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Rio, 09/ 07/ 2018

AÇÃO ENZIMÁTICA – INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO

1) Objetivos

- Verificar a influência da concentração do substrato sobre a velocidade de uma reação


enzimática;
- Calcular graficamente Km e Vmáx.

2) Materiais e Equipamentos

- Eppendorf;
- Estante para Eppendorf;
- Béquer (2 de 10mL, 1 de 50mL e 1 de 100mL);
- Pipetas (1000µL e 200µL);
- Tubos de Ensaio;
- Estante para tubos de ensaio;
- Erlenmeyer (10mL e 25ml);
- Banho-maria;
- Espectofotômetro Sp-33 (biospectro) nº3;
- Cubeta de vidro de 1mL.

3) Procedimentos e Métodos

3.1) Soluções Estoque


- Sacarose 0,02M; 0,03M; 0,05M; 0,1M; 0,15M;
- Utilizar solução de sacarose 0,2M;
- Preparar 1mL da solução de sacarose 0,01M e o 0,15M.

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- Cálculos:
[S]i = 0,2M Ci x Vi = Cf x Vf
[S]f = 0,01M 0,2 Vi = 0,01x1000
Volf = 1000µL 0,2 Vi = 10
Voli = ? Vi = 50µL
H2O = ? H2O = 950µL

[S]i = 0,2M Ci x Vi = Cf x Vf
[S]f = 0,15M 0,2 Vi = 0,15x1000
Volf = 1000µL 0,2 Vi = 150
Voli = ? Vi = 750µL
H2O = ? H2O = 250µL

3.2) Soluções Estoque


- Invertase 0,025% (0,25mg/ mL);
- Tampão: acetato de sódio 50mM; pH 5,0.

3.3) Procedimentos Experimentais

Sacarose (µL) Tampão


Tubo 0,01M 0,02M 0,03M 0,05M 0,1M 0,15M (µL)
B - - - - - - 30
1 50 - - - - - 30
2 - 50 - - - - 30
3 - - 50 - - - 30
4 - - - 50 - - 30
5 - - - - 50 - 30
6 - - - - - 50 30

I. No tubo B, adicionar 100µL de DNS;


II. Levar todos os tubos para o banho-maria 42ºC (inclusive o estoque da enzima);
III. Aguardar 5 minutos;
IV. Após 5 minutos, acrescentar 20µL da invertase no tubo B;
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V. Após 30 segundos, acrescentar 20µL de invertase no tubo 1;


VI. Aguardar sempre 30 segundos entre os tubos e acrescentar 20µL de invertase;
VII. Para a reação, após 5 minutos com 100µL de DNS (tubo 1);
VIII. Após 30 segundos, acrescentar 100µL de DNS no tubo 2 e assim sucessivamente
nos demais tubos;
IX. Levar os tubos para o banho-maria à 100ºC por 5 minutos;
X. Após 5 minutos, retirar os tubos do banho, esperar esfriar e acrescentar 1,3mL de
H2O;
XI. Ler as absorbâncias à 540ƞm;

4) Resultados

I) A partir dos Estoques de sacarose (0,01M; 0,02M; 0,03M; 0,05M; 0,1M e 0,15M),
foram obtidos os valores de [Sacarose]mM, por intermédio dos seguintes cálculos:

Tubo 1:
[Sacarose]i = 0,01M Ci x Vi = Cf x Vf
Volf = 100µL 0,01M x 50µL = Cf x100µL
10𝑚𝑀 × 50𝜇𝐿
Voli = 50µL Cf = 100𝜇𝐿

Cfsacarose = ? Cfsacarose = 5mM

Tubo 2:
[Sacarose]i = 0,02M Ci x Vi = Cf x Vf
Volf = 100µL 0,02M x 50µL = Cf x100µL
20𝑚𝑀 × 50𝜇𝐿
Voli = 50µL Cf = 100𝜇𝐿

Cfsacarose = ? Cfsacarose = 10mM

Tubo 3:
[Sacarose]i = 0,03M Ci x Vi = Cf x Vf
Volf = 100µL 0,03M x 50µL = Cf x100µL

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30𝑚𝑀 × 50𝜇𝐿
Voli = 50µL Cf = 100𝜇𝐿

Cfsacarose = ? Cfsacarose = 15mM


Tubo 4:
[Sacarose]i = 0,05M Ci x Vi = Cf x Vf
Volf = 100µL 0,05M x 50µL = Cf x100µL
50𝑚𝑀 × 50𝜇𝐿
Voli = 50µL Cf = 100𝜇𝐿

Cfsacarose = ? Cfsacarose = 25mM

Tubo 5:
[Sacarose]i = 0,1M Ci x Vi = Cf x Vf
Volf = 100µL 0,1M x 50µL = Cf x100µL
100𝑚𝑀 × 50𝜇𝐿
Voli = 50µL Cf = 100𝜇𝐿

Cfsacarose = ? Cfsacarose = 50mM

Tubo 6:
[Sacarose]i = 0,15M Ci x Vi = Cf x Vf
Volf = 100µL 0,15M x 50µL = Cf x100µL
150𝑚𝑀 × 50𝜇𝐿
Voli = 50µL Cf = 100𝜇𝐿

Cfsacarose = ? Cfsacarose = 75mM

- Tabela com os cálculos de [Sacarose]mM e as leituras das absorbâncias:


Tubos [Sacarose]mM [Abs]540ƞm *1
B 0 0
1 5 0,015
2 10 0,017
3 15 0,010
4 25 0,022
5 50 0,003
6 75 0,078

*1 – As absorbâncias precisariam estar aumentando ao invés de diminuir. Então a


leitura das absorbâncias foi refeita por outro grupo, onde descobriu que o erro ocorreu
devido um problema com a enzima.

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II) Com a utilização de uma nova enzima, foram obtidas novas leituras das
absorbâncias (dados do outro grupo):

Tubos [Sacarose]mM [Abs]540ƞm [Abs]540ƞm * [AR]mM Velocidade


(mM/min)
B 0 0 0 0 0
1 5 0,662 0,340 8,5 1,7
2 10 0,956 0,510 12,8 2,6
3 15 0,467 0,251 6,3 1,3
4 25 1,489 0,910 22,8 4,6
5 50 1,352 0,768 19,2 3,8
6 75 1,582 1,384 34,6 6,9

*Como as absorbâncias dos últimos tubos (4, 5, 6) ficaram altas, foram retiradas
650µL de cada tubo, repassando este volume para um novo tubo contendo 650µL de
H2O.

∑ 𝒂𝒃𝒔
III) Com a utilização do valor de a = ∑ 𝒈𝒍𝒊𝒄𝒐𝒔𝒆
~ 0,08 encontrado no primeiro relatório

(Dosagem de açucares redutores do caldo de cana-de-açúcar pelo método do 3,5


Dinitrossalicilato), obtemos os valores de [AR]mM, através dos cálculos:

Tubo 1: Abs = a x C  0,340 = 0,08C  C = 4,25mM


Como diluímos, então: 4,25 x 2 = 8,5mM
Tubo 2: Abs = a x C  0,510 = 0,08C  C = 6,38mM
Como diluímos, então: 6,38 x 2 = 12,8mM
Tubo 3: Abs = a x C  0,251 = 0,08C  C = 3,14mM
Como diluímos, então: 3,14 x 2 = 6,3mM
Tubo 4: Abs = a x C  0,910 = 0,08C  C = 11,38mM
Como diluímos, então: 11,38 x 2 = 22,8mM
Tubo 5: Abs = a x C  0,768 = 0,08C  C = 9,6mM
Como diluímos, então: 9,6 x 2 = 19,2mM
Tubo 6: Abs = a x C  1,384 = 0,08C  C = 17,3mM
Como diluímos, então: 17,3 x 2 = 34,6mM
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IV) Cálculo da Velocidade (mM/min):

Tubo 1: 8,5mM/5min = 1,7mM/min


Tubo 2: 12,8mM/5min = 2,6mM/min
Tubo 3: 6,3mM/5min = 1,3mM/min
Tubo 4: 22,8mM/5min = 4,6mM/min
Tubo 5: 19,2mM/5min = 3,8mM/min
Tubo 6: 34,6mM/5min = 6,9mM/min

V) Gráficos Velocidade (mM/min) x [Sacarose]mM

Gráfico de Michaelis-Menten
[Velocidade (mM/min)

8
6.9
7
6
4.6
5
3.8
4
2.6
3
1.7
2 1.3
1
0
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80

Sacarose]mM

[Sacarose]mM Velocidade 1/[Sacarose]mM 1/Velocidade


(mM/min) (mM/min)
0 0 0 0
5 1,7 0,2 0,588235
10 2,6 0,1 0,384615
15 1,3 0,066667 0,769231
25 4,6 0,04 0,217391
50 3,8 0,02 0,263158
75 6,9 0,013333 0,144928

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Gráfico de Lineweaver-Burk
0.9
0.8
0.7 y = 2,5708x + 0,1766
0.6
0.5
0.4
1/V

0.3
0.2
0.1
0
-0.15 -0.1 -0.05 -0.1 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
-0.2
1/[Sacarose]

Y= 2,5708x + 0,1766

1/Vmax = 0,1766  Vmax = 1/0,1766 = 5,66

KM / Vmax = 2,5708  KM = 5,66 x 2,5708 = 14,55

5) Conclusão

Segundo a literatura, quando fazemos o gráfico Velocidade (mM/min) x [Sacarose]mM,


a velocidade inicial em relação a concentração da Sacarose deve-se observar uma
relação linear. Dessa forma, pode-se perceber que a atividade da enzima é
proporcional à sua concentração no meio, o que define a atividade específica da
mesma que é uma constante. Além da Vmax também ir aumentando de acordo com o
aumento de velocidade. Porém, como observado no gráfico isto não ocorre, já que em
muitos momentos percebesse que a velocidade diminui, que faz com que seu Vmax
também diminua em muitos momentos.