1.

Datos de RNA-seq de soja

Los datos de secuenciación de RNA (RNA-seq) de soja L29, que llevan la secuencia Rsv3,
se obtuvieron previamente de “La proteína fosfatasa tipo 2C, que es un regulador clave de la
propagación de virus de resistencia extrema antiviral”.
Se generaron 10 bibliotecas a partir de plantas tratadas de forma simulada, plantas infectadas
con SMV-G5H y plantas infectadas con SMV-G7H tomándose muestras a las 8, 24 y 54 horas
después de la infección.
2. Anotaciones de las Funciones Genéticas
Con Phytozome y las bases de datos EXPath se anotaron los genes v1.0 en el conjunto v2.0
Las anotaciones de un genoma ayudan a los científicos a entender qué significa su secuencia,
cómo está estructurado y cómo funciona. La parte fundamental de los métodos de anotación
es la localización de genes en un genoma, así como la determinación de su estructura y de las
proteínas que producen.
Phytozome, el portal de Genómica Comparativa de Plantas es un centro para acceder,
visualizar y analizar genomas de plantas, así como genomas seleccionados y conjuntos de
datos.
La herramienta EXPath, se desarrolló para la anotación de la ruta y el análisis comparativo
de los perfiles de expresión génica en diversas condiciones y así inferir rutas metabólicas.
3. Análisis de vías
Utilizando EXPath se analizó los RNA-seq para obtener listas de genes expresados
diferencialmente (DEGs).
Un gen se declara expresado diferencialmente si una diferencia observada o un cambio
en los recuentos de lectura o los niveles de expresión entre dos condiciones
experimentales es estadísticamente significativo.
Los DEG que no fueron compartidos por las plantas inoculadas de forma simulada o
inoculadas con G7H se analizó en busca de sus perfiles de Enrutamiento de Vías.
4. Diagramas y mapas de calor de Venn
Los diagramas de Venn que agrupan los Genes de Expresión diferencial se generaron
utilizando la herramienta gráfica en línea:
(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)
Los mapas de calor para los genes implicados en las vías hormonales fueron generados por
Heatmapper, herramienta gráfica en línea: (http://www.heatmapper.ca/)
5. Tratamiento con Ácido Abscísico (ABA)
Las primeras hojas trifoliadas de la línea L29 (de 16 días) se rociaron con ABA (100 μM) o
simulada (metanol al 0.1%) 24 horas antes de la inoculación con SMV-G7H-GFP (Green
Protein Fluorescent, proteína que se utiliza como marcador para dilucidar procesos en células
y organismos). Las plantas recibieron otro tratamiento con ABA dos días después de la
infección (dpi) y se recolectaron muestras de 5 dpi para su análisis.
6. Infección vírica
Las dos hojas unifoliadas de las plantas L29 se infectaron con 10 μM/hoja de plásmido
pSMV-G7H-GFP (para la caracterización in vivo de la red de interacción de proteínas
celulares de la soja). Un grupo de hojas de 4 plantas se mezclaron y se dividieron en alicuotas
de 0.1 g como fuente de inóculos de virus. Se agito 1 mL de tampón fosfato con 0.1g de
tejidos infectados y se centrifugó durante 10 minutos a 13 000 rpm.

7. Análisis de ARN
El ARN total se extrajo utilizando un kit de extracción de ARN (Bio Cube) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se utilizó 1 μg de ARN total para la síntesis de ADN
complementario (ADNc) utilizando el kit GoScript. La RT-qPCR cuantitativa en tiempo real
se llevó a cabo con SYBR-Green (reportero fluorescente) para medir la expresión relativa de
los genes diana.

El RT-qPCR en tiempo real se basa la incorporación de reporteros fluorescentes al ADN

durante cada ciclo de la reacción de PCR realizada bajo luz UV. El objetivo de la PCR en
tiempo real ha sido detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos
mediante el uso de reporteros fluorescentes en la reacción. El principio de la técnica se basa
en la PCR clásica, sólo que la forma en cómo se detectan y analizan los productos de la
amplificación es diferente. El término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar
la cantidad de ADN en la muestra, a diferencia de la PCR clásica, en donde no es posible
detectar en tiempo real ni cuantificar la secuencia blanco. La nomenclatura qPCR que se usa
si utilizamos ADN genómico pero, si primero obtenemos ADNc a partir de ARN y la enzima
retrotranscriptasa, y, luego hacemos la PCR, nos referimos a una RT-qPCR
Los reporteros fluorescentes tienen afinidad por el ADN de doble cadena y, al ser oxidados,
generan una señal fluorescente. La fluorescencia emitida es capturada en la etapa de extensión
de cada ciclo y es proporcional al número de copias de ADN de doble cadena obtenidas en
cada ciclo. El reportero más usado para estos fines se llama SYBR Green, esta molécula,
cargada positivamente, cuando está sin unirse al ADN de doble cadena, prácticamente no
emite fluorescencia; sin embargo, cuando se une al surco menor del ADN incrementa hasta
1,000 veces su fluorescencia, dando como resultado la cantidad de ADN que se produce.
8. Transferencia de Proteínas
La proteína total se extrajo de 0.1g del conjunto de hojas inoculadas de 3 plantas (descrito en
Infección vírica). La detección del SMV-G7H-GFP se llevó a cabo con transferencia de
proteínas utilizando un anticuerpo policlonal antiGFP.
Western blot, es una técnica analítica que identifica proteínas específicas en una mezcla de
proteínas, tal como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza
tres etapas para lograr esto: 1) separación por tamaño, 2) transferencia a un soporte sólido y,
3) visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o
secundarios apropiados
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee:
peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. (existen tantas posibilidades como tipos de
electroforesis), luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de
nitrocelulosa) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.
Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática o fluorescencia
(u otros métodos). De esta misma forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el
extracto y analizar su cantidad relativa respecto a las otras proteínas.