UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA DE HIGIENE Y SEGURIDAD
INDUSTRIAL

SIEMBRA, AISLAMIENTO, TRANSPLANTE Y OBTENCION DE CULTIVOS

PUROS DE BACTERIAS
QUINTO LABORATORIO DEL CURSO MICROBIOLOGIA AMBIENTAL- BO-112

AZAÑERO GIRÓN, ELIZABETH 20187504B

CHAVEZ TORRE, DANEL 20185505A

DOCENTE: MSc. Blgo. ALVARO MARTÍN MARTÍNEZ VILA

Lima, Perú
10 de Mayo del 2019
Contenido
1. RESUMEN .................................................................................................................... 3
2. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................... 3
3. OBJETIVOS ................................................................................................................... 3
a) Objetivos Generales ............................................................................................ 3
b) Objetivos específicos. ......................................................................................... 4
4. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................ 4
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ............................................................................... 7
c) Materiales, medios de cultivo y equipos ............................................................ 7
d) Metodología. ....................................................................................................... 9
6. RESULTADOS ............................................................................................................. 10
7. DISCUSION DE RESULTADOS ..................................................................................... 12
8. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 12
9. RECOMENDACIONES ................................................................................................. 13
10. FUENTES DE INFORMACIÓN ................................................................................. 13
11. ANEXOS ................................................................................................................. 14
12. APENDICE .............................................................................................................. 16
DIAGRAMA DE FLUJO .................................................................................................... 16
 1. RESUMEN

En la experiencia se realizó la siembra por estrías, para poder obtener cultivos

puros de las bacterias, el objetivo que se planteo fue el de ejecutar las técnicas
de cultivo, así como también el de aprender a usar los diferentes medios de
cultivo como lo es el Agar Nutritivo, Agar ENDO, Agar EMB y Agar Manitol Salado
su uso y el tipo de bacteria que crecerá en estos tipos de medio de cultivo
selectivo, determinaremos el tipo de bacterias que crecieron después de la
incubación, como el número de placas Petri es limitado se tendrá que dividir a
estas en 2 o 3 sectores para poder así realizar la siembra de las 8 colonias de
las diluciones, la muestra de la cavidad bucal y el de las manos. Finalmente
obtendremos los resultados los cuales fueron plasmados en este informe.

2. INTRODUCCIÓN

Un cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas,

químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma
controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función
de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de
la disponibilidad de nutrientes en el medio.
Los medios de cultivo que vamos a utilizar son indefinidos o naturales, porque en
su preparación siempre se incluye algún extracto de composición química
desconocida. El más utilizado, el caldo común o su versión solidificada con agar,
es un medio que permite el crecimiento de la mayoría de las bacterias que se van
a utilizar en estas prácticas, pero también se emplean otros que contienen
inhibidores semiespecíficos como el agar de McConkey, cuyas sales biliares
inhiben el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram positivas. En algunos
casos, se utilizarán medios que contienen componentes tales como indicadores
de pH que cambian de color cuando el microorganismo realiza una actividad
metabólica preferente sobre substratos concretos (Ej: fermentación).

3. OBJETIVOS

a) Objetivos Generales
 Aprender el uso de los distintos medios de cultivo
 Ejecutar técnicas de aislamiento.
b) Objetivos específicos.
 Conocer una nueva técnica de aislamiento en medio de cultivo solido: método
del estriado, para la obtención de cultivos puros de bacterias
 Utilizar medios de cultivo diferenciales y selectivos para cultivar bacterias de
importancia ambiental
 Cultivar microorganismos en agar TSA

4. MARCO TEÓRICO

Diferentes métodos de siembra

- Sembrar: Es el acto de colocar el material bacteriológico en el medio de cultivo
para promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicación. El
resultado de una siembra se llama: Cultivo
Las siembras pueden ser:
- Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez
- Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria
Métodos generales
1. Siembra por estrías en superficie
Se siembra el material en la superficie del agar inclinado en un tubo de ensayo,
allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente
esterilizada y cargada con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias,
pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la parte más profunda de la superficie
inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del tubo. Medio
de cultivo: agar base inclinado Instrumento: asa o aguja bacteriológica
2. Siembra por estría por agotamiento:
Con éste procedimiento se puede conseguir una buena separación de las
colonias y aislarlas fácilmente. Para ello se hunde el medio de cultivo, se vuelca
en caja de Petri y se deja solidificar. Con el asa previamente esterilizada se toma
material de un cultivo heterogéneo y se descarga sobre la superficie del medio
formando estrías. Esto puede realizarse de varias formas:
a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se continúa con las estrías. Cuando se
quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de Petri,
para lo cual se repite la operación sin tomar con el asa nuevo material.
b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado el
material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace una
estría luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar nuevamente el
asa; en el último cuadrante aparecerán las colonias aisladas
c-El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa, próxima al borde,
se esteriliza el asa y se traza otra estría a partir del depósito y así sucesivamente.
Medio de cultivo: solido en placa de Petri Instrumento. Asa Finalidad. Obtener
colonias aisladas

Aislamiento

Aislamiento: Permite la separación de microorganismos al estado de pureza a

partir de una MUESTRA PROBLEMA.
Trasplante: Es la separación primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado
en tubo, que puede ser liquido o solido.Se conserva la cepa pura y por tanto
trasplantes en medios especiales, se logran conocer las propiedades bioquímicas
y como resultado la identificación especifica.
Los trasplantes pueden ser:
De liquido a solido
De liquido a liquido
De solido a liquido
De solido a solido
Cultivo microbiano: Un cultivo es el crecimiento de poblaciones microbianas de
forma controlada en medio artificial
Medio de cultivo: Soporte que va a contener los nutrientes necesarios, asi como
unas condiciones optimas de Ph y humedad que permite el desarrollo y
crecimiento de microorganismos.
Clasificación de los medios de cultivo
En función de su consistencia
Sólidos: Al medio de cultivo solido se le añade un agente gelificante o
solidificante.Se preparan en Erlenmeyer, se dejan enfriar y luego se pueden pasar
o bien a una placa o bien a un tubo.
Los gelificantes mas habituales son:
Agar Agar: es una alga que se carcteriza por ser inerte frente a los
microorganismos y porque es liquido a la temperatura de ebullición y solidifica
entre los 45-50°C.
Líquidos o caldos: Contiene los nutrientes y, en lugar de añadir el agar, tienen el
agua que se utiliza para diluir el medio de cultivo. Se preparan en tubo.
Semisólidos: Contienen agar (<5-10%).Se utilizan cuando queremos observar
movilidad bacteriana. Se hace en tubo y se utiliza la siembra en picadura con asa
recta.
Caldo Nutritivo: Extracto de carne+ peptona+agua
Agar Nutritivo: extracto de carne+peptona+agua+agar
En función al uso que se le da
Enriquecidos: Son aquellos medios en los cuales a un medio base se le añaden
determinadas sustancias nutritivas que son necesarias para el crecimiento de un
microorganismo exigente. Ejemplo: agar-sangre.
De enriquecimiento: Se utilizan solamente cuando se sospecha que el
microorganismo de la muestra se encuentra en un número muy pequeño. Se le
aporta los nutrientes y se espera que crezcan de 6 a 8 horas. Esto se utiliza, por
ejemplo, cuando se sospecha que la contaminación es por Salmonella.
Diferenciales: Incorpora determinadas sustancias. El agar de sal y manitol: nos
permiten diferenciar en el caso de los staphylococos, los que utilizan el manitol en
su metabolismo de los que no.Si lo utilizan originan acidos, con lo que el ph
disminuye y el indicador cambia de color.
Selectivos: llevan incorporadas determinadas sustancias que inhiben el
crecimiento de un microorganismo y facilita el crecimiento del microorganismo que
nois interesa,Ejemplo.Agar de sal y manitol el NaCl (5%) inhibe el crecimiento de
ciertos microorganismos y facilita el desarrollo de otros que crecen mejor en ese
medio.
Transporte y mantenimiento: Se utilizan cuando la muestra no se puede
procesar inmediatamente después de haberla tomado.

5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

c) Materiales, medios de cultivo y equipos

Tubos de ensayo: Son pequeños tubos de vidrio que presentan una abertura en
la zona superior y una curvatura cerrada en la parte inferior. Está hecho de un
vidrio especial (Pyrex) con el fin de resistir temperaturas muy altas. Es usado para
contener pequeñas muestras líquidas, y preparar soluciones.
Placas de Petri: Recipiente redondo, de vidrio o plástico, posee diferentes
diámetros, es de fondo bajo, con una cubierta similar que la placa, pero un poco
más grande de diámetro, ya que se puede colocar encima y cerrar el recipiente,
como una tapa. Usado para el cultivo y observación de bacterias.

Asa de Kolle: Es un instrumento de laboratorio tipo pinza que consta de una base
que termina en aro o en punta. Se emplea para transportar inóculos desde la
solución madre a la de medio de cultivo, o de un medio a otro.

Gradilla: Utensilio que sirve para colocar tubos de ensayo. Este material facilita el
manejo de los tubos de ensayo.

Mechero de Bunsen: Instrumento utilizado en laboratorios para calentar o

esterilizar muestras o reactivos químicos. El quemador tiene una base en la que
se introduce el suministro de gas y perforaciones en los laterales del tubo para la
entrada de aire en el flujo de gas.

MEDIOS

Caldo BHI (Infusión Cerebro Corazón): Es un medio líquido usado para cultivar
microorganismos patógenos y no patógenos, incluyendo bacterias aerobias y
anaerobias, además también es usado en la preparación de inóculos en pruebas
de susceptibilidad microbiana. Es un medio de cultivo nutritivo que contiene
infusión de cerebro, tejido de corazón y peptonas que proporcional proteínas y
otros nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de microorganismos
patógenos y no patógenos.

Caldo Nutritivo: Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el

desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso
está descripto en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y
otros materiales de importancia sanitaria.

Agar Nutritivo: Es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo
tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativamente altas
temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la
superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas. En un caldo de
nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia espesa,
con colonias difícilmente observables.

Agar EMB: Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Agar Endo: Es un medio de cultivo microbiológico de color rosa pálido. Fue

originalmente desarrollado para el aislamiento de Salmonella typhi, pero ahora es
usado mayormente como un medio para coliformes. La mayoría de los organismos
Gram negativos crecen bien en este medio, mientras que otros organismos Gram
positivos son inhibidos

Agar Manitol Salado: Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el

aislamiento y diferenciación de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento
de estafilococos patogénicos a partir de muestras clínicas, alimentos, productos
cosméticos, etc. También puede utilizarse para el cultivo de especies halófilas de
Vibrio, si no se dispone de medios apropiados, aunque algunas especies pueden
no desarrollar.

EQUIPOS

 Incubadora: Dispositivo que sirve para mantener y hacer crecer cultivos

microbiológicos o cultivos celulares. La incubadora mantiene la
temperatura, la humedad y otras condiciones en grado óptimo, tales
 como el contenido de dióxido de carbono (CO2) y de oxígeno en su
atmósfera interior.
 Refrigeradora y Congeladora: Sus funciones consiste en mantener, en
un ambiente controlado (espacio refrigerado) diversos fluidos y
sustancias, para que los mismos se conserven en buenas condiciones
(mientras más baja sea la temperatura, menor actividad química y
biológica).

d) Metodología.

Para la realización de esta experiencia primero observamos el crecimiento en

los caldos BHI y Nutritivo, en tubos de ensayo, (previamente anotamos su
comportamiento), luego sembramos el inoculo de cada tubo de ensayo en los
agares Nutritivo, Endo, EMB, Manitol Salado (ya solidificados en placa Petri)
aplicando el método del estriado para lo cual primero esterilizamos el asa de
siembra al rojo vivo con la ayuda del mechero Bunsen, luego a una distancia
próxima del mechero abrimos el tubo y tomamos el inoculo, a continuación
abrimos la placas Petri (previamente rotuladas y divididas en 2 o 3 secciones
para lograr que alcancen las placas para poder sembrar de todos los tubos de
ensayo) y en cada división esparcimos mediante estrías primero muy juntas
luego tocando el extremo de las estrías anteriores realizamos otras estrías un
poco más separadas después tocando el extremo de las ultimas estrías
realizamos estrías con una separación considerable por último ya sin esterilizar
esta vez sembramos en la parte del medio con una separación mayor.
Realizamos este procedimiento para cada muestra en cada agar. Luego
colocamos en la incubadora a 35°C por 48 horas las placas ya sembradas,
realizamos la lectura pasado éste tiempo y anotamos sus características.
 6. RESULTADOS
Al observar las colonias se obtuvieron los siguientes resultados
N° Agar Nutritivo Agar ENDO Agar EMB Agar Manitol
Salado
Crecimiento Destrucción del Crecimiento
bueno, No hubo medio, no se moderado
1 colonias muy crecimiento. observa muy
pequeñas y crecimiento. expandido,
juntas colonias
grandes y
muy juntas de
color rojo.
Crecimiento Agar muy Crecimiento
bueno, No hubo destruido moderado,
2 colonias muy crecimiento. colonias
medianas y pequeñas un
separadas. poco
separadas,
con centro
rojo circular.
Crecimiento Crecimiento Crecimiento
bueno, No hubo mediano abundante,
3 colonias crecimiento. colonias colonias
pequeñas y pequeñas y pequeñas y
alejadas se ve medianas, algunas
invadido por la consistencia puntiformes,
colonia 1. mucosa, muy
superficie cercanas
umblicada. color rojo.
Poco
crecimiento o Buen
por un lado. No hubo No hay crecimiento,
4 Colonias crecimiento. crecimiento colonias
circulares y presencia de grandes
puntiformes, hongo blanco circulares,
 superficie pupiladas,
plana con planas, olor
bordes terroso.
redondeados
color opaco
Poco Crecimiento
5 crecimiento en No hubo No hubo regular,
toda la placa, crecimiento. crecimiento. colonias
colonias circulares
irregulares. planas.
Poco
6 No hubo No hubo crecimiento, No hubo
crecimiento. crecimiento. colonias crecimiento.
puntiformes de
consistencia
seca y color
purpura.
Buen Crecimiento
crecimiento, No hubo abundante
7 colonias crecimiento. No hubo por un lado,
grandes y crecimiento. convexo
pequeñas de plana, olor
forma terroso.
espiculada,
textura
mucosa.
Excelente
Crecimiento No hubo crecimiento,
8 abundante crecimiento. No hubo muy juntos,
muy juntas crecimiento. bordes
redondeados,
plano
convexo,
circulares,
olor terroso.
 Excelente Excelente
crecimiento, crecimiento, Buen
9 colonias colonias crecimiento,
Boca No hubo pequeñas y pequeñas y colonias del
crecimiento. muy juntas muy juntas tipo rojoide y
redondeadas redondeadas cerebroide
de de consistencia con superficie
consistencia mucosa y color pupilada.
mucosa. fucsia.
Excelente
crecimiento, Poco Buen Buen
colonias crecimiento crecimiento, crecimiento,
10 pequeñas y colonias colonias colonias
Mano muy juntas regulares. amarillas y de circulares de
redondeadas consistencia superficie
de mucoide, convexa,
consistencia algunas mucosa,
mucosa y color filamentosas. algunas son
opaco puntiformes.

7. DISCUSION DE RESULTADOS

En el agar Endo no se encontró crecimiento para la mayoría de las muestras.

Para el agar Nutritivo se observó un buen crecimiento casi en todas las placas en
las cuales se pudo hacer la caracterización de las colonias con facilidad.
En el caso del agar EMB se destruyó el medio en unas muestras lo cual
imposibilito las lecturas.

8. CONCLUSIONES

 El agar EMB con el que trabajamos en el laboratorio no es muy bueno.

  En este experimento se realizó la siembra de dilución la cual dio como
resultado la formación de colonias sobre las placas de agar nutritivo,
ENDO, EMB y Manitol Salado

9. RECOMENDACIONES

 Esterilizar el área antes de realizar el trabajo.

 En el momento de realizar la siembra el asa de Kolle debe esterilizarse al
rojo vivo con ayuda del mechero bunsen.
 Evitar repasar el estriado
 Coger la muestra necesaria del tubo de ensayo.
 Observar las colonias formadas en los plazos establecidos para evitar el
desarrollo excesivo y poder caracterizarlas.

10. FUENTES DE INFORMACIÓN

 Microbiología General-Schlegel-séptima edición-Año 1997-Ediciones
Omega S.A., Barcelona-España
 Gamazo, I. López- Goñi y R Díaz. Manual de Laboratorio de Microbiología
Editorial Masson. 2012
 Universidad de Alicante. Facultad de Ciencias. Manual de Supervivencia
en el Laboratorio. Marzo 2001.
 Microbiología General. Schlegel. Séptima edición. Enero 1997.Ediciones
Omega S.A. Barcelona-España.
 11. ANEXOS
Colonia
s1y2

Colonia
s3y4

Colonia
s5y6

Colonia
s7y8

Colonia
s boca
y mano
 12. APENDICE

DIAGRAMA DE FLUJO

Tomar el inoculo de la muestra Cerrar la Placa Petri,

problema con el asa de siembra y manteniendo cerca de la flama
depositar una gota sobre el medio de de llama para evitar la
la placa Petri, que descansa en contaminación
posición normal sobre la mesa.

Desechar la espátula en el frasco Introducir la espátula de drigalsky y

bacteriano. diseminar la gota por la superficie
del medio, no pasando dos veces
por el mismo plano.

Incubar igual a los métodos

anteriores.