INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO

Bioquímica y Laboratorio QIBQ 73-2

Informe No.003, (05/04/2019)

Extracción y cuantificación de proteínas a partir de tejido

hepático.
Diego León Castaño Muñoz
Sandra Milena Bolívar Cuartas
Yiceth Carina Mosquera Bonilla
Instituto tecnológico metropolitano
Correo: diegocastano76395@correo.itm.edu.co
zamiboku@gmail.com
yicethmosquera232789@correo.itm.edu.co

Resumen: En esta práctica se identificaron las variables y condiciones experimentales necesarias para la
extracción de proteínas a partir de muestras biológicas y se realizó la extracción de proteínas: lisis celular y
solubilización proteica, también se analizó el fundamento bioquímico de la cuantificación de proteínas mediante
métodos colorimétricos y se comprendieron los fundamentos teórico prácticos tanto de la extracción de
proteínas como de la cuantificación de proteínas mediante técnicas colorimétricas.
Abstract: In this practice, the variables and experimental conditions necessary for the extraction of proteins
from biological samples were identified and the extraction of proteins was carried out: cell lysis and protein
solubilization. The biochemical basis of protein quantification was also analyzed by colorimetric methods. The
theoretical and practical fundamentals of both protein extraction and protein quantification were understood by
colorimetric techniques

Palabras clave: Proteínas, determinación cuantitativa, colorimetría.

1. Introducción se dé la correcta liberación del contenido celular, este

Las proteínas corresponden a los principales efectores
celulares, involucradas en funciones biológicas de alta
importancia, entre las que se enumeran, señalización y
transporte celular, soporte y estructura, respuesta
inmune, entre otras. Cada tipo celular, tiene un rol
específico determinado por su composición proteica.
Con la posibilidad de que 20 aminoácidos diferentes
puedan estar unidos en diferentes órdenes para
conformar polipéptidos de cientos de aminoácidos.
Esta variedad permite a las proteínas funciones tan
refinadas como las de las enzimas que permiten el
metabolismo celular1.
Extracción de Proteínas
Para el estudio de las proteínas, diferentes
procedimientos han sido establecidos, entre ellos, la
extracción y cuantificación proteica.
La extracción de proteínas implica como paso inicial
la ruptura de la membrana plasmática con el fin de que
proceso se denomina homogeneización y la disolución
resultante es un homogenado celular o extracto crudo.
La obtención del homogenado puede ser realizado a
través de distintos métodos.
Espectrofotometría
La espectrofotometría, consiste en una técnica
analítica que utiliza el espectro de luz UV-visible para
cuantificar la concentración de una sustancia o analito
en una solución. La colorimetría, incluye aquellos
análisis de espectrofotometría de sustancias o analitos
coloreados, es decir que tienen la capacidad de
absorber luz en el espectro visible (400-750nm).
Cuantificación de Proteínas
La cuantificación de proteínas mediante
espectrofotometría puede realizarse utilizando
diferentes métodos, entre ellos el método de Lowry,
Bradford, ácido Bicinconínico (BCA) y Biuret, este
último se basa en la formación de un complejo

coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los
enlaces peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se
acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas
(enlaces peptídicos) y la reacción es bastante
específica, de manera que pocas sustancias interfieren.
Los compuestos que tienen dos o más
enlaces peptídicos, dan un color rosado a lila
característico cuando se tratan con sulfato de cobre
(CuSO4) diluido en solución alcalina (KOH), Reactivo
de Biuret. El color es debido al complejo de
coordinación del átomo de cobre con cuatro átomos de
nitrógeno (en solución alcalina) o de oxigeno (en
solución ácida) proveniente de enlaces peptídicos2.
2. Parte experimental
2.1 Materiales y equipos
- Micropipeta de Volumen Variable 10 µl, 100
µl y 1000 µl
- Puntas de 10-100-1000 µl
- Pipetas de 1-10 ml
- Pipeteador
- Tubos de ensayo de 50, 15 y 2 ml.
- Celdas cuadradas de 10 mm para
espectrofotometría
- 20 g de hígado licuado
- Buffer RIPA
- Metanol
- Reactivo de Biuret
- Solvente: agua destilada
- Solución patrón: Solución de albumina sérica
bovina de concentración conocida o solución
de gelatina sin sabor de concentración
conocida.
- Microcentrifuga
- Espectrofotómetro para lectura de
absorbancias de 400-640 nm (GENESYS 20)
INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO
2.2 Procedimiento
Extracción de proteínas desde muestras de
hígado:
Método 1:
- Licuar 100 gramos de hígado de res,
garantizando la mayor homogeneidad posible
(evite que queden restos de tejido sin licuar).
- 2.Centrifugue 5-10 ml de la suspensión
celular (hígado licuado) a 2000 gravedades
durante 10 minutos
- 3.Descarte el sobrenadante, conservando el
pellet (botón) de células.
- 4.Agregue 5 ml de buffer RIPA frío al botón
de células
- 5.Agite en vórtex durante 10 minutos
- 6.Centrifugue los tubos a 16.000 gravedades
durante 15 minutos
- 7.Recolecte el sobrenadante en un tubo
limpio y refrigérelo.
Método 2:
- Cortar un fragmento pequeño de hígado de
res y ponerlo en un mortero.
- 2.Agregar 5 ml de buffer RIPA.
- 3.Homogeneizar con la ayuda del mortero,
evite dejar fragmentos de tejido sin macerar.
- 4.Agite en vórtex durante 10 minutos
- 5.Centrifugar a 16.000 gravedades
durante 15 minutos.
- 6.Recolecte el sobrenadante en un tubo
limpio y descarte el precipitado.
-
Cuantificación de proteínas mediante Biuret:
- Preparar una solución Blanco con 500µl de
solvente (agua destilada) y 2ml de solución
de color (Reactivo de Biuret)
- Preparar diluciones seriadas de la solución
patrón (proteínas): sin diluir, 1:2 y 1:4
- Mezclar 500µl de cada solución patrón y una
muestra desconocida y 2 ml de reactivo
de Biuret; dejarlas en reposo mínimo 20
minutos.
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- Mezclar 500µl de la solución de proteínas 7. Referencias

hepáticas y 2 ml de reactivo de Biuret;
dejarlas en reposo mínimo 20 minutos.
- seleccione la longitud de onda para la 1. guía de trabajo práctico-experimental,
lectura (490 nm) talleres y laboratorios de docencia ITM.
- Configurar
Blanco: Tramitancia 100%/Abs 0 2. Lodish. Biología Celular y Molecular.
- Realizar la lectura de la absorbancia en la Tercera edición. Edit: Panamericana. 2003.
longitud de onda adecuada para las muestras
preparadas.

3. Datos
A continuación, se presentan los datos experimentales:
Tabla 1. Absorbancia de las Muestras

Tubo Dilución Absorbancia Concentración

(490) nm (mg/ml)

1 Sin diluir 0,145

2 1:2 0,075

3 1:4 0,042

4 Muestra 0,029
desconocida

5 Muestra de 0,368
hígado

4. Análisis de Resultados

5. Profundización

6. Conclusiones