UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

2016 - A Facultad de Ingeniería Química

IDENTIFICACION DE BACTERIAS

1. OBJETIVOS:

 Identificar bacterias Gram positivas y negativas de inóculos conocidos en

medios selectivos.

2. FUNDAMENTO TEORICO:

TINCION DE GRAM:

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en

microbiología para la visualización de bacterias. Debe su nombre al bacteriólogo danés
Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse
a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación
a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias
que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan
de color rosa o rojo.

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares
de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna
de la pared celular y unido a la membrana plasmática, se encuentra el ácido lipo-
teicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el
peptidoglucano (también conocido como mureína).

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se

encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición
distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Tiene una capa delgada de
peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipo-proteínas. La membrana
exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipo-polisacárido.
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Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas

diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el
material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo
poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la

membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como
por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración
azul-violácea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular
más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la
acción del solvente orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos,
lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloración azul-violácea.

BACTERIA GRAM NEGATIVA

En microbiología, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no

se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, y lo hacen de un color rosado
tenue: de ahí el nombre de "Gram-negativas" o también "gran negativas".

Esta característica está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por

lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana.

Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos

Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseriagonorrhoeae), meningitis
(Neisseriameningitidis) y síntomas respiratorios (Moraxellacatarrhalis), entre otros. Los
bacilos Gram-negativos incluyen un gran número de especies. Algunos de ellos
causan principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilusinfluenzae,
Klebsiellapneumoniae , Legionellapneumophila, Pseudomonasaeruginosa),
enfermedades urinarias (Escherichiacoli, Proteusmirabilis, Enterobactercloacae,
Serratiamarcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori,
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Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros están asociadas a infecciones

nosocomiales (Acinetobacterbaumanii).

Estructura

La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas está compuesta por una

membrana citoplasmática (membrana interna), una pared celular delgada de
peptidoglicano, que rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared
celular de estas bacterias. Entre la membrana citoplasmática interna y la membrana
externa se localiza el espacio periplásmico relleno de una sustancia denominada
periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutrición en estas bacterias.

La membrana externa contiene diversas proteínas, siendo una de ellas las porinas o
canales proteicos que permiten el paso de ciertas sustancias. También presenta unas
estructuras llamadas lipo-polisacáridos (LPS), formadas por tres regiones: el
polisacárido O (antígeno O), una estructura polisacárida central (KDO) y el lípido A
(endotoxina).

BACTERIA GRAM POSITIVA

En microbiología, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se

tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el nombre de "Gram-
positivas" o también "gran positivas". Esta característica está íntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana. La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la
membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de
peptidoglicano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana
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citoplasmática mediante moléculas de ácido lipo-teicoico. La capa de peptidoglicano

confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte
durante la tinción de Gram. A diferencia de las Gram-negativas, las Gram-positivas no
presentan una segunda membrana lipídica externa a la pared celular y esta pared es
mucho más gruesa.

Incluyen especies tanto móviles (vía flagelos) como inmóviles con forma de bacilo
(Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco
(Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas
(Mycoplasma). Algunas especies son fotosintéticas, pero la mayoría son heterótrofas.
Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones desfavorables.
Realmente, no todas las bacterias del grupo son Gram-positivas (no se tiñen por la
aplicación de ese método), pero se incluyen aquí por su similitud molecular con otras
bacterias Gram-positivas.

La célula bacteriana está rodeada por una envoltura que, observada al microscopio
electrónico, se presenta como una capa gruesa y homogénea, denominada pared
celular. Luego en sección (corte) se observa una estructura semejante a dos líneas
paralelas separando una capa menos densa; esto corresponde a la membrana
plasmática. Entre la membrana plasmática y la pared celular se encuentra el peri-
plasma o espacio peri-plasmático. En el interior de la membrana plasmática se
encuentra el citoplasma que está constituido por una disolución acuosa, el citosol, en
el cual se encuentran ribosomas y otros agregados de macromoléculas, y en el centro
se ubica la zona menos densa llamada nucleoide, que contiene una madeja de hebras
difícil de resolver (distinguir) y cuyo principal componente es el ADN.

La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene como
base química fundamental el peptidoglicano, que es un polímero de N-acetil-2-D-
glucosamina, unido en orientación ß-1,4 con N-acetil murámico, a éste se agregan por
el grupo lactilo cuatro o más aminoácidos. Esta molécula se polimeriza gran cantidad
de veces, de modo que se forma una malla especial, llamada sáculo de mureína.
Dicho compuesto es de vital importancia para conservar la forma y darle rigidez a la
célula bacteriana (si este compuesto no existiese, la célula reventaría debido a su gran
potencial osmótico).
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Las siguientes características están presentes generalmente en una bacteria Gram-

positiva:

 Membrana citoplasmática.
 Capa gruesa de peptidoglicano.
 Ácidos teicoicos y lipo-teicoicos, que sirven como agentes quelantes y en
ciertos tipos de adherencia.
 Polisacáridos de la cápsula.

Comparación de las envolturas celulares bacterianas

ARRIBA: Bacteria Gram-positiva. ABAJO: Bacteria Gram-negativa.

1- Membrana citoplasmática. 1- Membrana citoplasmática.

2- Peptidoglicano. 2- Espacio peri-plasmático.
3- Fosfolípidos. 3- Membrana externa.
4- Proteínas. 4- Fosfolípidos.
5- Ácido lipo-teicoico. 5- Peptidoglicano.
6- Lipoproteína.
7- Proteínas.
8- Lipo-polisacáridos.
9- Porinas
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3. MATERIAL DE PRACTICA

 Mechero Bunsen.
 Asa de siembra esterilizada.
 Placas petri.
 Pipetas.
 Tubos con cultivos bacteriano crecidos
 Agua destilada.
 Lugol.
 Lavado con acetona: agua (80) y acetona (20).
 Safranina.
 Laminas para objetos.

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

a) Todos los materiales deben ser esterilizados por dos minutos por lo menos.
b) Preparar la muestra para identificar las bacterias gram positivas o gram
negativas.
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c) Esterilizar el asa de siembra en el mechero por unos dos minutos.

d) Coger una pizca de muestra (colonia bacteriana) con el asa de siembra y

colocar en la lámina porta objetos, disolver sobre una gota de agua destilada.

e) Extender la muestra como una capa fina sobre la lámina porta objetos. Se deja
secar la preparación, se fija la colonia al calor suave (mechero).
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f) Adicionar una gota del colorante cristal violeta, dejar reposar por un minuto y
luego enjuagar con agua destilada.

g) Luego añadimos una gota de lugol, dejamos reposar por un minuto y

enjuagamos con agua destilada.
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h) Tinción de contraste con safranina. Las bacterias gram positivas ya están

teñidas con cristal violeta y permanecen de color purpura. Las bacterias gram
negativas se tiñen de color rosa. Por un minuto enjuagar con agua destilada.

5. CALCULOS Y/O RESULTADOS

Las muestras dadas en forma separada ambas fueron bacterias gram

negativas.
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6. CONCLUSIONES

 Para la primera muestra que dio una coloración azul o violeta, nos da una

bacteria gram positiva.

 Para la segunda muestra, también nos dio una coloración azul o violeta e

indica una bacteria gram positiva.

 Se logró comprobar que la tinción gram nos ayuda a diferenciar por

coloración las bacterias gram positivas de las gram negativas.

7. RECOMENDACIONES

 Se debe extender la suspensión con mucho cuidado hasta conseguir una

capa fina.
 Al secar la preparación acercándola a la llama del mechero, evitar que se
caliente demasiado para no afectar a la estructura y forma de los
microorganismos.