Identificación de Especies Procariotas

Martha E. Trujillo
mett@usal.es

Departamento de Microbiología y Genética

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

• Miembro del Comité Internacional de Sistemática de Procariotas

• Editora en Jefe de la revista International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM)
• Miembro del Consejo Manual de Bergey de Sistemática Bacteriana
 NOMENCLATURA

CLASIFICACIÓN
TAXONOMÍA MICROBIANA

IDENTIFICACIÓN

DIVERSIDAD
 http://www.the-icsp.org/icsp-members

¿Cuales son los requisitos para describir

una especie en procariotas?

¿Qué métodos tengo que aplicar?

No existe una Taxonomía Oficial

Misión del ICSP

• Cumplimiento de las reglas de nomenclatura según el Código Internacional de

Nomenclatura de Procariotas (ICNP)

• http://ijs.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijsem.0.000778
Concepto de Especie Procariota

Grupo de microorganismos que comparten muchas

propiedades estables y difieren de manera significativa de otro
grupo de microorganismos.

Definición pragmática:

• Identidad de la secuencia del gen rRNA 16S ≥95%

• Similitud entre genomas: Average Nucleotide Identity of

orthologs (Valor ANI): ≥95%

• Ecotipo común: (hábitat, metabolismo, etc.)

• Transferencia horizontal de genes

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN

• Microbiología clínica
• Microbiología de los alimentos
• Depende de las bases de Datos

En la mayoría de los casos NO es posible identificar una bacteria aislada de una muestra ambiental. Por lo
tanto será necesario CLASIFICAR y NOMBRAR el nuevo microorganismo.
1. Caracterización Fenotípica (morfología, fisiología, etc)
2. Quimiotaxonomía (pared celular, lípidos celulares, etc.)
3. Caracterización genotípica (gen rRNA 16S, MLSA, WSG)

¿Qué métodos debemos aplicar?

Depende del grupo Taxonómico

Secuencia del gen rRNA 16S - Filogenia
 Limitaciones:
• Gen altamente conservado

• Comparación de un solo gen frente a los

miles que posee una bacteria

• NO tiene resolución a nivel de especie

• Se considera que dos bacterias con un índice de similitud ≥ 95% pertenecen al mismo género
IDENTIFICACIÓN A NIVEL DE ESPECIE

Se considera que dos cepas pertenecen:

• A la MISMA especie, si los valores de hibridación

entre ellas es ≥ 70%

• A especies DIFERENTES, si los valores de

hibridación son < 70%

La regla de oro no es perfecta…..

• Método indirecto
• Altamente irreproducible, poco fiable
• Alto coste
• Laboratorios especializados
• Resultados no acumulables
• No se pueden crear bases de datos
 Análisis MLSA – Multilocus Sequence Analysis una alternativa a la DDH

Reconstrucciones filogenéticas basadas en secuencias parciales de genes de mantenimiento “housekeeping”

16S rRNA gyrB rpoB atpD recA

Ventajas:
16S rRNA gyrB rpoB atpD recA • Método reproducible
• Bases de Datos disponibles - limitadas
• Mayor resolución que el gen rRNA 16S

Análisis MLSA
• Selección de genes (gyrB, recA, rpoB, atpD, etc.)
Desventajas:
• Amplificación de los genes seleccionados (diseño de primers) • Calidad de las secuencias
• Alineamiento de las secuencias (NT y AA) • Longitud de los fragmentos
• Problemas de alineamiento incorrecto
• Concatenado de los genes • No existe un grupo de genes común para
• Reconstrucción de arboles filogenéticos todos los microorganismos
¿Cuanta caracterización es necesaria para definir una nueva especie?

• Taxonomía Molecular (secuencia del gen rRNA 16S, contenido G+C,

hibridación DNA-DNA)

• Análisis fenotípicos (morfología, tinciones, movilidad, metabolismo, etc.)

• Quimiotaxonomía (análisis de estructuras celulares p.ej. Pared celular,

lípidos polares, menaquinonas, ácidos grasos, proteínas totales, etc.)

TAXONOMÍA POLIFÁSICA
• 16S rRNA: 99.2%

• Hibridación digital: 27.8%

• Caracteres fenotípicos

• Marcadores quimiotaxonómicos
 ¿Cuanta caracterización es necesaria para definir una nueva especie?

1. Caracteres fenotípicos
• Caracteres morfológicos: forma, tamaño, tinción Gram,
movilidad, microscopía
• Metabolismo: fuentes de carbono, nitrógeno, actividades
enzimáticas (oxidasa, reducción de nitratos, catalasa, celulasas,
etc.)
• Ensayos de temperatura, pH, salinidad, oxígeno, etc.
• Pruebas miniaturizadas (Biolog, API, etc).

2. Marcadores quimiotaxonómicos
• Perfil de lípidos polares
• Perfil de ácidos grasos
• Perfil de menaquinosas respiratorias
• Perfil de poliaminas
• Perfil de azúcares celulares o de pared
• Análisis del peptidoglicano de la pared celular
• Perfil de proteínas celulares

En muchas ocasiones la caracterización incluye una gran

cantidad de pruebas sin ninguna relevancia taxonómica
Problemas de la Taxonomía Polifásica

1. Métodos moleculares (Gold Standard)

• La hibridación DNA-DNA es una medida indirecta
• No es reproducible, es un método laborioso
• No es portable- no se pueden crear bases de datos de referencia
• Coste alto

2. Pruebas fenotípicas
• Estas pruebas deben repetirse una y otra vez con las cepas de referencia
• Resultados contradictorios entre laboratorios
• Coste alto

3. Métodos de quimiotaxonomía
• Se requiere de gran experiencia para realizar estos análisis

Vandamme, P., and Peeters, C. (2014). Time to revisit polyphasic taxonomy. Antonie van
Leeuwenhoek, Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 106, 57–65. doi:10.1007/s10482-014-0148-x.
Utilización de Secuencias de Genomas en Taxonomía de Procariotas

Ventajas
• Método altamente reproducible
• Rápido
• Permite la comparación directa entre genomas
• Depósito en Bases de Datos
• Accesibilidad
• Coste cada vez es menor
• Herramientas bioinformáticas disponibles

Limitaciones
• Falta por secuenciar muchas cepas tipo
• Calidad de las secuencias de genomas
• Validación de los nuevos métodos (ANI, etc).
Herramientas bioinformáticas para comparar genomas
• Análisis filogenómico
• Genome Blast Distance Phylogeny (GBDP) - (http://ggdc.dsmz.de)
• (Meier-Kolthoff et al. 2013)
• Up to date Bacterial Core Gene (UBCG) - (https://www.ezbiocloud.net)
• (Na et al. 2018)

• General overall genome relatedness indices (OGRI)

• Average Nuclecotide Identity (ANIb) (cutoff value 95-96%)
• (Goris et al. 2007)

• Ortho-ANI - (https://www.ezbiocloud.net) (cutoff value 95-96%)

• (Lee et al., 2016)

• Digital DDH (dDDH) - (http://ggdc.dsmz.de) (cutoff value 70%)

• (Meier-Kolthoff et al. 2013)

Chun y Rainey, 2013; IJSEM

 Bacteria aislada

Secuencia y análisis
Si el valor del 16S es ≥ 98.7%
del gen rRNA 16S

Si el valor de similitud es ≤98.7% con

las especies más próximas Secuencia del genoma (ó DDH)
• OGRI (ANI >95-96; dDDH 70%)

Posible nueva especie

Secuenciación del Genoma Identificación a nivel de

Caracterización Fenotípica
especie
Morfología, Gram, pruebas Tamaño, número de ORFs,
bioquímicas principales, contenido G+C, índices OGRI (ANI,
características diferenciales dDDH, etc)
(Tabla), Quimiotaxonomía
(depende del grupo)
Agradecimientos

Dra. Alba García Trespalacios Rangel

Dra. Sandra Baena Garzón

Comité Organizador del Curso

Pontificia Universidad Javeriana - Bogotá