CONCEPTO DE CROMATOGRAFÍA.

La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos

o más compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales
es estacionaria y la otra una fase móvil.

Varios tipos de cromatografía son posibles, dependiendo de la

naturaleza de las dos fases involucradas: sólido-liquido (capa fina,
papel o columna), liquido-liquido y gases-liquido

(Fase vapor).

Todas las técnicas cromatográficas dependen de la distribución de los

componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles: una fase móvil,
llamada también activa, que transporta las sustancias que se separan
y que progresa en relación con la otra, denominada fase estacionaria.
La fase móvil puede ser un líquido o un gas y la estacionaria puede
ser un sólido o un líquido.

Todos los sólidos finamente pulverizados tienen el poder de adsorber

en mayor o menor grado otras sustancias sobre su superficie; y,
similarmente, todas las sustancias pueden ser adsorbidas, unas con
más facilidad que otras. Este fenómeno de adsorción selectiva es el
principio fundamental de la cromatografía.
CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA DEFINICION

Es una de las más antiguas y simples formas de hacer cromatográfica.

Se utiliza para la evaluación, identificación, verificar pureza y para
explorar los parámetros de métodos de cromatografía “flash”.

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa,

uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de
vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión,
otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se
desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con
facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.

La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La

fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo
general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los
componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos
polares.

Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:

Hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído

Aldehído < Ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas

El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza

normalmente por el método ascendente, esto es, al permitir que un
eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la acción de la
capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta. Para conseguir
la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara, las
paredes se tapizan con papel impregnado del eluyente. A veces
pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las
paredes, cosa que no debe olvidarse.

Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes

del desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de
desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una
cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que
el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de
horas.

Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta

que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen.
Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente
esta distancia es de 10 cm.; parece ser la más conveniente para medir
valores de RF. Después del desarrollo, las placas pueden secarse
rápidamente con una corriente de aire caliente.

La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio

entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las
impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente
del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.

Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz, se secará en

una cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.
REVELADORES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN
CAPA FINA

Las manchas de color son, por supuesto, inmediatamente visibles; las

incoloras pueden revelarse mediante:

• Luz UV: si la sustancia absorbe luz ultravioleta, se puede usar una

fase estacionaria impregnada con un indicador fluorescente (F254 ó
F366), el número que aparece como subíndice nos indica la longitud
de onda de excitación del indicador utilizado.

• La introducción de la placa en vapores de yodo.

• El rocío con una solución de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un

compartimiento especialmente protegido y bajo una campana de
extracción de gases).

• Después calentar intensamente, por ejemplo, con un mechero hasta

carbonizar los compuestos.

ADSORBENTES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFÍA EN

CAPA FINA.

a) Silica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)

b) Óxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica)

c) Celulosa (Nativa o micro-cristalina)

d) Poliamidas
Para la selección del adsorbente deber tomar las siguientes
consideraciones:

a) Polaridad

b) Tamaño de partícula

a. Diámetro

b. Área Superficial

c) Homogeneidad

d) Pureza

PREPARACION DE PLACAS

El adsorvente se deslíe en agua destilada. Para mezclar la papilla

homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. La
proporción de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos
partes de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma
general, no obstante, habrán de consultarse las instrucciones del
fabricante.

Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, láminas

de vidrio, pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros
compuestos orgánicos más flexibles. Dependiendo del tipo de
separación que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un
tamaño de placa u otro. En general para realizar una separación
preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio
de 20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de agua destilada.

Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la

adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para
mantener el pH deseado. En la preparación de las placas también se
pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.
 Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso
se le denomina argentación, y se utiliza para separar componentes
insaturados.

El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la

placa, en general suele ser de:

0.1-0.2 mm. para separaciones analíticas.

0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.

La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectarían al

desarrollo del proceso cromatográfico. Para ello existen en el
mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecánica
placas homogéneas del espesor deseado. Si no se disponer de
extensor, el proceso a seguir es el siguiente:

1. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.

2. Agitar enérgicamente.
3. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
4. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
5. Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.

Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo

después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas. En este
momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las
placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien
calentándolas durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de
celulosa no deben calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para
expulsar así el aire. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente
al aire, para evitar los agrietamientos que se producirían por efecto del
cambio de temperatura.
APLICACIÓN DE LAS MUESTRAS

Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un

disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo
suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación..
Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla
cloroformo: metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean
disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga
20 µg de producto sólido. Muchos reactivos de revelado llegan a
detectar 0.1 µg de material; por esto con esta carga puede llegarse a
observar un 5% de impurezas.

Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para

realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. También
pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza
tocando con la punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc.) sobre la
placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un
centímetro aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se
denomina toque.

Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente,

de forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar.

ELUYENTES MÁS COMUNES PARA CROMATOGRAFIA DE CAPA

FINA

 -éter de petróleo
 -tolueno
 -dietil-éter, t-butil-éter
 -diclorometano
 -acetato de etilo
 -n-pentano, n-hexano
 -ciclohexano
 -tetracloruro de carbono
 -éter dietílico
  -cloroformo
 -acetona
 -iso-propanol
 -etanol
 -metanol
 -ácido acético

La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que

estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez
menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.

b) Aplicando un eluyente poco polar.

c) Aplicando un eluyente más polar.

Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir

utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares,
hasta dar con el más apropiado.

Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar

varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo
capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto
permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de
forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza
de una manera más eficaz.
 LOCALIZACION DE LA SUSTANCIA

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar

la posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de
métodos:

 Métodos químicos.
 Métodos físicos.

Métodos químicos

Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador

y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los
reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una
pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire
comprimido.

Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el

reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverización
deberá realizarse en una vitrina de gases bien ventilada.

La pulverización se realizará poco a poco. En cromatografía en capa

fina no puede realizarse el bañado del cromatograma (en
cromatografía en papel sí).

Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma

complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos
amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo
que es conveniente señalar las manchas aparecidas.

Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que

reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas
negras.

El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de

componente separado.

Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:

 2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehídos y cetonas).
 Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).
 Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
 Ninhidrina (para aminoácidos).

Métodos físicos.

El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador

fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara
ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda,
aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.

Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es

normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una
lámpara de ultravioleta.

CONSTANTES Rf Y Rx

La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de

expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una
fracción decimal, mide la retención de un componente. Se define
como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde

el centro de la mancha, los cálculos se simplifican si el denominador
es 10. Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie
de condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria,
cantidad de muestra). El máximo valor de RF que se puede alcanzar
es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos
sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez
desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse
con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el
contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o
no serlo.

Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen

sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor
polaridad, hasta apreciar una separación mínima. En este caso no se
pueden usar reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos,
sino indicador ultravioleta.

También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un

compuesto (X), que tenga una posición de desarrollo conveniente;
todos los demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste.
De esta manera se tiene el, RX , ya que:

FACTORES QUE INFLUYEN EN UNA SEPARACIÓN POR

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA.

a) Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben

más en la fase estacionaria.

b) La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de

aire.

c) Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con

grasa o agentes plastificantes o adhesivos. Para el trabajo a pequeña
escala, éstas deben limpiarse corriendo primero una mezcla de
cloroformo y metanol y después dejar secar completamente antes de
aplicar la muestra.

d) Pureza de los disolventes.

VENTAJAS DE LA CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a

otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase
gaseosa,...) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que
se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la
separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores
corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. El método es
simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que
sea un método adecuado para fines analíticos.