Laboratorio de Cultivo de Tejidos www.espe.edu.

ec
2019

Inducción de callo in vitro de Zanahoria (Daucus carota)

C. Panchana1*, A. Ortega2*, M. Jadán,3*

*Universidad de las Fuerzas Armadas. Laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. Departamento de Ciencias
de la Vida y de la Agricultura, Sangolquí, Ecuador
Correspondencia: cjpanchana@espe.edu.ec1, akortega@espe.edu.ec2, mbjadan@espe.edu.ec3.

Palabras Claves: callo, zanahoria, raíz, in-vitro, medio MS, contaminación.

RESUMEN

La inducción de callos in vitro es una de las técnicas en el cultivo de tejidos que se ha

convertido en una invaluable herramienta en el campo de la botánica experimental.
En este trabajo se estudia el comportamiento in vitro de explantes a partir de raíz de
Daucus caurota con el objetivo de inducir callo. Se establecieron protocolos de
desinfección con detergente al 1% durante 15 minutos, y cloro al 5% por 10 minutos,
la siembra se realizó en dos frascos cada uno con 4 explantes en un medio MS
(Murashige-Skooge) suplementado con 30 g de azúcar, 6 g de agar, 0.5 mg/L de BAP
y 3mg/L de 2,4-D. La evaluación del explante fue valorado por tres semanas
determinando la presencia de contaminación por hongo (25%) y bacteria (25%), el
estado de desdiferenciación del callo y el estado del explante (viable (50%), oxidado
(16%) y necrosado (34%). El estadio del callo fue de 50% para el inicio del ccallo. El
análisis estadístico se lo realizó en InfoStat y OringPro.

Key words: callus, carrot, root, in-vitro, MS, pollution

ABSTRACT

Induction of callus in vitro is one of the techniques in tissue culture that has become
an invaluable tool in the field of experimental botany. In this work the in vitro
behavior of explants from the root of Daucus caurota is studied in order to induce
callus. Disinfection protocols were established with 1% detergent for 15 minutes,
and 5% chlorine for 10 minutes, sowing was done in two bottles each with 4 explants
in an MS medium (Murashige-Skooge) supplemented with 30 g of sugar, 6 g of agar,
0.5 mg / L of BAP and 3mg / L of 2,4-D. The explants were evaluated for three weeks
determining the presence of contamination by fungus or bacteria, the state of
dedifferentiation of the callus and the state of the explant (viable, oxidized or
necrotic).

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INTRODUCCIÓN
La zanahoria es una raíz cultivada alrededor del
mundo, y es conocida por ser rica fuente en β-
caroteno, α-caroteno, vitamina E y C (Kaur, et al.,
2010). En el Ecuador se cultiva zanahoria desde hace
500 años, pero siempre de la manera tradicional,
siendo la variedad Chantenay la más cultivada, el
promedio de rendimiento es de 10 t/ha (Tayupanta,
2010).
En Ecuador existen casas comerciales que buscan la
manera de que los agricultores cambien sus semillas
a nuevos híbridos, teniendo innumerables ventajas
(Araujo, 2010). Las técnicas de cultivo han tenido
una acogida e importancia para la producción de
semillas de alta calidad (Manzano y col., 2003; 2005).
En 1958, explantes de zanahoria cultivadas en agua
de coco dentro de un dispositivo rotatorio, demostró
la totipotencia de estas células, abriendo un campo
de cultivo de tejidos vegetales y la generación de
plantas modificadas por ingeniería genética
El cultivo in vitro de zanahoria puede apoyar al
mejoramiento de disponibilidad de plantas de
diferentes variedades. (Rodriguez et al., 2008). La
técnica de cultio de callo in vitro brinda la ventaja de
estudiar las respuestas celulares, separada de las
respuestas de la planta completa (Cardenas, 2001).
Es necesario establecer condiciones estandarizadas
para el medio de cultivo, dependiendo del tejido
vegetal bajo condiciones estériles y libres de
contaminantes, las características del medio en
donde permanece los explantes deben ser benéficas
para el crecimiento y desarrollo (Tello, 2016).
El objetivo de este estudio es familiarizarse con las
técnicas de cultivo vegetal mediante la inducción de
callo a partir de explantes de raíz de zanahoria
(Daucus carota).
METODOLOGÍA
Colecta y transporte del material botánico. Se
compraron raíces de zanahoria de 10 cm de la
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variedad de Chantenay en un supermercado, un día
antes de la práctica, estas fueron refrigeradas toda la
noche. El material fue transportado a los
laboratorios de cultivo en fundas ziploc.
Preparación del medio de cultivo. Para la preparación
del medio MS se tomaron 20 mL del stock I, 10 mL
del stock II, III, IV y V en un matraz, se enriqueció
con las hormonas de crecimiento BAP (0.5 mg/L),
2.4-D (3mg/L), y se añadió 30g de azúcar. Se midió
que el pH esté en 5,7-5.8, finalmente se agregó agar
y se procedió a dispensar en los frascos y autoclavar.
Esterilización del material biológico. Las raíces de
zanahoria fueron lavadas con agua de la llave
retirando cualquier desecho de tierra, enseguida
fueron sumergidos en detergente al 1% por 15
minutos en frascos de vidrio, durante este tiempo se
agitó levemente los frascos de forma manual.
Posteriormente se lavó las muestras con agua estéril
retirando todo el detergente, e inmediatamente se
sumergió las muestras en los frascos con cloro al 5%
por 10 minutos agitando de forma manual.
Siembra del explante en el medio de cultivo. En la cámara
de flujo laminar con las muestras ya esterilizadas y
en condiciones de asepsia, se procedió a cortar sobre
servilletas los extremos de la raíz y las partes
quemadas. Se seccionaron discos de 1 cm de la parte
media de la zanahoria, aislando 2 pedazos de la
parte nuclear (cambium) y dos pedazos de los
extremos (floema). Con ayuda de la pinza se
introdujo los explantes en el medio, sellando con
plástico los frascos e incubando a una temperatura
de 27°C en fotoperiodos de oscuridad.
Monitoreo de la formación del callo. El monitoreo se
llevó durante tres semanas, evaluando los
parámetros de contaminación por hongo o bacteria,
el estado de desdiferenciación del callo, y el estado
del explante (viable, oxidado o necrosado). El
programa estadístico utilizado fue InfoStat versión
2016 y OringPro versión 2019.
RESULTADOS
Explantes de zanahoria. Los explantes fueron
tomados del núcleo (cambium, xilema) y del floema
como se indica en la Fig1. En el primer frasco se
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sembró explantes de la parte más próxima a la zona

distal de la zanahoria, y en el segundo frasco se
sembró solo explantes de la parte media de la
zanahoria.

Cambium

Floema

Figura 3: Diagrama de pastel global de los estadios de explantes.

De los 88 explantes sembrados el 50% resultaron viables, el 34%
necrosados y el 16% oxidados. Fuente (InfoStat,2016).

Xilema

Figura 1: Seccionamiento de los discos de zanahoria. En el frasco

uno los explantes 1, 2, 4 fueron sembrados con el corte
longitudinal sobre el medio, y el explante 1 fue sembrado con el
corte transversal sobre el medio. En el frasco dos se sembraron
3 explantes de la zona del cambium y 1 de la zona del floema
con el corte transversal sobre el medio

Estado del explante: La evaluación del explante se
la realizó en tres semanas y consistió en determinar
el estadio del explante en las siguientes categorías
necrosado (explante de color negro), oxidado
(explante de color blanquecino) y viable (explante
de buena condición).
Figura 4: Observación de un explante necrosado a las 2
semanas, este presente una coloración negrusca, además de
tener una contaminación por bacteria (zona blanquecina).
Estado de contaminación de los explantes: La
evaluación de contaminantes fue de tres categorías
bacteria (zona blanquecina alrededor del explante y
segregado en el medio), hongo (presencia de hifas),
y explantes no contaminados, durante tres semanas.

Figura 2: Diagrama de barras compuestas de los 6 grupos en
relación con el porcentaje del estado de los explantes. El grupo
3 presenta la mejor calidad de explantes viables con un 88% de
las 16 muestras sembrados, mientras que el grupo 2 presenta el
porcentaje más alto del 56% de explantes necrosados, de un total
de 16 muestras. Fuente (OriginPro, 2019).
Figura 5: Diagrama de barras comparativas de los estadios de
contaminación de los 6 grupos en relación con el número de
explantes. El grupo 3 no presenta contaminantes en los 16
explantes, mientras que para el grupo 4 se observa la
contaminación más alta por bacteria con 11 explantes, y para el
grupo 5 la contaminación más alta por hongos con 10 explantes.
Fuente (OriginPro, 2019).

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Figura 6: Diagrama de pastel global de los estadios de
contaminación. De los 88 explantes sembrados el 50% no
resultaron contaminados, el 25% se contaminaron por hongos y
el 25% por bacterias. Fuente (InfoStat,2016).
Figura 7: Observación de un explante de dos semanas
contaminado por bacteria, se presencia una segregación
blanquecina en el medio y alrededor del callo.
Estado de desdiferenciación del callo: Los estados
de desdiferenciación se la realizó en tres semanas
mediante una escala siendo "a" ningún cambio, "b"
inicio del encorvamiento del explante o
ensanchamiento, "c" formación parcial de callo, y "d"
formación completa de callo
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Figura 8: Diagrama de barras compuestas de los 6 grupos en
relación al porcentaje del estado de desdiferenciación de los
explantes. El grupo 3 alcanzó el mejor estado de
desdiferenciación con formación parcial del callo en un 69% de
los 16 explantes, mientras que el grupo 5 y 1 lograron el 19% de
la formación parcial del callo de los 16 explantes sembrados.
Fuente (OriginPro, 2019).
Semana 1
A B
Semana 2
C D
Figura 9: Etapa de desdiferenciación del callo. (A) No se observa
ningún cambio, (B) Dos explantes presentan un
ensanchamiento, (C) Ensanchamiento, (D) Tres explantes
presentan un encorvamiento y una formación parcial de callo.
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Figura 10: Estado de formación del callo. El 50% indica que no
hubo presencia de callo (a), el 25% inicio del encorvamiento del
explante o ensanchamiento (b), el 25% formación parcial de
callo (c), y un 0% para la formación completa de callo (d)
DISCUSIÓN
Uno de los pasos más importantes para la inducción
del callo es la esterilización del explante, en la
actualidad se ha generalizado el uso de etanol,
hipoclorito de sodio de 1% al 3% y contenidos en
productos de uso doméstico como detergentes, con
menor frecuencia hipoclorito de calcio y cloruro de
mercurio, porque son compuestos altamente tóxicos
y que no son fácilmente removibles del explante
(Linz & Jarret, 1993).
De los 88 explantes sembrados ninguno llegó a la
etapa de callo mostrado en la Fig8, para Doddy &
Roberts (1985), el tiempo en que tarde de formarse
el callo de un explante de zanahoria es de uno a tres
meses en cultivo in vitro.
Otro de los factores para la formación del callo es la
zona del explante (cambium, floema y xilema). Se
observa en la Fig9 que la formación de callo en el
frasco 1 a partir de explantes de floema es muy
pobre a diferencia del frasco 2 donde existió una
formación parcial del callo de explantes
provenientes del cambium. La formación de callo se
presenta mayormente en centros de actividad
meristemática y en regiones cambiales con zonas de
diferenciación celular como es el caso de la zona de
cambium en la zanahoria (Dodd y Lorin, 1982),
mientras que en el floema el callo prolifera
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débilmente provocando pústulas de células
separadas Gauthered, 1959 (citado por Dodd y
Lorin, 1982).
En la Fig 7 y 9 se observa explantes pequeños
contaminados por bacterias. En la gráfica 6 se
observa una contaminación global del 25% por
hongos y el 25% por bacterias. Para Alemán (2000),
el tamaño del explante es una condición que influye
en la etapa de desinfección y regeneración de la
planta, a medida que la muestra sea más grande el
peligro de contaminarse va ser mayor.
Ammirato (1983), indica que la contaminación de los
cultivos vegetales se da mayormente en los procesos
de siembra, por malas técnicas de asepsia del
operario o por flujos de aire no controlados, y
además señala que la contaminación por bacteria se
debe a un mal manejo o falta de desinfección del
material utilizado para la inoculación del explante.
Para Pierik (1990), el cloro puede causar efectos
negativos, penetrando el explante y provocando un
efecto tóxico, el cual puede llegar a causar la muerte
del tejido vegetal (necrosis) y más en explantes
pequeños.
CONCLUSIONES
De los 88 explantes desinfectados con detergente al
1% durante 15 minutos, cloro al 5% por 10 minutos
y sembrados en medio MS, enriquecidos con BAP y
2,4-D, presentaron el 50% de explantes viables, el
16% de explantes oxidados, y 34% de explantes
necrosados. Con respecto a la contaminación del
explante el 50% no resultaron contaminados, el 25%
se contaminó por hongos y el 25% por bacterias.
Para la evaluación de la formación del callo el 50%
indica que no hubo presencia de callo, el 25% inicio
del encorvamiento del explante o ensanchamiento,
el 25% formación parcial de callo, y un 0% para la
formación completa de callo.
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