Microscopia electronica

HISTOTECNOLOGÍA

“Una disciplina técnica y tecnológica que se

encarga de estudiar los fundamentos teóricos
y la secuencia de manipulaciones técnicas que
permiten transformar una muestra biológica
humana, animal o vegetal en un preparado
histológico para ser posteriormente
analizado”.
 De la Microscopía Óptica a la
Microscopía Electrónica

Poder de Resolución
Es la menor separación para la cual dos
puntos pueden ser vistos como entidades
diferentes

Ojo desnudo 0,1 mm

Microscopio Óptico 0,2 m
Microscopio Electrónico 2 a 5 nm
 Algunas características….

 Los microscopios electrónicos enfocan haces

de electrones.
 Tienen lentes electromagnéticas.
 El sistema de vacío es una parte relevante del
microscopio electrónico.
 Cuentan con un sistema que registra y
muestra la imagen que producen los electrones.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
 Un microscopio sirve para aumentar el tamaño de una
imagen.
 Los microscopios ópticos funcionan con base en la luz
y una lente, en donde los haces de luz que refleja la
muestra son desviados al pasar a través de un medio
con índice de refracción diferente una frontera curva.
 Convergen en un punto focal y son proyectados en el
“plano imagen”.
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
 En este plano, la imagen es rotada 180°.
 En el caso del microscopio electrónico, se utiliza un
haz de electrones en lugar de un haz de luz.
 La microscopía electrónica tiene componentes básicos
indispensables para el correcto funcionamiento del
microscopio electrónico, ya sea de barrido o de
transmisión.
 CAÑÓN DE ELECTRONES
 Está constituido por un filamento de tungsteno por el
cual fluye una corrienteeléctrica.
 Cuando se calienta el filamento emite electrones.
 Los electrones son acelerados por un campo eléctrico
inducido por una diferencia de potencial entre dos
placas metálicas que se encuentran dentro del
microscopio.
 CAÑÓN DE ELECTRONES
 Posteriormente, estos electrones se concentran
mediante repulsión electrostática en un haz que será el
que refleje en la muestra.
 LENTES MAGNÉTICAS
 El funcionamientos de los microscopios electrónicos
está relacionado con lentes magnéticas, las cuales
están formadas por dos electroimanes que producen
dos campos magnéticos, un campo por cada
electroimán.
 Estos electroimanes se encuentran paralelos y cuando
se producen los dos campos se encuentran y forman la
lente magnética.
 LENTES MAGNÉTICAS
 Cuando un electrón viaja a través de un campo
magnético será afectado por una fuerza que lo
acelerará perpendicularmente a su dirección de
movimiento y perpendicularmente al campo
magnético.
 Cuando un electrón pasa a través de una lente
magnética describe un movimiento helicoidal.
 LENTES MAGNÉTICAS
 En la producción de imágenes, las lentes magnéticas
funcionan similarmente a lasópticas.
 La lente magnética desvía el haz electrónico y lo hace
converger sobre un plano focal de la lente. La única
diferencia es que la imagen se rota más de 180°. La
rotación depende de la intensidad del campo
magnético.
Microscopía Electrónica
Hay dos tipos de Microscopios Electrónicos:

 Microscopio Electrónico de
Transmisión (TEM)

 Microscopio Electrónico de
Barrido (SEM)
 Microscopio Electrónico de Transmisión (MET):

 Poder de resolución: 2 nm.

 Permite la observación de muestras en
cortes ultrafinos.
 Brinda detalles ultraestructurales de
células y tejidos.
 Dirige el haz de electrones hacia el objeto
que se desea aumentar.
 TÉCNICA HISTOLÓGICA

● Fijación
● Deshidratación, Aclaramiento e

Inclusión
● Corte Histológico

● Montaje

● Tinción
 Fijación

 La elección del fijador es crucial, cualquier

error de fijación puede producir artefactos.
 Hay que mantener un pH y una concentración
iónica (osmolaridad) similar al de la célula viva.
 Para microscopía electrónica en general se
utiliza la siguiente mezcla fijadora:
* Glutaraldehído 2%.
* Solución de Buffer fosfato 0,2 M, pH 7.
 Deshidratación, Aclaración e
Inclusión

● Se realiza, con pasos crecientes de

alcohol (50-100%).
● Óxido de Propileno en vez de Xilol.

● Se utilizan resinas plásticas llamadas

Epoxi o Araldita.
● Los cortes deben tener un grosor de
0,08 a 0,1 µm.
 Corte Histológico

Los cortes se realizan con un ultramicrótomo

● Utilizan cuchillas de vidrio o de diamante.
● Los cortes se montan sobre grillas de metal.
 Tinción

Debido a que el microscopio electrónico

utiliza un haz de electrones los cortes se
tiñen con colorantes que presentan sales
con metales pesados que se asocian a los
diferentes componentes de los tejidos.
 Microscopio Electrónico de Barrido (MEB):

 Los microscopios electrónicos de

barrido tienen magnificaciones de 25x a
1.000.000x.
 Produce imágenes tridimensionales
realistas de la superficie del objeto.
 A medida que el haz de electrones
barre la muestra, se presenta la imagen de
la misma en el monitor.
Microscopio de Barrido FEI FEG Quanta 200
¿Qué sucede cuando los electrones ingresan a la muestra?
 VENTAJAS DE UN MEB

 Magnificaciones de 25x a 1.000.000x

 Gran profundidad de campo
 Imágenes de alta resolución
 Análisis de composición química
 Preparación sencilla de las muestras
ALTO VACÍO: Se reduce al máximo el número de
partículas dentro de la cámara minimizando la probabilidad
de dispersión de electrones y mejorando así la resolución.
(1x10-10
atm).

BAJO VACÍO: Facilita la observación de muestras no

conductoras, sin ningún tipo de recubrimiento. (1x10-4 –
1x10-3
atm).

MODO ESEM: Brinda la posibilidad de observar

estructuras de tejido blando con protocolos de preparación
básicos que implican una mínima intervención en la muestra.
(1x10-4–1x10-3atm).
 TECNICA HISTOLOGICA

 Fijación
 Deshidratación
 Secado
 Metalización de las muestras
Fijación

Coagulantes
 F.A.A

 C.R.A.F

No Coagulantes
 Glutaraldehído

 Tetróxido de Osmio

 Acroleína
 Deshidratación

Se utilizan solventes orgánicos:

 Acetona

 Alcohol
 Fijación y Deshidratación

 Se utiliza mezcla fijadora:

* Glutaraldehído 2%
* Solución de Buffer-Fosfato 0,2 M pH 7.

 Pasos crecientes de alcohol (50-100%).

 Secado

 Secado por Congelamiento

Secado al Aire desde Solventes

Orgánicos

 Secado por Punto Crítico

 Secado por Congelamiento

 El especímen se congela
rápidamente en nitrógeno líquido,
cuando el hielo se ha evaporizado
completamente se lleva a
temperatura ambiente.
 Freón

 Propano
 Secado al Aire desde Solventes Orgánicos

 Fijación en Glutaraldehído

 Tampón buffer

 Deshidratación

 Freón 113

 Secado en Desecador de Vacío

 Secado por Punto Crítico

Utiliza la propiedad de los líquidos

de cambiar de la fase líquida a la
fase gaseosa sin generar calor de
vaporización o cambio de densidad.
Secado al Aire Secado por Punto
Crítico
 Metalización de las Muestras

 Montar la muestra sobre el

portamuestras.

 Recubrir con oro, oro/paladio o carbono

(dependiendo si es conductora o no).
Amplio intervalo
de aumentos

1 mm
Rostro de un guerrero antiguo
(Jarrón Japonés S XVIII )

Granos de Polen
5 m
 Trochodiscus longispinus

Resolución y
Profundidad
de campo
 Espectrometría por energía dispersiva
de Rayos X-EDS
Cuando el haz de electrones del SEM interactúa con nuestra muestra surgen

los rayos-x característicos que sirven para caracterizar los

elementos en una muestra.

Rayos X característicos:

Su energía es característica
del elemento del cual
provienen, por ende se
pueden identificar en un
espectro.
Los usos y aplicaciones de la Microscopia Electrónica
de Barrido con Microanálisis Elemental por Energía
Dispersiva de Rayos X (SEM/EDS)

 Análisis de residuos de arma de fuego.

 Análisis comparativo de suelos.
 Identificación de medicamentos.
 Análisis comparativo de pinturas automotrices.
 Entomología y Palinología forense.
Cada pico es como “una huella digital” de cada
átomo que contiene la muestra.
 Por ende el espectro de dicha muestra es una

comprobación irrefutable.
 Sus aplicaciones son muy
variadas:

 Reconocimiento de microorganismos.
Determinación de la morfología y cambios de
materiales sometidos a diversos tratamientos,
estudios de fatiga.
Control de materiales mediante observación de
superficies.
 Determinación de tamaño y forma de partículas.
 Industria Textil.
 Industria Láctea.
 Mecánica.
 Importaciones.
 Industria Química y Petroquímica.
 Construcción.
 Automotrices.
 Bienes Culturales

Hemerotecas
Museos
Monumentos
Restauración de Patrimonio
Histórico y Cultural
Aplicaciones en Conservación de Bienes
Culturales

Soldado Escribiendo Barrio de Barcelona

 La ciencia aplicada al arte y a la
conservación permiten:
 La datación de los materiales.
 Diagnosticar el estado de conservación. Diseñar el
ecosistema más adecuado para su conservación y
difusión.
 Identificar las causas de su alteración. Evaluar los
mejores materiales y procedimientos para su
intervención de restauración.
 El estudio de su procedencia.
 El conocimiento de la técnica de fabricación y uso.
 La identificación de los mecanismos de transformación
que provocan su degradación.
Otra gran ventaja es la posibilidad de hacer análisis de
composición química y/o detectar estructuras cristalinas

Imagen electrónica

Mapas de composición

Zinc Carbono Plomo

Lino original Lienzo de re-entelado
Cinta de video formato VHS
atacada por hongos
Museo del Oro
 Área Forense

Detección de GSR (gun shot

residue)
Palinología
Entomología
Detección de fibras
Pinturas
Rupturas de filamentos
 APLICACIONES EN LA PRÁCTICA FORENSE

 Estudios en Palinología

Arabidopsis thaliana
Análisis de residuos de disparo de arma de fuego

Partículas
Características:
Plomo, Antimonio,
Bario

Partículas
Consistentes:
Sb, Ba, Pb, Al,
Fe
Entomología Forense: estudio de los insectos encontrados en un cadáver a
fines de determinar el IPM.

 Determinar la taxonomía y basarse en el análisis de caracteres

morfológicos.
 Identificación de género o especie, permite conocer datos de tasa de
desarrollo y ciclo de vida.
 Determinar estadio larval.
 ESTUDIO DE FIBRAS

 Tejidos orgánicos, vegetales o animales.

 Textura de algunos minerales como el amianto.

 Filamentos obtenidos por procedimiento químico en la industria

textil.
Fibras Naturales: Pelos

Canino Humano
 Pelo de ratón

Pelo de gato
 Papel Moneda

VERDADERO APÓCRIFO
 Ruptura de Filamentos de Lámparas
FRACTURAS EN CALIENTE
FRACTURAS EN FRÍO
 ESTUDIO DE PINTURAS

Espectro EDX de pinturas de capas

seleccionadas.
(a) Capa 9; (b) Capa 13; (c) Capa 15.
 Biología
Botánica
Aves
Reptiles
Caracoles
Huesos
Animales marinos (Valvas,
Braquiópodos, Bivalvos)
 Biología: Botánica

Arabidopsis thaliana
 EBSD (Electron
Biología: Basckttering
Diffraction)
• Aves
• Reptiles
• Caracoles
• Animales Marinos
Biología: Huesos
EDS
 Materiales
Investigación
Desarrollo
Industria
Docencia
Materiales: Acero, Titanio, Zinc, Magnesio, Cobre,
Aluminio, Níquel, Silicio, etc.

Selección de la muestra
 Corte
 Montaje
 Pulido grueso
 Pulido fino
 Pulido final
 Medicina

TRAUMATOLOGÍA
ODONTOLOGÍA
PATOLOGÍAS RENALES
DERMATOLOGÍA
FARMACOLOGÍA
HEMATOLOGÍA
Medicina: Traumatología

Estudio de Prótesis:

• Composición
• Estudio de Fases
• Aleaciones
• Ensayos de fatiga
Medicina: Odontología
Estudios para endodoncias y
ortodoncias:

Composición
Estudio de Fases
Aleaciones
Ensayos de fatiga
Estudios de microdureza
Medicina: Patologías renales
STEM

Glomérulo renal humano

Medicina: Dermatología
Medicina: Farmacología
Medicina: Hematología

Globulos rojos
Elementos figurados de la sangre
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS

 Elevados costos de los equipos y una

infraestructura adecuada no permiten el
uso de la técnica en cualquier laboratorio.
 La manipulación de reactivos se torna
peligrosa por la elevada condición tóxica
de los mismos.
 Altos costos de procesamiento de las
muestras.
 La complejidad de los equipos
requiere de personal técnico
especializado.

 Proporciona resultados de
amplia resolución y magnificación.