[2016]

Determinación de Proteínas -
Método de KJELDAHL
 Determinación de proteínas – Método de
KJELDAHL
Introducción
En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los
alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El
nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato de amonio.
La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El
destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así
formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar el nitrógeno
contenido en la muestra.

El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda
del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteico

1. Objetivos
Determinar la concentración de nitrógeno presente en la muestra para luego ser
transformado a través de un factor en proteína.

2. Fundamento Teorico
El Método Kjeldahl es un proceso de análisis químico para determinar el contenido
en nitrógeno de una sustancia química y se engloba en la categoría de medios por
digestión húmeda

Se usa comúnmente para estimar el contenido de proteínas de los alimentos.

El principal inconveniente de este método consiste en la posible valoración de

nitrógeno no proteico (NNP), e incluso de sustancias tóxicas y sin ningún valor
nutritivo.

El método de Kjeldahl es conveniente para trabajos precisos, realizados con un

número restringido de muestras, pero no para los análisis de rutina aplicable a
muestras muy numerosas y cuyo precio ha de ser bajo. Sirve de método de
referencia, con el que se comparan los métodos rápidos.

Utilizando un factor que varía de 6,24 a 6,40, se pueden trasformar los resultados en
pesos de proteína.

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Fundamento del método de análisis
 La muestra se disuelve en ácido sulfúrico concentrado y se calienta con la
finalidad de que:
o La materia carbonosa se libera en forma de CO2
o Los minerales se sulfaten
o El nitrógeno se transforme en sulfato de amonio
 Como catalizador se utiliza CuSO4, puede usarse sales de Hg, Zr, Se, pero estos
dos últimos son muy caros y el Hg es toxico. El K2SO4 sirve como elevador de la
temperatura de ebullición (no es catalizador), por cada 10 ˚C de elevación de la
temperatura, la Velocidad de la reacción se duplica. El ataque finaliza cuando
la solución se torna de un color verde-esmeralda límpido.
 En este proceso de digestión o ataque de la muestra, se libera en la digestión
en forma de CO2: la grasa, fibra, carbohidratos presentes en la muestra.
 La parte oxigenada de la proteína también se libera.
 Solo queda la parte nitrogenada de la proteína.
 Al final del ataque, se tiene en la solución H2SO4 sobrante, sales sulfatadas de
los minerales disueltos, y el sulfato de amonio

N orgánico + H2SO4  (NH4)2SO4

Destilación
 En el proceso de destilación, se añade al balón de Kjeldahl 500ml de agua con
la finalidad de :
o Diluir al ácido sulfúrico remanente
o A la vez que el sulfato de potasio, sulfato de cobre, sulfato de Amonio
disueltos precipiten
o Dejando libre en la parte superior el H2SO4 sobrenadante; es decir ha y
formación de dos fases
 Luego se añaden algunas granallas de Zinc con la finalidad de evitar la
ebullición tumultuosa creando núcleos de vaporación.
 Inmediatamente después de este paso se adiciona la soda caustica por los
bordes del balón, para evitar una reacción violenta con el ácido sulfúrico
remanente y el (NH4)2SO4.
 La adición de la soda neutraliza la acción del ácido sulfúrico sobrante, y
favorece la liberación del amoniaco en forma de NH4OH que será recibido en el
frasco de Erlenmeyer que contiene la solución de ácido bórico.

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  Inicialmente al producirse el calentamiento desaparecen las dos fases, se forma
una solución de color celeste oscuro , luego al ebullir se torna color marrón
debido a la presencia de un complejo cúprico, que desaparece a medida que se
libera el amoniaco.
 El amoniaco es captado por la solución de H3BO3 que forma un complejo
estables que forma un complejo estable, esto se observa debido al cambio de
color que experimenta la solución de ácido bórico, rojo a amarillo, producido
por el amoniaco y que alcanza la solución progresivamente, a medida que es
captado por el ácido bórico; esto es visible gracias al indicador rojo de metilo,
pudiéndose usar otro indicador según el rango de viraje
(NH4)2SO4 + NaOH  NH3 + H3BO3  NH4H2NO3

Titulación
 Posteriormente, se determina por titulación con HCl 0,1N hasta cambio de
color, en este caso, Amarillo a rojo-grosella
 Anotar el volumen gastado de ácido y proceder con los cálculos.
 Este método de análisis es aplicable a todo tipo de alimento en general.
NH4H2BO3 + HCl  NH4Cl + H3BO3

3. Materiales y reactivos
Titulación
 Harina de trigo
 Extracto resultante de la extracción acuosa

Reactivos
 H2SO4 concentrado
 Mezcla catalizadora (CuSO4 y K2SO4)
 H2SO4 0.02N padronizado
 NaOH 50%
 H3BO3
 Indicador (rojo de metilo + verde de bromocresol)

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4. Procedimiento
Primera parte: Digestión
1. Ligar el reóstato del bloque digestor,
verificado el voltaje correcto.
2. Muestras
 Pesar cerca de 0,2g sobre papel
vegetal previamente pesado, colocar
justamente con el papel de pesado
en el tubo de digestión. Colocar
0,2g de CuSO4, 1,0g de K2SO4 y
5ml de H2SO4 concentrado. Agitar
cuidadosamente el tubo para
mezclar la muestra (en caso de
muestras con alto contenido de
proteínas, el pesado deberá ser
menor, cerca de 0,1g).Hacer un
blanco.
 Iniciar el calentamiento solamente
cuando la muestra estuviera lista y
colocarla en el bloque digestor. La
temperatura debe ser en torno a
105 ˚C. Aumentar gradualmente
hasta 400 ˚C
3. Muestras liquidas
 Medir 2,0 ml, con pipeta volumétrica. Adicionar los catalizadores en la
misma cantidad en 5,0ml de H2SO4, agitar cuidadosamente el tubo para
mezclar la muestra.
 Iniciar el calentamiento solamente cuando la muestra estuviera lista y
colocada en el bloque digestor. La temperatura debe ser en torno a 50 ˚C.
Aumentar lentamente hasta 400 ˚C (No debe aumentar bruscamente,
pues puede ocurrir perdida de muestra).
4. El término de la digestión es verificada cuando la muestra estuviera limpia y
verdosa en caliente, y limpia y azulada en frio.
5. Terminada la digestión se vuelve el dial al reóstato para cero y se desliga la red
eléctrica.
6. Retirar los tubos del bloque, colocándolos en el soporte de tubos para su
enfriamiento y posterior destilación.

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Segunda parte: Destilación
1. El nivel de agua en el balón de
generación de vapor debe estar
encima del sensor. Completar
siempre, colocando agua destilada a
través del embudo apropiado y cerrar
la llave.
2. Ligar el aparato verificándose el
voltaje de la red eléctrica.
3. Abrir la llave de agua para circulación
en el contenedor.
4. Girar el dial de la resistencia hasta
7/8 para calentamiento del agua del
generador de vapor y esperar que
hierva.
5. Diluir la muestra que está en el tubo
de digestión con 15ml de agua
destilada (muestra fría).
6. Girar el dial para cero y abrir la llave
del embudo del balón generador de
vapor.
7. Colocar en Erlenmeyer de 125ml
conteniendo 10ml de H3BO3 (2%) con
indicador (verde de bromocresol o rojo
de metilo) en el soporte abajo del
condensador.
8. Conectar el tubo de proteína digerida en el local de encaje.
9. Adicionar NaOH 50 % en el embudo dosador de soda (la llave deberá estar
cerrada)
10. Abriendo la llave del embudo dosador de soda lentamente (gota a gota),
adicionar NaOH 50 %hasta neutralizar (la muestra neutra quedara de color
oscuro marrón)
11. Terminada la neutralización, cerrar la llave del embudo de soda y del balón
generador de vapor, inmediatamente girar el dial para 10 para iniciar el
calentamiento y formación de vapor.
12. Colectar cerca de 50ml del destilado.

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 13. Retirar el Erlenmeyer, girar el dial para ¾, abrir la llave del balón generador
de vapor y retirar el tubo digestor (cuidado)
14. Para limpiar el sistema, conectar el tubo digestor limpio, concretando 20 ml
de agua destilada, cerrar la llave generador de vapor, girar el dial 10 y destilar por
5 minutos.
15. Retirar el tubo de lavado procedimiento como en el ítem 13. El aparato está
listo para nueva destilación (proceder en los ítem 7 al 13)
16. Terminadas todas las destilaciones, proceder a la última a la última
destilación de limpieza con agua destilada,
teniendo el cuidado de agotar la soda de su
reservatorio, lavándolo también con agua
destilada.

Tercera parte: Titulación

1. Preparar una bureta de 50ml con H2SO4 0,2N
facturado
2. Titular directamente en el Erlenmeyer en el
que fue colectado el destilado.
3. El punto final de la titulación será indicado
por la mudanza de color de la solución.

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5. Cálculos y resultados
Datos
1ª Muestra
Muestra 3.4245
Gasto de H2SO4: 5ml
Factor: 4.0

1. porcentaje de nitrógeno
(𝑔𝑎𝑠𝑡𝑜 𝐻2 𝑆𝑂4 )𝑥(𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑)𝑥(𝑓𝑐 )𝑥(𝑚. 𝑒𝑞 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜)
% 𝑑𝑒 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = 𝑥 100
𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
5𝑚𝑙 𝑥 0,1 𝑥 1,0876 𝑥 0,014007
% 𝑑𝑒 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = 𝑥 100
3.4245𝑔
% 𝑑𝑒 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = 2.2222
2. determinación de proteínas
% 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 = % 𝑑𝑒 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 𝑥 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
% 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 = 2.2222 𝑥 4
% 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 = 8.8888
2ª Muestra
Muestra 2.5841g
Gasto de H2SO4: 5ml
Factor: 4.0

1. porcentaje de nitrógeno
(𝑔𝑎𝑠𝑡𝑜 𝐻2 𝑆𝑂4 )𝑥(𝑛𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑)𝑥(𝑓𝑐 )𝑥(𝑚. 𝑒𝑞 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜)
% 𝑑𝑒 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = 𝑥 100
𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
5𝑚𝑙 𝑥 0,1 𝑥 1,0876 𝑥 0,014007
% 𝑑𝑒 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = 𝑥 100
2.5841𝑔
% 𝑑𝑒 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 = 0.2947
2. determinación de proteínas
% 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 = % 𝑑𝑒 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛𝑜 𝑥 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟
% 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 = 0.2947 𝑥 4
% 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎𝑠 = 1.1790

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6. Conclusiones y recomendaciones
El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla
compleja de proteínas.
Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos.
El defecto del método de Kjeldahl, que es el de no permitir la determinación de todas
las formas de nitrógeno.
EL método absoluto para la determinación de las proteínas es el aislamiento y pesado
directo de las proteínas pero dicho método se utiliza solo a veces en investigaciones
bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico.

7. Bibliografía
Nielsen, S.S. (1994). “Introduction to the Chemical Analysis of Foods”. Ed. Jones and
Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212.
Ranganna, S. (1977). “Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products”. Ed.
McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi.
Alais, C. (1985) “Ciencia de la leche: principios de técnica lechera”. Ed. Reverte.
España. pp199-200