PRÁCTICA Nº 1

AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS A PARTIR DE

MATRICES AMBIENTALES
Introducción

La vida microbiana evolucionó en el planeta mucho antes de que lo hicieran las

plantas y los animales. Durante un período de más de 3 Ga (109 años) los
microorganismos, principalmente procariotas únicos habitantes de la tierra,
mediaron los procesos biogeoquímicos que dieron origen a una biosfera habitable
favoreciendo la evolución de otros organismos. Resulta sorprendente que esas
nuevas formas de vida más complejas no desplazaron a los microorganismos y, por
el contrario, bacterias, hongos, algas, protozoos y virus se encuentran ampliamente
distribuidos en el planeta pues continuaron evolucionando y coexistiendo con
plantas y animales. La ubicuidad y diversidad microbiana que encontramos
actualmente en los diferentes ambientes puede explicarse principalmente por tres
factores: su temprana aparición que implica un largo período de evolución, la
flexibilidad metabólica que les permite ocupar nichos que no pueden ocupar otras
formas de vida y su pequeño tamaño que favorece un rápido crecimiento.

En razón a lo anterior, es comprensible hallar una gran diversidad de bacterias y

hongos en cualquier matriz ambiental. Estos microorganismos llevan a cabo
procesos esenciales en el medio ambiente, como la formación del suelo, el
metabolismo de la materia orgánica, el ciclaje del carbono, nitrógeno, oxígeno,
azufre, entre otros. Derivado de su función en el medio ambiente surge su uso
potencial en la industria: debido a sus características fisiológicas y metabólicas, los
microorganismos pueden tomar diferentes moléculas presentes en el medio y
transformarlos en productos que pueden llegar a tener múltiples aplicaciones.
Adicionalmente, su capacidad para tolerar diversas condiciones ambientales de
temperatura, pH, concentración de sales y de oxígeno, junto con una extensa gama
de rutas metabólicas, hacen posible su utilización en múltiples procesos industriales
como las fermentaciones, de donde se obtienen múltiples productos de interés
industrial tales como ácidos orgánicos, alcoholes, CO2, aminoácidos, biopolímeros,
entre otros.

El estudio y la aplicación de los procesos microbianos, sin embargo, depende en

gran medida de nuestra habilidad para aislarlos y de la cuantificación de sus
abundancias en las matrices ambientales. Las técnicas que se aplican para el
estudio de la microbiota en dichas matrices son variadas e incluyen desde técnicas
clásicas de aislamiento hasta técnicas moleculares que identifican con alta
sensibilidad y especificidad a los microorganismos. En esta práctica, el estudiante
adquirirá destrezas para el procesamiento y manipulación de muestras ambientales
a través de la aplicación de sus conocimientos de siembra en superficie y de
recuento en placa, y así podrá identificar y reconocer la variedad de
microorganismos que se pueden aislar de una muestra de suelo y estimar su
número.
Procedimiento:
A partir de una muestra representativa de un suelo (un suelo por grupo y cada
estudiante realizará las siembras respectivas):
1. Pese 10 gr de suelo usando una espátula previamente esterilizada con
alcohol.
2. Adicione los 10 gr de suelo en un Falcon que contiene 30 mL de agua
peptonada estéril.
3. Agite en vortex por 5-10 minutos.
4. A partir de esta solución, realice diluciones seriadas 1:10 hasta 1x10 -6 en
solución salina. Para esto:
 Cada estudiante debe marcar 6 tubos con las diluciones 10 -1 a 10-6, y
las 3 cajas de Petri con agar nutritivo con las diluciones 10-4,10-5 y 10-
6.

 A partir de la solución y en condiciones asépticas, tome una alícuota

de 1 mL y transfiéralos al primer tubo marcado como 10-4 que contiene
9 mL de solución salina. Mezcle con el vortex y repita este proceso
para preparar las diluciones posteriores. Es posible utilizar la misma
pipeta para realizar todas las diluciones siempre y cuando no olvide
que debe purgar la pipeta en cada paso.
5. Siembre por el método de siembra en superficie las 3 últimas diluciones en
cajas de Petri que contienen agar nutritivo. Para esto:
 A partir de las diluciones y en condiciones asépticas, tome 0.1 mL de
la mayor dilución (10-6) y deposítelo en el centro del medio de cultivo.
 Con el asa de Digralsky estéril, realice una buena distribución de la
muestra en la superficie del agar. Para este proceso, tome el asa,
sumérjala en alcohol, elimine el exceso de alcohol (evite el goteo) y
esterilícelo flameándolo con el mechero permitiendo que la llama
consuma el alcohol remanente y enfríelo ligeramente antes de hacer
contacto con la muestra.
 Repita el proceso para la siembra de las siguientes diluciones.
 Espere a que seque un poco la muestra sobre el agar.
6. Incube a 37 °C por 24 h.
7. Describa las colonias obtenidas y realice recuento en placa aplicando sus
conocimientos previos.

Análisis de resultados
1. A partir de los aislamientos obtenidos, describa macroscópicamente, las
colonias obtenidas.
2. A partir de los datos de recuento y teniendo en cuenta la dilución en la que
se reporta, calcular el número de Unidades Formadoras de Colonia que hay
por mililitro (UFC/ml) de cultivo de la bacteria.
3. Compare los resultados de la identificación y del recuento en placa obtenidos
por los otros compañeros de su grupo. ¿Qué puede concluir?