UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y TIOS DE SEMBRADO DE

BACTERIANO

CURSO: MICROBIOLOGÍA

DOCENTE: ARANGUREN BELAUNDE, LUIS ANTONIO

CICLO: VII

SECCIÓN: 3A

GRUPO: G2

INTEGRANTES:

 CUSICAHUA HUAMAN, LULEIANA

 HUAYLLA CCORI, ELIZABETH
 MALPARTIDA CHAVEZ, EULALIA
 PALPA MALPARTIDA, MARY LUZ

2019
DEDICATORIA

El presente informe está dedicado a nuestros

padres por su interminable apoyo en todo
momento de nuestras vidas, por sus
enseñanzas, consejos y por su eterna paciencia
y perdón ante nuestros constantes errores.
 INTRODUCCIÓN

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados;

normalmente bajo la forma de liofilizados a los que es preciso rehidratar. En estos
casos la preparación del medio de cultivo se reduce sencillamente a pesar la
cantidad deseada del mismo y disolverla en agua destilada siguiendo las
instrucciones del fabricante.

Las sustancias termolábiles, se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los

componentes después de que estos hayan sido previamente esterilizados en el
autoclave y enfriados a temperatura ambiente o a 40-50ºC si se trata de medios con
agar. Antes de su esterilización los medios líquidos se reparten en los recipientes
adecuados (tubos, matraces, etc.). Si es un medio sólido y se ha de distribuir en
tubos o en matraces será necesario fundir el agar en baño María, una vez fundido
y homogenizado, se distribuye en caliente a los tubos o matraces (no en placas
Petri) se tapa y se esteriliza en la autoclave. Una vez finalizada la esterilización los
medios se dejaran enfriar a temperatura ambiente y en el caso de medios sólidos
contenidos en tubos deberán, en su caso, inclinarse para que al solidificarse
adopten la forma de agar inclinado o pico de flauta si tal es su finalidad.

Las placas Petri se preparan vertiendo el medio fundido y estéril dentro de ellas y
en un ambiente aséptico (por ejemplo, en la proximidad de la llama de un mechero
Bunsen) es conveniente homogenizar el medio en el transcurso de la operación
para evitar que el agar sedimente en el fondo del recipiente y no se distribuya por
igual en todas las placas.
 ÍNDICE

CAPÍTULO I .......................................................................................................... 5
1.1 OBJETIVOS ........................................................................................................ 5
1.2 LA EVOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO ............................................... 5
1.3 MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGÍA ..................................................... 6
1.4 CONSTITUYENES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO .................... 6
1.5 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO ....................................................................... 9
1.6 CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS 10
1.7 SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ................................... 13
1.8 MÉTODOS DE AISLAMIENTO EN PLACA MEDIOS SÓLIDOS ........................ 14
1.9 AGAR USADO EN CLASE ................................................................................ 19
CAPÍTULO II ......................................................................................................... 30
2.2 MUESTRAS DE CULTIVO .......................................................................... 31
2.3 Procedimiento:............................................................................................. 33
CAPÍTULO III ........................................................................................................ 36
3.2 Resultados................................................................................................... 36
3.3 Conclusiones: .............................................................................................. 36
3.4. Recomendaciones .......................................................................................... 37
3.4 Referencias Bibliográficas ........................................................................... 37
CAPÍTULO I

1.1 OBJETIVOS

 Reconocer los distintos tipos de agar

 Aprender los tipos de sembrado de cultivo

1.2 LA EVOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia

en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los
primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios
de cultivo y la utilización del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos
de inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo

Brefeld, que consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos
realizados a base de gelatina. Sin embargo este sistema no era adecuado para las
bacterias (por su menor tamaño) y no fue hasta el año 1878 cuando Lister popularizó
un método enfocado al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio
líquido. Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas
de patata como soporte nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne
líquido, diseñado por Loeffler, al que, en 1881, añadió gelatina, logrando un medio
sólido transparente ideal para la observación de la morfología macroscópica de las
colonias microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en

relación con los medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-
agar (polisacárido extraído de algas rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal

planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas
bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre
las bacterias quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron
gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento.
Diseñaron este tipo de medios de tal forma que su especial composición química
favorecía el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en función de sus
procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos
nutrientes del medio.

En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores

de pH a la composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la
producción de ácidos en la fermentación en ciertos microorganismos.

1.3 MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGÍA

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las
bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de
oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio
de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe
estar exento de todo microorganismo contaminante.

1.4 CONSTITUYENES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de
muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la
que se añadirán otros ingredientes.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales:

 Para incrementar el valor nutritivo del medio

  Para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que
ayuden a identificarlos.

A continuación, se da una idea general sobre algunos de los constituyentes

habituales de los medios de cultivo.

AGAR: Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.
En el agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido que se
obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de que a
excepción de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente.
Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de
los 40ºC, dependiendo de su grado de pureza.

LA GELATINA: es otro agente solidificante, pero se emplea mucho menos ya que

bastantes bacterias provocan su licuación.

EXTRACTOS: Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos animales

o vegetales (por ejemplo carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son extraídos con
agua y calor y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo.
Estos preparados deshidratados son a menudo empleados en la elaboración de
los medios de cultivo. Los más utilizados son el extracto de carne, de levadura y el
de malta.

PEPTONAS: Son mezclas complejas de compuestos orgánicos, nitrogenados y

sales minerales, que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas
animales o vegetales (soja caseína carne, etc.). Las peptonas son muy ricas en
pépticos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y
sales minerales.

FLUIDOS CORPORALES: Con frecuencia es necesario añadir a los medios de

cultivo de algunos patógenos sustancias como sangre completa, sangre
desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, sobre todo para conseguir el primer
aislamiento a partir del hospedador. La sangre no puede ser esterilizada, y por
tanto debe de ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal
sano, y adicionada al medio de cultivo después de que este haya sido auto
clavado. Los fluidos corporales no solo aportan factores de crecimiento, sino que
también aportan sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de
algunas bacterias. Un ejemplo podría ser la catalasa presente en las células
sanguíneas destruye el peróxido de hidrógeno que algunas bacterias que no
poseen este enzima acumulan como producto del metabolismo del oxígeno.

SISTEMAS AMORTIGUADORES: Para mantener el pH dentro del rango optimo

del crecimiento bacteriano a veces, es necesario añadir algunos componentes al
medio de cultivo. Debido a que la mayoría de las bacterias son neutrófilas, se
suelen emplear sales del tipo de los fosfatos disódicos ò bipotásicos u otras
sustancias como las peptonas para prevenir la desviación del pH.

INDICADORES DE PH: Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH debido

a fermentaciones u otros procesos, se hace necesario a veces añadir indicadores
acido-base que nos lo indiquen. por ejemplo, la formación de ácido o como
inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa
como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las
bacterias Gram-positivas).

AGENTES REDUCTORES: Con el objetivo de crear en los medios de cultivo

condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos ò anaerobios
se añaden estos agentes reductores siendo, los más empleados la cisteína y el
tioglicolato entre otros.

AGENTES SELECTIVOS: La adición de determinadas sustancias a un medio de

cultivo puede convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta,
sales biliares, azida sódica, telurito potásico, antibióticos, etc., a la concentración
adecuada hará que actúen como agentes selectivos frene a determinados
microorganismos.
1.5 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Por su estado físico

LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en

solución acuosa.

SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo)

a razón de 15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacárido
(hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia
no es digerida por las bacterias no constituye ningún elemento
nutritivo. Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser
vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la
posibilidad de aislar y diferenciar bacterias, "procesos que antes no
eran posibles en medio líquido".

SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan

para determinar la motilidad de las especies en estudio.

Por su utilidad práctica

Medios para aislamientos primarios

Medios generales: Son aquellos que permiten el crecimiento de una

gran variedad de microorganismos.

No son selectivos, es para cultivo de una amplia variedad de

organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos
con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina,
u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar
Sangre, Schaeadler, etc)
 Medios selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un
tipo de microorganismos determinado, inhibiendo el desarrollo de los
demás. (Pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden
sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias,
permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancias
añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey,
Kanamicina-Vancomicina) enriquecidos: ralentizan/suprimen el
crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y
crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Medios para aislamientos especializados: Son formulaciones

nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos
específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

Medios para identificación

Medios diferenciales: Son aquellos en los que se pone de manifiesto

propiedades que un determinado tipo de microorganismos posee.
formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades
fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las
bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la
identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación)

1.6 CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE

MICROORGANISMOS

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.
a) Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener,

como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos
casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del
crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer
de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan
lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de

carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de
estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de
los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es

utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de
nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y
otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a

muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente
pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,
magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

b) consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo

productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en
estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al
punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.

c) presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno
normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos.
Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán
adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio,
los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas
parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
las citadas condiciones.

d) condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las
estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que
se deseque el medio.

e) Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los
microorganismos fotosintéticos.

f) pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe
olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metabólicos normales.

g) Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y

43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a
temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC,
y los saprofítos tienen rangos más amplios.

h) Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos
medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que
utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

1.7 SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Siembra, Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra

(inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su
desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

 Que se efectúen asépticamente.

 Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados.
 Que se realicen solo los manipuleos indispensables.
 Que se trabaje fuera de toda corriente de aire, utilizando un mechero o bien
Flujo laminar.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los

requerimientos del microorganismo a estudiar.
Gracias a la aplicación de los medios de cultivo, se ha llegado a conocer
ampliamente el comportamiento cultural y fisiológico de la variada flora microbiana
que pulula en los ambientes, permitiéndose la identificación específica. Para ello es
necesario considerar la metodología que conduzca a la exacta determinación de la
especie en el laboratorio.

Las siembras se realizan con 2 finalidades: para hacer aislamientos y trasplantes.

Aislamiento: permite la separación de microorganismos al estado de pureza a partir

de una muestra problema. Se requiere un medio sólido con gran superficie para que
los microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie
formando colonias separadas. Si se aíslan colonias distintas, cada colonia tendrá
caracteres especiales. La morfología bacteriana será también distintiva.

Trasplante: significa que la separación primaria de la cepa a un medio de cultivo

apropiado en tubo, que puede ser líquido o sólido. Se conserva la cepa pura y por
tanto trasplantes en medios especiales, se logran conocer las propiedades
culturales y bioquímicas y como resultado, la identificación específica.

1.8 MÉTODOS DE AISLAMIENTO EN PLACA MEDIOS SÓLIDOS

A.- Método de aislamiento por el método de estriado

El método de estrías en placa es el procedimiento clásico para aislar cepas de

bacterias. Este método consiste en la separación de un determinado
microorganismo del resto de microorganismos que le acompañan. Estriar para aislar
implica una sola inoculación de una sección de la placa de Petri y a continuación,
disminuir la colonia arrastrando microorganismos de la sección inicial a dos o tres
secciones adicionales, achicando eficazmente la población de microorganismos.
Generalmente es utilizado para separar un cultivo mixto de bacterias
a) Estría Simple: Esta técnica es ampliamente utilizado para la visualización de
ciertas propiedades metabólicas tales como la producción de enzimas hidrolíticas
(a través de la hidrólisis de las sustancias - yema de huevo, sangre) y la producción
de pigmento.

Técnica 1: Transferir una asada al medio sólido de

placa de cultivo y estriar en forma de zig-zag en toda
la placa.

Técnica 2: Se divide la placa Petri por la mitad.

Colocamos el inóculo en el extremo de la placa y
sembramos en forma de zigzag decreciente, luego
se esteriliza el asa al mechero. Nuevamente
tomamos el inóculo y lo sembramos de la misma
manera en la otra mitad de la placa. Se puede
diferenciar la forma y el color de colonias.

b) Estriar para aislar:

Implica una sola inoculación
de una sección de la placa de
Petri y a continuación,
disminuir la colonia
arrastrando microorganismos
de la sección inicial de dos o tres secciones adicionales, achicando eficazmente la
población de microorganismos. Generalmente utilizado para separar un cultivo
mixto de las bacterias, los bacteriólogos también utilizan este método para aislar
una línea de bacterias que nacen de un solo progenitor
Estria en T: Se dibuja una T en la placa y se procede a estriar en 3 cuadrantes (A,B,
C)

c) Estriado por agotamiento sobre cuatro cuadrantes: Este es también un

método de estriado para el aislamiento, pero utiliza cuatro secciones en lugar de
tres. Divide la placa de Petri en cuatro partes iguales con un marcador permanente.
Consiste en sembrar uno a uno los cuadrantes, sin flamear el asa entre estría y
estría, de tal forma que en el cuarto cuadrante, al ir agotando la muestra del asa,
tendremos los microorganismos aislados. Objetivo: obtener colonias aisladas.

Es importante no volver a repasar el cuadrante que ya hemos sembrado. Para

conseguir que al final de la estría tengamos colonias aisladas. Es importante no
cruzar las estrías (no tocar con el asa la estría anterior) para reducir el inóculo a
cada estría y obtener colonias aisladas. Puede, alternativamente, flamear el asa al
terminar cada cuadrante y tocar la punta del asa la última estría anterior para
arrastrando un pequeño inóculo a la siguiente estría. También es importante que en
los primeros cuadrantes hagamos la estría más junta y que la cantidad de muestra
tomada en el asa sea la adecuada, y que en los últimos dos cuadrantes hagamos
las estrías más separadas.

d) Estriado en tubo: esterilizar el asa como, tomar la porción de muestra con el

asa. Con la mano opuesta a la que sujeta el asa tomar el tubo por la parte inferior.
Con el dedo meñique de la mano con la que sostiene el asa, retirar el tapón de
algodón o la tapa de rosca del tubo, y reténgala, no la coloque en la mesa de trabajo.
Flamee de inmediato la boca del tubo de ensayo, pasándola una o dos veces por la
llama del mechero, con el objetivo de eliminar por incineración los microorganismos
contaminantes que se encuentren en esa zona. Introducir el asa con la muestra en
el tubo.

A partir de aquí la siembra se puede realizar de distintas maneras:

 Deslizando el asa desde el fondo hacia

arriba, por toda la superficie de la cuña
trazando una línea longitudinal.
 Deslizando el asa por la superficie de la
cuña desde el fondo hacia arriba,
imprimiéndole un movimiento de zigzag.
 Moteando toda la superficie de la cuña
con un hisopo.
Al concluir la siembra se flamea y se taponea nuevamente el tubo procediendo a
esterilizar el asa en el mechero.

B.- Método de aislamiento por diseminación

El método de aislamiento por diseminación en placa es un procedimiento en el cual
el investigador coloca una muestra diluida sobre una superficie de agar estéril en
una placa de Petri, y disemina uniformemente la mezcla diluida de células sobre
una superficie de agar, utilizando una varilla doblada de vidrio (Asa de Digralsky),
esterilizada. Los cultivos son incubados por un periodo de tiempo específico. Y
posteriormente, en el medio sólido aparece un crecimiento macroscópicamente
visible esto se debe a que cada célula forma una colonia separada, por lo tanto cada
colonia representa un cultivo puro. Luego de que las colonias han crecido, son
contadas y se calcula el número de bacterias en la muestra original.

C.-Método de aislamiento por Difusión

El procedimiento de placa vertida se utiliza extensivamente con bacterias y hongos

y también puede producir colonias aisladas. Se prepara una muestra bacteriológica
diluida. El investigador introduce una pequeña cantidad de muestra dentro de una
placa petri vacía. Se vierte agar derretido o fundido dentro de la placa petri que
contiene la muestra. El agar y la muestra se mezclan meticulosamente al tapar la
placa y realizar giros suaves sobre la mesa. Se le da tiempo para que el agar se
vuelva gel mientras se asienta sobre la superficie plana. Finalmente, las placas se
invierten y se dejan incubar por un periodo de tiempo específico. Las colonias son
luego observadas y contadas, y se registra la información.

Criterios para la diferenciación de colonias

El aspecto de las colonias, su coloración, tamaño, etc. permiten diferenciar

diferentes bacterias, aunque son propiedades generales muy influenciadas por las
condiciones de cultivo, por lo que a continuación se realiza una descripción muy
general. Las colonias pueden ser opacas, translucidas o transparentes. Algunas
producen pigmentos fluorescentes cuando se iluminan con luz ultravioleta. Otras
aparecen con superficie pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o poseen anillos
concéntricos. En ocasiones el olor es también característico.

1.9 AGAR USADO EN CLASE

A. AGAR SIM

CONTROL DE CALIDAD

Introducción

SIM (Sulfide Indole Motility) Medium (medio de sulfuro indol para movilidad) se
utiliza para determinar la producción de sulfuro, formación de indol y movilidad de
Los Microorganismos Entéricos.

Realización del Procedimiento de Analisis

1. Inocular muestras representativas con los cultivos enumerados a continuación.

 a) Aflojar las tapas, hervir y enfriar antes de utilizar.
b) Inocular los tubos insertando una aguja recta hacia el centro del medio,
aproximadamente hasta la mitad de su profundidad, utilizando diluciones de
10-1 de cultivos de caldo de soja Trypticase de 18 – 24 h.
c) Incubar los tubos con las tapas flojas a 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia.

2. Examinar los tubos después de 18 – 24 h y 42 – 48 h para detectar crecimiento,

movilidad y producción de sulfuro.

3. Después de 48 h, realizar la prueba para detectar producción de indol. Añadir 0,2

mL de reactivo Kovacs hacia el interior de los tubos. Observar la generación de un
color de rosa a rojo (reacción positiva).

4. Resultados previstos

CONTROL DE CALIDAD ADICIONAL

1. Examinar los tubos como se describe en la sección “Deterioro del producto”.

2. Examinar visualmente los tubos representativos para asegurarse de que los

defectos físicos existentes no interfieran con el uso.

3. Incubar tubos representativos sin inocular a una temperatura de 20 – 25 °C y 30

– 35 °C y examinar después de 7 días en busca de contaminación microbiana.

INFORMACIÓN DEL PRODUCTO

Uso Previsto

SIM Medium se utiliza para diferenciar los bacilos entéricos por su producción de
sulfuro, formación de indol y movilidad.

Resumen Y Explicacion
La producción de ácido sulfhídrico, la formación de indol y la movilidad son
características distintivas que ayudan a la identificación de Enterobacteriaceae,
especialmente Salmonella y Shigella. SIM Medium, por consiguiente, es útil en el
proceso de la identificación de patógenos entéricos.

Principios Del Procedimiento

Los elementos de SIM Medium posibilitan la determinación de tres actividades por

las que se pueden diferenciar las bacterias entéricas. El tiosulfato sódico y el sulfato
ferroso de amonio son indicadores de producción de ácido sulfhídrico. El sulfato
ferroso de amonio reacciona con gas de H2S para producir sulfuro ferroso, un
precipitado de color negro. La peptona de caseína es rica en triptófano, que
determinados microorganismos atacan, lo que da como resultado la producción de
indol. El indol se detecta mediante la adición de reactivos químicos posteriormente
al período de

incubación. La detección de motilidad es posible gracias a la naturaleza semisólida

del medio. Un crecimiento que se propague hacia el exterior a partir de la línea
central de inserción de la muestra indica que el organismo de prueba es móvil.

Reactivos

SIM Medium

Fórmula aproximada* por litro de agua purificada

Digerido pancreático de caseína ................................. 20,0 g

Digerido péptico de tejido animal ................................ 6,1 g

Sulfato ferroso de amonio ............................................. 0,2 g

Tiosulfato sódico ............................................................ 0,2 g

Agar ................................................................................. 3,5 g

*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.

Advertencias y precauciones

Para uso diagnóstico in vitro.

Los tubos con tapas ajustadas deben abrirse con cuidado para evitar lesiones por
la rotura del vidrio. Emplear una técnica aséptica y seguir las precauciones
habituales contra riesgos microbiológicos durante todo el proceso. Después de su
utilización, los tubos preparados, los recipientes de muestras y otros materiales
contaminados deben esterilizarse en autoclave antes de ser desechados.

Instrucciones para el almacenamiento

Al recibir los tubos, almacenarlos en un lugar oscuro a 2 – 25 °C. No congelar ni

sobrecalentar. No abrir hasta que vayan a utilizarse. Reducir al mínimo la exposición
a la luz. Los medios en tubos almacenados como se indica en sus etiquetas hasta
momentos antes de su utilización pueden ser inoculados hasta la fecha de
caducidad e incubados durante los períodos recomendados de incubación. Dejar
que el medio se caliente a temperatura ambiente antes de la inoculación.

Deterioro del producto

No utilizar los tubos si muestran evidencia de contaminación microbiana,

decoloración, deshidratación o cualquier otro signo de deterioro.

B. MACCONKEY II AGAR

Uso Previsto

BD MacConkey II Agar es un medio de diferenciación selectivo para el aislamiento

y la diferenciación de Enterobacteriaceae y diversos otros bacilos gram negativos a
partir de muestras clínicas.

Principios y explicación Del Procedimiento

Método microbiológico.

En la actualidad, existen numerosos medios de cultivo para aislamiento, cultivo e

identificación de Enterobacteriaceae y determinados organismos no fermentadores.
Uno de los primeros fue desarrollado por MacConkey y publicado en 1900 y
19051,2. Esta fórmula fue diseñada sabiendo que las sales biliares precipitan por
acción de ácidos y determinados microorganismos entéricos fermentan la lactosa,
mientras que otros no presentan dicha capacidad. Posteriormente, este medio fue
modificado varias veces3,4. El agar MacConkey es sólo ligeramente selectivo, dado
que la concentración de sales biliares, que inhiben los microorganismos gram
positivos, es baja en comparación con otros medios en placa entéricos. Se
recomienda el uso de este medio en muestras clínicas con posible flora microbiana
mixta, tal como procedentes de la orina, del sistema respiratorio, de heridas y otras,
porque permite la agrupación preliminar de bacterias entéricas y otras bacterias
gram negativas en organismos fermentadores y no fermentadores de lactosa5,6. El
agar MacConkey también se utiliza en el examen microbiológico de alimentos. La
fórmula del agar MacConkey II se diseñó para mejorar la inhibición del agrupamiento
dinámico de la especie Proteus, lograr una diferenciación más definitiva de los
organismos fermentadores y no fermentadores de lactosa y alcanzar un crecimento
superior de las bacterias entéricas.

En BD MacConkey II Agar, las peptonas proporcionan los nutrientes. Cristal violeta

inhibe las bacterias gram positivas, en especial los enterococos y estafilococos. La
diferenciación de los microorganismos entéricos se logra mediante la combinación
de lactosa y el indicador de pH rojo neutro. Se producen colonias incoloras o de
color de rosa a rojo según la capacidad del aislado para fermentar carbohidratos.

Almacenamiento Y Vida Util

Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y

8 °C, envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la
congelación y el calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su
fecha de caducidad (ver la etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos
de incubación recomendados.

Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos pueden usarse durante una semana
siempre que se almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 °C.

Control De Calidad Del Usuario

Inocular muestras representativas con las cepas siguientes (para obtener los
detalles, véase el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO). Incubar
las placas a 35 ± 2 °C en una atmósfera aerobia. Examinar las placas después de
18 – 24 h para comprobar la extensión del crecimiento, el tamaño de las colonias,
la pigmentación y la selectividad.

C. AGAR MANNITOL SALT

USO PREVISTO

Mannitol Salt Agar se utiliza para el aislamiento selectivo de estafilococos y para la

detección de Staphylococcus aureus a partir de muestras clínicas.

PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO

Método microbiológico.

El agar sal manitol en una fórmula diseñada por Chapman para la diferenciación de
estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) de los
estafilococos negativos a la coagulasa. Este agar se utiliza para el aislamiento de
estafilococos a partir de muestras clínicas, de cosméticos y de pruebas de límite
microbiano. El agar sal manitol contiene peptonas y extractos de carne bovina, que
suministran los nutrientes esenciales. Una concentración de cloruro sódico de 7,5%
tiene como resultado una inhibición parcial o completa de los organismos
bacterianos diferentes de los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada
por el cambio del indicador de rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de
estafilococos. Los estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo,
Staphylococcus aureus) producen colonias de color amarillo y un medio circundante
de color amarillo, mientras que los estafilococos negativos a la coagulasa producen
colonias de color rojo y no producen cambio de color en el indicador de rojo fenol.

Almacenamiento Y Vida Util

Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y

8 °C, envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la
congelación y el calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su
fecha de caducidad (ver la etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos
de incubación recomendados. Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos
pueden usarse durante una semana siempre que se almacenen en un lugar limpio
a una temperatura entre 2 y 8 °C.

Resultados

Examinar las placas después de 18 – 24 y 48 h para comprobar la extensión del

crecimiento, el tamaño de las colonias, la pigmentación y la selectividad. Las
reacciones típicas son las siguientes:
 D. AGAR TSA (Tryptic Soy Agar)

Tryptic Soy Agar (agar de soja tríptica BD), suministrado en frascos, es un medio de
uso general completado parcialmente que, vertido en placas de Petri o tubos,
favorece el crecimiento de microorganismos tanto no exigentes como
moderadamente exigentes. En la microbiología clínica, no se utiliza para el
aislamiento de patógenos a partir de muestras clínicas, pero puede ser utilizado
para el cultivo de cepas bacterianas. Después de suplementarlo con sangre, se
puede utilizar como medio de aislamiento primario en la microbiología clínica.

PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO

Método microbiológico.

Dada su composición nutritiva, el agar de soja tríptica se ha convertido en un medio

de uso muy extendido durante muchos años. Este medio se encuentra especificado
como medio de agar digerido de caseína y harina de soja en las Farmacopeas
Europea y de Estados Unidos por la porción de recuento microbiano aerobio total
de los procedimientos de prueba de límite microbiano. El medio preparado se utiliza
para numerosas aplicaciones, incluidos el mantenimiento de cultivos de referencia,
el recuento en placa, el aislamiento de microorganismos a partir de una variedad de
materiales. Se incluye en los compendios de métodos de examen de agua, aguas
residuales y alimentos. El uso de este medio en microbiología clínica es limitado,
dado que no favorece el crecimiento de una variedad de bacterias exigentes. Sin
embargo, dado que el agar de soja tríptico no contiene los factores de crecimientos
X y V, puede ser utilizado para la determinación de requisitos de estos factores de
crecimiento por los aislados de las especies Haemophilus mediante la adición de
tiras de factor X, V y XV a las placas inoculadas. BD Tryptic Soy Agar también puede
ser utilizado como medio para el mantenimiento o subcultivo de cepas de referencia,
por ej., Enterobacteriaceae y estafilococos. El medio sin suplementar no se utiliza
como medio de aislamiento primario para aplicaciones clínicas. Después de agregar
sangre (por ej., sangre de carnero al 5%), se puede utilizar para el aislamiento de
bacterias a partir de muestras clínicas.

En BD Tryptic Soy Agar, la combinación de caseína y peptonas de soja hace al

medio nutritivo, al suministrar nitrógeno orgánico, en especial aminoácidos y
péptidos de cadena más larga. El cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico. BD
Tryptic Soy Agar (medios en frasco) son medios completados parcialmente
(=semifinalizados) suministrados en frascos de los que el usuario puede preparar
un medio en placa o en tubo. Estos medios se fabrican a partir del medio
deshidratado Difco.

ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL

Al recibir los frascos, almacenarlos en un lugar oscuro a 5 – 25 ºC. No congelar ni

sobrecalentar. El medio puede utilizarse hasta la fecha de caducidad e incubarse
durante los períodos de incubación recomendados. Los frascos de envases abiertos
pueden ser utilizados hasta la fecha de caducidad. Los frascos abiertos deben ser
utilizados de inmediato. Para preparar las placas o tubos a partir del medio en
frascos, primero debe licuarse No licuar el medio más de una vez después de la
solidificación.

CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO

Medio sin suplementar: Preparar placas o tubos a partir del medio completado
parcialmente, sin añadir suplementos tales como sangre. Inocular las placas o los
tubos con las cepas de prueba indicadas en la tabla inferior. Para más detalles,
consultar el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO. Incubar las
bacterias durante 18 – 48 h en atmósfera aerobia a 35 ± 2 °C. Incubar Aspergillus
niger durante 3 - 4 días en atmósfera aerobia a 25 - 28 °C. Según las Farmacopeas
Europea y de Estados Unidos, el medio se incuba a 30 - 35 °C.

Medio suplementado con sangre de carnero desfibrinada al 5%: Preparar las placas
a partir del medio completado parcialmente (véase PROCEDIMIENTO: Preparación
de reactivos) y suplementar con sangre de carnero al 5% después de refrigerar a
48 – 50 °C. Se recomienda analizar el medio suplementado según la norma de
NCCLS M22-A211. Incubar las cepas durante 20 - 24 h en atmósfera aerobia
enriquecida con dióxido de carbono.

Resultados

Después de la incubación, es posible que en las placas aparezca una sección donde
confluye el crecimiento. Dado que el procedimiento de extensión de la muestra es,
de hecho, una técnica de “dilución”, se depositan cada vez menos microorganismos
en las áreas extendidas. Por consiguiente, una o más de estas áreas presentarán
colonias aisladas de los organismos que contenga la muestra. Por otra parte, el
crecimiento de cada organismo podrá medirse semi-cuantitativamente basándose
en el crecimiento ocurrido dentro de las áreas en donde se extienden las muestras.
• Método de vertido en placa:

Consultar las referencias apropiadas. Si se inoculan con el inóculo adecuado, los

agares inclinados mostrarán crecimiento en toda la superficie. Los tubos pueden
mantenerse refrigerados durante varias semanas sin que el cultivo pierda viabilidad.
El tiempo de supervivencia depende de las cepas individuales. El número y tipo de
organismos cultivados en medios completados preparados de BD Tryptic Soy Agar
(medios en frasco) es muy elevado. Por tanto, aquí no se presentan detalles
específicos acerca de su aspecto. Consultar las referencias. A partir de los aislados
obtenidos en los medios, se deben realizar subcultivos apropiados para permitir la
diferenciación e identificación adicionales.
CAPÍTULO II
2.1 Materiales y Equipos:

Espatula Balanza analítica Frasco Boeco

Probeta Agua destilada beaker

 Purificador de agua

2.2 MUESTRAS DE CULTIVO

Agar Maconkey Agar Sal y Manitol

Tryctuc Soy Agar Sin Mediun

CALCULO DE LA MUESTRA DE CULTIVO A UTILIZAR:
 Lo primero que tenemos que hallar es sacar el calculo la cantidad que vamos a utilizar

AGAR MACONKEY .-

50 1000mL
X 70mL
X = 3,5g

AGAR SAL Y MANITOL.-

110 1000mL
X 70mL
X = 7.7g

TRYPTIC SOY AGAR.-

40 1000mL
X 70mL
X = 2,8 g

SIN MEDIUN.-

36,23 1000mL
X 70mL
X = 2,53g
2.3 Procedimiento:

 Lavar todos los materiles y enjuagar con agua destilada

 Pesar lo mas rapido posible para evitar que la muestra se dañe .

AGAR MACONKEY

 En una probeta medir 70 ml de agua destilada , y pesar de la muestra Agar

Maconkey 3,5 g en la balanza analitica y agregar en el frasco Boeco agitar
esto se va diluir en el calor llevar a temperatura de 121°C.
SIN MEDIUN.-

 En una probeta medir 70 ml de agua destilada , y pesar de la muestra SIN

MEDIUN 2,53 g en la balanza analitica y agregar en el frasco Boeco.
Agitar y llevar a temperatura .

AGAR SAL Y MANITOL.-

 En una probeta medir 70 ml de agua destilada , y pesar de la muestra Agar
sal y manitol 7,7g en la balanza analitica y agregar en el frasco Boeco.
 Agitar y llevar a temperatura .

TRYPTIC SOY AGAR.-

 En una probeta medir 70 ml de agua destilada , y pesar de la muestra tryptic
soy agar 2,8 g en la balanza analitica y agregar en el frasco Boeco.
Agitar y llevar a temperatura .para su disolucion

MEDIOS DE CULTIVO
CAPÍTULO III

3.2 Resultados

 Un buen aprendizaje en la elaboración de cultivo bacterianos

 Se pudo conocer los tipos de sembrado en placas Petri, tubos de ensayo.
 Modo de sembrado correcto
 Uso correcto del asa de siembre
 El correcto autoclavado de los agares usados en clase (SIM, MC CONKEY,
TSA, SAL Y MANITOL)

3.3 Conclusiones:
 Condiciones óptimas de incubación como temperatura, pH, presión,
condiciones atmosféricas (concentración de O2). Estos medios de cultivo son
sólidos (cultivos en reposo), o líquidos (para cultivos en agitación) Al realizar
una siembra de microorganismos, debemos tener en cuenta que técnica se
va a utilizar, debido a que estas varían respecto a las características del
microorganismo a tratar. También debe tenerse en cuenta la forma, espacio
y el objetivo al que se quiere llegar, pues dependiendo de esto la técnica de
siembra es diferente. Un microorganismo se puede sembrar en un medio
líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Un cultivo de bacterias
o de hongos es con el fin de aislarlas en el medio para lograr un mejor estudio
de ellos
 Se preparó el medio en un matraz de acuerdo a las instrucciones del envase
y se dejó enfriar hasta que el alumno lo pudo soportar con las manos y se
vació en las placas de petri; después se dejó hasta que enfríe y gelifíque. Se
tapan las placas de petri y se envuelven en papel almacenadas hasta que se
vayan a utilizar en un refrigerador. En la presente práctica se prepararon
exitosamente los medios de cultivo. En esta práctica se puede concluir que
el alumno elaboro de manera correcta los medios entes mencionados y
podrán ser utilizados en la próxima clase.
 3.4. Recomendaciones

 Leer cuidadosamente el rótulo del envase. Controlar la fecha de

vencimiento.
• No introducir ningún tipo de herramientas en el medio
(espátulas, varillas, cucharas, etc.)
• Para homogeneizar el medio agitar tomando el envase desde
el cuello del erlenmeyer, evitar las varillas de vidrio.
 realizar el pesado los más rápido posible pues los agar son
fácilmente de humedecer

3.4 Referencias Bibliográficas

 http://elblogdeadepi.blogspot.com/p/microbiologia-bacteriologia-medios-
de.html
 https://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf
 http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/tecnicas-y-metodos-
de-estriado-en-caja.html
 http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
 file:///C:/Users/mary%20luz/Desktop/lab%20nicrobiologia%20pdf.pdf
 https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/HB/CE/BA/ES-BA-
256665.pdf
 https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8770
 https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8771
 https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8763