AGROBIOTECNOLOGIA

CURSO 2016 -

Transformación Genética de Especies Vegetales

Dra. Marisa LOPEZ BILBAO

lopezbilbao.marisa@inta.gob.ar

Instituto de Biotecnología, INTA

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
 -
Para transformar una especie vegetal

Mercedes R
Sistema de cultivo de tejidos Vector de Transformación (gen de
Eficiente y reproducible, interés, gen de selección, promotor,
Descendencia fértil otras secuencias regulatorias)

Método de selección
(Sin escapes) Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)

Ensayos de transformación

Analizar las plantas obtenidas (presencia,

estabilidad y nivel de expresión del transgén)
 Sistemas de transferencia genética en plantas

-
• Sistemas de transferencia de ADN basados
en vectores biológicos

- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens

y Agrobacterium rhizogenes

- Sistemas basados en virus vegetales

Entrega: Cepa de
Agrobacterium o
Gen Gun (otros • Sistemas de transferencia directa de ADN
métodos menos
usados) - Transferencia por biobalística

- Transferencia mediada por cationes divalentes

y/o electroporación

- Transferencia por microinyección

 Biología de Agrobacterium tumefaciens

Procesos celulares involucrados Procesos celulares Etapas de infección

-
en las etapas de interacción entre
Agrobacterium se une a
la bacteria y la planta -
Reconocimiento célula célula la célula húesped
Agrobacterium tumefaciens
BI BD
Formación del complejo T
Procesamiento del ADN inmaduro, compuesto por
VirD2 y la hebra T

Hebra T

Formación del complejo T

maduro, compuesto por
Empaquetamiento del VirD2 y la hebra T cubierta
ADN por VirE2

Formación del pilus para el

Tumor de tallo provocado
transporte del complejo T
por Agrobacterium tumefaciens Transporte intercelular dentro de la célula húesped

Importación de la hebra T al
Importación al núcleo núcleo de la célula húesped

Integración del ADN Integración de la hebra T y la

y expresión de los genes formación del tumor

Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.

 Biología de Agrobacterium tumefaciens

Mapa genético del plásmido

Ti de octopina
 -

Mapa genético del

plásmido Ti de
octopina

Estructura de la
región T de un
plásmido Ti de
octopina
Mecanismos moleculares implicados en la transformación por Agrobacterium tumefaciens

-
2

Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.

 -

Agrobacterium
tumefaciens posee
un sistema
regulatorio de dos
componentes para
reconocer las
células vegetales
susceptibles
Procesamiento de la hebra T y formación Ensamblaje de las proteínas de Agrobacterium
del complejo T maduro involucradas en el transporte del complejo T

VirB2

Se requieren
600 moléculas
de VirE2 para Una única molécula
recubrir los 20 de proteína VirD2 se
Kbp del ADN-T halla unida
covalentemente al
extremo 5’ del DNA.
 -

La integración
del ADN-T al genoma
de la célula vegetal
involucra
el apareamiento
no homólogo entre
éste y el ADN
cromosómico

(1) y (3): digestión de las cadenas desplazadas de ADN

de la planta por endonucleasas. (2): digestión del
extremo no apareado
del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes
en la cadena desapareada del ADN de la planta
 -

Protocolos de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens

Se obtienen plantas y su descendencia

Transformación estable portadoras del transgén
Transformación transiente No se hereda y se usa para estudios en
el laboratorio de función, especificidad,
nivel de expresión, etc
 Transformación estable
Desinfección
Transformación Explanto inicial
semillas en -
girasol Germinación germinación

Agroinfección
&
Transformación Explanto inicial plantas maduras Co-cultivo
en macetas
tabaco
Re1

Re2

Kan
Regeneración 50 mg/L
Re3

Re4

Enraizamiento RA

Invernáculo
 -

Transformación lechuga Explanto inicial cotiledones expandidos y verdes

 Transformación estable

Transformación
estable por floral dip
en Arabidopsis
 -
Bombardeo en hojas de cebolla
Agroinfiltración en Nicotiana benthamiana

Evaluación
sobre el
explanto
inicial a los ¾
días de la
agroinfección
«estable» de
girasol
 Protocolos de transformación mediante Agrobacterium rhizongenes

Cultivo de raíces de tabaco transformadas

por Agrobacterium rhizogenes

Tumor de raíces producido por

Agrobacterium
rhizogenes en discos de remolacha

Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus

No se necesita marcador de selección porque se ve

directamente la raíz
Protocolos de transformación mediante Agrobacterium rhizogenes

Genetic transformation of
Calibrachoa excellens via
Agrobacterium rhizogenes:
Changing morphological
traits
 Transformación estable

-
El uso de Agrobacterias implica el agregado de antibióticos para eliminar la
bacteria del medio de cultivo de plantas
Los más utilizados son cefotaxina, carbenicilina, timentina, augmentina.
La evaluación de estos antibióticos se realiza casi al mismo tiempo que la
puesta a punto del protocolo de cultivo de tejidos
 Sistemas de transferencia directa de ADN
• Ventajas -

- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos

vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal

- No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas
transgénicas

- Requieren construcciones más simples y pequeñas

- Son apropiados para estudios de expresión transitoria

• Desventajas
- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del
vector en varios sitios del genoma de las células transformadas

- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes

 Acelerador de micropartículas PDS 1000/He -
Bombardeo de
por descarga de helio a alta presión
micropartículas
Modelo comercial actual
1984. Sandford et al.,
describen la técnica de Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
bombardeo de
micropartículas para la Interruptores de control

transferencia directa de Medidor de vacío

Portador del disco
ADN (Universidad de de ruptura
Cornell, EEUU). Portador del
macroproyectil
Ensamblaje del propulsor
de microproyectiles

Cámara de
bombardeo

Células blanco

Soportedel
Soporte del tejido
blancoblanco

Válvula de medición
de helio

Controles del flujo

de aire y de vacío
 • Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia
- del
ADN
- Método de aceleración de las micropartículas

- Naturaleza química y física, densidad y volumen de micropartículas

- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración del ADN

La transformación
- Vacío y distancias de bombardeo
por biobalística
depende de - Diámetro de apertura de la placa de retención
factores físicos, - Número de bombardeos
químicos
y biológicos • Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada
- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y genes marcadores
de selección

• Parámetros relacionados con el tejido o células blanco

 -
- Transferencia de genes a células,
tejidos y órganos vegetales

- Transferencia de genes a
microorganismos y organelas
(cloroplastos)

- Estudio de expresión transitoria

- Análisis de promotores y de
delección de genes

- Estudio de mecanismos de
expresión. y regulación de genes

- Transferencia de ARN viral

 -

Transformación
genética de plantas in
vivo usando una
pistola génica Helios
 Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas

Transformación de Festuca arundinacea

-
a partir de suspensiones celulares
A B
Tipos de explantos
A B C

D E F
M

P
C D

A y B: callos de maíz. C: brotes

primordiales de maíz. D y E: callos y
brotes de soja. F: ápice de una plántula
de algodón de 4 días (M: meristema
apical y P: primordio foliar). A: suspensión de células de Festuca arundinacea sobre papel de filtro
antes del bombardeo. B: selección de células transformadas en medio
de selección conteniendo higromicina. C y D: plántulas transgénicas
de Festuca arundinacea regeneradas a partir de callos resistentes.
 Transferencia de ADN mediada por electroporación y/o
métodos químicos
-

Electroporación de protoplastos

Pulsador de Cubetas de
electroporación electroporación
 A B -

Cultivo y regeneración de
protoplastos de tabaco

C D

E F
 Aislamiento y electroporación de protoplastos de Citrus sinensis
-
(naranjo dulce) con el gen gfp

Línea celular embriogénica Protoplastos luego de Callos embriogénicos de 4

usada como fuente la electroporación semanas derivados de protoplastos
de protoplastos

Protoplasto fluorescente Callos embriogénicos GFP positivos a los 6 Planta regenerada a partir de
a las 24 h de la electroporación meses de la transformación callos en selección positiva
Expresión estable de genes transferidos a protoplastos de plantas por métodos
químicos y/o electroporación
-
Gen marcador de
Tipo de
Especie Técnica de transformación selección / agente de
transgénico
selección
Nicotiana tabacum Métodos químicos Plantas fértiles npt II / kanamicina
Lolium multiflorum Métodos químicos Callos npt II / kanamicina
Triticum monococcum Métodos químicos Callos npt II / kanamicina
Brassica campestris Métodos químicos Callos npt II / kanamicina
Petunia hybrida Métodos químicos Plantas npt II / kanamicina
Brassica napus Electroporación Callos npt II / kanamicina

Panicum maximum Electroporación Callos dhfr / metotrexato

Oryza sativa (Japonica) Electroporación Plantas fértiles hpt / higromicina
Dactylis glomerata Métodos químicos / Electroporación Plantas hpt / higromicina
Solanum tuberosum Electroporación Plantas fértiles npt II / kanamicina
hpt / higromicina
als / clorosulfuron
Arabidopsis thaliana Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina
Oryza sativa (Indica) Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina
Festuca arundinacea Métodos químicos Plantas fértiles hpt / higromicina
pat / fosfinotricina
Zea mays Métodos químicos Plantas fértiles npt II / kanamicina
pat / fosfinotricina
 -

La capacidad de Agrobacterium
tumefaciens de introducir ADN
en el genoma de la planta permitió
desarrollar vectores plasmídicos
basados en el plásmido Ti
 Vectores basados en el plásmidos T

-
Mapa de restricción
de los plásmidos
pBIN19; pPZP111;
pMON10098;
pGreen0029.

Abreviaturas:
BI: borde izquierdo; ori:
origen de replicación;
BD: borde derecho
GATEWAY vectors for
Agrobacterium-mediated plant
transformation
Mansour Karimi, Dirk Inzé and Ann
Depicker
TRENDS in Plant Science Vol.7 No.5 May
2002
 Genes Reporteros

Permiten ver la expresión del transgen (reportero) -

GUS Gen de la β glucuronidasa

GFP (green fluorescent protein) No es destructiva

Otras proteínas fluorescentes

 Genes reporteros utilizados en transformación de plantas
-

Genes reporteros Abreviatura Origen Detección

-glucuronidasa gus/uidA E. coli Fluorométrico (cuantitativo)

o histoquímico (in situ),
no radiactivo

Proteína de fluorescencia GFP Aequorea victoria Fluorescencia,

verde no destructiva

Cloranfenicol Cat E. Coli Ensayo radiactivo

acetiltransferasa sensitivo, semi cuantitativo

Luciferasa Luc Photinus pyralis Luminiscencia

Luciferasa luxA, luxB Vibrio harveyi Luminiscencia

 Ejemplo de utilización del gen reportero uid A

-
Promotores constitutivos vs tejido específico
 Promotores

• Promotores constitutivos
• todos los tejidos
• independiente de factores ambientales
• activos entre especies y reinos

• Promotores inducibles
– expresión dependiente de factores externos
– factores abióticos (luz, temperatura, heridas)
– factores bióticos (ataque patógenos)

• Promotores tejido o desarrollo específico

– expresión restringida en tiempo y/o espacio
– desde órganos completos durante todo el desarrollo hasta pocas células en
corto tiempo
– órgano especifico (semillas)
 -

Esqueleto del vector

Bordes Izquierdo y Derecho
Gene de selección en bacterias (en E coli y en Agrobacterium)
Genes Reporteros o Genes de Interés
Promotores
Terminadores
Secuencias Enhancer
 Genes de selección
Genes Marcadores ó Diferenciar células
-

de Selección transformadas de las

no transformadas

Selección negativa vs Selección Positiva manosa-6P

manosa–6P
 Manosa y otros azúcares isomerasa
 Antibióticos
Kanamicina,
Higromicina, fructosa-6P
Gentamicina,

 Fosfito
Evaluation of the
Glufosinato de sensitivity of
 Herbicidas Arabidopsis transgenic
amonio plants to phosphate
Glifosato (Pi) or phosphite (Phi)
as a phosphorus (P)
source
 Ejemplos de genes de selección

Gen de selección Producto genético Fuente Selección -

nptII Neomicina fosfotransferasa Tn5 Kanamicina, G418,

paromomicina, neomicina

Ble Resistencia a bleomicina Tn5 y Streptoalloteichus Bleomicina, fleomicina

hindustanus

dhfr Dihidrofolato reductasa Plásmido R67 Metotrexato

cat Cloranfenicol acetil Fago p1Cm Cloranfenicol

transferasa

aphIV Higromicina fosfotransferasa E. coli Higromicina B

SPT Estreptomicina Tn5 Estreptomicina

fosfotransferasa

aacC3, aacC4 Gentamicin-3-N- Serratia marcescens; Gentamicina

acetiltransferasa Klebsiella pneumoniae

bar Fosfinotricin acetil Streptomices Fosfinotricina, bialofos

transferasa hygroscopicus

EPSP 5-enolpiruvilshikimato-3- Petunia hybrida Glifosato

fosfato sintasa

ptxD / NAD-dependent phosphite dehydrogenase (oxidizes Phi into Pi) / Pseudomonas stutzeri
 -

Ya tenemos todos los elementos necesarios, por lo

que podemos armar un vector de transformación
Después de los ensayos de transformación, sigue Análisis T1, T2……

Diseño experimental para los ensayos en semillas de plantas transgenicas

-
 -
14 líneas T1 PrHaAP10

Ensayos fluorométricos

Ensayos histoquímicos
 -

Líneas T2
 -

¿Y este es el final del trabajo en un laboratorio con plantas

transgénicas??

Luego comienza el camino de los desafíos a los estreses, analizar

la equivalencia sustantiva, observar si aparece el silenciamiento
génico, la estabilidad de los transgenes, los niveles de expresión,
etc.
Esto en invernáculos de bioseguridad

Y así comienza el camino de la desregulación (Fase I).

Por último comenzar el camino de la desregulación en Fase II

que son las pruebas a campo
 Transgénicas Bt
(resistencia a
insectos)

Transgénicas RR
(resistencia a
herbicidas)

Resistencia a virus

Modificaciones en
rutas metabólicas

Pocas especies
vegetales soja,
maíz, algodón,
canola, remolacha
azucarera, calabaza,
berenjena, papa, papaya,
alamo
 -

Caña de azúcar Chacra Experimental Santa Rosa/EEA

Obispo Colombres Resistencia a herbicida y a virosis
Trigo-Maíz-Alfalfa INDEAR Resistencia a estrés abiótico
Sorgo Advanta Eficiencia en el uso del Nitrogeno
Naranjo UBA Resistencia a Cancrosis

En el INTA

Alfalfa: resistencia a insectos, manipulación de la senescencia,

tolerancia a sequía, tolerancia a salinidad, molecular farming
Maíz: tolerancia a sequía
Lechuga: resistencia a patógenos
Trigo: tolerancia a sequía
Algodón: resistencia a insectos
Papa: resistencia a patógenos
Tomate: tolerancia a sequía, mayor contenido de vitamina E