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Osatinsky, Raquel

¿Que es la electroforesis capilar?

Bioquímica y Patología Clínica, vol. 71, núm. 2, 2007, pp. 60-66
Asociación Bioquímica Argentina
Argentina

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Bioquímica y Patología Clínica

ISSN (Versión impresa): 1515-6761
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Asociación Bioquímica Argentina
Argentina

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Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
 ¿Que es la electroforesis capilar?
¿Que es la electroforesis capilar?
Raquel Osatinsky *
Bioquímica – Especialista en Química
Clínica: Orientación Proteínas
Lugar de Trabajo:
MANLAB - Diagnóstico Bioquimico
M. T. de Alvear 2263
gerenciaanalitica@emanlab.com.ar
Enviar Correspondencia a:
Av. Corrientes 2818 - Piso10 - Dto. “D”
1193 – Ciudad A. de BS.As
e- mail : raquelo@arnet.com.
Revista ByPC. Incorporada al Latindex.
ISSN 1515-6761 Código Bibliográfico: RByPC
Trabajo Recibido: 20-07-07 Aceptado: 08-08-07
RESUMEN
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación basada en la diferente
velocidad de migración de las distintas especies cargadas bajo la acción de un
campo eléctrico. La separación se lleva a cabo en un capilar de sílice fundida de
diámetro muy pequeño ( 10-200 µm). El uso de estos capilares tiene múltiples
ventajas: a) los capilares son anticonvectivos en sí mismos, por lo tanto, no es
necesaria la utilización de un gel soporte como medio; b) el calor generado al pas-
ar la corriente eléctrica (efecto Joule), que daría lugar a problemas de gradientes
de temperatura no uniformes ( cambios locales de viscosidad ), es fuertemente
reducido, ya que la disipación de calor es muy efectiva; c) pueden aplicarse altos
voltajes consiguiéndose una reducción del tiempo de análisis y altas eficiencias.
Se la considera una técnica intermedia entre la clásica electroforesis de zona
(ZE) y la cromatografía (HPLC) líquida.Utiliza el principio de la electroforesis capi-
lar en solución libre.
La separación por CE es muy rápida, se realiza en menos de 5 minutos, con una
reproducibilidad que muestran un coeficiente de variación (CVs) < 2%, muchos
investigadores consideran que su sensibilidad es 10 veces mayor que la de la
cromatografía líquida de alta performance.
Se conocen varios sistemas de separación por ésta tecnología. La electroforesis
capilar de zona(CZE); el isoelectroenfoque capilar (CIEF); la isotacoforesis capilar
( CITF) y la cromatografía micelar electrocinética (MECC). Desde 1990 el avance
en ésta campo fue vertiginoso, ya que podemos incluir diagnósticos estudiando
DNA, dficiencias enzimáticas, estudios de drogas de abuso en orina , estudios de
esteroides y en cuando a el labortorio clínicoa, métodos para separasión de pro-
téinas séricas, urinarias , variantes de hemoglobina, crioglobulinas, líquido céfalo
raquídeo, proteinas reactantes de la fase aguda y muchas variantes más.
SUMMARY
The process of electrophoresis is defined as the differential movement or migra-
tion of ions by attraction or repulsion in an electric field. In practical terms, a
positive ( anode) and negative (cathode) electrode are placed in a solution con-
taining ions. Then, when a voltage is applied across de electrodes, solute ions of
different charge, i.e. anions (negative) and cations (positive), will move through
the solution towards the electrode of opposite charge. Capillary electrophoresis,
then is the technique of performing electrophoresis in buffer-filled, narrow-bore
capillaries, normally from 25 to 100 µm in internal diameter.
The ends of a capillary are placed in separate buffer reservoirs, each containing a
electrode connected to a high-voltage power supply. Capillary electrophoresis is
very suited to automation, and the arrangement of comercial CE instruments will
seen familiar to those with knowledge of modern HPLC.
A vitally important feature of CE is the bulk flow of liquid through the capillry.
This is called the electroosmotic flow. An uncoated fused-silica capillary tube is
typically used por CE. The surface of the inside of the tube has ionisable silanol
groups, which are in contac with the buffer during CE. These silanol groups readily
dissociate, giving the capillary wall a negative charge. Therefore, when the capillary
is filled with buffer, the negatively charged capillary wall attracts positively charged ions
fron the buffer solution, creating an electrical double layer and a potential difference.
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Trabajo: págs 60 | 66

INTRODUCCION
Figura 1a. Tubo en U de Tiselius
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación (J. Gras Proteinas Plasmáticas pag. 31 Ed. JMS 1983)
basada en la diferente velocidad de migración de las distin-
tas especies cargadas bajo la acción de un campo eléctrico.
La separación se lleva a cabo en un capilar de sílice fundida
de diámetro muy pequeño ( 10-200 μm). El uso de estos
capilares tiene múltiples ventajas: a) los capilares son an-
ticonvectivos en sí mismos, por lo tanto, no es necesaria la
utilización de un gel soporte como medio; b) el calor genera-
do al pasar la corriente eléctrica (efecto Joule), que daría lu-
gar a problemas de gradientes de temperatura no uniformes
( cambios locales de viscosidad ), es fuertemente reducido,
ya que la disipación de calor es muy efectiva; c) pueden
aplicarse altos voltajes consiguiéndose una reducción del
tiempo de análisis y altas eficiencias. (1-2-3)
Se la considera una técnica intermedia entre la clásica elec-
troforesis de zona (ZE) y la cromatografía (HPLC) líquida.(4-
5) Utiliza el principio de la electroforesis capilar en solución
libre. J. Gras en el Capítulo 1 de su libro Proteínas Plasmáti-
cas (1983) dice: “Electroforesis libre.- Los grandes avances
obtenidos en el estudio de las proteínas plasmáticas fueron
conseguidos gracias a la electroforesis libre. Los elementos
técnicos más fundamentales para la misma están constituí-
dos por la célula con electrodos y los dispositivos ópticos que
permiten visualizar el fenómeno. Célula y electrodos: Desde
las primeras determinaciones de movilidad electroforética
llevados a cabo por Nernst y por Hardy, el tubo en U utilizado
fue perfeccionado incesantemente por numerosos investi-
gadores, entre ellos por Tiselius, quien llego en 1937 a idear
un tipo que ha sido desde entonces la base del utilizado en
todos los aparatos de electroforesis analítica libre y median-
te el cual el método adquiere todo su desarrollo actual”.
Arne Tiselius, Bioquímico sueco, fue Premio Nobel de Quími-
ca 1948. aisló e identificó por electroforesis proteínas de la Figura 1b. Tubo de Tiselius acoplado
sangre y de la leche, además obtuvo por absorción la sepa- a portaelectrodos y baño termo regulador.
ración de diversos aminoácidos. (6) (J.Gras Proteínas Plasmáticas- pag- 32. Ed. JMS 1983)
La separación por CE es muy rápida, se realiza en menos de
5 minutos, con una reproducibilidad que muestran un coefi-
ciente de variación (CVs) < 2%, muchos investigadores con-
sideran que su sensibilidad es 10 veces mayor que la de la
cromatografía líquida de alta performance.(7-8-9)
Desde 1937, luego de la primera publicación de Tiselius, se
multiplicaron las investigaciones sobre el tema, mejoran-
do el equipo , los capilares empleados, aplicando metodos
como el isoelectroenfoque sobre éste sistema y en los últi-
mos tiempos su aplicación en bioquímica clínica.
Se conocen varios sistemas de separación por ésta tecno-
logía. La electroforesis capilar de zona(CZE); el isoelectro-
enfoque capilar (CIEF); la isotacoforesis capilar ( CITF) y la
cromatografía micelar electrocinética (MECC). Desde 1990
el avance en ésta campo fue vertiginoso, ya que podemos in-
cluir diagnósticos estudiando DNA, dficiencias enzimáticas, de protéinas séricas, urinarias , variantes de hemoglobina,
estudios de drogas de abuso en orina , estudios de esteroides crioglobulinas, líquido céfalo raquídeo, proteinas reactantes
y en cuando a el labortorio clínicoa, métodos para separasión de la fase aguda y muchas variantes más. (10-11-12)
 ¿Que es la electroforesis capilar?
FUNDAMENTOS
La electroforesis capilar es la modalidad más utilizada por
su simplicidad operacional y versatilidad. Requiere peque-
ños volúmenes de muestra por lo que ha despertado un
gran interés en diferentes campos, tal como lo demuestra
el incremento de publicaciones realizadas en el área de la
bioquímica y biotecnología, industria farmaceútica, análisis
clínicos y medio ambiente. (13)
El capilar y los viales se llenan con una solución buffer. La
muestra está formada por un conjunto de aniones y catio-
nes que se introduce dentro del sistema ocupando una úni-
ca zona. Al someterlo a la influencia de un campo eléctrico,
migran hacia el electrodo correspondiente, estableciéndose
un movimiento de iones que forman parte del sistema.
Permite la separación de moléculas cargadas en función de
su movilidad electroforética, en un buffer a un pH determina-
do, según el punto isoeléctrico (pI) de la molécula y de un flu-
jo electrosmótico (EOF) más o menos importante. El EOF es el
flujo del líquido en el interior del capilar originado por la carga
eléctrica negativa existente en la pared interna del capilar. En
el caso de los capilares de sílice fundida ésta superficie de
carga es generado por la ionización de los grupos silanol.
La carga de la superficie interna del capilar atrae hacia si
iones positivos que forman una capa adyacente fija por
adsorción ( capa de Stern ), y una capa difusa y móvil, tam-
bién positiva ( capa de Gouy – Chapman ). Los iones de la
capa difusa experimentan una fuerza paralela a la superficie
y migran hacia el cátodo al aplicarse una diferencia de po-
tencial entre los extremos del capilar. Éstos iones, al estar
sulfatados, generan un movimiento global del flúido hacia
el cátodo. Éste movimiento del flúido constituye la fuerza
electrosmótica (EOF). (14-15)
Figura 2. Diagrama que muestra la dirección del flujo
electrosmótico (EOF). (Jenkins MA.-Clin Apli. of CE-
pag.3-Human Press Inc.1999)
La separación electroforética se efectúa en un capilar de
díametro inferior a 100 μ m, que contiene un buffer. El uso
de capilares para la separación electroforética tiene múlti-
ples ventajas. Los capilares son anticonvectivos, razón por
la que no es necesario el empleo de un gel como soporte.
El calor generado por el paso de la corriente eléctrica, que
daría lugar a problemas de temperatura, está muy reducido
porque la disipación del calor es muy efectiva.
DESCRIPCIÓN DE UN EQUIPO
Requiere una fuente de alto voltaje ( +/- 8000 voltios). Uno
o más capilares cuyos extremos se encuentren sumergidos,
junto con dos electrodos, en dos viales que contienen una
solución buffer, un detector y un sistema de adquisición de
datos. Los capilares son generalmente de sílice fundida, con
diametros internos de +/- 50 nm, cubiertos con poliamida
para darle flexibilidad y disminuir su fragilidad. El pequeño
diámetro facilita la disipación del calor generado por la re-
sistencia eléctrica del electrolito dentro del capilar. La sílice
fundida es mejor conductor de calor que cualquiera de los
otros materiales usados para fabricar capilares de diámetro
pequeño ( teflón, pyrex).
Durante las separaciones, los extremos del capilar están
colocados en dos recipientes que contienen un buffer, el
mismo con el que se ha llenado la columna. Junto con otras
condiciones, la composición del buffer define el método de
análisis. Ambos recipientes contienen el mismo buffer y su
nivel debe ser el mismo en los dos para evitar cualquier tipo
de flujo debido a un desequilibrio hidrostático. Al introducir
el electrolito en el capilar, pueden formarse burbujas de aire,
que provocan fluctuaciones en la línea de base e interrumpir
la corriente eléctrica. Debe evitarse este problema.(16)
Existen distintos modelos de aparatos con sistemas muy si-
milares, variando en la cantidad de capilares que funcionan
en forma simultánea. Es un método totalmente automatiza-
do. Se conocen dos equipos en el mercado*. que emplean
el principio de electroforesis capilar en solución libre, uno
tiene ocho capilares que funcionan en paralelo, permitien-
do realizar ocho determinaciones simultáneas y 90 en una
hora y otros trabajan con seis capilares en forma simultá-
nea.(17)
Figura 3. Esquema de un aparato de electroforesis
capilar. (Jenkins M A. Clin Aplic of CE.- pag 2.- Human
Press Inc. 1999)
High
Voltage
Detector
Capilary
Buffer
Recorder
INYECCIÓN DE LA MUESTRA
Existen diferentes sistemas de inyección en la electrofore-
sis capilar, se basan en aplicar un gradiente de voltaje ( elec-
trocinética) o en un gradiente de presión ( hidrodinámica o
hidrostática), entre los dos extremos del capilar. En todos
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los casos, para introducir la muestra dentro del capilar, se
cambia el vial de entrada por un vial con muestra y se aplica
la inyección de la misma durante 10-30 segundos. Introdu-
ciendose en el capilar un volumen de muestra del orden de
los nanolitros.
En la inyección hidrodinámica , la introducción de la mues-
tra en el capilar se efectúa mediante una diferencia de pre-
sión entre los dos extremos de la columna ( es el método
convencional de inyección).
Existen diferentes formas de producir una presión superior
al extremo del capilar en contacto con la disolución de la
muestra: por flujo gravitatorio de la disolución electrolítica
mediante la elevación del vial con la muestra y la aplicación
de presión sobre la misma, luego por succión de la mues-
tra aplicando vacío al vial de salida. Éste tipo de inyección
no depende de la movilidad electroforética , ni de la com-
posición de la muestra. El volumen de muestra inyectada
se define por las dimensiones del capilar, la viscosidad del
electrolito, la presión aplicada y el tiempo. Se debe contro-
lar con presición la temperatura capilar porque puede verse
afectada la viscosidad y variar la cantidad de muestra que
se inyecta. En gran parte de los instrumentos de CE la di-
ferencia de presión se utiliza, además de para introducir la
muestra, para renovar el buffer del capilar, ya que normal-
mente debe cambiarse luego de un número determinado de
análisis para conseguir repetibilidad en el tiempo de migra-
ción en las muestras a determinar.
La inyección electrocinética se basa en que el voltaje puede
causar movimientos electroforéticos y electrosmóticos. Se
introduce un extremo del capilar en el vial que contiene la
muestra y el otro extremo en el vial que contiene el buffer,
se aplica un voltaje elevado durante un breve período de
tiempo. Los compuestos se introducen en el caplilar por la
acción conjunta de la migración y del efecto de la movilidad
electrosmótica. Si el voltaje se aplica durante un un período
de tiempo corto, la muestra se introducirá por el movimiento
electroforético.
Diversos investigadores demostraron que por una serie de
fenómenos que produce la inyección electrocinética es me-
nos reproducible que la inyección hidrodinámica. Los límites
de detección de los compuestos estudiados mediante la in-
yección electrocinética son aproximadamente cinco veces
más bajos que los conseguidos con la hidrodinámica.
SISTEMA DE DETECCIÓN
La detección se realiza directamente sobre el capilar, es
decir que el mismo capilar actúa como celda de detección.
El tipo de detector escogido dependerá de los analitos a de-
terminar y, siempre que se pueda, se escogerá aquel que
proporcione una sensibilidad elevada para todos los com-
puestos.
El detector ultravioleta – visible es uno de los más emplea-
dos en la CE. La longitud de onda escogida es de 214 nm, o
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de 200 nm de acuerdo al equipo con el que se trabaja. Éste
sistema a pesar de la estabilidad y facilidad de operación,
presenta algunos incovenientes ya que opera a una única
longidtud de onda. La introducción del detector de diodos
en fila ha resuelto este problema permitiendo adquirir al
mismo tiempo el espectro de cada uno de los analitos en un
mismo análisis. Una alternativa a la detección UV-Visible es
la detección de fluorescencia, que es ampliamente utilizada
en bioquímica clínica. Otro tipo de detección utilizada por la
CE es la electroquímica, los más utilizados han sido los con-
ductimétricos y los amperométricos.
PRINCIPIOS DE SEPARACIÓN
Flujo electrosmótico (EOF).- En la CE, se desplazan por el ca-
pilar bajo la influencia de la corriente eléctrica, las moléculas
de soluto y la solución buffer. Éste es un fenómeno cono-
cido como flujo electrosmótico. El polo positivo o ánodo se
encuentra en el extremo del capilar donde se realiza la inyec-
ción de la muestra. El EOF va del polo positivo al negativo, de
manera que el buffer se mueve del vial que lo contiene ( el de
entrada) hacia el detector, en el vial de salida. La pared del
capilar está constituida por un entramado de grupos silanol
, por lo tanto al trabajar con bufferes básicos se encuentra
cargada negativamente con grupos sialonatos, y hace que
las otras cargas positivas libres se situen cerca de las cargas
negativas de la pared formando una doble capa. Al aplicar
una diferencia de potencial las cargas libres (positivas y ne-
gativas) se moveran hacia los polos contrarios. Las cargas
negativas de la pared no pueden moverse dando como resul-
tado un flujo de cargas positivas hacia el polo negativo.
FLUJO ELECTROFORÉTICO
Bajo la acción de un campo electrico, los solutos ionicos se
desplazan a través del capilar : a) por el flujo electrosmotico
que arrastra todo el seno de la disolución y b) la carga pro-
pia de un soluto hace que éste muestre una movilidad por si
mismo, a lo que se denomina flujo electroforético. La movili-
dad electroforética de un soluto es función de su carga, del
radio de la molécula y de la viscosidad del medio. Cuando se
introduce una muestra en el capilar y se aplica una diferen-
cia de potencial, cada uno de sus componentes tendrá una
movilidad que dependerá de las velocidades electrosmóti-
cas y electroforéticas. (18-19)
Una vez inyectada la muestra por aspiración en el o los capila-
res, se procede a la separación de la misma, aplicando una di-
ferencia de potencial de varios miles de voltios (≈ 8000), en los
extremos de cada capilar. La detección directa de las proteínas
se lleva a cabo a 200 nm en el extremo catódico del capilar.
Las proteínas separadas ( en capilares de sílice fundido)
son detectadas directamente en una burbuja existente en
el capilar por espectrofotometría de absorbancia. Emplean-
 ¿Que es la electroforesis capilar?

do buffer a pH alcalino, el orden de migración de las proteí-

nas es el siguiente: Figura 5a. Aumento de las fracciones α1 y α2
Gamma globulina con patente oligoclonal. ***
Gamma globulinas
2 globulinas
1 globulinas
2 globulinas
1 globulinas
Albúmina

Se visualiza la curva que produce el contenido proteico de

Figura 4a. Curva de CE normal *

Figura 5b. Gamma globulina con patente *** oligoclonal.

Alb. �1 �2 �1 �2 �

Figura 4b. Curva de CE normal *

Observar en fig. a y en la b los distintos picos correspondientes

a las múltiples bandas homogéneas.

Como ya se mencionó los equipos de CE para su aplicación

Alb. �1 �2 � 1 �2
Éste método tiene una sensibilidad mayor en la definición de las
fracciones que presenta la curva, relacionada con lasconcentraciones
de las proteínas tanto absolutas como las relativas.
la muestra. La detección es directa por cuanto “no existe el
paso correspondiente a la coloración y decoloración de las
corridas”. La figura similar a una electroforesis en agarosa
que se observa en un costado de la pantalla donde se obtie-
nen los datos es virtual. (20-21)
en el laboratorio bioquímico clínico separan las proteínas sé-
ricas en forma similar a las que se observan en los equipos
que emplean agarosa como soporte. Debe quedar claro que
el proteinograma electroforético está expresado directa-
mente en la curva que se observa en la pantalla del monitor.
La lectura de los valores se realizan a 200 nm y expresan
el contenido directo de cada fracción visualizada. Tiene una
� sensibilidad muy grande que se ve en los detalles de la cur-
va, sobre todo en la zona de las alfa 1, alfa 2 y gamas. Con
éste método se puede observar con más frecuencia la pre-
sencia de bisalbuminemias. Respecto de las patentes oligo
y monoclonales en la zonade las gamas, asi como la presen-
cia de pequeñas bandas homogéneas son visibles conclari-
dad. Probablemente las pequeñas bandas homogéneas en
la zona de las betas deban observarse con más detenimien-
to. Es un método completamente distinto a las electrofore-
sis de zona tanto en agarosa como en acetato de celulosa
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Trabajo: págs 60 | 66
y como toda innovación debe estudiarse, validarse, hacer
trabajos comparativos para asegurar un resultado correcto.
La gammapatías monoclonales se diagnostican por la curva
y la tipificación de las mismas se realiza por inmunofijación
(22) . En el sistema de CE la IF se efectúa por el método de
inmunosubstracción. (23-24-25-26)
Las electroforesis de hemoglobina realmente son inmejora-
bles, ya que permite la separación y valoración precisa de
las diferentes fracciones de la hemoglobina A, A2 y HbF, asi
como de las difrentes hemoglobinopatías estructurales. En
el caso de la presencia de una probable HbLepore la separa
de una probable HbS, tambien cuando se presentan proba-
bles Hb C y/o E se puede cuantificar la fracción de la HbA2
que ninguno de los métodos de electroforesis de zona sobre
agarosa lo soluciona. (27)
Figura 6a. Gamma globulina con un pico de
banda **** homogénea sobre patente policlonal
Figura 6b. Gamma globulina con un pico
correspondiente a **** un componente monoclonal,
y dos pequeños picos agregados
*,**,***,****, Estudios realizados con el Capillarys 2 -Sebia
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CONCLUSIÓN
Considero que la aplicación de la electroforesis capilar en el
laboratorio clínico permite contar con una herramienta téc-
nica de gran versatilidad. Es completamente automático,
tiene una gran sensibilidad, acorta el tiempo por cada análi-
sis que realiza disponiendo el profesional a cargo emplearlo
para analizar con tranquilidad los resultados y validarlos
y/o realizar otras tareas dentro del laboratorio.
* Los equipos mencionados son :Capillarys 2 de Sebia y Pa-
ragon 2000 CZE de Beckman.
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