INGENIERÍA BIOMOLECULAR PARA NANOBIO/BIOTECNOLOGÍA

MAUSSA OYAGA CAMILA TATIANA

MONTT ANDRÉS

SANDOVAL HEILBRON MAYRA ALEJANDRA

TEJERA REYGER ANDRÉS

CARLOS PARGA

DOCENTE

UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO

FACULTAD DE QUÍMICA Y FARMACIA

PUERTO COLOMBIA, ATLANTICO

2018-II
 1. INTRODUCCIÓN

La nanotecnología es la creación y utilización de materiales, dispositivos y sistemas

mediante el control de la materia a escala nanométrica, y es la tecnología del siglo
XXI. La capacidad de explotar las estructuras, funciones y procesos de moléculas
biológicas, complejos y nanosistemas para producir nuevos materiales biológicos
nanoestructurados funcionales ha creado los campos de rápido crecimiento de la
nanotecnología y la bionanotecnología, que son campos de investigación de la
fusión de la nanotecnología y la biotecnología. Generalmente estas palabras se
utilizan de manera general, sin embargo, en este caso se utilizarán de maneras
terminológicamente diferentes; a saber:

 La nanobiotecnología se utiliza en relación con las formas en que se utiliza

la nanotecnología para crear materiales, dispositivos y sistemas para
estudiar sistemas biológicos y desarrollar nuevos sistemas de ensayo
biológico, diagnostico, entre otros. Estos sistemas usan la nanotecnología
para avanzar los objetivos de los campos biológicos.

 La bionanotecnología se refiere a las formas en que se utiliza la biotecnología

para mejorar las nanotecnologías existentes o crear nuevas a través del
estudio de como funcionan los sistemas biológicos y las aplicaciones de las
moléculas y los sistemas biológicos a la nanotecnología.

Con la nanobiotecnología o bionanotecnologia, las moléculas biológicas son

bloques de construcción indispensables para la fabricación de nanomateriales,
nano dispositivos y nanosistemas funcionales. Los recientes avances en
ingeniería biomolecular, como ingeniería genética, ingeniería de ADN y ARN
ingeniería de proteínas, tecnologías de conjugación química y enzimática
especificas del sitio, han permitido mejorar, estabilizar, integrar y alterar las
funciones y propiedades de los materiales biológicos.

2. APLICACIÓN DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAS MODIFICADAS A

NANOBIO / BIONANOTECNOLOGÍA

La nanobio/bionanotecnología ha creado nuevas oportunidades para avances

en diversos campos, incluidas ciencias de la vida, medicina, electrónica,
ingeniería y biotecnología. Los materiales a nanoescala [Nanopartículas (NP),
nanofibras y nanotubos (NT)] combinados con varias moléculas biológicas
modificadas (Proteínas, enzimas, oligonucleótidos, polisacáridos, lípidos,
cofactores biológicos y ligandos) se han explorado en muchas aplicaciones
biológicas, por ejemplo, terapia, diagnostico, bioimagen, biodetección,
bioanálisis, biocatálisis, chips de células y órganos, dispositivos bioelectrónicos
y separación biológica. Sus propiedades y funciones novedosas y exclusivas,
como la alta relación volumen-superficie, la solubilidad mejorada, el tamaño
cuántico, dan como resultado nano-biomateriales que son drásticamente
diferentes de sus correspondientes materiales a granel.

Este análisis se centra en los avances en el desarrollo de nano-biomateriales

para aplicaciones de terapia, diagnostico, biodetección, bioanálisis y biocatálisis.

2.1. Nano-biomateriales para terapia y diagnóstico

NP inteligentes terapéuticos y de diagnóstico o bioimagen que transportan

materiales de carga, tales como fármacos, ADN, ARN, proteínas y reactivos
de imágenes, se han desarrollado ampliamente. Para lograr la administración
intracelular de NP y fármacos, se necesitan muchas estrategias para superar
diversas barreras biológicas, que incluyen: (i) prevenir la eliminación de la
circulación por las células del sistema reticuloendotelial; (ii) dirigirse a células
especificas; (iii) internalización en las células; (iv) escapar de los endosomas;
(v) tráfico a organelos específicos; y (vi) controlar la liberación de cargas, por
ejemplo, drogas, ADN o ARN.

2.1.1. Previniendo la eliminación de la circulación

Las NP hechas de polímeros sintéticos hidrofóbicos, metales o materiales

inorgánicos generalmente no son compatibles con la sangre. Su inyección en
el cuerpo puede provocar una respuesta de coagulación y activar la cascada
del complemento; posteriormente, pueden ser reconocidos por los fagocitos
y macrófagos, haciéndolos inútiles o dañinos. La modificación de la superficie
de las NP con polímeros sintéticos o biológicos, como el polietilenglicol
(PEG), la heparina o el dextrano, forma un cepillo estérico que imparte
resistencia a la adsorción de proteínas. Este tipo de modificación de la
superficie muestra un aumento de las propiedades intrínsecas
anticoagulantes y anti-complemento, así como otras actividades biológicas;
además, extiende la vida media de la circulación y reduce la inmunogenicidad
de las NP en el cuerpo humano.

2.1.2. Dirigiéndose a celdas especificas

La modificación de la superficie de las NP con ligandos biológicos, tales como

folato, péptidos de arginina-glicina-aspartato (RGD), aptámeros,
transferinina, anticuerpos o pequeños fragmentos de anticuerpos, facilita la
identificación, la formación de imágenes y la internalización de NP en células
específicas, por ejemplo, células cancerosas y tejidos tumorales.

El folato es una molécula pequeña muy conocida que se usa con frecuencia
como ligando dirigido a células cancerígenas y que se une a receptores de
folato con alta afinidad. La conjugación química del folato en la superficie de
las NP puede promover significativamente su administración dirigida a
células cancerosas que sobre expresan los receptores de folato.

Los anticuerpos monoclonales IgG (mAbs) han sido las moléculas diana
preferidas para receptores, proteínas de membrana y glicoantígenos en la
superficie de las células cancerosas. Debido a que muchas células de cáncer
de mama sobre expresan el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico
humano (HER-2), las NP recubiertas con anticuerpos anti-HER-2 pueden
dirigirse a las células de cáncer de mama con alta especificidad. De forma
similar, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) puede ser
dirigido por anticuerpos anti-EGFR. A pesar de los inmensos esfuerzos
dirigidos hacia su desarrollo, las NP conjugadas con mAb todavía enfrentan
muchos desafíos y limitaciones, tales como la dificultad o el costo de
fabricación, la inmunogenicidad y la penetración en los tejidos tumorales, ya
que los mAbs son muy grandes y moléculas complejas.

2.1.3. Internalización en las células

La modificación de la superficie de las NP con péptidos que penetran en la

célula (CPP), como el péptido Tat, penetraína, pVEC, transportan, MPG,
Pep-1 y poliargininas, podrían facilitar la internalización de las NP en las
células a través de la entrada directa en el citosol o las vías endosómicas.
Estos CPP soportan principalmente una carga positiva neta y consisten en
secuencias de aminoácidos (AA) con unidades de AA básicas repetidas y AA
hidrófobos o aromáticos.

2.1.4. Escape endosomal

La capacidad de escape endosómico de las NP al citosol y a los orgánulos

dentro de la célula. Se han desarrollado agentes de escape endósomico
basados en péptidos, y estos se derivan de los dominios de péptidos
pequeños de varias fuentes virales, bacterianas y humanas. Por ejemplo, la
subunidad HA2 de Haemophilus influenzae. La proteína hemaglutinina (HA)
del virus de la gripe con una cadena corta de un péptido aniónico N-terminal
ha mostrado actividad fusógenica. A un pH bajo, la protonación del glutamato
(Glu) y el aspartato (Asp) provoca un cambio conformacional a este péptido
desde una espiral aleatoria en una estructura anfílica α-helicoidal. Este
cambio permite que el péptido anfílico α-helicoidal se una a la membrana
endosomal, causando la disrupción de la membrana. Un péptido GALA
sensible al pH con unidades repetidas de glutamato-alanina-leucina-alanina
(Glu-Ala-Leu-Ala) podría alterar la bicapa lipídica por el mismo mecanismo y
facilitar el escape endosomal de las NP modificadas con GALA a valores de
pH ácidos. Los péptido ricos en arginina (Arg) y los péptidos catiónicos,
también derivados de proteínas virales, podrían imitar las propiedades
disruptivas endosómicas de partículas virales.

2.1.5. Trafico a organelos específicos

En las células eucariotas, las proteínas se clasifican específicamente durante

o después de la traducción y se administran desde el citosol a los orgánulos
diana, como el núcleo, el retículo endoplasmático, los peroxisomas y la
mitocondrias. Estas proteínas contienen señales peptídicas dirigidas a
orgánulos que a menudo se encuentran en la extensión N-terminal y
consisten en un tramo corto cargado positivamente de AA básicos y una
prolongación α-helicoidal de AA hidrofóbicos y una base de datos de señales
de localización experimental de proteínas. Los sistemas de administración de
genes para la terapia génica del ADN cromosómico y mitocondrial se han
desarrollado conjugando químicamente los péptidos señalizadores nucleares
y mitocondriales con NPs que consisten en ADN terapéuticos. <

2.1.6. Controlar la liberación de la carga útil

En muchos casos, las NP en los endosomas o el citoplasma deben colapsar

para permitir la liberación de sus cargas útiles. Se han utilizado varias
estrategias que utilizan mitades que responden a estímulos integrados en NP
para mejorar la eficacia de la liberación controlada. Estos incluyen polímeros
sensibles al pH y termosensibles, que controlan las interacciones entre
cargas útiles y NPs, y reticuladores externos sensibles al estímulo, que
conjugan cargas útiles con NPs, como enlazadores lábiles al pH, ligandos
fotosensibles y enzimáticos.

La diferencia en los valores de pH existentes entre los tejidos sanos (pH 7.4)
y el entorno extracelular de los tumores sólidos (pH 6.5-6.8), así como entre
el citosol (pH 7.4) y los endosomas (pH 5.6), se ha utilizado ampliamente
para desencadenar la liberación de drogas en un órgano especifico o
compartimiento intracelular. Los polímero con grupos funcionales que
pueden alterar la estructura y la hidrofobicidad de las NP como resultado de
la protonación o deprotonación en respuesta a la variación del pH pueden
utilizarse en NP poliméricas sensibles al pH.

Los polímeros e hidrogeles sensibles a la temperatura exhiben una transición

de fase volumétrica a una temperatura determinada que provoca un cambio
drástico en el estado de hidratación. Esta transición de fase refleja
propiedades competitivas de enlace de hidrogeno, donde el enlace de
hidrogeno intra e intermolecular de las moléculas de polímero es favorable
en comparación con la solubilización de los polímeros por el agua.

En el caso de los conjugados polímero-fármaco, los enlaces sensibles al pH,

como la oxima (pH <5) y la hidrazona (pH <5), la hidrazida (pH <5) y el acetal
(pH <4.5), se han utilizado para directamente unir moléculas de drogas a
polímeros. El uso de la luz como un estimulo para desencadenar la liberación
del fármaco se ha explorado activamente debido a su alta resolución espacio
temporal. La fotosensibilidad a menudo se introduce a NP a través de grupos
funcionales que pueden cambiar sus conformaciones y estructuras o romper
sus enlaces químicos.

2.1.7. Avances recientes en la entrega dirigida de medicamentos y

bioimagen

Un desafío importante de la administración dirigida de fármacos y bioimagen

en terapéutica y diagnóstico es la fabricación de NP modificadas con diversas
biomoléculas funcionales para superar las barreras biológicas mencionadas
anteriormente con un sistema de liberación de carga activado. Las micelas
plurónicas basadas en polímeros, a las que el acido fólico (FA), los grupos
tiol sensibles a redox y el fármaco anticanceroso doxorrubicina (DOX) se
conjugan químicamente con ligadores sensibles al pH, podrían administrarse
con éxito en tumores multirresistentes (MDR) en ratones y que ejercen una
alta citotoxicidad en los tumores MDR resistentes a DOX al eludir el eflujo de
MDR. El nanotransportador basado en óxido de grafeno carboxilado (GO) fue
multifuncionalizado por polietilenglicol (PEG) terminado con un grupo amino
y un grupo FA (FA-PEG-NH2) a través de la reacción de amidación. El
nanotransportador basado en GO podría adsorber grandes cantidades de
DOX en la superficie GO mediante interacciones de apilamiento π–π a un pH
neutro, pero liberarlo a un pH ácido. El nanovehículo basado en GO
modificado con FA-PRG cargado con DOX no solo mostro dispersibilidad
estable y capacidad de direccionamiento a células cancerosas con altos
niveles de expresión del receptor de FA, sino que también exhibió la
liberación controlada de DOX de bajo pH activado en los endosomas de
células.
2.2. Nanobiomateriales para biosensores y bioanálisis

La biodetección y el bioanálisis basados en nanomateriales nuevos y

nanotecnología en las áreas de nanoelectrónica, nanoóptica, nano patrones
y nano fabricación tienen una amplia gama de aplicaciones prometedoras en
diagnósticos en el punto de atención, diagnóstico temprano de
enfermedades, pruebas patológicas, pruebas de alimentos, monitoreo
ambiental, descubrimiento de fármacos, genómica y proteómica. Además de
ayudar a la fabricación de equipos como: colorimétrico, fluorescente,
electroquímico, dispersión Raman de superficie mejorada, resonancia de
plasmón de superficie localizada, micro balanza de cristal de cuarzo y
resonancia magnética (MRI), incluidos dispositivos implantables para la
detección de una amplia gama de biomarcadores con sensibilidad y
selectividad ultra alta y respuestas rápidas.

2.2.1. Nanomateriales para mejorar la sensibilidad de la biodetección y

bioanálisis

Durante la última década, varios nanomateriales prometedores (por ejemplo,

QD, NP, nanotubos de carbono (CNT) y grafeno) con superficies modificadas
con biomoléculas han sido ampliamente utilizado en los campos de
biodetección, bioanálisis y diagnóstico. Electrodos CNT modificados
mejoraron las densidades de corriente y mejoraron la reactividad de
biomoléculas, cofactores redox y enzimas redox. Además, los bosques CNT
alineados facilitaron la transferencia directa de electrones con los centros
redox de enzimas, lo que resulta en un mejor rendimiento general de
electrodos enzimáticos e inmunosensores etiquetados con enzimas. Varios
nanomateriales han mostrado una gran promesa en imágenes debido a sus
características de imagen intrínseca, como su brillo, ancho de banda agudo
y largo plazo estabilidad (por ejemplo, agentes fluorescentes, tales como
QDs, magnéticos NPs en MRI y AuNPs coloidales).

2.2.2. Tecnologías de nanofabricación para biodetección y bioanálisis

Microarrays y plataformas microfluídicas junto con nanomateriales

conjugados con biomoléculas han permitido la detección simultánea múltiple
de muchos biomarcadores de enfermedades para cáncer, enfermedades
infecciosas, diabetes, enfermedades cardiovasculares y la enfermedad de
Alzheimer. Estas plataformas exploraron la detección de ultrabajo
concentraciones de biomarcadores diana y se han realizado bioensayos
rápidos, ultrasensibles y rentables que requieren volúmenes de muestra
mínimos, que permitirán a los médicos de atención primaria y a los pacientes
realizar ensayos en sus respectivas configuraciones, utilizando los llamados
diagnósticos de los puntos de atención. La detección de biomarcadores de
cáncer mediante inmunoensayos y sensores que usan estos nanomateriales
diseñados también podría permitir el diagnóstico de cáncer en etapas muy
tempranas. La bionanofabricación, el uso de materiales biológicos y
mecanismos para la construcción de nanodispositivos para biodetección y
bioanálisis, ofrece enfoques convergentes para construir nanointerfaces
entre biomoléculas y dispositivos mediante ensamblaje enzimático o
autoensamblaje «. A través de la tecnología recombinante, la ingeniería
biomolecular permite que las proteínas diana estén dotadas de etiquetas
peptídicas para el ensamblaje, que permite la fabricación y controla la
bioconjugación química a través del reconocimiento molecular para la
generación enzimática de enlaces covalentes. Estos métodos de
autoensamblaje y ensamblaje enzimático también proporcionan mecanismos
para la construcción en una jerarquía de escalas de longitud. La
bionanofabricación permitirá la interacción eficaz de biomoléculas con
nanomateriales para crear dispositivos implantables.

2.3. Nanobiomateriales para biocatálisis

La inmovilización o el atrapamiento de enzimas en la superficie o el interior

de nanovehículos se ha logrado utilizando varios nanomateriales, como NP
de polímero (por ejemplo, ácido poliláctico, poliestireno, alcohol polivinílico y
quitosano), NPs magnéticas y superparamagnéticas, nanofibras de polímero
(por ejemplo, nylon, poliuretano, policarbonato, alcohol polivinílico, ácido
poliláctico, poliestireno y carbono), CNT, nanoláminas GO, NP de sílice
porosa, NP sol-gel y NP virales.

2.3.1. Inmovilización de la enzima

Hay muchas ventajas de inmovilizar eficazmente enzimas para modificar la

superficie de los nanomateriales e injertar grupos funcionales deseables en
su superficie a través de técnicas de funcionalización química. Sin embargo,
en algunos casos, las enzimas dramáticamente pierden sus actividades
debido a que muchos enfoques convencionales de inmovilización enzimática,
que dependen de la absorción inespecífica de enzimas a soportes sólidos o
el acoplamiento químico de grupos reactivos dentro de enzimas, tienen
dificultades inherentes, como desnaturalización proteica, poca estabilidad
debido a la absorción inespecífica, variaciones en la distancias espaciales
entre las enzimas y entre las enzimas y la superficie, disminuye la flexibilidad
conformacional de las enzimas y la incapacidad para controlar la enzima
orientación. Un enfoque se conoce como 'nanopartículas de enzima única',
en las que un polímero híbrido orgánico-inorgánico red menos de unos pocos
nanómetros de espesor es construido desde la superficie de una enzima. La
síntesis de SEN implica tres reacciones: primero, grupos amino en la
superficie de la enzima reacciona con el cloruro de acriloilo para producir
grupos de vinilo superficiales; luego, los radicales libres inician el vinilo
polimerización de la superficie de la enzima usando un vinilo grupos trimetoxi-
silano monoméricos y colgantes; finalmente, La polimerización ortogonal
ocurre a través de la condensación de silanol reacciones para reticular las
cadenas de polímero adjuntas en una red. Se han informado varios métodos
basados en este enfoque, como la modificación superficial de soportes
sólidos con polímeros sintéticos hidrófilos y péptidos con especificidades y
afinidades hacia enzimas, y la fusión de enzimas con etiquetas de péptidos.
Mediante el uso de estos péptidos, las enzimas pueden ser directamente
inmovilizado sobre una superficie de sustrato con orientaciones deseadas y
sin la necesidad de modificar la superficie del sustrato o procesos de
conjugación complicados. Una proteína de fusión entre la proteína S-capa
SBPA de CCM Bacillus sphaericus 2177 y la laminarinasa enzima a partir de
Pyrococcus furiosus retenido completamente la capacidad de auto-
ensamblaje de la fracción S-capa, y el dominio catalítico de lama se expuso
en la exterior superficie de la red de proteínas formada.

2.3.2. Sistemas complejos multienzimáticos

En la naturaleza, la organización macromolecular de los complejos

multienzimáticos tiene implicaciones importantes para la especificidad,
controlabilidad y rendimiento de las cascadas de reacciones bioquímicas de
varios pasos. Se ha demostrado que esta organización macromolecular a
escala nanométrica aumenta las concentraciones locales de enzimas y sus
sustratos, para mejorar la canalización intermedia entre enzimas
consecutivas y para evitar la competencia con otros metabolitos
intracelulares. Sin embargo, los métodos de inmovilización antes
mencionados para un tipo de enzima en nanomateriales no siempre se
pueden aplicar a sistemas multienzimáticos de manera directa porque es muy
difícil controlar la colocación espacial precisa y la relación molecular de cada
componente de un sistema multienzimático usando estos métodos.
Alternativamente, la canalización del sustrato en tales complejos
multienzimáticos como los metabolitos, incluidos la glucólisis, los ciclos de
Calvin y Krebs, el triptófano sintasa, la carbamoil fosfato sintetasa y la
síntesis de durrina, se utiliza para evitar la pérdida de intermedios de baja
abundancia, para proteger a los intermediarios inestables de la interacción
con solventes y para aumentar la concentración efectiva de reactivos. Desde
un punto de vista práctico, existen varios obstáculos para la fusión genética
de más de tres enzimas para construir complejos multienzimáticos. Por
último, aún no se han desarrollado métodos de diseño racionales para los
enlazadores peptídicos entre enzimas que permitan el control o la disposición
espacial y la orientación del enlazador. Por lo tanto, los métodos flexibles
postraduccionales que utilizan la conjugación enzimática de proteínas y
proteínas en sitios específicos y los andamios sintéticos empleando dominios
de interacción ortogonal para el ensamblaje han sido particularmente
atractivos debido a la naturaleza modular del diseño biomolecular.

2.3.2.1. Complejos multienzimáticos basados en la modificación

enzimática postraduccional

Por lo tanto, las modificaciones enzimáticas in vitro e in vivo se han

desarrollado para la conjugación proteína-proteína específica del sitio. Sin
embargo, el ensamblaje de proteínas usando modificaciones enzimáticas es
un método prometedor porque se consigue simplemente mezclando
proteínas sin técnicas especiales. Recientemente, demostramos un complejo
multienzimático condensado covalentemente con una «estructura
ramificada» que usa transglutaminasa microbiana de Streptomyces
mobaraensis, que cataliza la formación de un enlace isopéptido - lisina entre
las cadenas laterales de los residuos Gln y Lys. Por lo tanto, se ha sugerido
que la formación compleja de P450cam con PdX y PdR puede mejorar la
transferencia de electrones de PdR a PdX y de PdX a P450cam.

Este complejo multienzimático único con una estructura ramificada que

nunca se ha obtenido por fusión genética mostró una actividad mucho más
alta que la de la fusión lineal en tándem P450cam genéticamente fusionada
con PdX y PdR. Cuando la solubilidad del sustrato es bastante baja en una
solución acuosa, el sistema de micelas inversas a menudo se adopta para
reacciones enzimáticas simples, porque el sustrato se puede solubilizar a
una alta concentración en un disolvente orgánico, acelerando posteriormente
la velocidad de reacción. En el caso de un sistema multienzimático,
especialmente sistemas que incluyen procesos de transferencia de
electrones, como el sistema P450cam, el sistema de micelas inversas es
difícil de aplicar porque cada componente generalmente se distribuye en
diferentes micelas y porque la incorporación de todos los componentes en el
mismo conjunto acuoso de micelas es muy difícil.
2.3.2.2. Complejos multienzimáticos basados en proteínas de andamio

Recientemente, varios sistemas multienzimáticos se han desarrollado

utilizando proteínas andamio naturales y andamios sintéticos compuestos de
elementos de proteínas andamio naturales, como celulosomas y andamio de
transducción de señales. El antígeno nuclear de células proliferativas es una
abrazadera deslizante de ADN que forma una estructura simétrica en forma
de anillo que rodea el ADN bicatenario y actúa como un andamio para las
enzimas relacionadas con el ADN, tales como ADN polimerasa y helicasa.
Estos tres PCNA se fusionaron con las tres proteínas componentes (PdR,
PdX y P450cam) que componen el sistema Pseudomonas.putida P450.
Comparado con una mezcla equimolar de PdR, PdX y P450cam, el complejo
mostró una mejora de 52 veces en la actividad monooxigenasa de P450cam
debido a la transferencia de electrones eficiente dentro del complejo de PdR
a PdX y de PdX a P450cam.

Este sistema basado en el andamio PCNA se amplió aún más a un sistema

P450cam autosuficiente impulsado por fosfito in vitro mediante la
incorporación de fosfito deshidrogenasa para la regeneración de cofactor
NADH. El valor Te Km de PUPPET incorporado PTDH para NAD + en
presencia de d-alcanfor y fosfito fue ligeramente menor que el de una mezcla
equimolar de PUPPET y PTDH. Se han reportado celulosomas de diseñador
que contienen cuatro enzimas diferentes de Ter mobifda fusca, donde se
incorporaron cuatro enzimas celulolíticas fusionadas con dockerin en
ubicaciones específicas en un esqueleto quimérico artificial que contiene
cuatro cohesinas correspondientes a cada dockerina. Como era de esperar,
en comparación con su sistema de mezcla enzimática libre sin el andamio
quimérico, los complejos multienzimáticos resultantes mostraron una
actividad mejorada en la paja de trigo como sustrato celulósico complejo. Se
desarrollaron pliegues de proteínas con diversas disposiciones de dominios
de fusión a partir de los dominios de interacción de las proteínas de
señalización, los dominios SH3 y PDZ de ratón y la unión a proteína GTPasa
de rata.

2.3.2.3. Combinaciones de multienzimas basadas en el andamiaje de

oligonucleótidos

Los conjugados ADN-proteína son necesarios para lograr un ensamblaje de

proteína dirigida por ADN para la fabricación de complejos multienzimáticos
en los pliegues de ADN. Actualmente, existen varias metodologías para
conjugar proteínas con ADN. Las proteínas se han ensamblado en los
pliegues de ADN a través de moléculas adaptadoras intermedias, tales como
 biotina-estreptavidina, Ni-NTA-hexahistidina, anticuerpos-haptenos y
aptámeros. Alternativamente, la conjugación covalente directa con ADN se
puede lograr modificando residuos de cisteína o Lys mediante acoplamiento
de disulfuro o maleimida, así como mediante química bioortogonal, tal como
ligamiento de proteínas expresado, ligación de Staudinger y ciclo adición de
Huisgen.
Mediante la utilización de nanoestructuras de ADN como andamio de
ensamblaje, se ha hecho posible organizar el ensamblaje dirigido por ADN
de complejos multienzimáticos artificiales. El ensamblaje mediado por ADN
se empleó para controlar la actividad de una enzima multidominio. El
citocromo P450 BM3 está compuesto por dos dominios, un dinucleótido de
adenina de favin y un dominio de reductasa que contiene mono nucleótido
de favin y un dominio monooxigenasa que contiene hemo (BMP). Ambos
subdominios se fusionaron genéticamente a la proteína HaloTag, una enzima
de auto etiquetado, que permite la bioconjugación con ADN modificados con
cloroalcano y posteriormente reconstituir la actividad de BM3 mediante
ensamblaje mediado por ADN.

La disposición de los dos dominios en un andamio de ADN puede controlar

la distancia entre ellos. Las nanoestructuras 2D de ADN ofrecen una
oportunidad aún mayor para organizar sistemas multienzimáticos en
patrones geométricos más complicados. Los ácidos nucleicos tiolados se
unieron covalentemente a glucosa oxidasa y peroxidasa de rábano picante
usando N - como reticulante bifuncional. Las enzimas complementarias
conjugadas con ADN organizadas en las tiras de dos hexágonos mostraron
una actividad 1.2 veces mayor que las tiras de cuatro hexágonos. Con
distancias más cortas, la difusión intermedia fue más eficiente, lo que resultó
en una mayor eficiencia de reacción en cascada. Sin embargo, la cascada
de la enzima no se activó en ausencia de los pliegues del ADN o en presencia
de ADN extraño. Estas observaciones indican que la disposición espacial a
escala nanométrica usando una nanoestructura 2D que comprende un
dúplex de ADN rígido podría controlar el flujo de un intermedio de una enzima
primaria a una enzima secundaria y que el control de flujo dominó la
velocidad de reacción en cascada multienzimática.

3. INGENIERÍA BIOMOLECULAR PARA NANOBIO / BIONANOTECNOLOGÍA

La ingeniería biomolecular se encarga de la manipulación (estructuras, funciones y

propiedades) de biomoléculas siendo estas los componentes básicos de los
sistemas biológicos, algunas funciones destacadas de las biomoléculas son el
reconocimiento molecular, la unión molecular, el autoensamblaje, la catálisis, el
transporte molecular, la transducción de señales, la transferencia de energía, la
transferencia de electrones y la luminiscencia. Dado que cada biomolécula es
diferente, hay una serie de tecnologías utilizadas para manipular cada una
individualmente.

3.1. Ingeniería de ácido nucleico

La ingeniería de ácidos nucleicos se basa en las características de

emparejamiento de bases y autoensamblaje de los ácidos nucleicos es clave
para las nanotecnologías de ADN / ARN, como las que implican origami de
ADN/ARN, aptámeros y ribozimas.

3.1.1. Origami de ADN / ARN

Es un nuevo sistema de ensamblaje de ácido nucleico programado utiliza la

especificidad del emparejamiento de bases Watson-Crick para la construcción
de nanoestructuras mediante interacciones intermoleculares de cadenas de
ADN / ARN. el método simple de origami 2D de ADN de un recipiente llamado
"origami de ADN escamado", que implica el plegamiento de una larga cadena
única de ADN viral en un espacio anular de ADN de una forma deseada, en
cambio Las estructuras 3D de origami de ADN se pueden diseñar extendiendo
el sistema de origami 2D de ADN.
Debido a que las propiedades de plegamiento del ARN y el ADN no son
exactamente las mismas, el ensamblaje del ARN generalmente se desarrolló
bajo una perspectiva ligeramente diferente debido a las interacciones
secundarias en una cadena de ARN. Por esta razón, la tectónica de ARN basada
en interacciones terciarias se han introducido para el autoensamblaje de ARN.
En particular, las interacciones horquilla-horquilla u horquilla-receptor se han
usado ampliamente para construir estructuras de ARN. Sin embargo, los
principios fundamentales del origami de ADN son aplicables al origami de ARN.
Una de las características más importantes del origami de ADN / ARN es que
cada posición individual de la estructura 2D contiene información de secuencia
diferente. Esto significa que
las moléculas y partículas funcionales que están unidas a las hebras de grapas
se pueden colocar en las posiciones deseadas en la estructura 2D.
3.1.2. Aptámeros

Los aptámeros son ácidos nucleicos monocatenarios (ARN, ADN y ARN o ADN
modificados) que se unen a sus objetivos con alta selectividad y afinidad debido
a su forma tridimensional. El procedimiento general de selección in vitro para un
aptámero es el siguiente: se prepara un conjunto de ADN sintético por síntesis
química. Los ADN consisten en una región de secuencia aleatoria o
mutagenizada fusionada en cada extremo mediante una secuencia constante y
con un promotor de ARN polimerasa de T7 en el extremo 5 '.
Este ADN se amplifica por unos pocos ciclos de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y posteriormente se transcribe in vitro para hacer que el ARN
se acumule. Luego, las moléculas de ARN se seleccionan en función de su
afinidad de unión a la molécula diana.

3.1.3. Ribozimas

Las ribozimas naturales son moléculas de ARN que tienen actividad enzimática
para escindir enlaces fosfodiéster. Por lo tanto, las ribozimas tienen un gran
potencial para su uso en el cáncer, enfermedad genética, y la terapéutica viral al
inhibir específicamente la expresión génica mediante la escisión de sustratos de
ARN, tales como ARNm, con el genoma viral de RNA que contiene una
secuencia complementaria al centro catalítico de las ribozimas.
Las ribozimas naturales se unen a los ARN del sustrato a través del
emparejamiento de bases Watson-Crick, que ofrece la escisión específica de la
secuencia de los ARN del sustrato. Las ribozimas artificiales con propiedades
catalíticas se han aislado por selección in vitro a partir de bibliotecas de ácidos
nucleicos aleatorias o combinatorias

3.2. Ingeniería genética

La ingeniería genética es una herramienta poderosa para crear genes artificiales

para proteínas y enzimas con propiedades deseadas, mejoradas y múltiples,
esta tecnología se ha empleado para desarrollar genes in vitro a través de un
proceso iterativo que consiste en la generación recombinante. Esta tecnología
incluye tecnologías para la manipulación directa de genes, tales como la
mutagénesis génica, la amplificación de la secuencia de ADN [por ejemplo, PCR
y amplificación de círculo rodante (RCA)], shuffling de ADN y fusión génica.
3.2.1. Mutagénesis aleatoria

Con la mutagénesis aleatoria, las mutaciones puntuales se introducen en

posiciones aleatorias en un gen de interés, típicamente a través de mutagénesis
por PCR propensa a errores, en la que MnCl2 se agrega a la mezcla de reacción
para causar una reducción en la fidelidad de la amplificación de ADN. El método
de PCR modificado propenso a error modificado, que logra frecuencias más altas
de sustituciones de bases y mutaciones de transición y transversión, se
desarrolló utilizando mezclas de derivados de trifosfato de análogos de
nucleósidos.

3.2.2. Mutagénesis dirigida al sitio

La mutagénesis dirigida al sitio es un método para alterar una secuencia génica

en una ubicación seleccionada mediante el uso de una PCR de extensión
solapada. Mutaciones, inserciones o deleciones puntuales se introducen
incorporando cebadores de ADN que contienen la modificación deseada con una
ADN polimerasa en una reacción de amplificación.

3.2.3. DNA Shuffling

Es un método para la recombinación in vitro de genes homólogos para generar

rápidamente una gran biblioteca de genes de progenie quiméricos que
incorporan
fragmentos de secuencia de varios genes originales mediante fragmentación
aleatoria a través de DNasa I y extensión de PCR sin cebadores para el
reensamblaje; este proceso es seguido por la amplificación por PCR con
cebadores para generar quimeras de longitud completa adecuadas para la
clonación en un vector de expresión.

 Desventaja: este método de shuffling de ADN es la baja frecuencia de

genes quiméricos en la biblioteca shuffled, lo que puede deberse a la
formación homodúplex de fragmentos de ADN derivados de los mismos
genes parentales en el paso de recocido, cuya probabilidad es mucho
mayor que la de la formación de heterodúplex.

 Ventaja de estos métodos es que no se requiere conocimiento sobre la

estructura de proteínas detallada.
3.2.4. Fusión génica

Los genes de fusión se crean fusionando genéticamente los marcos de

lectura abiertos de dos o más genes en el marco mediante la ligación o la
PCR de extensión de solapamiento. Para construir tal
genes de fusión, dos tipos de conexión son posibles. Una de ellas es la
fusión "de extremo a extremo", en la cual el extremo 5 'de un gen está ligado
al extremo 3' del otro gen. El segundo es la fusión insercional, en la que un
gen se inserta en el marco en el medio del otro gen parental.

3.3. Ingeniería de proteínas

En el campo de la ingeniería de proteínas desempeña un gran papel en la

investigación de la biología, biotecnología y eventualmente en la
biotecnología para diseñar bloques de construcción de proteínas, en este
campo existen dos estrategias, el diseño racional y la evolución dirigida.

3.3.1. Diseño racional de proteínas

Como su nombre lo indica, es el conocimiento detallado de la estructura de

una proteína utilizada para realizar cambios en la misma, en otras palabras,
se encarga de modelar (crear) proteínas mejoradas de manera práctica,
teniendo como principal desventaja que la proteína esté disponible, otro
método racional es el diseño de proteínas computacionales, que se encarga
de diseñar nuevas proteínas con una estructura plegable con función o
comportamiento novedoso, En este enfoque, las proteínas pueden diseñarse
mediante la fijación trascendental de secuencias de AA compatibles con
plantillas existentes o postuladas.
Los enfoques de diseño de proteínas racionales hacen predicciones de
secuencias de proteína AA que se pliegan en estructuras 3D específicas.
Posteriormente, estas secuencias predichas deberían validarse
experimentalmente a través de la síntesis química de un gen artificial,
seguido de la expresión y purificación de proteínas.

3.3.2. Evolución dirigida (Ingeniería de proteínas basada en la selección

o selección de bibliotecas de alto rendimiento)

El enfoque de evolución dirigida involucra muchas tecnologías, como la

diversificación de bibliotecas de genes, tecnologías de vinculación genotipo-
fenotipo, etc., Este enfoque imita el proceso de selección natural (evolución
darwiniana) para evolucionar hacia un objetivo.
Implica someter un gen a rondas iterativas de mutagénesis, selección y
amplificación o in vitro. La diversidad molecular se crea típicamente por
diversos métodos mutagénicos aleatorios y / o recombinación génica in vitro.
El éxito de la evolución dirigida depende de las elecciones de ambos métodos
de generación de diversidad y HTS, La tecnología clave de HTS (métodos de
selección en la vinculación del genotipo) y el fenotipo.
Las tecnologías de enlace edad-genotipo-fenotipo se pueden dividir en
tecnologías de visualización in vivo e in vitro:

 In vivo, incluye la visualización de fagos y la visualización de

baculovirus, en la que un gen de proteína designado para la evolución
se fusiona con un gen de proteína de cubierta y se expresa como una
proteína de fusión en la superficie del fago y partículas de virus.

 En cambio, las tecnologías de visualización in vitro se basan en

sistemas CFPS (Síntesis de proteínas sin células). La tecnología de
visualización de ARN incluye visualización de ARNm y visualización
de ribosomas. Dichas tecnologías de visualización que usan
reacciones de traducción in vitro pueden detectar proteínas que serían
es tóxico para las células y puede abarcar bibliotecas bastante
grandes al eludir el cuello de botella de tamaño restringido de las
tecnologías de visualización in vivo.

Existen varias tecnologías de visualización de ADN in vitro, como CIS display,

M. Hae III display, STABLE display, microbead display y compartimentación
in vitro (IVC).
CIS muestra de forma no covalente la proteína de fusión RepA (proteína de
unión al ADN) y su plantilla de ADN de codificación a través de la interacción
entre RepA y el elemento CIS del molde de ADN. Para la presentación de M.
Hae III, la DNA metiltransferasa. M. Hae III une covalentemente una proteína
y su plantilla de ADN. La tecnología IVC utiliza las gotas acuosas en
emulsiones de agua y aceite para dividir en compartimentos los genes
individuales y los productos genéticos. La visualización estable y las
tecnologías de visualización de micro perlas utilizan unión no covalente de
biotina-estreptavidina para unir las plantillas de ADN marcadas con biotina y
las proteínas fusionadas con estreptavidina.

3.4. Tecnologías de conjugación química y enzimática

En la era postgenómica actual, muchos estudios requieren proteínas

químicamente modificadas o bioconjugados de proteínas que son imposibles
de preparar a través de la síntesis ribosómica estándar. Actualmente se han
desarrollado tecnologías de conjugación para modificar de manera específica
proteínas con diversas funciones naturales y no naturales.
Estas tecnologías van desde tecnologías de bio conjugación químicas
clásicas dirigidas a AA naturales hasta enfoques más sofisticados, como la
incorporación antinatural de AA (UAA) basada en la supresión del codón de
parada ámbar, conjugaciones químicas bioortogonales, ligaciones químicas
de proteínas y conjugaciones enzimáticas.

3.4.1. Tecnologías de conjugación química dirigidas a AA naturales

Las tecnologías estándar de conjugación química para proteínas se dirigen

a las cadenas laterales de AA naturales, como los grupos amino primarios
del residuo Lys y el N-terminal, los grupos ácido carboxílico.
Lys es uno de los residuos de AA más comunes en proteínas con una
abundancia promedio de aproximadamente 6% y a menudo está expuesto a
la superficie debido a su hidrofilicidad.
Por otro lado, el extremo N proporciona una ubicación más selectiva del sitio,
pero no siempre está expuesta a la superficie, el N-terminal puede
seleccionarse selectivamente para la modificación cuando es
suficientemente accesible y no está modificado postraduccionalmente.
También se han desarrollado métodos para la conjugación de Tyr, que tiene
una abundancia promedio de proteínas del 3%. En presencia de fuertes
agentes oxidantes (por ejemplo, H2O2) y catalizadores apropiados, la
cadena lateral fenólica del residuo de Tyr puede reticularse con otros
compuestos fenólicos.
Los métodos convencionales para la conjugación de Trp, que tiene una
abundancia promedio de aproximadamente 1%, requieren metales pesados
tóxicos o condiciones bioquímicamente incompatibles. Algunos de estos
métodos también muestran reactividad cruzada con otros AA
(particularmente Tyr), lo que limita el rango de aplicaciones.

3.4.2. Tecnologías de conjugación química dirigidas a los UAA

La incorporación de los UAA en las proteínas permite una mayor flexibilidad

en las modificaciones de las proteínas. A diferencia de los residuos AA
naturales, estos UAA pueden contener restos reactivos completamente
únicos, como los grupos azida, ciano, yodo, bromo, boc y dansilo, y por lo
tanto una reactividad completamente bioortogonal que puede ocurrir dentro
de los sistemas vivos sin interferir con los procesos bioquímicos nativos.
La incorporación de múltiples UAAs diferentes se ha logrado mediante la
extensión de pares codón-anticodón usando un codón de cuatro bases
diferente para cada ARNt.

3.4.3. Tecnologías de conjugación química bioortogonales

Las proteínas o péptidos incorporados en UAA pueden conjugarse

quimioselectivamente con otras biomoléculas y materiales inorgánicos /
orgánicos sintéticos que llevan grupos funcionales bioortogonales. Otras
biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, lípidos y materiales inorgánicos /
orgánicos sintéticos modificados con grupos funcionales bioortogonales,
también pueden someterse quimioselectivamente a una reacción de
bioconjugación.
La reacción debe ocurrir en una solución acuosa a pH casi fisiológico, tener
una cinética rápida incluso con concentraciones submilimolares de reactivos,
y ocurrir a temperaturas fisiológicas.

3.4.3.1. Reacciones de conjugación a través de aldehídos

Pueden reaccionar específicamente con nucleófilos α-efectos fuertes, como
hidrazidas y alcoxiaminas en condiciones acidas para producir hidrazonas y
oximas estables.

3.4.3.2. Reacciones de conjugación a través del grupo azida

El grupo azida son verdaderamente ortogonales en su reactividad a la mayor
parte de la funcionalidad biológica. La cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen de
alquinos y azidas se ha adoptado ampliamente, ya que esta reacción es
selectiva y de alto rendimiento cuando se cataliza con Cu para derivados de
propileno quelatados con Cu o mediante la liberación de cepas de ciclo-
derivados de heptina.

3.4.4. Tecnologías de ligadura química

Por ser simple, general y por su gran campo de eficiencia la ligadura química
nativa (NCL sus siglas en inglés) se ha vuelto el método más usado para la
conjugación de proteínas-péptidos, proteína-proteína, proteína-ADN, etc. Es
una reacción de acoplamiento quimicoselectiva que genera enlaces
peptídicos por la transtioesterificación reversible y un cambio acilo N-S
irreversible.
Ligadura de proteína expresada (EPL) y proteínas transsplicing (PTS) son
ambas tecnologías de conjugación químicas intein-based, que permite el
ensamble de una proteína de sintético pequeño o un polipéptido
desprotegido recombinante. Un intein es una proteína de dominio interno que
puede extirpar auto catalíticamente de una proteína precursora. La EPL, la
ligadura es un proceso químico que se lleva a cabo mediante un amplio rango
de reacciones para introducir una variedad de materiales funcionales, pero al
contrario de la PTS, la ligadura se lleva a cabo mediante condiciones
compatibles con proteínas plegables.
Los avances en NCL, PTS y EPL han hecho posible la introducción precisa
de una variedad de material funcional en los péptidos y proteínas, aun así,
tienen unos inconvenientes.

3.4.5. Tecnología de conjugación enzimática

En la naturaleza muchas proteínas son post-traduccionalmente modificadas

por enzimas y juegan un papel importante en el control de los procesos
celulares. Las enzimas participan en modificaciones post-traduccional
catalizando la adicción covalente de algunos grupos funcionales en las
terminaciones N- o C- y en residuos de AA en sitios específicos en proteínas
y pueden catalizar la ligadura de columnas peptídicas en proteínas.
La aplicación de conjugación enzimática y modificación de proteínas con
otras biomoléculas y material sintéticos están limitadas a proteínas
recombinantes que albergan proteínas/péptidos adicionales. La
funcionalización de proteínas usando el método de conjugación enzimática
es prometedor ya que solo se logra mezclando proteínas sin ninguna técnica
en especial.

3.4.5.1. FGE
La FGE oxida residuos de Cys o Ser en formilgliciina (FGly) dentro de una
secuencia de consensos 13-AA conservada encontrada en un procariota tipo
1 sulfatasa. La modificación se piensa que ocurre cotraduccionalmente,
antes del plegamiento de la proteína.

3.4.5.2. PFTasa
Es una enzima α/β heterodimera que cataliza la transferencia de un grupo
farnesyl isoprenoide desde un farnesyl pirofosfato atraves de un enlace
tioeter a un átomo de azufre en una secuencia tetrapetídica en Cys.

3.4.5.3. NMTasa
De la Candida albicans cataliza la transferencia de acilo del ácido mirístico
desde myristoyl-CoA hacia el grupo amino de una glicina N-terminal, residuos
de una proteína para formar enlaces amidas.
3.4.5.4. BirA
De la E. Coli, cataliza el ATP dependiente de la formación de enlace amidas
entre el grupo carboxilo de la biotina y el grupo ε-animo de Lys en una
secuencia peptídica aceptora.
3.4.5.5. LAL: de la E. Coli cataliza ATP-dependiente de la formación de
enlaces amidas entre el grupo carboxílico de los ácidos lipídicos y el grupo ε-
animo de una lisina en una secuencia aceptora de reconocimiento 13-AA
optimizada

3.4.5.6. MTGasa
La transglutaminasa es una enzima única que cataliza la reacción de
transferencia de acilo entre el grupo γ-carboxiamida de un residio de Gln en
proteínas y una amplia variedad de aminas primarias no ramificadas,
comúnmente el grupo ε-animo de residuos de Lys, y forma un enlace
isopeptídico entre un lado de la cadena de residuos de Gln y una amina
primaria.

3.4.5.7. SrtA
Son células transpeptidasas de housekeeping envelope-bound de bacterias
gram positivas, SrtA acopladas a la superficie proteínas como los factores
virulentos. SrtA reconoce la secuencia de péptidos y cataliza la división del
enlace amida entre el Thr y residuos de Gly por medio de activación de sitios
de residuos Cys.

3.4.5.8. GST
Cataliza la reacción de conjugación entre los residuos Cys de glutatión y
varios electrófilos y permite a la célula desintoxicar xenobióticos in vivo.

3.4.5.8. SpyLigase
Es una ligasa artificial obtenida por ingeniería de un dominio de la fibronectina
adhesiva de la proteína FbaB del Streptococcus pyogenes (Spy) que es
esencial para la bacteria para invadir las células humanas.

3.4.6. Tecnología de conjugación quimioenzimatica basado en

proteínas self-labeling

El método chemoenzymatic labeling explota el mecanismo de

reconocimiento molecular entre sustrato/inhibidor y enzima para crear un
nuevo enlace covalente especifico entre ellos.
3.4.6.1. SNAP-tag
Derivado de la proteína reparadora de ADN humano O6-alkylguanine-DNA
alkyl-transferase (AGT). El labeling mediado por SNAP-Tag de proteínas en
bacterias y levaduras es especifico, desde que AGT endógeno respectivo no
acepta O6-benzylguanine (BG) como sustrato.

3.4.6.2. CLIP-tag
Basado en un AGT mutado CLIP-tag, que reacciona específicamente con
O2-benzylcytosine (BC) derivados, fue desarrollado por evolución directa.
Para generar la mutación del AGT, residuos de AA en posición con
proximidad indirecta a enlaces BG en los sitios activados que fueron
escogidos con la ayuda de una estructura cristalina de Wild-type AGT.

3.4.6.3. HaloTag
Rhodococcus haloalcano deshalogenasa remueve haluros de hidrocarburos
alifáticos por un mecanismo de desplazamiento nucleofílico. Un enlace éster
covalente es formado durante la catálisis entre un residuo Asp106 en la
enzima y el sustrato hidrocarburo.

3.4.6.4. Trimetoprim (TMP)-tag

Fue un derivado de la E. Coli dihidrofolato reductasa (eDHFR) que se une
con gran afinidad y selectividad al inhibidor de moléculas pequeñas TMP. El
TMP-tag de primera generación aprovecha la interacción de alta afinidad
entre eDHFR y TMP para formar una unión de larga duración, pero reversible
sin formación de enlace covalente.