Resumen: Se realizaron experimentos para dilucidar los efectos de la inoculación de una

mezcla de varias rizobacterias de vida libre; Azotobacter, Bacillus, Entuobacter y

Xanthobacter fueron recolectados y examinados para determinar la capacidad de fijación
de nitrógeno en China, en la acumulación de nitrógeno, el crecimiento y el rendimiento
de grano de las plantas de arroz. La inoculación de varias especies bacterianas aumentó
significativamente la actividad reductora de acetileno en las raíces de las plantas de arroz.
El rendimiento total de materia seca, el rendimiento de grano y la acumulación de
nitrógeno se incrementaron por la inoculación bacteriana en 6 a 13%, 15 a 18% y 10 a
24%, respectivamente, en los experimentos de 1997 y 1998. El aumento de rendimiento
de grano fue asociado con el aumento de la longitud de la raíz y el área de la hoja, y
también con el aumento del contenido de clorofila y la tasa de fotosíntesis durante el
período de llenado del grano. Se planteó la hipótesis de que la inoculación de las
rizobacterias de vida libre en las plantas de arroz llevó a un aumento de la acumulación
de nitrógeno en las plantas, la estimulación de la fotosíntesis de la hoja, especialmente en
la etapa de llenado de grano, lo que resultó en un aumento del rendimiento de grano y
materia seca.

Palabras clave: rizobacterias de vida libre, rendimiento de grano, fijación de nitrógeno,

Oryza sativa L., fotosíntesis, arroz.

En los últimos años, se ha prestado mucha atención a la producción de cultivos sostenibles

de bajos insumos, porque muchas personas están preocupadas de que la mayor cantidad
de uso de fertilizantes químicos cause varios impactos negativos en el medio ambiente a
nivel mundial o local.

Varias especies de bacterias de vida libre se encuentran en la rizosfera en estrecha

asociación con las raíces de algunas especies de cultivos, y por lo tanto, se considera que
la asociación de las bacterias con las raíces podría contribuir al crecimiento y rendimiento
de los cultivos. Los efectos de la inoculación de varias especies bacterianas del género
Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, sobre el crecimiento
y el rendimiento de los cultivos, se han examinado en diversos pastos y cultivos de
cereales (Kapulnik et al., 1981; Baldani et al., 1987; Garcia et al., 1996) y también en el
arroz (Watanabe y Lin, 1984; Yoo et al., 1986; Fujii et al., 1987), y se observaron efectos
beneficiosos evidentes en algunas especies de cultivos. Sin embargo, el mecanismo de
los efectos beneficiosos de estos diazotrofos en las plantas de cultivo no se conoce bien.

Las bacterias beneficiosas de vida libre tienen una función de fijación de nitrógeno en la
atmósfera, pero se sabe poco sobre las cantidades de nitrógeno fijo en estas interacciones
debido a las dificultades metodológicas en la medición (Boddey, 1987). O'Hara et al.
(1981) sugirieron que la cantidad de nitrógeno fijo en estas interacciones era pequeña, lo
que llevó a la idea de que las bacterias de vida libre tenían algunas funciones beneficiosas
para promover el crecimiento de las plantas, aparte de la fijación de nitrógeno.

Algunos investigadores informaron que las hormonas de crecimiento de las plantas

producidas por las bacterias podría afectar la interacción entre la bacteria y la planta
(Barea y Brown, 1974; Tien et al., 1979). Para efectos exitosos de la inoculación, muchos
autores han recomendado el uso de cepas bacterianas aisladas de la misma especie de
cultivo (Boddey et al., 1986). La inoculación bacteriana no siempre resulta en respuestas
persistentes, debido a factores ecológicos y condiciones ambientales variables (Lynch,
1990). Los efectos de la inoculación de una sola especie bacteriana han sido examinados
en muchos cultivos. Sin embargo, solo se han llevado a cabo algunos estudios sobre los
efectos de una mezcla de varias especies de bacterias (Fayez, 1990; Garcia et al., 1996).
Cui aisló 200 especies de rizobacterias de vida libre de diferentes regiones de China y las
probó para determinar su actividad de inducción de acetil por separado y en varias
combinaciones. Cui et al. (1996) encontraron que una mezcla de diferentes cepas
bacterianas mostró una actividad reductora de acetileno significativamente mayor que
cualquier cepa individual. El presente experimento fue diseñado para dilucidar los efectos
beneficiosos de la inoculación de una mezcla de varias especies de bacterias en términos
de la acumulación de nitrógeno, el rendimiento total de materia seca y el rendimiento de
grano en plantas de arroz (Oryza sativa L.)

Materiales y métodos

El primer experimento se realizó en 1996 para examinar los efectos de la inoculación

bacteriana sobre la actividad de la nitrogenasa en las raíces escindidas, y el segundo
experimento se realizó en 1997 y 1998 para dilucidar los efectos beneficiosos de la
inoculación bacteriana sobre la acumulación de nitrógeno, la producción de materia seca
y el rendimiento de grano. de plantas de arroz.

En todos los experimentos, se utilizaron plantas en macetas. El suelo para las macetas se
tomó de la capa superior (0-20 cm) de un campo donde se habían plantado previamente
plantas de arroz. La acidez del suelo estuvo en el rango de pH 6.7 a 6.9. El suelo se secó
al aire, se trituró para pasar un tamiz de 2 mm y se vertió en macetas de plástico, sin
agregar ningún fertilizante, a una tasa de 3.5 kg por maceta en el experimento de 1996, y
10 kg por maceta en los experimentos de 1997 y 1998. El suelo se enturbió en la maceta,
luego se mantuvo bajo condiciones de inundación durante una semana antes de la
siembra. Los experimentos se llevaron a cabo en un diseño de bloques completamente al
azar con tres macetas replicadas para cada tratamiento. Todos los datos fueron
Sometido a un análisis de varianza (ANOVA) para determinar los efectos de los
tratamientos. Se usó la diferencia menos significativa (LSD) protegida de Fisher para la
comparación de las medias.

Experimento en 1996

Se inoculó una mezcla de seis inóculos bacterianos diferentes: Azotobacter nigricans, A.

armeniacus, Bacillus sphaericus, B. megaterium, Enterobacter y Xanthobacter. La
primera inoculación se realizó sumergiendo las raíces de las plántulas de plantas de arroz
de 29 días (Oryza sativa L. cv. Nipponbare) en el cultivo en suspensión de una mezcla de
diferentes tipos de bacterias (aproximadamente 10 8 células mL - 1) para 24 h. Se usó
suspensión de cultivo autoclavado como control. Las plántulas se trasplantaron el 2 de
julio de 1996, a razón de tres plántulas hill- 1 por- 1, y se cultivaron en el campo bajo un
techo de plástico para evitar la perturbación causada por la lluvia. La inoculación se
repitió a los 30 y 60 d después del trasplante, mediante la inyección de 10 ml de
suspensión de bacterias o una suspensión en autoclave con una jeringa en el suelo
alrededor de las raíces de la planta en la maceta. A los 50, 70 y 90 días después del
trasplante, se sacaron las plantas del suelo y se sacudieron las raíces para eliminar el suelo
y se usaron para un ensayo inmediato de la actividad reductora de acetileno. Para el
ensayo de la actividad reductora de acetileno, se pusieron raíces aisladas en el tubo de
ensayo y se incubaron a 30 ° C en el aire con C2H2 al 10%. • Después de 18 h de
incubación, la producción de C2H4 se determinó mediante cromatografía de gases (GC).
-14A, Shimadzu Co. Ltd, Japón). Después del ensayo de la actividad reductora de
acetileno, se determinó que el peso seco de la muestra de la raíz expresaba la tasa de
reducción de acetil por unidad de peso de la raíz.
Experimento en 1997

Las plántulas de plantas de arroz de veintiocho días de edad (cv. Koshihikari) a las que
se realizó la primera inoculación con los mismos procedimientos que en el experimento
de 1996, se transplantaron el 15 de mayo de 1997, a la tasa de tres plantas de semillero
colina 1 1. Treinta y 60 d después del trasplante,

la inoculación se repitió inyectando 20 ml de suspensión de cultivo de bacterias o

suspensión en autoclave de la misma manera que en 1996.
El área foliar se midió a los 45 días después del trasplante con un medidor de área foliar
(Modelo AAM-7, Hayashi Denko Co. Ltd, Japón). Las plantas fueron cosechadas el 26
de septiembre de 1997, y Se escindieron diferentes partes de las plantas para medir el
peso seco y el contenido de nitrógeno. Los pesos de materia seca de diferentes partes de
la planta se determinaron después de secar a 80 ° C durante 72 h en un horno de aire
forzado. El contenido de nitrógeno se midió por el método Kjeldahl como
modificado por Muraki et al. (1992).

Experimento en 1998

El 17 de mayo de 1998 se trasplantaron plántulas de plantas de arroz de veintiocho días

(cv. Koshihikari) a cada maceta, y se inocularon con una mezcla de cuatro bacterias
diferentes: Azotobacter nigricans, A. armeniacus, Bacillus sphaericus y B .material. El
procedimiento de inoculación y las condiciones de crecimiento fueron los mismos que en
1997.

Después de la partida, el tipo de cambio de C02 se determinó en el campo a un intervalo

de 7 días con un sistema de medición de intercambio de gas portátil (CIRAS-1 PP
Systems, Stotfold, Reino Unido). La medición se realizó para la hoja bandera bajo
irradiación de saturación (1500, umol m-2 s-1) que fue

Obtenido por luz suplementaria de una lámpara halógena. El contenido de clorofila se

determinó en la hoja bandera con un espectrofotómetro (Beckman DU-640, EE. UU.)
Según Schmid (1971). En la cosecha del 29 de septiembre de 1998, la longitud de la raíz
se midió con un escáner de raíces (Comair Root Length Scanner, Commonwealth aircraft
Corp. Ltd, Australia). El contenido de nitrógeno en diferentes partes de la planta se
determinó utilizando un analizador automático de N-C altamente sensible (SUMIGRAPH
NC-90).

Resultados

La actividad de la nitrogenasa se determinó en las raíces inoculadas con las bacterias

mixtas mediante la medición de la actividad reductora de acetileno (Tabla 1). La actividad
de la nitrogenasa en la planta inoculada fue 15, 75 y 59% más alta que en la planta control,
a los 50, 70 y 90 días después del trasplante, respectivamente. El área foliar también fue
significativamente mayor (en un 11,9%) en las plantas inoculadas que en el control a los
45 días después del trasplante (Tabla 2), y la longitud de la raíz de las plantas inoculadas
fue significativamente más larga (en un 28,4%) que la de las plantas control. en el
momento de la cosecha (Tabla 3). El efecto de la inoculación bacteriana sobre la
acumulación de nitrógeno se examinó en 1997 y 1998.

Los resultados demostraron claramente que el contenido de lola! El nitrógeno fue

significativamente mayor en las plantas inoculadas que en el control en ambos años
(Tabla 4). El contenido de nitrógeno en el brote, la raíz y el grano de las plantas inoculadas
fue 11.4, 23.7 y 6.3%, respectivamente, más alto que el control en 1997. En 1998, se
observaron efectos significativamente mayores de la inoculación que en 1997; el aumento
de la acumulación de nitrógeno fue de 27.3, 52.4 y 17.6% sobre el control, en el brote, la
raíz y el grano, respectivamente. El contenido de clorofila de la hoja también se determinó
en la hoja bandera a intervalos de 8 días después de la partida durante el período de
llenado del grano. La inoculación bacteriana condujo al aumento evidente del contenido
de clorofila, particularmente en la última etapa del llenado del grano (Fig. I). La tasa
fotosintética en la hoja bandera medida a intervalos de 7 días mostró un cambio similar
al del contenido total de clorofila, mostrando la diferencia máxima entre las plantas
inoculadas y de control en los últimos días antes de la cosecha (Fig. 2). En el último tanto
en 1997 como en 1998, la inoculación aumentó la producción total de materia seca y
también la producción de grano. El peso seco total se incrementó en un 6% en 1997 y en
un 13% en 1998 (Tabla 5). La inoculación aumentó significativamente el rendimiento de
grano en un 15% y 18% en 1997 y 1998, respectivamente. El análisis de los componentes
de rendimiento en ambos años indicó que las plantas inoculadas tenían un porcentaje de
grano relleno significativamente mayor que las plantas de control. Se consideró que el
aumento en el porcentaje de granos rellenos llevó a rendimientos de grano
significativamente más altos en las plantas inoculadas.

Discusión

Los experimentos realizados en 1997 y 1998 mostraron un aumento significativo en el

rendimiento de grano por la inoculación con una mezcla de varias bacterias, lo que estaba
de acuerdo con otros informes en arroz (Watanabe y Lin, 1984) y en trigo (Bhattarai y
Hess, 1993). Watanabe y Lin (1984) informaron que el aumento en el rendimiento de
grano obtenido por la inoculación bacteriana se derivó del aumento en el porcentaje de
granos rellenos. El aumento del porcentaje puede deberse a los efectos estimulantes de
las bacterias en el período de llenado del grano. En el presente estudio, observamos un
aumento de la fotosíntesis de la hoja durante el período de llenado del grano debido a la
inoculación (Fig. 2), y este aumento de la fotosíntesis de la hoja se asoció con el aumento
del contenido de clorofila de la hoja en ese período (Figura 1). Por lo tanto, el aumento
de la fotosíntesis de la hoja en las plantas inoculadas se atribuyó en parte al aumento del
contenido de clorofila de la hoja debido a la inoculación bacteriana, y este aumento de la
fotosíntesis de la hoja podría ser responsable del aumento del porcentaje de granos
rellenos. Dado que el área de la hoja en las plantas inoculadas fue mayor que en el control
a los 45 días después del trasplante (Tabla 2), y durante el período de llenado del grano
(datos no mostrados), consideramos que junto con el aumento de la actividad
fotosintética, la significativa el aumento en el área de la hoja también podría contribuir al
aumento de la asimilación de carbono fotosintético total durante el período de llenado del
grano. Se observó un aumento en el área foliar por la inoculación bacteriana en el sorgo
(Sarig et al., 1988). La inoculación de bacterias también podría estimular el alargamiento
de la raíz y el agrandamiento del área de la superficie de la raíz como se ha informado
anteriormente (Fulchieri et al., 1993; Khawas y Adachi, 1999).

Junto con los efectos sobre la expansión del área foliar, es cierto que la inoculación
bacteriana puede estimular el crecimiento de los órganos vegetativos, aunque aún se
desconoce el mecanismo preciso de la promoción del crecimiento mediante la inoculación
bacteriana. La actividad reductora de acetileno medida en el presente experimento mostró
valores más altos en las plantas inoculadas con bacterias que en las plantas de control. Lo
mismo ha sido reportado por otros (Cohen et al., 1980; Watanabe y Lin, 1984). Sin
embargo, varios documentos en los que se midió la actividad reductora de acetileno,
sugirieron que la cantidad de nitrógeno fijada por las bacterias de vida libre es baja, y no
podría contribuir significativamente a las necesidades de nitrógeno de las plantas (O'Hara
et al., 1981; Smith et al., 1984). En este documento, la cantidad de nitrógeno total se
incrementó por la inoculación con bacterias en ambos años, y esto sugiere que las
rizobacterias de vida libre pueden tener algunos efectos sobre la acumulación de
nitrógeno en las plantas inoculadas. Cohen et al. (1980) realizó un experimento de
inoculación con mijo de maíz dulce y cola de zorra, y presentó un resultado y una
hipótesis similares. Los mecanismos exactos involucrados en estos efectos estimulantes
de la inoculación de rizobacterias en la acumulación de nitrógeno aún no están claros.
Hay varios mecanismos posibles distintos de la fijación de N2 en la atmósfera por los
efectos beneficiosos de las bacterias en el crecimiento de plantas inoculadas. Uno puede
ser que las bacterias producen hormonas de crecimiento de las plantas, como el ácido
giberélico, el ácido indol-3-acético y la citoquinina, que promueven el crecimiento de las
plantas (Barea y Brown, 1974; Tien et al., 1979). Glick et al. (1994b) también sugirieron
que las rizobacterias sintetizan algunos compuestos de bajo peso molecular o enzimas
que no están bien caracterizadas y que pueden modular el crecimiento y desarrollo de las
plantas. Lin et al. (1983) informaron que la absorción de nutrientes de las plantas se puede
mejorar mediante la inoculación con bacterias de vida libre. Además, Brown (1974)
sugirió otro mecanismo para que las enfermedades pudieran ser eliminadas por la
inoculación bacteriana, que a su vez, estimula el crecimiento de la planta. El crecimiento
y el rendimiento de las plantas de arroz podrían, por lo tanto, verse afectados por uno o
más de estos mecanismos. Este estudio mostró que una mezcla de varias cepas de
rizobacterias de vida libre inoculadas dentro de la rizosfera del arroz mejoró el
rendimiento de la planta. Sin embargo, la potencialidad de la mezcla de rizobacterias de
vida libre del establecimiento y la actividad de las bacterias y su asociación con el arroz
requiere más investigación.
Agradecimientos

Este estudio fue financiado en parte por el Subsidio en ayuda del Ministerio de Educación,
Ciencia, Deportes y Cultura a R. Ishii (NO. 10306002)