan el mayor grado de eficiencia biodegradadora son los Streptomyces sp,
seguidos por las Pseudomonas sp, y entre los hongos están los Aspergillus sp,
especialmente los Aspergillus níger. Estos resultados no pretenden ser definitivos
en lo absoluto, quizá existan mejores o quizá el orden mencionado no sea el
correcto.
¿Cuáles son las condiciones que permiten una mejor biodegradación del LDPE?
Un estudio realizado por Nayak Priyanka y Tiwari Archana comparó [76], la
biodegradación del polietileno por la pérdida de peso considerando el tipo de
disposición del material que fue de tres formas distintas, enterrada, expuesta al
aire libre y en medios de cultivo a condiciones del laboratorio encontrando que las
condiciones de laboratorio fueron las que arrojaron una mayor pérdida de peso.
En cuanto a la cantidad de aditivo pro-degradable Obasi [190], encontró que la
pérdida de peso era mayor cuanto mas biopolímero se le adicione.
Los estudios demuestran que los microorganismos pueden iniciar la degradación
del LDPE, aun cuando no haya sufrido una degradación físico química previa, o
sea de elevado peso molecular, sin embargo cuando sufre una degradación
ambiental que oxida el material y le disminuye su peso molecular la
biodegradación se acelera, también si el LDPE a estudiar posee un bajo peso
molecular como lo demostró Tsuchii [275].
¿Qué microorganismos son mejores degradando polietileno de baja densidad los
hongos o las bacterias?: Los hongos en principio pueden ser mejores degradando
el LDPE, probablemente por su mayor tolerancia a las condiciones extremas de
pH, temperatura y humedad, pero las bacterias pueden llegar a mejorar los
niveles de degradación de LDPE a largo plazo, cuando se adaptan bien a las
condiciones del entorno y llegan a su máximo nivel de crecimiento o son las
bacterias más evolucionadas o adaptadas para degradar este tipo de materiales.
73
encontradas 21
(numero de artículos que los Pseudomonas sp 17
reportaron) Streptomyces 17
Bacillus 13
Rhodococcus sp 11
74
restringen su uso [67] siendo necesario una mejora aun en éstos. Cuando se
logren superar todas estas barreras, seguamente pronto, quizá se solucione el
problema definitivamente, o quizá surjan otros problemas nuevos, esto solo el
tiempo lo dirá, pero el abuso la irresponsabilidad y la inconciencia de nuestros
actos como sociedad aún serán y deben ser los problemas a erradicar de las
mentes de la sociedad.
Lo cierto es que a pesar de que sean los más reportados no implica que sean los
mejores realizando esta labor, simplemente que son los más ubicuos hasta la
fecha.
Sin lugar a dudas los
Aspergillus sp. Son los
microrganismos
degradadores de
polietileno más
ubicuos encontrados
hasta la fecha,
estando muy lejos de
los demás géneros
con 81 especies, lo
que demuestra que
los hongos son muy
versátiles y poco
exigentes con el
entorno, los alimentos
y las condiciones,
además de ser muy
populares entre los
investigadores.
Gráfica 2 número de
referencias obtenidas
por genero de hongos y
bacterias que están
vinculadas con la
biodegradación de
(LDPE).
75
En lo que respecta a las técnicas actuales que permiten analizar la biodegradación
del LDPE se encontraron entre 34 técnicas y 28 métodos o pruebas,
desarrolladas y utilizadas, lo que demuestra el ingénio de los investigadores, el
esfuerzo y el interés al respecto, la amplitud de aspectos que abarcan estos
estudios y la gran importancia para la ciencia y para la humanidad, en fin para
toda la vida del planeta, aunque todavía no ha sido ni suficiente ni lo necesario,
porque el problema sigue tan fuerte como antes o incluso mucho más, se requiere
que se continúe investigando y con mas intensidad, desde todas las áreas
(incluyendo las ciencias humanas), este problema requiere el esfuerzo de
múltiples disciplinas científicas, para solucionar la tragedia ambiental que
acontece, todos los investigadores son pertenecientes a las más diversas y
remotas partes del mundo, lo cual no es de extrañar considerando que el
problema de la contaminación con LDPE es igual de global.
7 CONCLUSIONES
77
hidofobicidad, capacidad de producion de multiples y especializadas enzimas
capaces de atacar el LDPE, etc.
Los estudios posteriores deben ser sobre las enzimas extracelulares
microbianas que son responsables de la biodegradación del polietileno y la
formación de los ácidos orgánicos presentes. Estas enzimas necesitan ser
caracterizadas y los genes responsables de esas enzimas deberían ser
trabajados. Una vez los genes responsables de la degradación del polietileno se
conozcan, se podrían usar para reforzar la capacidad degradadora de aquellos
microbios que demuestran capacidades excepcionales, en la cual los atributos
naturales se potencien, claro está que también cumplan estrictamente con todos
los criterios bioéticos relacionados con este tipo de organismos, e incluso podría
pensarse en el desarrollo de tratamientos enzimáticos a escala industrial o
comercial para su degradacion, y finalmente se deben esclarecer completamente
los posibles mecanismos de biodegradación, si aún no han sido esclarecidos.
8. RECOMENDACIONES
78
9. Bibliografía
79
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99
ANEXO A1
Aislamiento y cuenta de microorganismos degradadores de LDPE
100
ANEXO A2
Aislamiento e identificación de
Microorganismos degradadores de LDPE
101
ANEXO B
Purificación y aislamiento de microorganismos degradadores LDPE
102
ANEXO C
Prueba de biodegradación de LDPE
103
ANEXO D
Extracción de DNA de hongos
104
ANEXO E
Extracción de DNA de bacterias
105
ANEXO F
PCR Discriminación entre grupos microbianos utilizando
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Figura 22 identificacion bacteriana utilizando, prueba de agar LIA, Kligler, tioglicolato y triptófano.
107
ANEXO G2.
Pruebas de identificación bacteriana
108
ANEXO G3
Pruebas de identificación bacteriana
109
ANEXO G4
111
Extracto de levadura 3g
peptona 10g
sulfato ferroso 0,2g
Tiosulfato de sodio
agar agar
NaCL 5g
Glucosa 1g
proteasa de peptona 5g
rojo fenol 0,024g
agua destilada 1L
lactosa 10g
sacarosa 10g
tioglicolato Tripteína 17g Mechero bunsen
Extracto de levadura 5g
resazurina 0,001g
Peptona de soya 3g Asas de platino
Glucosa 6g Cotonetes
Cloruro de sodio 2,5g tubo eppendorf
Tioglicolato de sodio 0,5g
Agar 0,75g
L-cistina 0,25g
Sulfito de sodio 0,1g
rojo de metilo, Gradilla
RM-VP a-naftol 5% 0.6 ml tubos de cultivo
KOH 40% 0.2 ml
peptona 7g
Glucosa 5g
agua destilada 200mL
etanol 95%
Fosfato dipotásico 5g
UREASA Urea 20
Fosfato monopotásico 9,1
Fosfato disódico 9,5
Extracto de levadura 0,1
p- Dimetilbenzaldehido 0,1mL
agua destiada 1L
agar agar
Rojo fenol 0,01g
l SIM Triptofano 20mg
Peptona 6,1g
Sulfato de hierro y amonio 0,2g
Tiosulfato de sodio 0,2g
Agar 3,5g
112
reactivo de Erlich
Kligler Peptona de carne 13g
Cloruro de sodio 5g
Lactosa 10g
Triptona 10g
Glucosa 1g
Citrato de hierro y amonio 0,5g
Tiosulfato de sodio 0,3g
Rojo de fenol 0,025
Agar 15g
Moeller Peptona de carne 5g
Extracto de carne 5g
Glucosa 0,5g
Piridoxal 0,005g
Rojo de cresol 0,005g
Púrpura de bromocresol 0,01g
simmons Citrato de sodio 2g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato dipotásico 1g
Fosfato monoamónico 1g
Sulfato de magnesio 0,2g
Azul de bromotimol 0,08g
Agar 15g
fenilalanina Extracto de levadura 3g
DL-Fenilalanina 2g
Fosfato disódico 1g
Cloruro de sodio 5g
Agar 12g
LIA peptona 5g
Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g
L-lisina HCl 10g
citrato ferrico amónico 0,5g
tiosulfato de sodio 0,04g
agar agar 15g
purpura de bromocresol 0,02g
agar almidon extracto de carne 3g
almidón 10g
agar 12g
tinción Cristal violeta. 0,05 Microscopio óptico
Lugol de Gram. 0,005 Portaobjetos
Alcohol-acetona. 0,005 Asa de platino
Safranina. Agar macconkey 0,005 mechero
113
ANEXO I
Tabla 18 Procedimiento sugeridos para la siembra tomada de [276].
Prueba medio /reactivo Procedimiento para la siembra
Caseína Agar nutritivo Realice una siembra por agotamiento e incube a 37° C /2h,
adicionado con skin
milk
Desóxiribonucle Agar DNAsa Realice una siembra por agotamiento e incube a 37° C /2h,
asa Concluida la incubación, inunde las cajas con HCl 1M
Antibiograma Agar Moeller Hinton Siembre masivamente con hisopo estéril el microorganismo.
sensidiscos antibiótico Impregne cada sensidisco con un antibiotico diferente y
repartalos equitativamente en la superficie de la caja, señalando
en la parte posterior el antibiótico utilizado incube a 37°C /24h
114
ANEXO J1
Características preliminares bacterianas
Tabla 19 relación entre género y resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas tomada de [276].
reacción de Gram ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋
(cultivo fresco)
Forma Coco Coco Coco Coco Bac Bac Bac Bac Bac Bac Bac Bac coc
ilo ilo ilo ilo ilo ilo ilo ilo o
Agrupación Raci Raci Cade Tetra par
mos mos nas das es
Crecimiento aerobio ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊
Crecimiento ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋
anaerobio
Esporas ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₋
Movilidad ₋ ₋ ₋ ₋ ₋ ± ± ± ± ± ± ₊ ₋
Catalasa ₊ ₊ ₋ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊ ₊
Oxidasa ₊ ₊ ₋ ₊ ₊
fermentar glucosa a ₋ ₊ ₊ ₊ ₊ ± ₊ ₋ ₋ ₋ ₊ ₊ ₋
ácido y gas
O/F ₋ O F F O
Micrococcus X
Staphylococcus X
Streptococcus X
Lactococcus X
Enterococcus X
Leuconostoc X
Pediococcus X X
Aerococcus X
Lactobacillus X
Clostridium X
Bacillum X X
Alcaligenes X
Pseudomonas X
Enterobacterias X
Aeromonas X
Chromobacterium X
Neisseria X
115
ANEXO J2
Tabla 20 algunas características preliminares bacterianas, +positivo, -negativo.
Genero Especie forma Gram Catalas Oxidas Movi aerobi Estrict/Facul espor
117
ANEXO K1
Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR
118
ANEXO K2
Procedimiento para el análisis del polietileno usando FTIR
Tabla 22 Técnicas de muestreo de FT-IR para el análisis del LDPE tomada de [272]
Forma de la muestra técnicas sugeridas
119
ANEXO L Cuantificación de la producción de CO2 y metabolitos
Condición
Columna Temperatura ambiente
control 1 25°C
Inyector 40°C
Detector 100°C
Figura 29 Cromatograma donde se muestran
Gas acarreador Helio Flujo 55ml/min los gases cuantificados por CG-DCT.
Corriente 125mAmp
Tiempo de 5 min
corrida
120
ANEXO L2
Cuantificación de la producción de co2
E Identificación de metabolitos
El primer pico que sale es de inyección, el segundo corresponde a CO2, el tercero a O2,
el cuarto a N2 y el quinto a CH4 (Fig. 4.3). Cuando se hace la integración de los datos,
eliminar el primer pico de dicha integración, porque el resultado del área de cada pico se
toma en porcentaje. Tomar la lectura del área del pico de CO2 en porcentaje.
121