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“III Workshop Tecnológico sobre Hidrólise para

Produção de Etanol”

Projeto Programa de Pesquisa em Políticas Públicas

Sessão 3:
“Fermentação do Hidrolisado”

Palestrante: Carlos Eduardo Vaz Rossell


Pesquisador Sênior
Engenheiro Químico.
Mestre e Doutor em Engenharia de Alimentos, UNICAMP.
Grupo Energia-Projeto Etanol (MCT/NIPE-Unicamp)
Caixa Postal 6192 - CEP 13084-971
Campinas- SP
Fone (0xx19) 3512-1121

e-mail: crossell@energiabr.org.br

Debatedores:
Maria das Graças de Almeida Felipe – EEL / USP
Alfredo Maiorano - IPT
Fermentação alcoólica do licor resultante da hidrólise

Introdução
A fermentação do licor de açúcares redutores obtido após os a hidrólise dos materiais ligno-
celulósicos é um estágio crítico para atingir um processo de obtenção de etanol que assegure
uma conversão mínima destes açúcares e seja compatível com um custo de produção factível,
sob uma visão técnica e econômica. Ainda deve ser levado em conta o consumo energético
associado às condições de fermentação e o título de etanol no vinho final obtido.
Levando em conta a necessidade de realizar processos de pré-tratamento do bagaço sem os
quais a hidrólise torna-se inviável, independente da mesma ser catalisada por ácidos ou enzimas,
haverá a formação de uma serie de compostos secundários durante estes pré-tratamentos, que
inibem fortemente a atividade fermentativa dos microorganismos em geral e a levedura em
particular.
Os materiais ligno-celulósicos, constituídos de celulose, hemicelulose e lignina quando
hidrolisados disponibilizam uma fração de hexoses resultante da celulose que é facilmente
fermentescível. A hidrólise da hemicelulose fornece pentoses (xilose e arabinose), carboidratos
estes não diretamente fermentescíveis por leveduras industriais, sendo a bio-transformação
destas pentoses a etanol um dos desafios mais importantes a resolver no âmbito científico e
tecnológico. Ainda da hemicelulose resultam hexoses tais como: glicose, manose e galactose;
sendo que esta última exige linhagens de levedura específicas para produção de etanol.
Uma serie de alternativas tem sido propostas por diversos autores para realização da fermentação
de forma independente ou associada à sacarificação enzimática.
Existe um histórico de processamento dos licores resultantes da hidrólise e fermentação dos
açucares neles contidos que pelo fato de ter sido praticado em escala industrial constitui uma
referencia importante para comparar as propostas de novas tecnologias.
Ainda a experiência em fermentação alcoólica convencional a partir dos açúcares extraíveis da
cana não pode ser relegada quando a questão é avaliar propostas de rotas de fermentação de
licores hidrolíticos.
Na exame dos procedimentos de fermentação de licores resultantes da hidrólise deve ser seguido
o modelo particular de hidrólise para o Brasil, apresentado na Figura 1 e cujas bases se
ressumem a:
• Hidrólise da fração de biomassa ligno-celulósica da cana de açúcar, envolvendo o bagaço
e os resíduos da colheita (palha);
• Integração com uma destilaria padrão moendo 500 toneladas de cana hora, produzindo
aproximadamente 1.000.000 de litros por dia de etanol e uma moagem safra de 2.000.000 de
toneladas de cana por safra;
• Otimização energética desta destilaria para recuperação do máximo de bagaço possível;
• Introdução na mesma de processos e operações de processamento a fim de obter um
bagaço e uma palha de características adequadas para a hidrólise.

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Modelo de hidrólise para o Brasil, integrado a uma destilaria autônoma de etanol.
O modelo emprega como base uma destilaria autônoma de 1000 000 de litros por dia (Grupo
Energia Projeto Etanol, 2006) otimizada para geração máxima de excedentes de bagaço e
recuperação de 50% da palha disponível. Esta condição totaliza uma quantidade de biomassa
ligno-celulósica disponível equivalente a 280 kg de bagaço equivalente por tonelada de cana.
Empregamos estimativas disponíveis na bibliografia (Rossell, 2006a) para estabelecer as
conversões efetivas de bagaço em etanol, considerando: aproveitamento de hexoses e pentoses,
eficiências no inicio da introdução da tecnologia e após otimização e rotas por catálise ácida e
enzimática. As figuras 2 e 3 apresentam os modelos propostos e as conversões em etanol
previstas, levando em conta, eficiências de hidrólise para hexoses e pentoses, eficiências de
fermentação e de destilação.

Moagem 2.000.000 Ton/safra


Hidrólise ácida
Safra 167 dias
Moagem diária 12.000 TCD
Rend. agrícola Hidrólise
70 TCH
enzimática
Área de plantío 35.000 hectares

Destilaria autônoma Etanol proveniente da hidrólise


Excedente de bagaço: [1]: 60% das hexoses, [4]: 85% das hexoses,
140 Kg/TC 0% das pentoses: 0% das pentoses:
232176 litros/dia 325920 litros/dia

Excedente de palha: [2]: 80% das hexoses, [5]: 95% das hexoses,
equivalente 0% das pentoses: 85% das pentoses:
aproximadamente a 316512 litros/dia 501648 litros/dia
140 Kg/TC
Álcool proveniente dos [3]: 80% das hexoses,
açúcares: 1037000 85% das pentoses:
litros/dia 444192 litros/dia

Fig. 1. Cenários projetados para a hidrólise de bagaço integrada a uma destilaria.

1) Pré-tratamento e hidrólise ácida diluída com aproveitamento das


hexoses, no estágio tecnológico atual.
2) Pré-tratamento e hidrólise ácida diluída com aproveitamento das
hexoses e otimização da reação de hidrólise aos melhores
valores atingidos, reportados na literatura.
3) Pré-tratamento e hidrólise ácida diluída com aproveitamento das
hexoses e pentoses, otimização da reação de hidrólise aos
melhores valores atingidos, reportados na literatura.
4) Pré-tratamento e hidrólise enzimática com aproveitamento das
hexoses, no estágio atual da tecnologia.
5) Pré-tratamento e hidrólise enzimática com aproveitamento das
hexoses e pentoses, com a tecnologia otimizada.

Fig. 2. Cenários para introdução da hidrólise de bagaço integrada a uma destilaria

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Em função dos rendimentos projetados foi determinada a contribuição da hidrólise no aumento da
produção de etanol, para as diversas situações propostas.
Os resultados apresentados na Figura 1 mostram que a contribuição da hidrólise será sempre
expressiva e quando superadas as barreiras tecnológicas e atingida a otimização dos processos a
produção de etanol atingira um aumento entorno de 50%.

Cenário Etanol Etanol Etanol


Conversões previstas
Hexoses Pentoses Total
hexoses: 60% fermentação: 89%
[1] pentoses: 70 % fermentação: 0% 69,1 0 69,1
destilação: 99,5 %
hexoses: 80% fermentação: 91%
[2] pentoses: 785 % fermentação: 0% 94,2 0 94,2
destilação: 99,75 %
hexoses: 80% fermentação: 91%
[3] pentoses: 85% fermentação: 50% 94,2 37,9 132,2
destilação: 99,75 %
hexoses: 85% fermentação: 89%
[4] pentoses: 70 % fermentação: 0% 97 0 97
destilação: 99,5 %
hexoses: 95% fermentação: 91%
[5] pentoses: 85 % fermentação: 50% 111,4 37,9 149,3
destilação: 99,75 %

Fig. 3. Potencial de transformação de bagaço em etanol (litros/tonelada de bagaço)

O modelo aqui apresentado é importante para definir estratégias referentes à:


• Integração com a destilaria;
• Rotas de fermentação alcoólica a escolher;
• Tratamentos a realizar sobre o licor de hidrólise.

Antecedentes sobre fermentação de licores resultantes da hidrólise


Para avaliar as possíveis rotas de fermentação do licor de hidrólise é importante levar em conta as
experiências já realizadas anteriormente em escala industrial, de demonstração ou realizadas com
o propósito de estabelecer as bases para um processo de demonstração.
A hidrólise catalisada por ácidos diluídos foi praticada industrialmente na Rússia (Murtagh, 1997)
até recentemente. O processo praticado na unidade de Tavda era uma versão otimizada do
processo Schoeller, que empregava resíduos florestais e era realizado em batelada e por
percolação, atingindo conversão de 60% das hexoses. A fermentação era realizada combinando
mostos de amiláceos sacarificados com o licor resultante da hidrólise. O vinho final apresentava
teor alcoólico muito baixo, 1,3 ºGL e em conseqüência a demanda de vapor era de 20 kg por litro
de etanol. As pentoses não eram empregadas para fermentação de etanol, sendo direcionadas
para bio-síntese de proteína unicelular. Este processo apresenta elevado investimento em
equipamentos e em custo operacional não sendo econômico.
O Centro de Tecnologia Canavieira (Kirally, 2003, Zautsen, 2004, Rossell, 2006b) realizou um
extenso estudo sobre fermentação de licor de hidrólise proveniente do processo DHR para
demonstrar a etapa de fermentação alcoólica. O licor proveniente da hidrólise era misturado com
xarope e mel residual, a fim de reduzir o impacto dos inibidores provenientes da hidrólise ácida
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organosolv e procurando manter a fermentação em condições operacionais próximas às ótimas:
processo com reciclo de fermento, vinho final de 8,5 ºGL, temperatura de 34ºC. Os resultados
obtidos foram positivos, sendo estabelecidas as condições para realização da fermentação
alcoólica do licor obtido no processo DHR.
O processo Iogen (Tolan, 2006) em demonstração no Canadá, emprega pré-tratamento da
biomassa ligno-celulósica por explosão com vapor e pré-acidificação com ácido sulfúrico, seguido
de um estágio de hidrólise enzimática realizada por adição de preparados de celulase. A
fermentação alcoólica é realizada num estágio posterior misturando o licor de hidrólise a um
mosto de amido de amiláceos previamente sacarificado. As pentoses estão sendo descartadas,
pois a tecnologia de fermentação destas, que Iogen pretende empregar ainda não atingiu o
estágio de demonstração. Não são realizadas tratamentos de depuração do licor de hidrólise, os
inibidores que estejam presentes são diluídos aos níveis de tolerância na mistura com o mosto de
amiláceos.

Inibidores da fermentação alcoólica gerados durante os pré-tratamentos ou na hidrólise


ácida

Durante o pré-tratamento do material ligno-celulósico ou nos processos de hidrólise catalisada por


ácidos, não somente se obtém os açúcares provenientes da hidrólise e dissolução da celulose e
hemi-celulose. Por causa das altas temperaturas e condições ácidas nas que se desenvolvem
estes pré-tratamentos, se originam uma serie de compostos que podem atuar como inibidores
potenciais da fermentação. A natureza e concentração destes compostos dependem do tipo de
matéria-prima (conteúdo percentual de celulose, hemi-celulose e lignina), do pré-tratamento
utilizado, das condiciones do processo (temperatura e tempo de reação) e do emprego ou não de
catalisadores ácidos.
Os produtos de degradação, que são potenciais inibidores da fermentação, se agrupam em três
categorias (Dominguez, J.M.O., 2003):
• Derivados do furano;
• Ácidos alifáticos de baixa massa molecular;
• Derivados fenólicos.

Em conseqüência das altas temperaturas empregadas nos pré-tratamentos, os açúcares


originados na hidrolise, principalmente da hemi-celulose, se degradam originando os compostos
derivados do furano: o furfural, formado a partir da degradação das pentoses (xilose e arabinose)
e o 5-hidroximetilfurfural (HMF), formado como conseqüência da degradação das hexoses
(glicose, manose e galactose).

Por sua vez, estes dois compostos podem-se degradar a outros produtos. O furfural pode se
degradar a ácido fórmico ou se polimerizar. O HMF origina quantidades equimoleculares de
ácidos fórmico e levulínico. Ademais destes dois ácidos alifáticos (fórmico e levulínico), forma-se
ácido acético procedente da hidrolise dos radicais acetila da hemi-celulose.
O teor destes inibidores no licor, após o pré-tratamento depende da natureza do material ligno-
celulósico empregado. Os hidrolisados procedentes de materiais que contém uma percentagem

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comparativamente maior de hemicelulose apresentam una maior concentração de furfural e ácido
acético.
Durante o pré-tratamento, una parte da lignina também se degrada originando uma grande
variedade de compostos fenólicos. Trata-se de um grupo de compostos muito heterogêneo que
podem se encontrar em forma de monômeros, dímeros e polímeros com uma grande variedade
de substituintes. Dentre estes, encontram-se ácidos, aldeídos e álcoois aromáticos. Os fenóis
originados no pré-tratamento variam segundo o tipo de biomassa, considerando que existem
grandes diferenças na lignina dependendo da espécie vegetal da qual esta provém.
Um derivado fenólico muito abundante nos hidrolisados é o ácido 4-hidroxibenzoico, originado na
ruptura das ligações ester que unem os grupos hidroxilas dos álcoois cinámicos da lignina. Outros
derivados fenólicos abundantes nos hidrolisados são o siringaldeído e o ácido siríngico,
procedentes da degradação das unidades siringilpropano da lignina. O 4-hidroxibenzaldeído e os
ácidos gentísico, salicílico e protocatéquico também tem sido identificados nos hidrolisados.
Foram identificados também: a vanilina e o ácido vanílico, o catecol, o guaiacol, a hidroquinone, o
aldeído coniferílico e o ácido homovanílico.

Um tipo de compostos (não incluídos nos três grupos citados anteriormente) que se liberam
durante o pré-tratamento são os extrativos. Entre eles se encontram diferentes tipos de resinas
(ácidos graxos, terpenoides, esteróis e ceras) e compostos fenólicos (flavonoides, taninos, etc.).
Estes compostos, embora em baixa concentração, estão presentes no bagaço e podem agir como
inibidores dos microorganismos empregados na fermentação dos hidrolisados (Rossell, 2006a).

Efeitos dos compostos tóxicos sobre os microorganismos.


Furfural e hidroximetilfurfural (HMF).
Entre os efeitos negativos produzidos pelo furfural sobre os microorganismos em geral e as
leveduras de fermentação alcoólica em particular são descritos:
• Diminuição da taxa específica de crescimento;
• Diminuição da produtividade volumétrica ou específica de etanol;
• Redução da síntese de biomassa.

Os efeitos negativos produzidos pelo HMF embora menos intensos, considerando que a
toxicidade deste sobre os microorganismos é menor que a do furfural são os mesmos.
O efeito tóxico ocasionado pelos compostos furánicos parece estar associado ao fato de que por
serem aldeídos, quimicamente reativos, podem reagir com determinadas moléculas biológicas tais
como lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos ou ocasionar danos á membrana celular.
Ademais, o furfural inibe enzimas glicolíticas e fermentativas
A inibição que o furfural exerce sobre a álcool-dehidrogenase poderia explicar a excreção de
acetaldeído observada durante as primeiras horas de fermentação.
O furfural e o HMF são metabolisados tanto por bactérias como leveduras (Taherzadeh, 2000).
Em condições de anaerobiose, como conseqüência do metabolismo do furfural, se produz
principalmente álcool fufurílico e em menor concentração, ácido furoico. A hipótese de que a
redução do furfural a álcool furfurílico é catalisada por uma álcool - dehidrogenase dependente do
NADH está praticamente aceita. Em condições de anaerobiose, durante a fermentação se produz
glicerol para regenerar o excesso de NADH produzido na bio-síntese e manter o balanço redox
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intracelular. Nas fermentações em presença de furfural não se observa produção de glicerol, isto
sugere que a redução do furfural a álcool furfurílico oxida o NADH em condiciones de
anaerobiose.
Ácidos alifáticos.
Embora estiver bem documentado na bibliografia que os ácidos alifáticos fracos reduzem o
rendimento em etanol (Pampulha, 1989) e diminuem a produção de biomassa (Taherzadeh,
2000), o mecanismo pelo qual se produz a inibição não está completamente esclarecido.
Um dos mecanismos proposto para explicar o efeito inibitório dos ácidos alifáticos é a teoria do
desacoplamento. Segundo esta, o efeito tóxico depende do pKa dos ácidos e do pH do meio.
Unicamente a forma no dissociada dos ácidos penetra na célula por difusão, onde, devido ao
maior pH intracelular se dissocia, provocando uma diminuição do pH que deve ser compensada
por una ATPase de membrana que bombeia prótons afora da célula a expensas da hidrólise de
ATP. A menor quantidade de ATP disponível para a formação de biomassa celular, explicaria a
redução do crescimento observada quando há no meio ácidos alifáticos. Quando a concentração
de ácido é o suficiente alta, supera-se a capacidade de bombeio de prótons, o que origina a
acidificação do citoplasma e a posterior morte celular. Outro mecanismo proposto, para explicar
este efeito inibitório dos ácidos é a acumulação intracelular de anions. Segundo esta teoria,
enquanto que os prótons são excretados ao exterior os anions são capturados na célula
produzindo-se um acúmulo dos mesmos no interior desta. A inibição poderia estar relacionada
com a toxicidade do anion. Embora não se conheça com certeza o mecanismo de inibição dos
ácidos alifáticos, o efeito tóxico mostrado por estes compostos pode se dever tanto ao
desacoplamento como ao efeito inibitório do acumulo de anions. Provavelmente, o efeito dos
ácidos alifáticos de cadeia curta também se deva a um efeito direto destes compostos sobre a
integridade da membrana. A inserção das cadeias alifáticas na membrana pode alterar a estrutura
e hidrofobicidade, produzindo um aumento da permeabilidade da mesma e afetar a sua função de
barreira seletiva.
Compostos fenólicos.
Dos inibidores identificados nos hidrolisados dos materiais ligno-celulósicos, os compostos
aromáticos de baixa massa molecular são os que se tem mostrado como os mais tóxicos para os
microorganismos. Embora, o mecanismo de inibição não se conheça completamente, tem-se
estudado o efeito dos derivados fenólicos sobre procarióticos como Klebsiella pneumoniae e
Escherichia coli. O efeito tóxico dos aldeídos aromáticos pode estar relacionado à interação com
determinadas zonas hidrofóbicas das células e causar perda da integridade da membrana
afetando sua capacidade de agir como uma barreira seletiva. O efeito tóxico dos álcoois
aromáticos é atribuído ao dano ocasionado por estes na membrana plasmática. O efeito inibitório
mostrado pelos ácidos aromáticos pode basear-se em mecanismos semelhantes aos dos ácidos
alifáticos descritos anteriormente. Embora tenham sido realizados diversos estudos sobre o efeito
dos derivados fenólicos nas leveduras e em especial sobre Saccharomyces, o mecanismo de
inibição sobre os eucarióticos não está completamente esclarecido. Devido a que a estrutura da
membrana plasmática é semelhante à dos procarióticos, se postula que os mecanismos de
inibição poderiam ser similares. De igual forma que para o furfural e o HMF, existem dados na
bibliografia (Dominguez, J.M.O., 2003) que demonstram a capacidade de determinados
microorganismos, tanto bactérias como K. pneumoniae o Z. mobilis, como leveduras pertencentes
aos gêneros Saccharomyces, Pichia, Pachysolen e Candida de metabolisar os aldeídos
aromáticos. Porém, os dados disponíveis na bibliografia referentes ao papel da álcool-
dehidrogenase de S. cerevisiae na conversão destes compostos resultam contraditórios. Outros

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enzimas, que podem estar implicadas no metabolismo dos aldeídos aromáticos são a vanilina-
oxidoredutase, aldose redutase o a arilálcool dehidrogenase.

Tratamentos para remoção de inibidores e aumento da fermentabilidade dos licores de


hidrólise.
Com o propósito de aumentar a fermentabilidade dos hidrolisados obtidos após o pré-tratamento é
necessário reduzir a concentração, ou eliminar totalmente do meio, os compostos tóxicos gerados
no pré-tratamento.
Dependendo dos mecanismos empregados para a eliminação dos inibidores, estes métodos se
podem agrupar em: biológicos e químicos e físicos.
Métodos biológicos.
Consistem no emprego de microorganismos capazes de metabolisar alguns dos compostos
tóxicos presentes nos hidrolisados. Um exemplo de tratamento biológico é a destoxificação de
hidrolisados utilizando micélios de Trichoderma reesei. Este microorganismo é capaz de
metabolisar as pentoses e oligômeros presentes no hidrolisado sem ser afetado pelos produtos
tóxicos presentes no mesmo. Durante o tratamento com este fungo tem-se eliminado compostos
como o ácido acético, o furfural e o ácido benzoico.
Também podem empregar-se enzimas (lacase e peroxidase) procedentes de fungos ligninolíticos.
Tem-se utilizado também enzimas procedentes de Trametes versicolor para a eliminação
completa e seletiva dos monômeros fenólicos presentes em hidrolisados. Baseados nos espectros
de absorção parece que o mecanismo pelo qual estas enzimas reduzem o efeito tóxico dos
hidrolisados é uma polimerização oxidativa dos compostos fenólicos de baixa massa molecular a
compostos aromáticos de maior massa molecular, porém menos tóxicos.

Métodos químicos e físicos.


Extração com solventes.
Solventes orgânicos de volatilidade relativa elevada comparada a da água, se mostraram
eficientes na extração de ácidos alifáticos e aldeídos. Ésteres de ácidos e álcoois alifáticos de
baixa massa molecular como o acetato de etila, apresentam coeficientes de partição favoráveis,
extraindo ácidos alifáticos e aldeídos.
O acetato de etila, por exemplo, é eficiente na extração dos ácidos acético e fórmico e o furfural.
Tratamentos com hidróxidos alcalino-térreos.
O tratamento dos hidrolisados ligno-celulósicos com diferentes hidróxidos tem sido um dos
métodos más empregados para a eliminação dos compostos tóxicos gerados no pré-tratamento.
Pela dosagem de hidróxido de cálcio (outros como hidróxido de sódio ou de magnésio) ao meio
até atingir um pH de 10, se produz um precipitado formado por sais de cálcio de muita baixa
solubilidade que arrasta alguns dos compostos tóxicos presentes no hidrolisado, como o furfural e
o HMF e o ácido acético. Este precipitado deve ser eliminado do meio antes da fermentação. O
tratamento pode ser combinado com a adição de sulfito, o qual de por si é um eficiente método de
destoxificação. Mediante o tratamento dos hidrolisados do material ligno-celulósico com hidróxido
de cálcio tem-se conseguido aumentos significativos no rendimento e a produtividade em etanol.
Remoção por evaporação e destilação.
Este tratamento persegue a eliminação de compostos voláteis como o furfural, ácido acético e
ácido fórmico. Compostos como o ácido levulínico, o hidroximetilfurfural e os derivados fenólicos

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não são eliminados. O tratamento deve ser realizado a baixo pH, pois, compostos como o ácido
acético e fórmico somente são voláteis na forma protonada. A eficiência é parcial considerando
que apenas os inibidores voláteis são removidos enquanto que HMF e os compostos fenólicos
permanecem.
Adsorção em carvão ativo e carvão vegetal.
O emprego de adsorção a través de carvão ativo ou carvão vegetal (Miyafuji, 2003) tem-se
mostrado eficiente na destoxificação dos licores hidrolíticos.
Mediante a aplicação de carvão vegetal, preparado a partir de madeira tratada a temperaturas
superiores a 600 ºC tem-se conseguido um aumento da fermentabilidade dos hidrolisados
mediante a eliminação seletiva de compostos tóxicos como o furfural, HMF e derivados fenólicos,
sem afetar a concentração de açúcares fermentescíveis.
Emprego de Resinas de Troca Iônica.
Alguns autores tem encontrado efetiva a utilização de resinas catiônicas para a destoxificação de
hidrolisados, enquanto que outros reportam resultados negativos, atribuindo isto a os grupos
sulfônicos com carga negativa das resinas catiônicas que provocam efeitos de repulsão aos
inibidores presentes no hidrolisado. Os melhores resultados foram obtidos com resinas de
aniônicas fortes a um pH de10. Com estas resinas se consegue principalmente a eliminação dos
compostos fenólicos, devido à formação de fortes ligações entre os grupos amônio quaternários
da resina (carregados positivamente) e os fenóis (carregados negativamente).
Ao tratar os hidrolisados com resinas de intercambio iônico, também acontece a redução da
concentração dos furanos (devido neste caso a interações hidrofóbicas) e a dos ácidos alifáticos.
Embora tenham sido atingidos bons resultados na eliminação dos inibidores através de resinas de
troca iônica, o custo elevado destas inviabiliza por enquanto sua aplicação industrial. Resta ainda
também apurar a perda de açúcares nas resinas. O emprego industrial de resinas de troca iônica
tem sido muito questionado ambientalmente, pelo efluentes gerados no estágio de regeneração e
pelos volumes de água requeridos.
Emprego da lignina residual como adsorvente.
Um novo método proposto para a destoxificação de hidrolisados de ligno-celulose consiste em
utilizar a lignina que se produz como resíduo na hidrólise como adsorvente numa extração
aproveitando suas propriedades hidrofóbicas. As vantagens de utilizar a lignina residual como
agente destoxificador frente às resinas cromatográficas, são principalmente econômicas e para
reduzir os custos do tratamento. Sendo a lignina um subproduto da hidrólise depois de seu
emprego na destoxificação poderá ainda ser empregada como combustível primário
Emprego de zeólitos.
O término zeólitos engloba a um grande número de minerais, tanto naturais como sintéticos,
compostos de um esqueleto cristalino formado pela combinação tridimensional de tetraedros TO4
( T= Si, Al, B, Ga,) unidos entre sim a través de átomos de oxigênio comuns. Esta estrutura
confere aos zeólitos uma série de propriedades tais como:
• Forte capacidade de troca iônica;
• Elevada superfície específica;
• Presença de centros ativos que permitem uma importante atividade catalítica.
Embora seu mecanismo de ação seja desconhecido, os zeólitos tem sido aplicados com êxito em
numerosos processos. Tem-se utilizado como catalisadores de reações de hidrólise de diferentes

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dissacarídeos como a celobiose, maltose, lactose, etc., no controle ambiental de resíduos
industriais para eliminação de metais tóxicos (cromo, cobalto, níquel),
Os zeólitos tem-se utilizado nos processos de obtenção de etanol a partir melaço, para remover
inibidores de fermentação, como sais de alcalinos e alcalino-térreos e inibidores de natureza
orgânica presentes no melaço.
Experiências realizadas com licores hidrolíticos mostraram uma melhoria nas condições de
fermentação depois da depuração com zeólitos.

Fermentação alcoólica dos carboidratos obtidos da hidrólise


A fermentação da glicose é um processo completamente estabelecido. Não existe
microorganismo mais apropriado que a levedura Sacharomyces cerevisiae que a través de seu
emprego intensivo em fermentação industrial, já passou por um processo de seleção natural,
apresentando os melhores desempenhos em conversão de glicose a etanol, produtividade e
tolerância alcoólica. Desde que os impactos negativos dos inibidores sejam controlados a
fermentação acontece sem maiores problemas.
Quanto à fermentação das pentoses poucos microorganismos possuem a capacidade de
fermentar estas a etanol.
A transformação das pentoses em etanol é fundamental para atingir uma tecnologia eficiente de
hidrólise.
As linhas de pesquisa em andamento são:
• Procedimentos de seleção e melhoramento de leveduras que fermentam naturalmente as
pentoses a etanol;
• Desenvolvimento de linhagens recombinantes de Sacharomyces cerevisiae;
• Seleção de bactérias termofílicas;
• Seleção de bactérias mesofílicas.

Três espécies de leveduras foram identificadas como as de maior potencial para a fermentação
alcoólica das pentoses: Pichia stipitis, Candida shehatae e Pachysolen tannophilus. O
desempenho das mesmas é muito limitado. O metabolismo das pentoses exige a presença de um
nível mínimo de oxigênio, que deve ser rigorosamente controlado. Estas cepas apresentam baixa
tolerância ao etanol e aos ácidos alifáticos. Tem se tentado como alternativas a seleção de
mutantes mais resistentes e a fusão de protoplastos.

Os estudos para obtenção de linhagens geneticamente modificadas de Sacharomyces cerevisiae


para metabolizar as pentoses foram direcionados para as seguintes estratégias:
• Inserção de genes bacterianos que realizam a isomerização da xilose a xilulose (xilose
isomerase) está última fermentescível pelo Sacharomyces;
• Inserção no Sacharomyces cerevisiae dos genes que permitem a assimilação da xilose.
• Isomerização da xilose a xilulose via a adição de uma isomerase.
Até o presente não foram atingidos maiores avanços.
Quanto ao emprego de bactérias termofílicas têm sido realizados estudos com
Thermoanaerobacter ethanolicus. Este organismo exige operar com mostos muitos diluídos em

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pentoses. O Clostridium thermohydrosulfuricum tem sido amplamente estudado em processos
CDM. Dentre as dificuldades evidenciadas os autores citam: formação significativa de acetatos
que conduz a baixo rendimento alcoólico, baixa tolerância ao etanol e vulnerabilidade à presença
de contaminantes. Bactérias termofílicas geneticamente modificadas também tem sido estudadas
visando evitar a formação de acetato em paralelo à formação de etanol
Os principais problemas relacionados ao emprego de bactérias termofílicas são: baixa tolerância
ao etanol, forte sensibilidade aos inibidores, formação em paralelo de quantidade significativa de
subprodutos e a necessidade de adicionar fatores de crescimento no mosto.
Quanto à possibilidade de emprego de bactérias mesofílicas, certas bactérias como a Zymomonas
mobilis não são capazes de fermentar as pentoses, porém são muito eficientes no metabolismo da
glicose a etanol através da via Entner Doudoroff. A introdução de genes de Escherichia coli
possibilitou a fermentação da xilose a etanol.
A Zymomonas mobilis é um dos microorganimos mais promissores para fermentação do licor de
hidrólise. Possui forte tolerância ao etanol e aos inibidores e alta produtividade de fermentação. É
considerada um do microorganismos recombinantes mais promissores para realizar com sucesso
a fermentação das pentoses. Mesmo assim subsistem sem solução a curto prazo os problemas
relacionados à instabilidade do microorganismo geneticamente modificado. Outras bactérias
mesofílicas capazes de metabolisar as pentoses em ausência de oxigênio são: Escherichia coli e
Klebsiella. Estas depois de submetidas a modificações genéticas estão sendo estudadas como
alternativas para fermentação alcoólica do licor de hidrólise. É importante destacar que a única
experiência industrial de fermentação alcoólica de mostos a base açúcar empregando uma
linhagem de Zymomonas mobilis, realizada na Alemanha nos anos 90, não foi bem sucedida e a
unidade foi desativada voltando ao processo convencional com leveduras como agente de
fermentação. A informação que dispomos de aquele processo é de que nas condições em que a
fermentação procede aparece uma rápida contaminação que inibe a fermentação.
Para realizar a fermentação alcoólica de um licor contendo pentoses e hexoses as possibilidades
em estudo são: fermentação simultânea ou seqüencial de pentoses e hexoses. Na fermentação
simultânea dois microorganismos que fermentem respectivamente a glicose e a xilose são
cultivados em co-cultura. A maioria dos trabalhos realizados neste campo utilizaram duas
leveduras: S. cerevisiae e P. stipitis (pentoses). As dificuldades encontradas foram:
• O metabolismo da xilose procede mais lentamente que o da glicose, provocando a inibição
alcoólica sobre o microorganismo que metaboliza as pentoses;
• Repressão catabólica da glicose sobre a utilização da xilose
• Competição entre o S. cerevisiae e a levedura responsável pela fermentação da xilose,
pelo oxigênio presente no meio;
• Possível incompatibilidade entre as duas cepas.

Outra alternativa e a de operar a fermentação num esquema seqüencial, fermentando primeiro a


glicose e depois a xilose (ou vice-versa).
Os melhores resultados obtidos até agora foram usando uma linhagem mutante de Escherichia
coli incapaz de metabolisar glicose, seguida de uma segunda etapa de fermentação da glicose
com S. cerevisiae.

10
Processos de conversão dos materiais ligno-celulósicos em etanol.

A conversão de materiais ligno-celulósicos em etanol que envolve a hidrólise da hemicelulose a


açúcares redutores e a fermentação alcoólica destes últimos pode ser realizada simultaneamente
num só estágio ou sequencialmente em duas etapas. A figura. 4 apresenta as alternativas
possíveis que estão sendo objeto de estudo (Ogier, 1999, Domínguez, 2003).

Bagaço/Palha

Processos em dois estágios Processos num estágio

Hidrólise Hidrólise SFS CDM


ácida enzimática
ARRT

Monocultura Co-cultura
Organismo Organismos
Fermentação Fermentação Celulolítico e celulolítico +
pentoses simultânea de Etanol gênico etanol gênico
e hexoses hexoses
separadas e pentoses

Etanol
Fig.4.Rotas de hidrólise e fermentação

Nos processos em duas etapas a hidrólise (ácida ou enzimática) e a fermentação são realizadas
em separado (HFS).
A vantagem deste processo é que, ao estar separadas a etapa de hidrólise e a de fermentação,
ambas podem ser realizadas em condiciones ótimas. No caso de catálise enzimática a etapa de
hidrólise se realiza à temperatura ótima da enzima (em torno dos 50 ºC), enquanto que a de
fermentação se à temperatura ótima do microorganismo produtor de etanol (28-32 ºC).
A principal desvantagem do processo de HFS é devida a que, a glicose e celobiose liberadas
durante a etapa de hidrólise enzimática, inibem as enzimas envolvidas neste processo, se
obtendo baixos rendimentos.
Quando em lugar de enzimas como catalisadores da hidrólise, se emprega a hidrólise ácida, se
faz necessário neutralizar os hidrolisados antes da fermentação. Ademais, a maior geração de
produtos de degradação durante a hidrólise, poderá afetar o microorganismo responsável pela
fermentação.
Nos processos e num estágio a hidrólise e a fermentação se realizam no mesmo reator. A
principal vantagem destes processos é a redução da inibição pelo produto final que acontece na
operação em duas etapas, já que a presença de microorganismos fermentadores junto com as
enzimas celulolíticas reduz o acumulo de açúcar no fermentador. Por este motivo se conseguem
maiores taxas de hidrólise e percentagens de conversão em comparação ao processo de hidrólise
e fermentação em separado, sendo necessária uma menor quantidade de enzimas e se obtendo
como resultado um aumento dos rendimentos de etanol.

11
A principal desvantagem deste processo está relacionada com as diferentes condições ótimas de
pH e temperatura nas etapas de hidrólise e fermentação respectivamente.
Por este motivo se faz necessário realizar o processo numa condição compatível com as duas
etapas. Considerando que a temperatura ótima de hidrólise enzimática está próxima aos 50 ºC e
que as leveduras produtoras de etanol convencionais operam em torno dos 28-34 ºC é
recomendável à utilização de microorganismos termos-tolerantes realizarem os processos numa
só etapa.
Os processos em uma etapa podem-se dividir em dos grupos:
• Processos nos qual o mesmo microorganismo produz as enzimas e realiza a fermentação,
conhecido como conversão direta pelo microorganismo (CDM);
• Processos com sacarificação e fermentação simultânea (SFS), no qual se empregam
celulases provenientes de um microorganismo celulolítico (normalmente um fungo do gênero
Trichoderma), junto com a presença de um microorganismo produtor de etanol.

Nos processos CDM se podem empregar monoculturas, sendo que um único microorganismo
hidrolisa o material ligno-celulósico e fermenta os açúcares a etanol. Para isto tem-se empregado
bactérias do gênero Clostridium. Os rendimentos em etanol são baixos devido à formação de
subprodutos, à baixa tolerância do microorganismo ao etanol e ao crescimento limitado do
microorganismo nos hidrolisados devido à existência de produtos tóxicos.
Também podem empregar-se co-culturas, nas que se utilizam dois microorganismos. Um deles
realiza a hidrólise da celulose (Clostridium thermocellum) e o outro microorganismo de natureza
etanol gênica fermenta os açúcares produzidos.
Na atualidade o processo de SFS é o que oferece as melhores expectativas. As
celulases provém de fungos celulolíticos, normalmente o Trichoderma reesei e o microorganismo
fermentador é uma levedura. Kluyveromyces marxianus et Kluyveromyces fragilis parecem ser
linhagens mais apropriadas para produzir etanol em ambiente termofílico
Quanto ao processo SFS estudos realizados (Bollók, 1999) com o propósito de avaliar o
desempenho do mesmo mostraram as dificuldades para conduzir a fermentação alcoólica num
ambiente termofílico. Os rendimentos de conversão se mostraram aquém das expectativas, o
vinho final apresenta baixo teor alcoólico por causa da forte inibição do etanol formado quando se
opera a temperaturas elevadas. Os autores confirmam a incidência de contaminação nas
condições de operação para um processo SFS. Os ensaios foram realizados empregando
linhagens do gênero Kluyveromices.

Conclusões e recomendações

O modelo específico adotado para processamento de cana, obtenção de etanol dos açúcares
extraíveis, geração de vapor e energia e geração de excedentes de bagaço e palha é uma
determinante crítica na integração do processo de hidrólise de bagaço a etanol. Este modelo
deve ser levado em conta quando da escolha da tecnologia a empregar. Em particular a definição
dos processos de preparo do mosto, fermentação, destilação, desidratação e tratamento do
vinhoto estão fortemente vinculados à relação entre o etanol produzidos dos açúcares obtidos
através de extração e através da sacarificação do bagaço.

12
A formação de inibidores resultantes de reações de degradação associadas aos pré-tratamentos e
seu teor máximo no licor de hidrólise são críticos para atingir uma fermentação alcoólica estável e
com elevada produtividade e conversão de açucares. Devem se continuar os estudos de
identificação de inibidores, seu mecanismo de ação e a determinação de níveis de tolerância e
rotas de metabolismo dos mesmos pela leveduras ou outros microorganismos alternativos na bio-
síntese de etanol.

A diluição do licor hidrolítico com o mosto de fermentação é um procedimento eficiente é provado


para reduzir o impacto negativo dos inibidores.

O estado da arte dos processos de destoxificação do licor resultante da hidrólise foi levantado. No
estágio atual estes processos estão sendo desenvolvidos em escala de laboratório, sendo
importante continuar o desenvolvimento dos mesmos.
A informação disponível não permite ainda concluir sobre: a eficiência na remoção das três
categorias de inibidores contidos no licor, as vantagens e desvantagens dos mesmos,
investimentos e custos associados a estes processos. Os estudados devem ser aprofundados.

Os processos de hidrólise e fermentação em duas etapas são os únicos disponíveis e provados


em escala de demonstração e industrial.
Os processos numa só etapa, tais como o SFS e CDM, embora de grande interesse e objeto de
intensos estudos, encontram muitas dificuldades a superar para ser levados à prática.

A fermentação das pentoses a etanol continua sendo uma barreira tecnológica difícil de superar. A
seleção de linhagens de microorganismos ou a indução de mutações para reforçar a conversão
das pentoses em etanol e a produtividade de síntese de etanol a partir destes, não atingiu até
agora resultados favoráveis.
A modificação genética de leveduras, bactérias mesofílicas e termofílicas para metabolisar as
pentoses a etanol enfrenta dificuldades para se consolidar.

Referências Bibliográficas

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13
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Zautsen, R., Rossell, C.E.V. Fermentability of hydrolizate from sugar cane bagasse. Semester Project, october 2003 -
june 2004.

Apêndice I. Questões específicas propostas no termo de referencia e posicionamentos do


autor.

1. A fermentação do hidrolisado de celulose deve ser acoplada à etapa de hidrólise ou


à fermentação do caldo de sacarose na planta de álcool?

A questão aqui formulada precisa ser vinculada a um modelo. Respondemos a mesma na base do
modelo genérico para implantação da hidrólise acima descrito.
Neste caso por se tratar de uma destilaria autônoma a mistura de correntes de fermentação
convencional com o licor de hidrólise ira a exigir uma etapa adicional de concentração do caldo a
xarope. Ademais ou a hidrólise opera somente na safra ou a destilaria produz xarope rico invertido
para operar o ano tudo. Considerando que a destilaria padrão ira a co-gerar o ano tudo e o
investimento necessário para implantar a hidrólise ira seguramente exigir operar 330 dias por ano,
será necessário determinar destas duas alternativas, aquela que apresenta mais vantagens
econômicas.
A mistura de correntes é um procedimento de redução do nível de inibidores por diluição, neste
contexto se torna interessante na medida em que reduz os custos operacionais e os
investimentos. No curto prazo é uma solução que atende usinas com destilaria autônoma que
geram melaço residual e seguramente atenderá as primeiras versões comerciais de unidades de
hidrólise de bagaço, sejam estas catalisadas por ácidos ou por enzimas. Está solução foi aplicada
nas unidades que operaram na Rússia, foi provada nos CTC em escala de laboratório e está
sendo aplicada na unidade de demonstração da Iogen.
Os inibidores da fermentação discutidos neste trabalho deverão ser reduzidos por diluição num
fator de 5 a 10, para poder conduzir a fermentação alcoólica de forma estável. Levando em conta
que a previsão é de que gradativamente estarão disponíveis grandes estoques de bagaço e palha,
a técnica por diluição não será suficiente para reduzir o impacto dos inibidores, sendo necessária
uma depuração parcial ou profunda do licor de hidrólise que complemente ou substitua a mistura
de correntes.
Definitivamente deve se continuar no desenvolvimento e posta a ponto de processos de remoção
dos inibidores contidos no licor hidrolítico.

14
Quanto aos processos de hidrólise e fermentação simultânea (SFS e CDM), encontramos forte
incompatibilidade entre a condições de hidrólise e de fermentação. Eles dependem do
desenvolvimento de um microorganismo geneticamente modificados para operar eficientemente
num ambiente termofílico, serem tolerantes ao etanol, atingir uma produtividade e uma conversão
do substrato compatível com um processo comercial. Os intentos até agora realizados mostraram
se estar aquém do desempenho mínimo.
Ainda todos estes estudos foram realizados em laboratório, em condições controladas e com
meios sintéticos, não se tendo um histórico de desempenho industrial.
A operação com microorganismos termofílicos expõe a fermentação alcoólica a condições para
contaminação com bactérias ácidas. Os processos em ambiente termofílico não tiveram sucesso
quando tentados na fermentação alcoólica convencional a partir de açúcar como substrato. A
presença de material em suspensão junto com o microorganismo responsável pela fermentação
na produção de etanol se mostra desaconselhável.
A introdução da hidrólise e fermentação simultânea implica mudar todo o processo de
fermentação alcoólica praticado no Brasil, o qual mesmo com a introdução da hidrólise ira a ser
responsável pela maior parte do etanol produzido.
Um estudo extensivo de fermentação alcoólica SFS realizado na Hungria comprovou estas
dificuldades.
A Iogen que opera a única unidade de demonstração de hidrólise enzimática em operação
descartou a alternativa de operar um processo SFS.

2. É vantajoso, do ponto de vista econômico, converter o hidrolisado de hemicelulose


em etanol ou devem ser buscadas outras alternativas para o seu uso?

O rendimento potencial de pentoses em etanol é atrativo, nossa matéria prima ligno-celulósica


(bagaço e palha) apresenta uma percentagem comparativamente elevada de hemicelulose. Assim
sendo o custo de processamento do bagaço será muito menor aproveitando as pentoses, não
podendo se prescindir no meio prazo do aproveitamento desta fração.
Quanto à produção de etanol das pentoses as barreiras tecnológicas são grandes (vide resposta à
questão 3). Por outro lado o mercado de etanol combustível não tem expectativas de saturação. A
via das pentoses traz ganhos de escala, concentração na produção de etanol, utilização
combinada da unidade de processo (fermentação quando tecnicamente possível, destilação,
desidratação, estocagem e outros).
De forma alguma o desenvolvimento da bio-transformação das pentoses em etanol deve ser
relegado, entendemos que continua sendo a opção preferencial.

Por outro lado existem outras alternativas de aproveitamento das pentoses:


• Os processos que operaram na Rússia optaram pelo aproveitamento das pentoses
para bio-síntese de proteína unicelular;
• A transformação química das pentoses (processo Biofine e outros) na rota do
furfural e seus derivados é outra alternativa;

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• Processos biológicos como a produção de butanol biocombustível ou de bio-
polímeros (do ácido lático ou do ácido 3-hidroxibutírico) também devem ser levados
em conta.

Estas rotas têm potencial de desenvolvimento em curto a meio prazo, podendo ser uma solução
alternativa para viabilizar a introdução de processos comerciais de hidrólise de bagaço a etanol.

3. É tecnicamente viável e em que prazo a introdução, nas usinas de açúcar e álcool,


de microrganismos engenheirados capazes de fermentar concomitantemente os
hidrolisados de hemicelulose e celulose?

Até o presente todos os processos fermentativos nos quais foram empregados como agente de
transformação microorganismos geneticamente modificados com sucesso aconteceram nas
seguintes condições: produto final de alto valor agregado como as especialidades farmacêuticas,
operação em pequena escala, cultura pura e operação em batelada, bioreatores de alto custo
instalado (da ordem de U$S 150.000 a 500.000 por m³ de meio), processos assépticos e contidos.
A produção de etanol difere significativamente das condições acima citadas.

As principais barreiras tecnológicas a resolver no emprego de microorganismos “engenheirados”


continuam sendo:
• Estabilidade da transformação genética;
• Exigências nutricionais específicas;
As modificações genéticas em estudo para a realização da fermentação das pentoses progridem
lentamente, as alternativas propostas ainda não atingiram resultados animadores. Na
oportunidade em que se disponha de um microrganismo geneticamente modificado, que atenda
os pré-requisitos acima estabelecidos será necessária uma etapa de comprovação em escala de
demonstração. Isto considerando estratégias de ação, projeto e implantação da unidade, posta em
operação e comprovação de resultados levara acima de 5 anos.

Em curto prazo a menos que aparecer um salto tecnológico nas barreiras ao desenvolvimento de
um microorganismo capaz de conversão eficiente das pentoses e simultaneamente das hexoses
esta probabilidade é muito baixa. È difícil predizer quanto tempo levará ainda este
desenvolvimento.

Por outro lado a produção de complexos enzimáticos de celulose que é realizada em batelada, em
reatores de tamanho comparativamente menor, em cultura tecnicamente pura, num ambiente
mais controlado, poderá sim ser realizada empregando microorganismos geneticamente
modificados. Sua implantação industrial depende unicamente do avanço no desenvolvimento
destes microorganismos (5 a 10 anos). Isto se aplicaria á obtenção de enzimas para processos
em dois estágios ou para o processo SFS.

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