UNIVERSIDAD NACIONAL DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

LABORATORIO CLÍNICO E HISTOPATOLÓGICO

BIOLOGÍA CELULAR

DOCENTE: Msc. Iván Peñafiel Méndez

INTEGRANTES:

1. Almeida Adriana
2. Barrigas Evelyn
3. Calle Valeria

GRUPO:#1

TEMA:

 Principales células de estudio e importancia en el laboratorio clínico

 Métodos y técnicas de identificación de células en material biológico.

FECHA DE ENTREGA:19-12-2018

OCTUBRE 2018 – MARZO 2019

 CALIFICACIÓN Y TRABAJO

100% 50% 25% 0%

1.Almeida X
Adriana
2.Barrigas X
Evelyn
3.Calle X
Valeria

CALIFICACIÓN GRUPAL
Objetivo General:
Conocer la importancia que poseen las principales células obtenidas del material
biológico en el laboratorio clínico.

Objetivos Específicos:
1. Identificar qué tipos de células se pueden identificar en la visualización del
material biológico.
2. Analizar los métodos y técnicas más utilizados para la identificación celular.
3. Determinar qué tipo de material biológico se pueden utilizar para la observación
de células.

Marco Teórico

PRINCIPALES CÉLULAS DE ESTUDIO E IMPORTANCIA EN EL

LABORATORIO CLÍNICO

Introducción

La idea de que las células son las unidades fundamentales de los organismos vivos es
parte de la teoría celular. La mayor parte de las células son microscópicas, pero su
tamaño y forma varían en un rango muy amplio, lo cual se relaciona con las funciones
que éstas realizan. Los organismos pueden clasificarse en dos grupos fundamentalmente
diferentes, según la estructura y complejidad de sus células en eucariotes y procariotes.

Los primeros científicos, como Athanasius Kircher en 1657, describieron

“gusanos” en la sangre, y Anton van Leeuwenhoek en 1674 les dio el nombre de
glóbulos rojos, pero recién a fines de 1800 Giulio Bizzozero describió las plaquetas
como “placas pequeñas”. El desarrollo de la tinción de Wright por James Homer Wright
en 1902 abrió un nuevo mundo del examen visual de la sangre a través del microscopio.
Aunque ahora muchos instrumentos automatizados permiten diferenciar y contar las
células sanguíneas, la tinción de Wright, y las modificaciones posteriores, siguen siendo
el centro de la identificación de las células sanguíneas. En el laboratorio de hematología
actual se analiza el aspecto de los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas en forma
visual mediante el examen por microscopia óptica de las células fijadas a un
portaobjetos y teñidas con tinción de Wright o de Wright-Giemsa. El término científico
para expresar el aspecto de la célula es morfología, que abarca el color, el tamaño, la
forma, las inclusiones citoplasmáticas y la condensación nuclear.

SANGRE

Sangre, sustancia líquida que circula por las arterias y las venas del organismo. La
sangre es roja brillante o escarlata cuando ha sido oxigenada en los pulmones y pasa a
las arterias; adquiere una tonalidad más azulada cuando ha cedido su oxígeno para nutrir
los tejidos del organismo y regresa a los pulmones a través de las venas y de los
pequeños vasos denominados capilares. El cuerpo humano posee cinco litros de sangre
en su totalidad.

COMPOSICIÓN DE LA SANGRE: En una persona normal sana, el 45%

del volumen de su sangre son células, glóbulos rojos (la mayoría), glóbulos blancos y
plaquetas. Un fluido claro y amarillento, llamado plasma, constituye el resto de la
sangre. El plasma, del cual el 95% es agua, contiene también nutrientes
como glucosa, grasas, proteínas, vitaminas, minerales y los aminoácidos necesarios para
la síntesis de proteínas.
GLÓBULOS ROJOS, ERITROCITOS O HEMATÍES.

Los eritrocitos son las células

más abundantes en la sangre.
Son bicóncavas y anucleadas
que contienen una proteína
rojiza, la hemoglobina (Hb), que
transporta el oxígeno y el
dióxido de carbono. Los
eritrocitos presentan un aspecto
rosado a rojo y miden de 6 a 8
mm de diámetro, con una zona
pálida que recubre un tercio de
su centro que refleja su
biconcavidad. Los eritrocitos tienen una membrana muy flexible, por lo que pueden
penetrar en capilares cuyo diámetro es inferior al suyo propio.

Desde antes de 1900, los médicos y los laboratoristas contaban los eritrocitos en
volúmenes medidos para detectar anemia o policitemia. Anemia significa pérdida de la
capacidad de transporte de oxígeno y a menudo se refleja en un recuento reducido de
eritrocitos. Policitemia significa un aumento del recuento de eritrocitos que refleja una
masa mayor de eritrocitos en el organismo, una enfermedad que conduce a la
hiperviscosidad.

HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO E ÍNDICES

HEMATIMÉTRICOS

Parámetros cómo: recuento de eritrocitos, hemoglobina, hematocrito, índices y

morfología de los eritrocitos, se usan para detectar, diagnosticar, evaluar la intensidad y
supervisar el tratamiento de la anemia, la policitemia y numerosas enfermedades
sistémicas que afectan a los eritrocitos.
RETICULOCITOS

En el frotis sanguíneo teñido con Wright, del 1 al

2% de los eritrocitos superan el diámetro
promedio de 6 a 8 mm y se tiñe de color azul
grisáceo. Estos son eritrocitos policromatófilos,
liberados recientemente desde la médula ósea, el
sitio de producción de los eritrocitos.

Los eritrocitos policromatófilos se observan en

detalle porque indican la regeneración de la
médula ósea en casos de pérdida de sangre y
ciertas anemias.

LEUCOCITOS

Los leucocitos, o glóbulos blancos, no son realmente células sanguíneas; son una
agrupación vagamente relacionada de familias de células dedicadas a proteger a su
huésped de infecciones y lesiones Los leucocitos son como “pasajeros” en la sangre
desde su origen, en general la médula ósea o el tejido linfoide, a su destino en los
tejidos. Se denominan así porque son casi incoloros en una suspensión celular no teñida.
En la leucemia crónica, el aumento extremo en el recuento de leucocitos imparte un
aspecto lechoso a la sangre.

La disminución en el recuento de
leucocitos (menos de 4.500/mL) se
denomina leucopenia y el aumento del
recuento (más de 11.500/mL) se llama
leucocitosis, pero los recuentos de
leucocitos solo tienen valor clínico
moderado. El laboratorista debe diferenciar
las familias de leucocitos transportados en
la sangre mediante un frotis sanguíneo
teñido con Wright y microscopia óptica.
Los tipos de leucocitos son los siguientes:

1. Neutrófilos polimorfonucleares PMN o neutrófilos segmentados. Son células

fagocíticas cuyo único propósito es fagocitar y destruir las bacterias que han sido
marcadas antes como nocivas por el sistema inmunitario. El aumento de PMN se
denomina neutrofilia y a menudo indica infección bacteriana. La disminución se
denomina neutropenia y a menudo es causada por la administración de fármacos a
largo plazo o por una infección viral.
2. Neutrófilos en banda o en cayado. Estos neutrófilos son parte de la familia de los
PMN; son simplemente menos diferenciados o menos “maduros” que los PMN. El
aumento de los neutrófilos en banda indica infección bacteriana y se suele
denominar como desviación a la izquierda. El citoplasma de los neutrófilos
segmentados y en banda tiene gránulos submicroscópicos, teñidos de rosa, que
contienen secreciones bactericidas.
3. Eosinófilos. Los eosinófilos son células con gránulos citoplasmáticos regulares de
color anaranjado brillante que contienen histamina. El recuento elevado de
eosinófilos se denomina eosinofilia e indica una respuesta frente a una alergia o
infección parasitaria.
4. Basófilos. Los basófilos son células con gránulos citoplasmáticos de colores violeta
oscuro e irregulares que enmascaran al núcleo. El recuento de basófilos elevado se
denomina basofilia, una situación rara que a menudo indica una enfermedad
hematológica, como la leucemia.
5. Los PMN, los neutrófilos en banda, los eosinófilos y los basófilos se denominan
en conjunto granulocitos debido a sus gránulos citoplasmáticos prominentes,
aunque difieren en sus funciones. La distribución de eosinófilos y basófilos en
sangre es tan pequeña en comparación con los PMN que los términos eosinopenia y
basopenia son teóricos y no se utilizan. La leucemia es una proliferación
descontrolada de leucocitos que puede ser crónica, por ejemplo, la leucemia
mielógena crónica (granulocítica), o aguda, como la leucemia mie loblástica aguda.
Hay varias formas de leucemias granulocíticas, clasificadas por sus respectivas
alteraciones genéticas, y los laboratoristas son responsables de su identificación
mediante el uso de frotis de médula ósea teñidos con Wright, tinciones citoquímicas,
citogenética y técnicas de diagnóstico molecular.
6. Linfocitos. Los linfocitos constituyen un sistema complejo de células que
proporcionan inmunidad al huésped; estas células reconocen los antígenos extraños
y montan respuestas de anticuerpos (humoral) y respuestas antagónicas mediadas
por células. El aumento en el recuento de linfocitos se denomina linfocitosis y a
menudo se asocia con infecciones virales. El recuento de linfocitos anormalmente
bajo se conoce como linfopenia o linfocitopenia y se asocia con el tratamiento con
fármacos a largo plazo o la inmunodeficiencia. Los laboratoristas clasifican las
leucemias linfocíticas, de las cuales hay varias, sobre la base de frotis sanguíneos
teñidos con Wright y la citometría de flujo.
7. Monocitos. El monocito es un macrófago inmaduro que pasa a través de la sangre
desde su punto de origen, en general en la médula ósea, a una localización tisular
específica. Los macrófagos son las células más abundantes en el organismo, más
abundante que los eritrocitos o las células cutáneas, aunque son un componente
menor del recuento diferencial en los frotis sanguíneos. Ocupan cada una de las
cavidades del cuerpo; algunos son móviles y otros inmóviles. Su función consiste en
identificar y fagocitar partículas extrañas y ayudar a los linfocitos en el desarrollo de
la respuesta inmunitaria.
PLAQUETAS

Las plaquetas, o trombocitos, son células sanguíneas verdaderas que mantienen la

integridad de los vasos sanguíneos al promover las reparaciones de la pared vascular.
Las plaquetas se adhieren con rapidez a las superficies de los vasos dañados, forman
agregados con las plaquetas vecinas para taponar los vasos y secretan proteínas y
pequeñas moléculas que activan la trombosis o formación de coágulos.

Las plaquetas son las células que controlan la hemostasia, una serie de mecanismos
celulares y plasmáticos que sellan las heridas, las reparaciones de las paredes de los
vasos y mantienen la permeabilidad vascular. Miden tan sólo de 2 a 4 mm de diámetro,
son redondas u ovaladas y ligeramente granulares, su citoplasma se tiñe azul claro a
púrpura y su concentración normal en sangre periférica es entre 150.000 y 450.000/µl.
Su duración en circulación es de 8 a 11 días Su pequeño tamaño las hace parecer
insignificantes, pero son esenciales para la vida y están ampliamente estudiadas por su
fisiología compleja. La activación hemostática y descontrolada de las plaquetas
determina la aparición de trombosis de las venas profundas, embolia pulmonar, infartos
agudos de miocardio, accidentes cerebrovasculares y abortos espontáneos repetidos.

Los recuentos elevados de plaquetas, conocidos como trombocitosis, indican

inflamación o traumatismo, pero tienen escaso significado intrínseco. La trombocitemia
esencial es una enfermedad maligna rara caracterizada por recuentos de plaquetas muy
elevados y la producción descontrolada de plaquetas que representa un trastorno
hematológico potencialmente mortal.
El recuento bajo de plaquetas, conocido como trombocitopenia, es una consecuencia
común del tratamiento con fármacos y puede ser mortal. Dado que las plaquetas parti-
cipan en la reparación y el mantenimiento de los vasos sanguíneos normales, la
trombocitopenia suele acompañarse por hematomas y hemorragia no controlada.

OTROS PROCEDIMIENTOS EN HEMATOLOGÍA

Él laboratorista de hematología revisa los recuentos celulares, la distribución y la

morfología en los líquidos corporales distintos de la sangre. Estos incluyen los líquidos
cefalorraquídeo, sinovial (articular), pericárdico, pleural y peritoneal, en los que puede
haber eritrocitos y leucocitos en la enfermedad y en los que además puede haber células
malignas que requieren habilidades de detección especializadas. El análisis de los
líquidos corporales no sanguíneos siempre debe realizarse en forma rápida, porque las
células en estos ambientes hostiles pierden con rapidez su integridad. Las enfermedades
en las que se necesita la obtención de líquidos corporales para el diagnóstico siempre
son agudas.
 CÉLULAS EN EL EXAMEN MICROSCÓPICO DE ORINA

El examen microscópico del sedimento urinario no solo evidencia una enfermedad

renal, sino también indica la clase de lesión presente.

Leucocitos: Los leucocitos más abundantes en la orina son los polimorfonucleares o

neutrófilos. Su importancia radica en la cantidad o número en la que se encuentren y
puede ser un indicador de daño o cronicidad del proceso patológico involucrado, se
pueden identificar piocitos también conocidas como células centellantes, las cuales son
leucocitos que presentan en el citoplasma abundantes gránulos con movimiento y su
presencia es indicador de una probable pielonefritis. También se encuentran en
enfermedades autoinmunes, lesión en vía renal o infecciones cerca al aparato urinario.

Son células sanguíneas que llegan a la orina por un mecanismo bastante complicado
donde intervienen sustancias tóxicas de origen bacteriano, vírico, fúngico y otros, que
estimulan la liberación de sustancias proinflamatorias y la producción y liberación de
leucocitos.

Se entiende por leucocituria significativa la presencia de >2 leucocitos/campo 40x en

varones y >5 leucocitos/campo 40x en mujeres.

Se debe tener en cuenta si la muestra está contaminada principalmente en mujeres en

este caso el informe de laboratorio se debe reportar como: Contaminación vaginal, se
siguiere recoger nueva muestra previo aseo.
Hematíes: El hematíe es una célula ajena a la orina, su presencia indica casi siempre un
sangrado a nivel del riñón o de vías urinarias, o una contaminación vaginal.

Su morfología es de suma importancia y aporta datos valiosos. La cantidad existente

nos puede hablar de la cronicidad del proceso patológico. En condiciones no patológicas
se pueden observar en cantidad reducida. Los eritrocitos dismórficos se observan con
cierta frecuencia en los pacientes con nefritis lúpica activa. Indican sangrado a nivel de
vías urinarias. Se debe mirar si los hematíes son intactos los que son hematurias bajas,
crenados que se observan en orinas hipertónicas, hematíes dimorfos que indican una
hematuria glomerular.
Células epiteliales: La orina no es un buen medio de conservación para las células;
conforme va aumentando el tiempo de contacto con la orina se acelera su proceso de
deterioro, sobre todo a determinados valores de pH, y con elevadas concentraciones de
solutos. Entre los cambios experimentados por la célula, se producen degeneraciones,
roturas de orgánulos y membranas, granulaciones del citoplasma. Todos estos cambios
pueden hacer inidentificable a la célula, y siempre se ven más afectadas aquellas células
que provienen de segmentos más altos del aparato urinario (pérdida de energía, cambios
importantes y bruscos de la osmolalidad del medio por el que están circulando), de tal
manera que las células de las paredes de los túbulos proximales de la nefrona
difícilmente se ven intactas, por el contrario, las células de la vejiga urinaria se
conservan bastante bien. La diversidad celular que puede encontrarse en la orina es muy
amplia: células epiteliales del riñón y del tracto urinario; de epitelio mono o
pluriestratificado; de capas superficiales y de capas profundas, etc. Además, en la orina
se pueden encontrar células prostáticas y de espermiogénesis en un varón adulto, así
como de epitelio vaginal en la mujer.

En condiciones normales se pueden observar en el sedimento urinario en mayor o

menor cantidad lo que dependerá de las condiciones fisiológicas y el sexo del paciente.
Se pueden encontrar algunas células en la orina como consecuencia del desprendimiento
normal de las células envejecidas. Un marcado aumento puede indicar inflamación del
conducto del tracto urinario.
Las células epiteliales son de tamaño irregular, alargadas, presentan núcleo y
granulación en el citoplasma. En condiciones normales se pueden observar de manera
escasa en hombres, en tanto que en mujeres puede ser variable relacionado al ciclo
menstrual. Otro tipo de células epiteliales que pueden ser encontradas son las célula
renales o tubulares, las cuales son redondas, presentan un tamaño ligeramente mayor a
un leucocito con un núcleo grande y redondeado.

CULTIVO DE HECES
Si nos limitamos al grupo de las bacterias debemos considerar dos mecanismos
principales de patogenicidad, la producción de entero toxinas y la invasión de la mucosa
intestinal. En el primer caso, el mecanismo es eminentemente bioquímico, la diarrea es
generalmente acuosa y por lo general no se observan leucocitos en las heces.

En las diarreas invasivas, participan mecanismos toxigénicos distintos que ocasionan

daño estructural de las células intestinales, es frecuente encontrar leucocitos en las
heces, a veces acompañados de eritrocitos si el daño ha ocasionado erosión de la
mucosa intestinal. Algunos de los agentes ofensores pueden actuar por ambos
mecanismosLos agentes patógenos que más comúnmente causan diarrea, el mecanismo
de patogenicidad.

Cada una de estas bacterias tiene condiciones especiales para ser cultivada en el
laboratorio por lo que resulta imposible, desde el punto de vista práctico, efectuar un
cultivo único para detectar todos o la mayor parte de estos agentes.

Tradicionalmente, ante una solicitud de "coprocultivo" los laboratorios utilizan medios

para el aislamiento de Salmonella y Shigella bajo el concepto de que éstos son los
agentes más frecuentes de diarrea, pero la realidad es otra; Campylobacter, por ejemplo,
es un patógeno tan o más frecuente que los anteriores que debe ser investigado con igual
intensidad, pero el problema es que el método de cultivo para Campylobacter es
enteramente diferente. Algunos laboratorios lo incluyen como parte del coprocultivo
rutinario, otros lo hacen por solicitud expresa del médico y muchos no tienen la
capacidad instalada para hacer estos cultivos.
 MICROORGANISMOS QUE COMÚNMENTE CAUSAN DIARREA, SU
MECANISMO DE PATOGENIDAD Y PERÍODO DE INCUBACIÓN

Campylobacter jejuni

Es una especie del género Campylobacter.

Es un bacilo que responde negativamente a

la tinción de Gram, presenta movilidad
mediante uno o dos flagelos polares (que se
encuentran en sus extremos);
es microaerófilo capaz de crecer en una
atmósfera de composición 5% de oxígeno, 10%
de dióxido de carbono y 85% de nitrógeno; no utiliza los
hidratos de carbono.
Campylobacter coli:

Es una especie bacteriana gramnegativa, microaerófila, que no forma endospora, con

forma de S dentro del género Campylobacter.

Al igual que el C. jejuni, C. coli tiene la capacidad de causar enteritis con síntomas
como dolor abdominal, diarrea, heces con sangre, vómitos y fiebre. Estos síntomas son
causados, en parte, por una toxina que separa el citolethal secretada.

Escherichia coli-enterotoxigénica (ETEC):

Es un tipo de Escherichia coli y la principal bacteria causante de diarrea en países en

desarrollo, así como la mayor causa de la diarrea del viajero. Existe información
insuficiente, pero los datos registrados sugieren que cada año, ocurren aproximadamente
210 millones de casos y 380,000 muertes, principalmente en niños, de ETEC. Lo que
diferencia a este tipo de bacterias, es la expresión de una o más enterotoxinas y la
presencia de fimbrias utilizadas para adherirse a las células intestinales del huésped.
Salmonella

Salmonella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae

Constituidopor bacilos gramnegativos intracelulares anaerobios

facultativos con flagelos peritricos. Constituye un grupo importante de patógenospara
animales y humanos. Está compuesto por dos especies: S. enterica y S. bongori de las
cuales la S. enterica representa la especie de mayor patogenicidad.

Salmonella crece con facilidad en agar sangre formando colonias de 2 a 3 mm. En

laboratorios de microbiología clínica se aísla con medios selectivos —Selenito,
Hektoen, SS o XLD— para inhibir el crecimiento de otras bacterias patógenas y de
la flora intestinal saprofita. Tienen los siguientes antígenos:

 Somático O, del lipopolisacárido en la pared celular, termoestable y es la base de la

clasificación en subgrupos.
 Flagelar H, de la proteína flagelina, termolábil, es la base de la clasificación de
especies.
 Envoltura Vi, termolábil, responsable de la virulencia de varias especies
patogénicas.
Bacillus cereus

Se trata de un bacilo gram positivo, esporulado, anaerobio facultativo y móvil.

La espora es ovoidea, central y no deformante. Hidroliza la lecitina de la yema
del huevo y no fermenta el manitol. La temperatura óptima es de 30 a 37 °C, su
temperatura de crecimiento es de 5 a 55 °C y su temperatura de germinación, de 5 a 8
°C. Su pH óptimo, 4,5 a 9,3, Aw 0,95 y su concentración de sal, 7,5 %. Produce dos
tipos de toxiinfecciones alimentarias: la forma diarreica y la forma emética.

Papanicolaou
La prueba de Papanicolaou es un procedimiento que se usa para la obtención de células
del cuello uterino con el fin de observarlas con un microscopio y así detectar si hay
cáncer y precáncer.

El médico primero coloca un espéculo dentro de la vagina. Este instrumento de metal o

plástico mantiene la vagina abierta, de manera que el cuello uterino pueda verse bien.
Seguidamente se obtiene, mediante raspado ligero, una muestra de células y mucosidad
del ectocérvix con una pequeña espátula. Se inserta en la abertura del cuello uterino un
pequeño cepillo o una torunda de algodón para tomar una muestra del endocérvix. Si se
extirpó su cuello uterino (debido a cervicectomía o histerectomía) como parte del
tratamiento del cáncer de cuello uterino o precáncer, la muestra se tomará de las células
de la parte superior de la vagina (conocida como el manguito vaginal). Entonces, las
muestras se preparan para que se puedan observar al microscopio en el laboratorio.

 Células escamosas atípicas de importancia incierta (ASC-US): cuando existen

células que lucen anormales, pero que no es posible saber si esto se debe a
infección, irritación o es un precáncer. La mayor parte del tiempo, las células
identificadas como ASC-US no son precancerosas, aunque se requiere de más
pruebas para confirmar esto.

 Células escamosas atípicas en las que el alto grado de lesión intraepitelial

escamosa (HSIL) no puede ser excluido (ASC-H): cuando las células parecen
anormales, pero causa más preocupación que se trate de un posible precáncer
que requiera más pruebas y que podría necesitar tratamiento.
Lesiones intraepiteliales escamosas (SIL) Estas anomalías se dividen en dos
categorías:

 En SIL de bajo grado (LSIL): las células que se ven ligeramente anormales.

 En SIL de alto grado (HSIL): las células se ven significativamente anormales y

son menos propensas que las LSIL a desaparecer sin ningún tratamiento.
También son más propensas a convertirse en cáncer con el pasar del tiempo si no
se recibe tratamiento.

Carcinoma de células escamosas: este resultado significa que la mujer tiene mayores
probabilidades de padecer un cáncer invasivo. Se estarán realizando estudios
adicionales para asegurarse del diagnóstico antes de que se pueda planear el tratamiento.

Anomalías de células glandulares

Células glandulares atípicas: cuando las células glandulares no lucen normales, pero
tienen características que causan inquietud sobre la posible presencia de un cáncer. En
este caso, la paciente debe someterse a pruebas adicionales.

Adenocarcinoma: los cánceres de las células glandulares se llaman adenocarcinomas.

En algunos casos, el patólogo que examina las células puede indicar si el
adenocarcinoma comenzó en el endocérvix, en el útero (endometrio) o en alguna otra
parte del cuerpo.

Otras neoplasias malignas

Esta categoría es para otros tipos de cáncer que casi nunca afectan al cuello uterino,
tales como el melanoma maligno, los sarcomas y los linfomas.
MÉTODOS Y TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS EN
MATERIAL BIOLÓGICO

EL MÉTODO: Desde una perspectiva amplia, se entiende por método el camino a

recorrer para alcanzar un objetivo. El método incluye diversas técnicas y
procedimientos.

LA TÉCNICA: Es un procedimiento o conjunto de estos, (reglas, normas o

protocolos), que tienen como objetivo obtener un resultado determinado, ya sea en el
campo de la ciencia, de la tecnología, del arte, de la educación o en cualquier otra
actividad. Son los pasos prácticos que se emplean en la instrumentación (llevar a cabo)
de un método.

EL PROCEDIMIENTO: Conjunto de acciones secuenciadas y sistematizadas que

conducen a la consecución de un fin predeterminado. Implican un proceso de reflexión,
de toma de conciencia en la aplicación de cada una de las acciones que lo constituyen.

Diferencia:

 El Método es únicamente la forma en que se realiza algo, con orden y siguiendo

ciertos principios, por ello en pedagogía se habla de método constuctvista,
humanista, conductista, etc. La técnica hace referencia a las herramientas que se
utilizan para hacer llegar el conocimiento.

MÉTODOS Y TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS EN

HEMATOLOGÍA

Para contar los eritrocitos, los laboratoristas pipetean con cuidado una pequeña
alícuota de sangre entera y la mezclan con solución fisiológica al 0,85% (normal). Esta
concentración de solución fisiológica coincide con la osmolalidad normal de la sangre;
en consecuencia, los eritrocitos en suspensión conservan su morfología original, no
están hinchados ni contraídos.
La sangre diluida se transfiere una cámara de recuento o hemocitómetro. El
laboratorista observa y cuenta los eritrocitos en áreas seleccionadas de la cámara,
aplicando una fórmula matemática basada en la dilución y en el área contada, en el
informe consta el recuento de eritrocitos en células por microlitro (mL), mililitro (mL,
también llamado centímetro cúbico o cc) o litro (L). El recuento visual de eritrocitos fue
desarrollado antes de 1900 y, aunque nunca exacto, era la única forma de contar los
eritrocitos hasta 1958, cuando se introdujeron los contadores de partículas
automatizados en el laboratorio clínico. El primer contador electrónico, patentado en
1953 por Joseph y Wallace Coulter de Chicago, Illinois, tuvo un uso

Hemoglobina, hematocrito e índices hematimétricos

La medición de la hemoglobina se basa en una solución débil de cianuro de potasio y

ferrocianuro de potasio, conocido como reactivo de Drabkin. Una alícuota de sangre se
mezcla con un volumen medido de reactivo de
Drabkin, la hemoglobina se convierte en
cianmetahemoglobina estable (hemoglobincianuro) y
la solución se coloca en un fotómetro con luz
incidente de 540 nm de longitud de onda.

La intensidad de color se compara con la de un

blanco del reactivo y un estándar conocido y en
forma matemática se convierte en concentración de
hemoglobina. El reactivo de Drabkin se utiliza en las
aplicaciones manuales y la mayoría de las
automatizadas.

El hematocrito es la relación entre el volumen de eritrocitos y el volumen de sangre

entera; se determina mediante la transferencia de sangre a un tubo de plástico graduado
que se centrifuga, se mide la columna de eritrocitos y se divide por la altura total de
eritrocitos y plasma. La relación normal se aproxima al 50% (los valores de referencia
se muestran en la retiración de tapa). El hematocrito también se llama volumen de
células empacadas (VCE); las células empacadas se refieren a los eritrocitos. A menudo
se puede ver una capa de color claro entre el plasma y los eritrocitos. Esta es la capa
enriquecida de leucocitos y plaquetas
El laboratorista puede utilizar los tres resultados numéricos, el recuento de eritrocitos, la
hemoglobina y el hematocrito, para calcular los índices hematimétricos: el volumen
corpuscular medio (VCM), la hemoglobina corpuscular media (HCM) y la
concentración hemoglobínica corpuscular media

Los eritrocitos también se evalúan para determinar la concentración de hemoglobina y

el hematocrito. La medición de la hemoglobina se basa en una solución débil de cianuro
de potasio y ferrocianuro de potasio, conocido como reactivo de Drabkin. La
variabilidad extrema del volumen de los eritrocitos se observa en el frotis de sangre
teñido con Wright.

En el laboratorio se utiliza de manera habitual el examen visual con aumento 1.000×

para revisar la morfología de los eritrocitos, en la que describen el diámetro de estos, el
color o la hemoglobinización, la forma y la presencia de inclusiones citoplasmáticas.

RETICULOSITOS

Para diferenciar y contar estos eritrocitos jóvenes, se utilizan los colorantes de azul de
metileno, denominados tinciones de ácidos nucleicos o vitales, que son colorantes
absorbidos por las células viables. Los eritrocitos jóvenes contienes ácido ribonucleico
(RNA) y se denominan reticulocitos cuando el RNA se destaca mediante el empleo de
tinciones vitales. El recuento de reticulocitos fue (y sigue siendo) una tarea visual
tediosa e imprecisa. Ahora, todos los equipos completamente automatizados
proporcionan un recuento absoluto de reticulocitos y una medida particularmente
sensible de la función de la médula ósea, el recuento de reticulocitos inmaduros o la
fracción de reticulocitos inmaduros. A pesar del desagrado de algunos, todavía es
necesario confirmar de vez en cuando los recuentos realizados en los equipos
automatizados con el análisis visual para que los laboratoristas mantengan esta destreza.

LEUCOCITOS

Los leucocitos pueden contarse en forma visual mediante el empleo de un microscopio,

un hemocitómetro y una pipeta de Thoma. La técnica es similar a la del recuento de
eritrocitos, pero la dilución típica es de 1:20 y el diluyente está formado por ácido
acético diluido en solución fisiológica normal. El ácido provoca la lisis (destrucción) de
los eritrocitos; sin ello, los eritrocitos enmascararían a los leucocitos, cuyo número
oscila entre 4.500 y 11.500/mL. El recuento visual de leucocitos ha sido reemplazado en
gran medida por equipos automatizados de hematología, pero es exacto y útil en
situaciones en que no se dispone de esta automatización. Los laboratoristas que analizan
los líquidos corporales, como el líquido cefalorraquídeo, emplean a diario el recuento
visual de leucocitos. El laboratorista debe diferenciar las familias de leucocitos trans-
portados en la sangre mediante un frotis sanguíneo teñido con Wright y microscopia
óptica.

LINFOCITOS

En un frotis teñido con Wright, casi todos los linfocitos son redondos, algo más grandes
que los eritrocitos y tienen núcleos casi redondos sin características especiales y un
borde delgado de citoplasma no granular. Los laboratoristas clasifican las leucemias
linfocíticas, de las cuales hay varias, sobre la base de frotis sanguíneos teñidos con
Wright y la citometría de flujo.

MONOCITOS

En los frotis teñidos con Wright los monocitos presentan un diámetro algo mayor que
los otros leucocitos, citoplasma gris y núcleo lobulado.

PLAQUETAS

El profesional del laboratorio cuenta las plaquetas en un hemocitómetro, con la misma

técnica utilizada para el recuento de leucocitos, aunque el recuento se suele limitar al
milímetro cuadrado central del hemocitómetro. Debido a su volumen minúsculo, las
plaquetas son difíciles de distinguir visualmente en el hemocitómetro y se utiliza
microscopia de fase para facilitar su identificación. Los equipos automatizados han
reemplazado en gran medida el recuento visual de plaquetas y proporcionan mayor
precisión. Una ventaja de estos equipos automatizados es su capacidad para generar un
volumen plaquetario medio (VPM), que no puede determinarse por los métodos
visuales. La presencia de plaquetas predominantemente mayores genera un valor
elevado de VPM, que a veces indica una respuesta regenerativa de la médula ósea ante
el consumo de plaquetas
HEMOGRAMA COMPLETO

El laboratorista puede recolectar una

muestra de sangre para realizar el
hemograma completo; un
flebotomista, enfermero, médico o
técnico que asiste al paciente
también puede recolectar la
muestra. En todos los casos, el
laboratorista es responsable de la
integridad de la muestra y de
asegurar que está exenta de
coágulos, hemólisis y proporciones inadecuadas de anticoagulante-muestra conocidos
como “extracciones cortas”. El laboratorista también asegura que la muestra es lo
suficientemente reciente como para el análisis exacto y luego registra con precisión la
muestra en la lista de trabajo, un proceso conocido como adquisición de la muestra. Esta
puede automatizarse, sobre la base del código de barras o la tecnología de identificación
por radiofrecuencia. Aunque todos los laboratoristas están preparados para realizar los
recuentos visuales de eritrocitos, leucocitos y plaquetas con pipetas de dilución,
hemocitómetros y microscopios, la mayoría de los laboratorios emplea equipos
automatizados para generar los parámetros del hemograma completo.

Los equipos más sofisticados proporcionan comentarios sobre la morfología de

eritrocitos, leucocitos y plaqueta.

El examen del frotis es una actividad

especializada, exigente y fundamental del
hemograma completo. No obstante, si todos
los resultados brindados por el equipo son
normales, se omite el examen del frotis
sanguíneo en el hemograma completo.

Para realizar el examen del frotis sanguíneo, el

laboratorista prepara un extendido con la
técnica en cuña sobre un portaobjetos de
vidrio, permite que se seque, se fija y se tiñe con la tinción de Wright o Giemsa-Wright.
El laboratorista fija el portaobjetos a la platina del microscopio y examina los eritrocitos
y las plaquetas para determinar alteraciones de la forma, el diámetro, el color y las
inclusiones mediante el empleo de objetivos de inmersión en aceite 100×.

MÉTODOS Y TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS EN ORINA

Desde el punto de vista del laboratorio clínico una de las pruebas más solicitadas de
manera rutinaria es el examen microscópico de orina (EMO), en el cual se realiza el
análisis químico (pH, glucosa, urobilinógeno, etc.), análisis físico (color, aspecto) y de
manera conjunta el análisis microscópico del sedimento urinario (SU) en busca de
elementos formes (eritrocitos, leucocitos, bacterias, cilindros, etc.). Si bien es una
prueba considerada «de rutina» es de suma importancia su adecuada interpretación ya
que nos proporciona datos sumamente importantes. Los puntos clave de esta
estandarización son:

MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

La recolección de la muestra de orina se realiza en la primera micción de la mañana; la

bolsa recolectora, la punción supra-púbica y el cateterismo vesical son los métodos
recomendados en los menores de 2 años cuando aún no hay control de esfínteres,
mientras que la recolección por micción espontánea es el método aconsejado para los
mayores de 2 años.

El cuidado en la recolección de la orina y su entrega rápida en el laboratorio, son

cruciales para obtener una información óptima. La orina debe ser colectada en un
recipiente limpio, estéril, que tenga un cierre seguro para prevenir posibles
derramamientos, evaporación o contaminación. Estos recipientes deben rotularse con el
nombre del paciente, fecha y hora de recolección.
TÉCNICA DE RECOLECCIÓN

Para obtener un resultado adecuado en el uroanálisis, es necesario tener en cuenta lo

siguiente en la recolección de la muestra: Lavar el área genital y perineal, momentos
antes de la toma de la muestra. No utilizar antisépticos. Tener listo el frasco recolector
de orina, sin uso, estéril y sellado. Tomar la muestra de orina a partir del chorro medio
descartando la primera parte de la micción. La orina recolectada en el frasco no debe ser
tocada ni por los dedos ni por ningún otro objeto. Recolectar un volumen de orina
suficiente para su estudio —10cm mínimo—. Evitar que la orina rebose el frasco, el
rebosamiento facilita su contaminación. Sellar inmediatamente el frasco una vez
recolectada la orina y rotularlo con el nombre del paciente, número de historia clínica,
hora y fecha de recolección. Conservar el frasco en un lugar seguro, evitando la
exposición solar y los movimientos constantes —agitación—.

Procesar la muestra en el laboratorio clínico lo más pronto. Si después de 30 minutos de

recolectada no se procesa, se debe refrigerar en la puerta de la nevera a 4 grados
centígrados por un tiempo máximo de 24 horas, de lo contrario se corre el riesgo de que
se alteren las sustancias contenidas en ella por efectos de la temperatura ambiental y la
luz solar.

Las razones por las cuales se aconseja tomar la muestra de orina en la primera micción
de la mañana es porque este es el momento en que la orina está más concentrada, su
permanencia en la vejiga durante las horas de la noche ha facilitado el desdoblamiento
de los nitratos a nitritos por parte de las bacterias, y porque da facilidad logística a las
instituciones prestadoras de salud de procesar los exámenes clínicos tempranamente.
Para evitar alteraciones en la orina recogida esta debe ser procesada en los siguientes 30
minutos, de lo contrario 2 a 3 horas después pueden presentarse cambios.
MÉTODO MICROSCOPICO

Microscopio óptico: permite realizar la mayoría de los análisis de la orina.

Microscopio de contraste de fases: logra reconocer elementos de la orina con menor

contraste

MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO DE UNA ORINA NO TEÑIDA.

La microscopía de campo claro no coloreada emplea luz reducida para delinear los
elementos más translúcidos de la orina, como, cilindros hialinos, cristales y filamentos
de moco. La identificación precisa de leucocitos, macrófagos, células del epitelio
tubular renal, y células que contienen inclusiones virales puede ser muy difícil en
preparaciones no coloreadas. Para confirmar los resultados deben emplearse técnicas
citológicas y preparaciones teñidas.

PROCEDIMIENTO

La orina debe examinarse mientras esté fresca, algunas células y cilindros pueden
desintegrarse en un lapso de una a tres horas. La refrigeración de 2° a 8° C por 48 horas,
usualmente previene la desintegración de las células y entidades patológicas. Con
propósitos de estandarización, cada espécimen de orina debe concentrarse de diez a
veinte veces. El examen se realiza de la siguiente manera:

1. Mezcle bien el espécimen. 2. Ponga un volumen fijo (10, 12, ó 15 mL) de orina en
un tubo de centrífuga graduado. 3. Centrifugue a 1500 rpm aproximadamente por 5
minutos. 4. Extraiga el sobrenadante por decantación cuidadosa o aspiración hasta
un volumen fijo: 1ml y 0.4 mL, son los más comunes. Resuspenda el sedimento
golpeando suavemente en el fondo del tubo. 5. Ponga una gota el sedimento
resuspendido en un área de una lámina estandarizada. 6. Examine con bajo poder
(100x) y luz atenuada. Ajuste el enfoque fino permanentemente mientras se explora
al azar el área cubierta. Durante la revisión evalúe el espécimen en busca de células
epiteliales transicionales y escamosas. La identificación posterior de cilindros,
células epiteliales renales, eritrocitos y leucocitos debe ser refinada empleando el
objetivo de alto poder.
2.
 MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO CON TINCIONES SUPRAVITALES.

El detalle celular se realiza en sedimentos teñidos. Es frecuente el uso de un colorante

de cristal violeta-safranina para la evaluación rápida de ciertos elementos celulares.

PROCEDIMIENTO

1. Añadir una o dos gotas de colorante violeta-safranina a, aproximadamente, 1 mL

de sedimento de orina precentrifugado y concentrado a ese volumen.
2. Mezclar con una pipeta y poner una gota de esta suspensión en una placa.

Estudio del sedimento teñido A veces, aunque no de forma rutinaria, es necesario

utilizar técnicas de coloración en el sedimento que permiten identificar elementos
particulares: eosinófilos, bacterias, grasas; o diferenciar unos elementos de otros: células
cúbicas de leucocitos, hematíes de levaduras, sales amorfas de bacterias.

Ejemplo de tinciones utilizables en el examen microscópico del sedimento.

.
CITOMETRÍA DE FLUJO

Fundamento.

La Citometría de flujo se basa en medir

características de cada elemento particulado
en suspensión (principalmente celular),
cuando se le incide un rayo de luz. La
técnica necesita de un equipamiento
sofisticado y relativamente complejo que
combina un sistema lumínico (rayo de luz de
tipo láser y combinación de espejos, filtros y
cristales que llevan la señal luminosa hasta
receptores fotomultiplicadores), un sistema
fluídico (las células en suspensión e
individualizadas, es decir, sin que se agrupen, se llevan por un circuito líquido a una
cámara de flujo en la que se define un flujo laminar por el que una célula se sitúa de
manera precisa y estable frente al rayo lumínico) y un sistema electrónico/informático
(recoge, maneja y per mite representar y cuantificar todos los parámetros recogidos)
para la evaluación de los distintos parámetros lumínicos.
La CMF emplea anticuerpos monoclonales (AcMo) unidos a fluorocromos, que son
detectados y visualizados mediante un sistema informático apropiado y de forma rápida,
permite analizar un elevado número de partículas en suspensión en un corto periodo (5
000 partículas/s); ofrecer información simultánea de varios parámetros celulares,
identificar paralelamente antígenos de superficie y citoplasmáticos, cuantificar la
intensidad antigénica por medio de los canales medios de fluorescencia y emplear
múltiples marcajes Esta técnica posee una sensibilidad superior a 1 x 10-4, es decir, es
capaz de detectar una célula tumoral entre 10 000 células normales.

FLUOROCROMOS

Son productos químicos que al ser estimulados con fotones con longitud de onda
comprendida entre determinados rangos (de excitación) emiten a su vez otro fotón de
longitud de onda mayor (de emisión). El prototipo es la fluoresceína que al ser
estimulada con luz ultravioleta (no visible) emite luz de color verde (visible) aunque
existen muchos otros como picoeritrina, rodamina, rojo de texas etc.

TIPO Y CANTIDAD DE MUESTRA

Los especímenes más utilizados en hematología, inmunología y hemoterapia para su

inmunofenotipaje son variados y habitualmente incluyen: aspirados de médula ósea
(MO), sangre periférica (SP) y sangre de cordón umbilical. Pueden emplearse también
los productos de leucoféresis y transfusión como los concentrados de hematíes, de
plaquetas y el plasma. En este caso, pueden haberse obtenido por procedimientos
quirúrgicos, biopsia o punción-aspiración con aguja fina (PAAF).

ANÁLISIS DE DATOS

Los datos generados por los citómetros de flujo pueden ser dibujados en relación a una
variable, en forma de histograma, o en gráficos de puntos (dot-plot) de dos dimensiones
y dos o más variables, o incluso en gráficos tridimensionales. Las regiones delimitadas
en estos gráficos pueden ser separadas secuencialmente, de acuerdo con la intensidad de
la fluorescencia, para crear una serie de subgrupos llamados "gates" (portales). Existen
protocolos específicos para hacer la separación en gates, proceso conocido como gating,
tanto para propósitos clínicos como diagnósticos, especialmente en relación con
la hematología.

TÉCNICAS BÁSICAS DE MARCAJE CELULAR

A continuación, se detalla la técnica de rutina para evaluar moléculas de superficie en

células sanguíneas mediante anticuerpos marcados con fluorocromos. Las diluciones
que se indican son a título orientativo, deben ajustarse para cada antígeno y tipo celular
concreto.

ANTICUERPOS DIRECTOS.

Se utilizan anticuerpos monoclonales específicos contra antígenos concretos que vienen

ya marcados con el fluorocromo en su presentación comercial.

1.- En un tubo seco colocar 100 µl de una solución celular de 10 Mc/ml (1 Mc).

2.- Controles .- Añadir el anticuerpo marcado generalmente se ponen 20 µl excepto para

los de ruido de fondo que son uso 1:40 en 15 µl.

3.- Colocar los tubos en hielo picado y trasladar a nevera, incubar 30 minutos.

4.- Extraer las muestras del frio, añadir 3,5 ml de solución de Hanks, centrifugar a 1800
rpm, descartar el sobrenadante, resuspender y añadir 500 µl de solución de Hanks. Las
muestras ya están listas para pasar por el citómetro de flujo.

ANTICUERPOS INDIRECTOS.

Habitualmente los anticuerpos contra los principales marcadores de superficie ya vienen

conjugados con fluorocromos. Para buscar marcadores poco comunes o en
experimentación no siempre es posible disponer de dicho anticuerpo conjugado en
presentaciones comerciales en esos casos se debe de usar el anticuerpo sin conjugar y
detectar la fijación del mismo a través de marcaje indirecto, se trata de enfrentar el
anticuerpo específico (no conjugado) contra el antígeno buscado, se lava para retirar el
no fijado y a continuación se añade un segundo anticuerpo conjugado con fluorocromo
que reconoce como antígeno al primer anticuerpo:
1. Enfrentar las células 30 minutos a 4ºC con el primer anticuerpo (1:40, por ejemplo).

2. Lavar dos veces con solución de Hanks para retirar los restos del anticuerpo.

3. Resuspender las células y añadir 4 µl del anticuerpo anti-ratón (si el primario era de
ratón) marcado. Incubar otros 30 minutos a 4ºC.

4. Lavar las células con solución de Hanks y resuspender como si se tratase de un

marcaje directo en un volumen final de unos 400 µl.

CITOMETRÍA DE FLUJO EN MUESTRAS DE ORINA

La citometría de flujo viene utilizándose desde hace décadas en el recuento y

clasificación de elementos formes de la sangre en contadores hematológicos. Desde
hace algunos años, esta tecnología también se está aplicando al estudio de los elementos
formes de la orina.

La muestra de orina sin centrifugar es identificada, aspirada, mezclada y teñida por

dos colorantes (en los primeros modelos se trata de fenantridina que tiene apetencia por
los ácidos nucleicos y carbocianina que tiñe los fosfolípidos de las membranas
celulares. La muestra, inmediatamente es orientada a una cámara de flujo, circulando a
su través a gran velocidad y de manera que las partículas pasen de una en una, con lo
que se consigue un mejor recuento e identificación. Las partículas son iluminadas con
un rayo luminoso procedente de una fuente que puede ser un láser de argon que emite
una radiación azul de una longitud de onda de 488 nm.

Parámetros Parámetros de Otros parámetros Otra información

principales presencia

Células rojas Cilindros patológicos Conductividad Morfología de

los hematíes
Células blancas Células redondas Partículas totales en Proporción de
y pequeñas el volumen de hematíes lisados
muestras analizado
Células epiteliales Células tipo levadura
Conclusiones

1. Identificamos qué tipos de células se pueden identificar en la visualización del

material biológico.
2. Analizamos los métodos y técnicas más utilizados para la identificación celular.
3. Determinamos qué tipo de material biológico se pueden utilizar para la
observación de células.

Recomendaciones

1. Utilizar sin excepción el material de bioseguridad al momento de ingresar al

laboratorio.
2. Debemos tener un manejo correcto de los equipos y materiales para realizar los
exámenes requeridos.
3. Es de suma importancia saber diferenciar lo que es un método y técnica antes de
realizar cualquier procedimiento.
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