“Métodos de autenticación de microorganismos I.

Consideraciones generales y métodos más

utilizados en procariotas”

Rosa Aznar
Catedrática de Microbiología
Universitat de València
Directora de la CECT

Bogotá 30/10/2018 Curso Internacional Colecciones de Microorganismos: aspectos técnicos y legales

 Identificación / Autenticación: Autentificación
Cepa Cepa
desconocida conocida

Nuevo Cepa cedida Generación

Técnica elegida
Depósito por otra de nuevo lote
para identificar
Colección
Secuencias génicas, Sistemas Miniaturizados,
Control de Calidad
Sistemas Multiprueba, GC-FAME, MALDI-TOF, etc.
Técnica elegida

Autentificación
Identificación

para autentificar

Secuencias génicas, Sistemas Miniaturizados,

Sistemas Multiprueba, GC-FAME, MALDI-TOF, etc.
Datos

Datos
Comparación
con bases de
datos existentes

Comparación
Ne con bases de
a ga datos existentes
tiv tiv
osi a
P
Ne
va ga
siti tiv
Po a
Perfil no incluido
en la base de Posible nueva
Identificación especie
datos consultada
Autentificación Contaminación,
Necesidad de nuevas pruebas Autentificación deriva genética…

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 Procedimientos de control en procariotas

Viabilidad
Objetivos de cualquier
método de conservación Pureza microbiológica

Estabilidad de fenotipo y genotipo

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 ¿Cuando se realiza el control?

Ø Cuando se recibe el material original

Pureza y viabilidad

Ø Después de la primera conservación (1er Lote)

Viabilidad, pureza y autenticidad (RNAr 16S siempre, otras)

Ø Después de cada nuevo lote generado

Viabilidad, pureza y autenticidad (FAME, RNAr 16S, depende
del grupo)

Además, con una periodicidad que depende del microorganismo,

realizamos controles de viabilidad post-almacenamiento

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 Procedimiento de control

Preparación y reposición de lotes

Comprobación de lote

Viales de trabajo

Cultivo activo en
condiciones óptimas de
crecimiento Suspensión celular con el
crioprotector adecuado

Lote homogéneo

Viales de reserva

Viales de reserva
2º almacén

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 Control de viabilidad

El control de viabilidad consiste en observar el

crecimiento de la cepa en su medio recomendado
• No utilizar nunca un medio selectivo/diferencial
• Las cepas liofilizadas/congeladas tienen una fase
lag mayor de lo normal. Prolongar el tiempo de
incubación (p.e. hasta 7 días para cepas que
crecen en 24 h)

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 Control de pureza

El control de pureza consiste en observar el aspecto y

morfología de las colonias en placa de medio sólido
• No utilizar nunca un medio
selectivo/diferencial
• Hacer la siembra por triple estría
• Hacer observaciones al microscopio
• Registrar la información morfológica

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 Control de autenticidad

Técnicas utilizadas en la CECT

Caracteres fenotípicos, sistemas miniaturizados
Análisis de la secuencia del gen de RNAr 16S
Análisis de la secuencia de otros genes “housekeeping”
Composición relativa de los ácidos grasos celulares (FAME)
Composición relativa de proteínas celulares (MALDI-TOF)

No se aplican todas las técnicas a todos los lotes

Se seleccionan según la especie / género / grupo microbiano al que
pertenecen (arqueas: secuencia rpoB; enterobacterias: FAMEs)
En los nuevos depósitos siempre incluimos la secuencia del RNAr 16S,
aunque apliquemos además otros métodos

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 Caracteres fenotípicos

Caracteres fenotípicos
Morfología (colonial y celular)
Test del KOH 3% à Gram positivo o Gram negativo
Citocromo oxidasa (reactivo N,n,n,n-tetrametil-p-fenilendiamina)
Catalasa (peróxido de hidrogeno al 30%)

Para confirmar pureza

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 Caracteres fenotípicos

VENTAJAS
Sistemas Miniaturizados • Menor espacio de almacenamiento
• Galerías API-Biomerieux • Caducidad más larga
• BBLCrystal • Estandarización
• Remel RapID • Facilidad de manejo
• Microgen • Resultados más rápidos
• Biolog
INCONVENIENTES
• etc.
• Limitado a patógenos,
fundamentalmente
•Base de datos limitada
• Estandarización (pH,
requerimientos iónicos, de factores
de crecimiento, etc.)

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 MALDI-TOF MS
Ø “Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry”
Ø Perfil de proteínas, mayoritariamente ribosomales (2-20 KDa), que se expresan
constitutivamente à técnica reproducible
Ø El perfil proteico no se ve afectado por las condiciones de cultivo o fase de
crecimiento en que se recoge la biomasa

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 MALDI-TOF MS
Perfil MALDI-TOF Lactobacillus casei CECT 475T

Espectro: 16/cepa Librería: normalización picos 16 espectros

Comparación de
BIOTYPER 1.1 librerías con base de
datos

Dendrograma
Identificación por valor numérico (log score)

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 MALDI-TOF MS

Autentificación en cepas de la CECT

Base de datos
MALDI-TOF MS
CECT

Ø Ventajas: Técnica reproducible y de fácil manejo

Ø Desventajas: Requiere de una base de datos previa

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 GC FAME
Ø “Fatty Acid Methyl Ester Gas Chromatography”
Ø Perfil de ácidos grasos característicos de especie bacteriana

Condiciones de cultivo pre-establecidas:

ü Medio de cultivo
ü Atmósfera
ü Temperatura
ü Tiempo de incubación

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 GC FAME
FID1 A, (E09B25.668\A0041041.D)
Volume: DATA File: E09B256.68A Samp Ctr: 4 ID Number: 1041

0.698
0.708

2.249

2.405
2.433

2.788
2.840

2.982
Type: QC Bottle: 3 Method: RTSBA6
Created: 11/25/2009 4:25:50 PM

2.207

2.775
Sample ID: CECT 115

2.055
25

3.045
1.332
RT Response Ar/Ht RFact ECL Peak Name Percent Comment1 Comment2
0.6980 630450 0.006 ---- 66.159 ---- < min rt
0.7077 1,19E+12 0.018 ---- 66.801 SOLVENT PEAK ---- < min rt Reference 20
12.123 4151 0.010 1.163 99.992 10:00 0.81 ECL deviates -0.001 0.003
Reference
13.317 21007 0.009 1.130 106.153 11:0 iso 3.97 ECL deviates -0.003 0.001
Reference
13.495 431 0.009 1.125 107.073 11:0 anteiso 0.08 ECL deviates 0.002 0.006
14.479 636 0.013 1.101 111.769 10:0 2OH 0.12 ECL deviates -0.001
15

1.671
15.122 1298 0.010 1.089 114.505 10:0 3OH 0.24 ECL deviates 0.003
16.004 8631 0.009 ---- 118.261 unknown 11.825 ---- ECL deviates 0.001

3.414
2.345
16.710 11326 0.009 1.059 121.099 11:0 iso 3OH 2.01 ECL deviates 0.002

1.600
17.763 821 0.018 ---- 125.005 unknown 12.502 ---- ECL deviates -0.001 Reference
18.097 3872 0.010 1.038 126.244 13:0 iso 0.67 ECL deviates 0.001 0.003
Reference 10
18.344 590 0.009 1.034 127.161 13:0 anteiso 0.10 ECL deviates 0.002 0.004

3.430
1.212

2.723
19.478 719 0.011 1.019 131.242 12:0 iso 3OH 0.12 ECL deviates 0.004

1.834 1.810

2.098

3.620
3.679
2.520
20.085 363 0.009 1.012 133.288 12:1 3OH 0.06 ECL deviates 0.004

2.278

3.480
1.634
1.512

3.076
20.548 22772 0.009 1.006 134.850 12:0 3OH 3.83 ECL deviates 0.002

3.103

4.242
Reference

2.190
1.948
1.350

1.697
1.448

1.966

2.152
1.776

2.008

2.315

3.018
2.365
20.976 2722 0.009 1.001 136.290 14:0 iso 0.46 ECL deviates 0.001 0.002 5
21.905 819 0.011 ---- 139.421 unknown 13.951 ---- ECL deviates -0.009 Reference -
22.071 23289 0.008 0.990 139.981 14:00 3.85 ECL deviates -0.002 0.001 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
22.493 27856 0.009 0.985 141.336 13:0 iso 3OH 4.59 ECL deviates 0.002
22.781 2312 0.011 0.983 142.257 13:0 2OH 0.38 ECL deviates 0.002
23.446 8867 0.009 0.976 144.388 15:1 iso F 1.45 ECL deviates -0.003 13:0 3OH/15:1
23.655 489 0.012 0.975 145.059 Sum In Feature 1 0.08 ECL deviates 0.003 iso H
Reference
24.048
24.334
25.199
217845
44783
2468
0.009
0.009
0.009
0.971
0.969
----
146.318
147.237
150.008
15:0 iso
15:0 anteiso
15:00
35.38
7.26
----
ECL deviates 0.000
ECL deviates -0.001
ECL deviates 0.001
0.001 -
Reference
0.001
Reference
MIDI Sherlock
27.230 3836 0.009 0.947 156.337 16:0 iso 0.61 ECL deviates 0.001 0.001
27.754 21281 0.008 0.943 157.970 16:1 w9c 3.36 ECL deviates -0.003 16:1 w7c/16:1
27.885 76204 0.009 0.943 158.378 Sum In Feature 3 12.01 ECL deviates -0.002 w6c
Reference
28.405
29.825
45746
30192
0.009
0.010
0.939
0.932
160.000
164.424
16:00
Sum In Feature 9
7.19
4.70
ECL deviates 0.000
ECL deviates -0.005
0.000
17:1 iso w9c Comparación
cromatogramas con
30.181 405 0.010 0.930 165.534 17:1 anteiso w9c 0.06 ECL deviates 0.001 Reference -
30.446 21044 0.009 0.928 166.359 17:0 iso 3.27 ECL deviates -0.001 0.001
Reference -
30.756 1381 0.010 0.927 167.325 17:0 anteiso 0.21 ECL deviates 0.000 0.001
31.025
34.144
1016
9707
0.010
0.009
0.926
0.914
168.165
177.940
17:1 w8c
18:1 w9c
0.16
1.48
ECL deviates 0.001
ECL deviates 0.000
base de datos
34.303 5014 0.010 0.914 178.439 Sum In Feature 8 0.77 ECL deviates -0.004 18:1 w7c -
Reference
34.799 1668 0.010 0.913 179.994 18:00 0.25 ECL deviates -0.001 0.001
Reference
36.789
42.419
3069
1055
0.011
0.014
0.909
----
186.394
204.810
19:0 iso 0.47
----
ECL deviates 0.001
> max rt
0.000
Matches:
ECL Deviation: 0.003 Reference ECL Shift: 0.002 Number Reference Peaks: 15
Library Sim Index Entry Name
Stenotrophomonas-maltophilia
Total Response: 623828 Total Named: 615892 RTSBA6 6.10 0.905 (Xanthomonas, Pseudomonas)
Percent Named: 98.73% Total Amount: 597913

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 GC FAME
Autentificación en cepas de la CECT

Ø Ventajas: Fácil manejo y bajo coste

económico
Ø Desventajas: Reproducibilidad
Base de datos dependiente de las condiciones de
GC FAME
cultivo empleadas y necesidad de una
CECT
base de datos previa

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 Secuenciación y análisis del gen RNAr 16S
Ø Gen universal
Ø Cobertura total en procariotas
Ø Resultados comparables interlaboratorio
Ø Técnica económica
Ø Sencilla (PCR – método Sanger)
Tamaño: 1522 bp à suficiente con 1000 bp en extremo 5’

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 Secuenciación y análisis del gen RNAr 16S

Bacterias 61.828
https://www.ezbiocloud.net
Arqueas 2.832

leBIBI QBPP

Herramientas públicas para el análisis

EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)
BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
RDP (http://rdp.cme.msu.edu/)
LeBibi (http://umr5558-bibiserv.univ-lyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi)
SILVA (http://www.arb-silva.de/)

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 Secuenciación y análisis del gen RNAr 16S
Si > 98,7% pertenecen a la
misma especie

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 Secuenciación y análisis del gen RNAr 16S

u Secuencia parcial de otros genes: u Overall genome relatedness index (OGRI)

rpoB, rpoD, gyrB, recA, … ANI: Average Nucleotide Identity
dDDH: Digital DDH
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20
 Secuenciación y análisis de otros genes

Genes Housekeeping (genes estructurales codificantes de proteínas)

Ø Aplicación a grupos que no se resuelven con el RNAr 16S

Ø Transferencia Horizontal de Genes (THG)
Ø Base de datos incompleta
Ø Cepas de interés biotecnológico, clínico y fitosanitario
Ø Análisis con Blast (frente a base de datos GenBank/EMBL/DDBJ)

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Gene Function Genus
atpD ATP synthase F1 Ensifer
dnaJ Chaperone with DnaK Neisseria, Ensifer, Thermus, Deinococcus
gap Glyceraldehydes-3-phosphate Ensifer
gapA Glyceraldehydes-3-phosphate Vibrio
groEL Post-translational modification, protein Streptococcus
turnover and chaperone genes
gyrB Gyrase B subunit Streptococcus, Vibrio, Bradyhizobium, Geobacter, Bradyrhizobium
luxABE Region of lux operon Vibrio, Photobacterium
pyrH Uridilate Kinase Vibrio
rctB Replication origin-binding protein Vibrio,
recA Recombinase A Vibrio, Ensifer, Bradyhizobium, Mycobacterium, Mycobacterium,
Geobacter, Bradyrhizobium
recN Recombination/repair protein Bordetella, Corynebacterium, Mycobacterium, Neisseria, Yersinia,
family Leuconostocaceae
rpoA RNA Pol alpha subunit Vibrio, Enterobacter, Lactobacillus
rpoB Transcription genes// RNA Pol Beta subunit Streptococcus, Vibrio, Bacillus, Legionella, Mycobacterium,
Pseudomonas, Staphylococcus, Bradyhizobium, Ensifer,
Geobacter, Halobacterium, Brucella
rpoD Factor sigma 70 RNA Pol Vibrio
sodA Inorganic ion transport and metabolism genes Streptococcus, Mycobacterium
toxR Transmembrane regulatory protein Vibrio

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 Consideraciones finales

ü Las colecciones microbianas albergan una enorme diversidad

à diferente estrategia a la hora de controlar la viabilidad,
pureza, autenticidad y estabilidad

ü No existen métodos universales (a veces ni dentro de la misma

especie) à con cada cepa hay que determinar las condiciones
más favorables

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Gracias por vuestra atención!!

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