UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

LABORATIO N°3 DE CINÉTICA BIOQUIMICA

``INMOVILIZACION DE ENZIMAS EN DESECHOS DE
PECANAS ´´

CURSO:
- Cinética Bioquímica

DOCENTE:
- Ramos Matías, Pedro

INTEGRANTES:
 Chavez Cristobal, Bryan 20161109I
 Castro Aparicio, Jhon Bryan 20162104K
 Centeno Narváez, Gabriel Alonso 20152655D
 Capcha Vertíz, John Kevin 20154550E
 Rivera Rodríguez, Henrry Rodil 20151297G
 Esquivel Lorenzo, Stephany Janeth 20177501K

2019
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1 INTRODUCCIÓN

Las enzimas juegan un papel amplio en la obtención de productos químicos,

farmacéuticos o alimenticios, dado que estas presentan grandes ventajas sobre
sustancias químicas que en la actualidad podrían reemplazar su función.
La denominación de enzima inmovilizada es aquella que se puede encontrar en un
espacio específico de tal forma que conserve su propiedades enzimáticas, se podrá
separar una enzima para poder inmovilizar y con ello se podrá dar evidencia del su
trabajo. Este laboratorio te ayudara a poder transportar las ventajas de una enzima en
una región definida.
La aplicación enzimática podrá darse evidente cuando la ureasa trabaje sobre la urea
que agregaras a tu espacio defino que este caso se inmovilizara la enzima en cascaras
de pecanas, que cuando se agregue fenolftaleína a la solución tratada sea un color
grosella eso dará evidencia que la solución es básica y que la enzima trabajo
correctamente removiendo la urea.

2 OBJETIVO GENERAL

Conocer los principios básicos de la inmovilización enzimática en soporte solido

por el método de adsorción
Objetivos específicos:
a) Tratar los residuos de pecanas extrayendo los fenoles con peróxido de
hidrogeno.
b) Acondicionar los residuos de pecanas por tratamiento alcalino para
aumentar el potencial Z.
c) Acondicionar la enzima ureasa a partir de frijol de soya.
d) Inmovilizar la enzima ureasa en los residuos de pecanas tratada.

3 FUNDAMENTO TEORICO

Como producto del avance de la biotecnología y su aplicación en procesos

industriales para la obtención de productos químicos, farmacéuticos o
alimentarios se ha recurrido al uso de enzimas. Éstas presentan grandes
ventajas sobre catalizadores no biológicos, entre ellas gran actividad catalítica,
a temperatura ambiente y presión atmosférica, y gran especificidad de sustrato.
La inestabilidad que presentan en los procesos químicos industriales y la
dificultad de poder separarse de sustratos y productos, todos solubles en agua,
hacen que las enzimas no se puedan reutilizar. Como alternativa se ideó el
método de inmovilizarlas a un soporte inerte para hacer factible que un proceso
biotecnológico sea rentable.
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Se denomina una “enzima inmovilizada” aquella que está físicamente localizada

en una región definida del espacio, manteniendo su actividad catalítica y
pudiendo ser usada repetida y continuamente. Las ventajas del proceso:
a) aumento de la estabilidad
b) reutilización de los componentes
c) la enzima no permanece en la solución al finalizar el tratamiento
d) diseño de reactores adaptables para cada enzima inmovilizada, permitiendo
un reciclado de producto que aumente su pureza.
Básicamente un reactor comprende un recipiente o tanque con agitación con las
enzimas inmovilizadas, una vía de entrada para sustrato y otra de salida para el
producto. Las desventajas:
a) alteración de la enzima respecto de su estado nativo
b) heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas
proteínas inmovilizadas
c) pérdida de actividad
d) el sistema puede ser más caro que la enzima nativa.

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

A pesar de las conocidas ventajas del uso de enzimas, por razones técnicas y
económicas, su empleo en condiciones de procesos industriales no se ha
generalizado. Debido a su alto costo, problemas de estabilidad y difícil
separación del producto final, a menudo requieren ser inmovilizadas sobre un
soporte.
La inmovilización consiste en mantener la biomolécula unida o atrapada en un
soporte físico, conservando su actividad catalítica y permitiendo el flujo de
sustratos y productos. Combina la actividad elevada y específica de
biomoléculas activas, como las enzimas, con la estabilidad química y mecánica
del soporte. Proporciona una base para lograr la aplicación repetida de la enzima
y tiene eficacia funcional (aumento de estabilidad). Algunos inconvenientes que
pueden presentarse con la inmovilización son: alteración de la conformación de
la enzima, pérdida de actividad enzimática, pueden presentarse fracciones de
proteínas inmovilizadas con diferente número de uniones al soporte y el
incremento de costo. A pesar de que los preparados inmovilizados son de alto
costo, la recuperación de la enzima del medio de reacción y el desarrollo de
operaciones en continuo disminuyen los costos del proceso. No existe un
método de inmovilización válido para todas las enzimas, por lo que el tipo de
enzima, así como las características y aplicaciones deseadas se deben
considerar para seleccionar el método más adecuado. Las enzimas pueden ser
inmovilizadas por retención física o unión química.
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Los métodos de inmovilización de biocatalizadores por atrapamiento o adsorción

son más sencillos y económicos, pero presentan pérdidas de actividad a largo
plazo ya que la unión enzima-soporte es muy débil. Por otro lado, los métodos
de unión covalente son más difíciles de preparar y costosos, pero permiten
obtener biocatalizadores más estables y duraderos y son los más utilizados para
inmovilizar enzimas.

Para la elección del soporte y el tipo de enlace se debe tomar en cuenta: la

inercia, fuerza física, estabilidad, presencia de grupos funcionales necesarios
para unirse a los grupos de la enzima, capacidad para aumentar la especificidad
enzima/actividad, reducir la inhibición con el producto y contaminación
microbiana. Un requerimiento importante, es que no debe interferir con la
estructura del sitio activo de la enzima, ya que podría comprometer su actividad
biológica. Existen numerosos tipos de soportes, los cuales pueden ser de
diferente origen: naturales u orgánicos (celulosa, quitosano, dextrano, alginato,
etc.), inorgánicos (zeolitas, sílice, carbón, óxidos de metales, etc.) y polímeros
sintéticos (cloruro de vinilo, poliestirenos, alcohol polivinílico, poliuretano, etc.) y
ser aplicados en diferentes tamaños de partícula, incluyendo nano dimensiones.
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4 MATERIALES Y METODOLOGIA

Materiales:

- 02 baldes de 04 litros
- 02 cucharas de metal
- 02 cernidores
- 03 juegos de guantes
- 01 bandeja de plástico/metal
- 01 Bomba de pipeta
- 03 Piseta con agua destilada
- 01 Columna para destilación de vidrio de 300 mm con terminaciones cónicas
- 01 soporte universal por grupo
- 02 matraz con tapa de 500 mL por grupo
- 02 vasos precipitados de 250 ml por grupo.
- 01 rollo de papel aluminio

Reactivos: Por grupo

- 02 litros de agua destilada

- 01 litro de agua desionizada y destilada
- 02 kilos de residuos de pecanas por grupo
- 100 g de frijol soya por grupo
- 500 ml de solución de NaCl al 1%
- 100 ml de solución de urea al 1%
- 40 ml de HCl al 5%.
- 100 ml de detergente neutro sin colorantes ni perfume.
- 100 ml de NaOH al 20%.
- unas gotas de fenolftaleina

5 PROCEDIMIENTO

PARTE A: PREPARACION DE LOS COMPONENTES PARA INMOVILIZAR

Actividad 1.- Preparación del extracto enzimático

- Pese 50g de soya previamente remojada y colóquela en un mortero.

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- Adicione 100 mL de NaCl al 1% y triture la mezcla hasta formar una pasta,

luego filtre la suspensión con una tela o lienzo y centrifugue durante 5
minutos a 2500 rpm.

- Transfiera el sobrenadante a una probeta, adicione al residuo 100 mL de

NaCl 1% y repita el procedimiento anterior. Reúna los sobrenadantes y
complete hasta 250 mL con solución de NaCl 1%.
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- Mantener refrigerado

Actividad 2.- Extracción de fenoles de los residuos de pecanas Carya

illinoinensis.

- Con ayuda de un molino o mortero grande moler los residuos de pecanas

procurando obtener un tamaño uniforme entre 0,3 mm y 0,5 mm.

- En un balde colocar aproximadamente 2 kg de residuos de pecanas y

lavar con detergente neutro. Enjuagar con agua corriente.
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- En un balde colocar los residuos de pecanas lavados y remojar por 10

minutos en una solución de peróxido de hidrogeno al 1% acidificado a pH
3.

- En un balde colocar los residuos de pecanas tratados con peróxido y

remojar por 10 minutos con NaOH al 5%.

- Enjuagar una última vez con agua destilada y dejar secar extendiendo los
residuos tratados en una bandeja.
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PARTE B: INMOVILIZACION PROPIAMENTE DICHA

Actividad 1.- Preparación del empacado de los residuos tratados de
pecanas

- En una columna de vidrio colocar los residuos de pecanas tratados y

sostenerlo en un soporte universal. Previamente se debe haber tapado
con algodón y gasa estéril en ambas puntas o terminaciones.

- Agregar el extracto enzimático (ureasa) lentamente a la columna y recoger

el eluyente en el otro extremo dentro de un beaker. TRATAR DE TAPAR
EN TODO MOMENTO. Dejar reposar por 15 minutos.
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- Luego agregar la solución de NaCl al 1% en la columna para lavar los

residuos de pecanas, recoger el eluyente.

Actividad 2.- Prueba cualitativa de presencia de enzima ureasa

- Sobre la columna obtenida en la actividad 1, agregar la solución de urea

al 1% lentamente.

- Recoger el eluyente y agregar una gotas de fenolftaleína

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- Apuntar sus observaciones.

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6 RESULTADOS

7 DISCUSIONES

8 CONCLUSIONES:
 La enzima extraída de la soya (ureasa) pudo ser retenida por la cascaras de pecanas por
el método de adsorción que se puso en práctica en el laboratorio. Esto se dio, debido a
que los poros de la cáscara de pecanas funcionaron como almacenamiento de la ureasa,
para una prolongada conservación, en comparación al tipo de almacenamiento común
(dentro de un ambiente frio).
 Se pudo acelerar el proceso de la transformación de hidrolisis de la urea a dióxido de
carbono y amoniaco; utilizando el catalizador enzimático ureasa.
 La reacción observada (cambio de color) se dio debido a que la solución resultante
(dióxido de carbono y amoniaco) interactuó con la fenolftaleína, denotándose una
coloración rosada en estado básico.
 La limpieza de las cascaras fue efectiva ya que pudo retener la enzima ureasa.
 Este método para la adsorción de la enzima es el más utilizado y efectivo para la ureasa.
 La ureasa es altamente sensibles a las cantidades de trazas de iones de metales pesados.
 El proceso de eliminación de sustancias toxicas (fenol y yodo) es indispensable para que
la enzima, al momento de la adsorción, quede retenida en los poros de las cascaras de
pecanas.

9 RECOMENDACIONES:
 Utilizar adecuadamente el uso del agua potable y agua destilada para el lavado de las
cascaras de pecanas; optimizando esto con el cloruro de sodio al 5%, eliminando las
sustancias toxicas (fenol y yodo).
Tratar de utilizar la cantidad necesaria de soya, para no generar gran cantidad de
desperdicios.
 Tener todos los reactivos ala mano para que el proceso sea ordenado y rápido.
 Se recomienda un trabajo en equipo, para generar una mayor organización en los
distintos procesos del laboratorio.

10 CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son las aplicaciones de la inmovilización de enzimas en el área
médica, alimentaria y ambiental? Recurrir a datos de la literatura para
contestar a esta pregunta.
Aplicaciones médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas. El estudio de las
enzimas inmovilizadas para aplicaciones biomédicas se inició en la década de 1960 (,
con el objetivo de resolver algunas de las limitaciones para el uso de enzimas clínicas.
Desde entonces, varios enfoques han sido utilizados en la terapia de enzimas ya sea
para la detección de sustancias bioactivas en el diagnóstico de enfermedades o con el
objetivo de tratar una condición de enfermedad. Por ejemplo la L-asparaginasa se
utiliza en el tratamiento de leucemias y cánceres diseminados que requieren
asparragina para desarrollarse. Se ha diseñado un hemodializador de fibra hueca que
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contiene asparaginasa inmovilizada (Callegaro y Denti., 1983). Se han probado

preparados de enzimas microencapsuladas para tratar enfermos con alteraciones
genéticas, en las cuales estaban ausentes algunas enzimas. También los preparados
pueden ser utilizados para mejorar la digestión, eliminando metabolitos tóxicos y
prevenir el desarrollo de tumores. Debido a su aplicación práctica, el estudio de las
enzimas inmovilizadas en los soportes o microencapsuladas permitirá una mejor
comprensión de su funcionamiento in vivo
Aplicaciones alimentarias: Son muchas las enzimas que se emplean en el procesado, la
preparación y la conservación de los alimentos. Normalmente, las enzimas solubles
añadidas son inactivadas por calentamiento una vez que el tratamiento ha concluido.
En ocasiones se permite que continúe su actividad para que los alimentos desarrollen
el aroma y la textura deseados, pero nunca se reutilizan. La inmovilización permite que
las enzimas puedan ser reutilizadas repetidamente en operaciones continuas o
discontinuas. De todas maneras, existen limitaciones a su empleo relacionadas con los
requisitos económicos y sanitarios inherentes al procesado de alimentos. A
continuación se resumen algunas de las aplicaciones conocidas de las enzimas
inmovilizadas en la industria alimentaria:
1) En la hidrólisis de proteínas: Las enzimas proteolíticas se emplean en la modificación
del contenido proteico de los alimentos. De esta forma se han conseguido hidrolizados
de proteínas de trigo mediante el uso de pepsina y proteasa coinmovilizadas en
chitosan . Otras proteasas inmovilizadas han sido empleadas en la disminución del
contenido de lactoglobulina en la leche, en la industria quesera y en la solubilización
de concentrados proteínicos de pescado.
2) En la hidrólisis de hidratos de carbono: La presencia de lactosa en la leche (4,3-4,5%)
y en algunos derivados lácteos es perjudicial para aquellas personas que carecen de
lactasa intestinal, y su ingesta provoca diarreas y diversos trastornos intestinales. La
eliminación de este azúcar se puede conseguir tratando la leche con ß-galactosidasa de
levaduras inmovilizada en fibras de acetato de celulosa (30) y es de gran importancia
en la preparación de productos lácteos dietéticos. Su eliminación también es
interesante en la preparación de helados, ya que la lactosa tiende a cristalizar a
temperaturas bajas. El proceso de degradación del almidón, procedente de diversas
fuentes vegetales como el maíz, se realiza mediante la utilización de amilasa,
glucoamilasa y glucoisomerasa inmovilizadas (31). De esta manera, se consigue un
jarabe enriquecido en fructosa, que sirve de edulcorante en bebidas refrescantes como
la Coca-Cola o Pepsi. La pectinasa se emplea para hidrolizar la pectina, componente
estructural de frutas y verduras. Esto permite la obtención de un zumo menos viscoso
y más concentrado. La pectinasa se emplea inmovilizada sobre diferentes soportes
(PVC, poliéteres, poliacrilamidas, alúmina, etc.En la mejora de las características
organolépticas de ciertos alimentos. Así el empleo de células de Arthobacter globilis
atrapadas en poliacrilamida permite eliminar el MIGUEL ARROYO 23-39 15 Ars
Pharmaceutica, 39:2; 1998 sabor amargo del zumo de los cítricos. Por otra parte, las
células de Leuconostoc oenos inmovilizadas en alginato se han utilizado en la
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desacidificación del vino. Endo-ß-glucosidasas inmovilizadas en esferas acrílicas

permiten incrementar el aroma de vinos y zumos. Finalmente ciertas lipasas y protesas
encapsuladas se están aplicando en la maduración de quesos (33). 4) En la obtención
de edulcorantes y aditivos alimentarios (21): En la obtención industrial del ácido L-
málico interviene la fumarasa de Brevibacterium flavum atrapada en k-carragenato.
Este es un aditivo importante para zumos de frutas, refrescos, mermeladas y dulces.
También, las enzimas inmovilizadas permiten la obtención industrial de edulcorantes
alimentarios como el aspartamo, fructooligosacáridos, diversos dipéptidos, etc.
Aplicación Ambiental: El uso de células inmovilizadas en el área ambiental ha sido
poco explotada, a pesar de que se reconoce su potencial en la biodegradación de
contaminantes debido al incremento en la estabilidad de las células y la tolerancia ante
ciertos compuestos tóxicos. Los ensayos de biodegradación de contaminantes
orgánicos se han realizado principalmente en medio líquido, y son escasos los ensayos
de biodegradación de contaminantes en suelos, es por esto que el inter ´ es del
presente trabajo se centró en revisar el estado del arte de la uso de microorganismos
inmovilizados para la degradación de contaminantes orgánicos ´ en suelos. Se hace una
revisión de los soportes comúnmente usados en la inmovilización de microorganismos
para fines ´ ambientales, así como de los diferentes enfoques que se han trabajado,
para así identificar posibles áreas de oportunidad para ´ futuras investigaciones
2. ¿Qué tipo de inmovilización es la que se ha llevado a cabo en la presente
práctica fundamente su respuesta? ¿Qué ventajas y desventajas tiene este
método?

Métodos de inmovilización de enzimas por retención

Atrapamiento Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores
de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros
fotoentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato
o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la
suspensión de la enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la
polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo
químico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser más
resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de
un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las
microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez desde el
punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener
derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su
estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las
condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química
del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína.
Método Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización
más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión
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covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen
con nucleófilos de las proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se
encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de
enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina,
y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y
glutámico. El resto de aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran
expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unión
covalente. Este método presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla;
2. La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización;
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho
fluidizado o tanque agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, de los
disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.
En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una serie de
inconvenientes:
1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que
condiciona el número de uniones enzima-soporte y su geometría, que puede ser
distorsionante y conducir a derivados inactivos.
2. El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo. Para
evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia de un inhibidor
que bloquee el centro activo. La inmovilización covalente no es aconsejable en
aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc.

11 BIBLIOGRAFÍA:
 Edgardo Ridner. (2006). Soja. Argentina-Buenos aires: soja.
 Florencia Grasso. (2006). Desarrollo de una formulación estable de ureasa líquida para
la determinación de urea en suero. Scielo, V.17, n.3.
 Jabri, E.; Carr, M. B.; Hausinger, R. P.; Karplus. (2011). Ureasa. 2018, de wikipedia Sitio
web: https://es.wikipedia.org/wiki/Ureasa
 Lluís Nadal y Balandras. (2015). Reacciones espectaculares y de química recreativa.
Instituto Lluís de Requesens: Molins de Re.
 Anna Lorenc. (2010). La investigación de la acción de la ureasa. Science in school, 15, 9.