UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE INGENIERÍA ELÉCTRICA Y ELECTRÓNICA

E.A.P DE INGENIERÍA ELECTRÓNICA

CURSO

Biosensors
Microelectrónica Phd. Tran Minh Cahn
(Trabajo monográfico)

GRUPO PROFESOR

1 Dr. Alarcon Matutti, Ruben Virgilio

APELLIDOS Y NOMBRES CODIGO

Rodríguez Vega, Jeremías Jhoel 15190130

Lima – 23 de mayo de 2019

 Índice
sumilla. ......................................................................................................... 3
objetivos generales y específicos ................................................................. 3
marco teórico ............................................................................................... 4
construcción de biosensores ........................................................................ 5
bioreceptores................................................................................................ 5
transductores................................................................................................ 7
biosensores de efecto de campo ISFET ...................................................... 11
inmovilización de bioreceptores ................................................................... 13
aplicaciones ................................................................................................. 16
métodos de fabricación ............................................................................... 18
Construcción de un biosensor amperométrico ............................................. 20
Materiales y Equipos Utilizados en la fabricación y diseño de biosensores . 24
Tendencias futuras ....................................................................................... 26
Referencias ................................................................................................. 27

2
 Biosensores: Fundamentos y Aplicaciones

Sumilla:

El libro trata acerca de la descripción y Estudio de sensores, dejando de lado los

diferentes aspectos de la señal y el procesamiento de señales. Se centra en
enfatizar el Carácter multidisciplinario de los biosensores y sus aplicaciones. Los
factores en los que se enfoca son la construcción del biosensor basados
esencialmente en la inmovilización de un bioreceptor en el transductor
correspondiente. Se encontrará que Hay una gran variedad de técnicas para
inmovilizar enzimas, cofactores y mediadores, microorganismos,
inmunoagentes, tejidos, y orgánulos. Una gran parte del libro está dedicado a las
enzimas ya que han sido ampliamente estudiado y son los más disponibles
comercialmente. También se abarca otros tipos de biosensores respecto a los
principios de operación y su construcción. Los biosensores forman parte de la
ciencia de la ingeniería en ambos conceptos y aplicación.

Objetivos:
Objetivos generales:

Aprender y comprender conocimientos prácticos aplicado en un entorno real en

el campo de la microelectrónica mediante el uso de biosensores y su aplicación
comercial.
Objetivo específico:

Conocer el área donde bifurcan varias ramas científicas como la biología y la

química, como se aprovechan sus propiedades en aplicaciones de ingeniería.

3
 Marco Teórico
Definición:

En términos de instrumentación, un sensor se define como un dispositivo de

medición que exhibe una característica de naturaleza eléctrica (carga, voltaje o

Corriente) cuando se somete a un fenómeno que no es eléctrico. La señal

eléctrica que produce debe llevar toda la información necesaria sobre el proceso
en investigación.
Bajo esta definición, un sensor podría ser considerado como un transductor,
ya que es un sistema que transforma una cantidad física en otra,

que es una función de la primera. Esta idea es restrictiva porque el transductor

es un dispositivo cuantitativo, un sensor en realidad posee mayor capacidad.

En primer lugar, reconoce el fenómeno, de forma específica si es posible, y lo

traduce en una propiedad cuantificable, que es entonces transformado en una
señal eléctrica por un transductor. Así, el evento se representa como una señal
eléctrica que pueden ser aplicados en técnicas modernas de recolección de
datos, control y regulación.

En un biosensor, el fenómeno es reconocido por un sistema biológico llamado

bioreceptor, que está en contacto directo con la muestra y forma el componente
sensible del biosensor. El bioreceptor tiene una particularidad selectiva que
identifica al analito.

4
 Construcción de biosensores
La construcción del biosensor consiste en combinar dos elementos con
diferentes características Esto conlleva tres pasos. Primero se elige un
bioreceptor, luego un transductor, y finalmente el componente biológico se fija al
transductor.

El bioreceptor desempeña el papel de un dispositivo de reconocimiento

molecular. En la presencia de la sustancia investigada, debe producir un efecto
fisicoquímico que es detectable por el transductor. Esto implica uno de varios
procesos, como la biocatálisis, acoplamiento inmunológico, o quimio-recepción.

Bioreceptores
Encimas
El biocatalizador empleado suele ser una enzima, los cuales están disponibles
comercialmente, por ejemplo, glucosa oxidasa y ureasa. Las enzimas también
se pueden extraer de una o más sustancias biológicas para necesidades
extremadamente específicas, y se pueden utilizar solos o juntos con sus
cofactores, como NAD y NADP.

El uso de enzimas comercializadas tiene una serie de ventajas, tales como

reproducibilidad por lotes, características conocidas y tiempos de vida, y
disponibilidad rápida Las enzimas comercializadas juegan así un papel
importante en los biosensores presentes en el mercado. La desventaja de las
enzimas radica en el hecho de que no siempre son muy estables, y con
frecuencia requieren la presencia de sus cofactores para su correcto
funcionamiento.
Microorganismos

Si un biosensor utiliza esquemas de reacción complejos, entonces puede ser

más conveniente utilizar microorganismos o células. Estas entidades poseen
todas las enzimas y cofactores necesarios en un entorno que ya ha sido
optimizado por la naturaleza. En el cultivo apropiado, los microorganismos
pueden reproducirse y compensar cualquier pérdida en la actividad enzimática
con el tiempo.
Tejido y orgánulos

Otra posibilidad para ampliar el campo de los biosensores es emplear secciones

de tejido animal o vegetal como fuentes de material enzimático el tejido tiene la
ventaja de la cohesión y tiene una estructura robusta suficiente para ser
conectado directamente al transductor sin tener que recurrir a las técnicas de
inmovilización de proteínas.

5
Inmuno-receptores

A diferencia de la biocatálisis, el acoplamiento inmunológico no implica liberación

de productos de reacción ni consumo de sustrato. Ahí esta una variación
extremadamente débil en el potencial que surge del antígeno anticuerpo
Reacción que en la práctica es difícil de detectar. La respuesta del transductor
se puede mejorar provocando una reacción. Esto se puede hacer marcando el
antígeno con una enzima que cataliza la producción de especies detectables
electroquímicamente.

Quimio-receptores

Muchas membranas celulares pueden ser excitadas por estímulos químicos que
induce un cambio conformacional en sus quimiorreceptores. Estos cambios, y
las modificaciones funcionales que resultan, son reversibles y proporcionan un
modelo interesante para la construcción de biosensores.

Los neuro-receptores también pueden usarse en la detección de drogas, toxinas

y ciertas otras sustancias.

6
 Transductores
El transductor proporciona la evidencia de que la reacción de la se ha producido
un biorreceptor. La elección del transductor depende del tipo de reacción, y las
sustancias liberadas o consumidas según la tabla.

En general, la elección es el transductor comercializado apropiado para el

método de detección requerido. Hay una gran cantidad de electrodos disponible
para la detección electroquímica, por ejemplo, electrodos que son sensible al pH,
a los aniones o cationes, y a los gases (p02, PCO2 y PNH3). El componente

7
sensible se puede comprar de forma independiente (por ejemplo, un termistor o
una fibra óptica), y luego un bioreceptor adjunto a este.

Detección física:

Un evento natural se caracteriza por ciertas propiedades, que pueden ser

explotados por su identificación mediante métodos de biodetección. Los sentidos
de los organismos vivos son las herramientas más adecuadas para el
reconocimiento específico de estas propiedades, cuyas características
individuales significan que las técnicas utilizadas para su detección deben
basarse tanto en las leyes de la física y químicas. Esto es comparable con
nuestros sentidos como la vista, el tacto y el oído explotan preferentemente los
principios de la física, mientras que el olfato y el gusto hacen más uso de las
reacciones químicas.

En realidad, la información se transmite a través de un conjunto de sistemas

fisicoquímicos. Lo mismo se aplica a los biosensores donde, en principio, el
transductor desempeña un papel físico, y el bioreceptor tiene el trabajo del
reconocimiento molecular.

La información decodificada por el bioreceptor se convierte en una señal eléctrica

del transductor mediante técnicas de medición como potenciometría,
amperometría, termometría o fotometría, todo lo cual se basan en la variación de
cantidades físicas. El método elegido debe ser simple y de un tamaño razonable,
de modo que sea barato y fácil de utilizar. Es por esto que los electrodos
potenciométricos y amperométricos son los más utilizados.

Detección electroquímica:

Técnicas potenciométricas

La potenciometría mide la diferencia de potencial entre dos electrodos

sumergidos en una solución. Uno de los electrodos sondea la solución, mientras
que el otro sirve de referencia. El electrodo de referencia tiene un potencial
constante y reproducible que es independiente de su ambiente. El potencial del
electrodo de la sonda es el potencial interfaz entre las fases sólida y líquida,
donde la oxidación y la se producen reacciones de reducción. Por ejemplo, en la
interfaz entre un cable conductor y un sistema redox, hay un intercambio de
electrones entre el alambre y los compuestos siendo oxidados y reducidos.

8
El equilibrio se logra cuando las tasas de oxidación y reducción son iguales, y la
composición de la solución que rodea el electrodo es constante.

Técnicas Amperimétricas

La amperometría es la determinación de la intensidad de la corriente cruzando

una celda electroquímica de bajo un potencial impuesto. Esta la intensidad es
una función de la concentración electroquímica.

Especies activas muestran la oxidación o reducción de una especie realizada en

un electrodo de trabajo, y un segundo electrodo.

Actúa como referencia. Durante la electrólisis, el electrodo de trabajo puede

actuar como un ánodo o un cátodo, de acuerdo con la naturaleza del analito.
Por ejemplo, un biosensor sensible a la glucosa que usa glucosa oxidasa podría

detectar el H2O2 producido por la reacción enzimática, o la cantidad de oxígeno

consumido durante la oxidación de la glucosa. En el caso del H2O2, el electrodo
de trabajo de platino es un ánodo, porque es polarizado a un potencial positivo
(+0.6 V / SCE). En contraste, cuando el oxígeno se controla, el electrodo de
trabajo está polarizado a un potencial negativo (-0.65 V / SCE) y es un cátodo.

Transducción amperométrica en la determinación de glucosa a través de la enzima GOD

mediada con ferroceno.

9
Detección termométrica

Un biosensor también puede utilizar la detección termométrica de la variación en

reacción de entalpías. Hay muchos métodos de temperatura. Determinación
(óptica, mecánica o eléctrica). Los métodos eléctricos son los más útiles para la
construcción de biosensores térmicos porque la señal eléctrica se puede obtener
directamente de la variación en temperatura.

Detección Piezoeléctrica

Las mediciones piezoeléctricas utilizan la apariencia de un aparato eléctrico,

polarización, o una variación en una polarización existente, en ciertos materiales
dieléctricos anisotrópicos, por ejemplo, cuarzo. Esta polarización aparece
cuando se aplica una fuerza en la dirección apropiada. El efecto piezoeléctrico
es reversible porque el material puede deformarse o vibra cuando se aplica un
campo eléctrico en la dirección apropiada.

Los dispositivos piezoeléctricos se utilizan en sus frecuencias de resonancia

para la determinación de pequeñas variaciones en masa. Estas variaciones
pueden resultar a partir de reacciones biológicas que impliquen asociación o
acoplamiento, por ejemplo, asociaciones inhibidoras de enzimas o acoplamiento
antígeno-anticuerpo.

Detección Fotométrica

Las fibras ópticas también se pueden utilizar en la construcción de biosensores.

La luz entre la muestra y la fuente o detector se transporta a lo largo del interior
de las fibras siguiendo el principio de reflexión total. La luz se propaga a lo largo
de la fibra en diferentes modos, cada uno correspondiente a un ángulo de
incidencia dado. En contraste con los sensores interferométricos los cuales
requieren fibra monomodo, los biosensores detectan variaciones en la intensidad
de la luz utilizando fibras multimodo. Tales fibras son las menos caras y tienen
un mayor grado de transmisión de luz el reflejo total en una fibra nunca es
perfecto y en algunos la radiación electromagnética penetra en la vaina que
cubre la fibra. Esta Se llama onda evanescente, y su intensidad disminuye
exponencialmente con la distancia perpendicular de la interfaz. Olas
evanescentes a veces se puede utilizar para detectar variaciones en las
propiedades ópticas de películas químicas y biológicas colocadas alrededor de
la fibra.

10
 Biosensor de fibra óptica
basado en el fenómeno de
reflexión interna total (TIR)
a través de ondas guiadas.
Las modificaciones en el
campo evanescente, que
resulten de la interacción
analito-receptor,
repercutirán en la
respuesta del dispositivo.

Detección Química

Reacciones de transformación como todos los catalizadores, las enzimas

reconocen específicamente un particular compuesto, y convertirlo en un
producto que sea detectable por el transductor un ejemplo de esto es la
penicilinasa, que convierte la sustancia bajo investigación, la penicilina, en el
ácido penicilloico, que es luego se detecta utilizando un electrodo de pH. La
intensidad de la señal aumenta.

Con la concentración de penicilina, el analito el sustrato de una reacción

enzimática también puede ser monitoreado detectando el consumo de uno de
sus co-sustratos. La glucosa puede ser determinado utilizando un electrodo p02
que detecta el consumo de oxígeno de la oxidación enzimática de la glucosa; la
intensidad de la señal disminuye con concentración de glucosa. Además, un gran
número de reacciones enzimáticas usan cofactores, que pueden ser explotados
para medir la concentración de sustrato. El etanol se puede determinar por
detección fluorométrica del cofactor del alcohol deshidrogenasa, NADH, que está
inmovilizado en un biosensor óptico.

Finalmente, es posible determinar inhibidores de enzimas en lugar de sustratos.

Los inhibidores afectan las tasas de reacciones enzimáticas, por lo tanto

La intensidad de la señal obtenida. Un ejemplo es la colinesterasa electrodo que

determina los inhibidores, especialmente los pesticidas.

Biosensores de efecto de campo

Los ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistors) son una variación de los
transistores MOSFET (Metal Oxide Screen Field Effect Transistor). Su principio
de funcionamiento se basa en el control del flujo de cargas que se produce entre
dos electrodos (fuente y drenaje, ambos semiconductores tipo n) situados sobre
la superficie de un elemento semiconductor (tipo p). Un tercer electrodo de
naturaleza metálica (puerta) situado entre los dos anteriores cierra el circuito

11
eléctrico. El electrodo metálico está aislado de los electrodos semiconductores,
mediante una fina capa de óxido de silicio (SiO2), pero puede influir en la
corriente eléctrica (Idf) existente entre la fuente y el drenaje, aunque sólo de
manera electrostática. El campo eléctrico requerido para ello es proporcionado
por un voltaje externo (Vpf) entre la puerta y la fuente. Dicho de otro modo, la
corriente Idf está directamente relacionada con el voltaje Vpf.

Biosensor basado en la utilización de transistores ISFET. La presencia del analito modifica la

corriente eléctrica a través del canal entre la fuente y drenaje, modificando la respuesta del
dispositivo.

Reacciones de acoplamiento

Las reacciones de acoplamiento entre antígenos y anticuerpos son

generalmente extremadamente específicas, pueden producir variaciones en la
carga eléctrica, masa, y propiedades ópticas, todas las cuales son directamente
detectables por transductores. Las variaciones en la carga se pueden amplificar
asociando el Anticuerpo con un ionóforo, cuya carga es modificada por la
reacción de acoplamiento y se puede detectar con un electrodo potenciométrico
en los anticuerpos y el sistema del complemento lisa ciertas células. Esta
propiedad puede ser explotada porque produce iones que son detectables con
un electrodo durante una reacción antigénica. Las variaciones en masa en el
acoplamiento son más fáciles de detectar con transductores piezoeléctricos. El
límite de detección aquí es muy bajo y, por lo tanto, estos detectores son
especialmente adecuados para el monitoreo de inmunoagentes o inhibidores de
enzimas cuyas concentraciones son a menudo muy bajos.

12
 Inmovilización de bioreceptores
Las proteínas biológicamente activas requieren inmovilización directa o indirecta
sobre transductores para asegurar el máximo contacto y respuesta. El tejido
animal y vegetal ya tiene una estructura de membrana, y es una excepción a
esta regla. La inmovilización tiene la ventaja de estabilizar la proteína para que
se puede utilizar de forma repetitiva.
Tipos:
Atrapamiento físico

Las enzimas son proteínas con altos pesos moleculares y tamaños grandes
suficiente para ser atrapado en geles de poliacrilamida o, más simplemente, por
membranas para diálisis. El primer electrodo de enzima fue construido por
Updike y Hicks que atraparon la glucosa oxidasa en una capa de gel de
poliacrilamida, que se unieron a la membrana plástica de un electrodo de
oxígeno. Acrilamida y N-N 'metileno bis-acrilamida se co-polimerizaron en
presencia de la enzima que se convierte en atrapados en una matriz de
poliacrilamida. Aunque esta copolimerización es inhibida por el oxígeno, se
produce en menos de 10 minutos en presencia de luz.

También es posible atrapar una enzima al componente sensible de un Electrodo

mediante membrana de diálisis que evita la difusión de proteínas. Guibault y Shu
construyeron un electrodo enzimático sensible a la urea extendiendo una
suspensión de ureasa sobre la superficie de un electrodo equipado con una red
de nylon, y que cubre todo el conjunto con un membrana de diálisis; El electrodo
de enzima se enjuaga y está listo para utilizar.
Inmovilización por entrecruzamiento.
La reticulación es un proceso que utiliza un agente bi o multifuncional para
Formar un puente entre diferentes especies o proteínas biocatalíticas. Los
resultados del proceso en un aumento considerable en el peso molecular, y los
compuestos o agregados formados son insolubles.
Es posible entrecruzar moléculas de la misma enzima, o coreticular dos o más
proteínas diferentes (enzima con enzima, enzima con proteína, o más de una
enzima con una proteína de carga tales como BSA, albúmina de suero bovino).
Incluso orgánulos o células enteras.

Inmovilización electromagnética

Si una enzima puede incorporarse en soportes magnéticos, entonces puede ser

inmovilizado en un transductor utilizando un campo electromagnético. Por
ejemplo, una interacción bioespecífica permite la fijación de la glucosa oxidasa
a perlas magnéticas que llevan concanavalina A. El magnético, las partículas

13
que contienen la enzima se inmovilizan en la membrana de un electrodo de
oxígeno mediante la aplicación de un campo magnético producido pasando una
corriente continua a través de un solenoide. La corriente es regulada para dar
una distribución homogénea de partículas magnéticas sobre la superficie de la
membrana. La distribución de la enzima es homogénea cuando la señal deja de
fluctuar debido a que el magnético las interacciones se han estabilizado. El
electrodo está listo para su uso.
Inmovilización multienzimática

La naturaleza proteica de las enzimas significa que tienen un gran número de

grupos reactivos en común y pueden inmovilizarse simultáneamente en un
soporte. La glucosa oxidasa y la catalasa pueden así ser coinmovilizadas en el
mismo electrodo de oxígeno por coreticulación, Del mismo modo, El nucleósido
de fosforilasa y la xantina oxidasa pueden coinmovilizarse en un electrodo de
oxígeno para medir los iones de fosfato que son esenciales en la transformación
enzimática de inosina en ácido úrico. La inmovilización de más de una enzima,
como el malato deshidrogenasa y lactato monooxigenasa en un electrodo de
oxígeno, también permite que el sustrato sea reciclado, mejorando así la
sensibilidad de la respuesta del electrodo enzimático.
Inmovilización de mediadores.

Los mediadores se utilizan para regenerar los cofactores involucrados en la

enzima catalizada en reacciones redox. La movilidad del cofactor se reduce si la
enzima no está en solución y se requiere un mediador para transportar
electrones entre el electrodo y el cofactor. El mediador debe cumplir una serie
de condiciones:
1. La cinética de su transferencia de electrones debe ser rápida y reversible, con
respecto tanto a la enzima como al cofactor.
2. Deben ser estables tanto en forma oxidada como reducida.

3. No deben reaccionar con las otras especies en solución (especialmente el

oxígeno).
4. Su potencial de regeneración debe ser bajo e independiente del pH.
5. Deben ser no tóxicos para aplicaciones in vivo.

14
15
APLICACIONES DE LOS BIOSENSORES

Las principales aplicaciones de los biosensores en los últimos años se han

desarrollado con especial relevancia en tres campos: el medioambiental, el
agroalimentario y el clínico. Su utilización en medioambiente se extiende desde
el análisis de la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) hasta el control de
detergentes, pesticidas y otros tóxicos.

La demanda bioquímica de oxígeno es considerada el parámetro analítico de

mayor importancia para valorar la calidad de las aguas de desecho. Sin embargo,
el método oficial para su análisis resulta tedioso ya que se requieren cinco días
para conseguir los resultados. En el año 1977 Karube desarrolló el primer sensor
construido con un electrodo de oxígeno y una membrana impregnada con la
levadura T. cutaneum. En el año 1990 este método se estableció como estándar
de la industria japonesa. En la actualidad y basándose en el mismo principio que
utilizó Karube, se emplean estos biosensores en todo el mundo y en numerosos
campos, entre los que destacan el farmacéutico, el alimentario y el de la industria
del papel.

Además de estos dispositivos, el grupo de Karube ha propuesto diferentes

prototipos de biosensores que emplean transducción óptica, como los que
utilizan bacterias luminiscentes y optrodos, o también transducción fotocatalítica
combinada con un electrodo de oxígeno. Se han utilizado también otras bacterias
como Proteus vulgaris combinadas con detección electroquímica y ferrocianuro
potásico como mediador.

Otros biosensores con utilidad en medioambiente son los dispositivos analíticos

para determinar los niveles de nitrificación y de inhibición de ésta, mediante
bacterias nitrificantes. En la actualidad se dispone de biosensores desechables
de un solo uso, útiles tanto para este fin como para determinar la DBO.

Existen también biosensores construidos con células completas que han

demostrado su eficacia para la monitorización de alquil sulfonatos (LAS),
utilizando cepas purificadas de microorganismos obtenidos a partir de aguas
residuales.

Uno de los indicadores más importantes que determina el grado de eutrofización

de un río, u otro tipo de agua, es la concentración del ión fosfato. Los valores
límite permitidos oscilan en torno a 0,3-0,4 µM, por lo que su medida representa
un dato importante para el control de la calidad de las aguas. Los métodos
convencionales que utilizan molibdeno son tediosos y adolecen de falta de
selectividad, a lo que hay que unir los inconvenientes ambientales asociados al
empleo de metales pesados. Por ello se han desarrollado diferentes biosensores
que se basan en la inhibición de la enzima fosfatasa alcalina o de la combinación
de enzimas nucleósido fosfatasa y xantina oxidasa. Otra opción más reciente

16
utiliza la enzima piruvato oxidasa (PyrOx) y peroxidasa (HRP) en un sistema de
inyección en flujo (FIA) con detección quimioluminiscente. Presenta la ventaja de
que puede compactarse y ser incorporado en una boya de flotación para la
monitorización permanente de los fosfatos en las aguas de los embalses, con un
intervalo lineal entre 96 nM y 32 µM. Han sido empleados otros métodos con la
combinación de tres enzimas, maltosa fosforilasa (MP), mutarrotasa (MUT) y
glucosa oxidasa (GOD) con transducción electroquímica, así como también las
proteínas captadoras de fosfato (PBP) procedente de Escherichia coli.

Es bien conocido que los óxidos de nitrógeno y el azufre causan la llamada lluvia
ácida. Recurriendo a la enzima nitrito reductasa (NIR) de Alcaligenes fecalis S-
6, en combinación con una transducción amperométrica y el mediador 1-metoxi-
5-metilfenacinio metil sulfato (1- metoxi) –PMS-, se ha propuesto un dispositivo
que permite la determinación de nitritos en aguas naturales con un límite de
detección de 0,010 mM.101 Para la medida del ión sulfato se ha descrito también
un biosensor de células de Thiobacillus ferroxidans combinadas a un electrodo
potenciométrico.

Basándose en la inhibición que determinados tóxicos pueden producir en la

respiración de microorganismos, se pueden utilizar sensores microbiológicos
como sistemas de detección de la presencia de numerosas toxinas. Así, por
ejemplo, el cianuro que produce una inhibición potente de la enzima citocromo
oxidasa, que afecta a la cadena respiratoria de células aerobias, puede
determinarse siguiendo este principio. El mismo proceso es igualmente válido
para la determinación de pesticidas y herbicidas.

Tabla de biosensores de glucosa de diversas marcas

17
 MARCO METODOLOGICO

Métodos de fabricación

Actualmente se suele incorporan una gran densidad de sondas en su superficie.

Se trata de un concepto íntimamente ligado a los biochips, de hecho, el término
microarray de material biológico es equivalente al de Biochip.

Los procesos de fabricación y generación de las matrices se han diversificado

mucho desde su origen y permiten establecer grandes diferencias entre los
distintos dispositivos y plataformas existentes en el mercado.

El material soporte de la matriz es un componente muy importante en el proceso,

puesto que su resistencia y otras características del mismo condicionarán el
modo en el que se puedan llevar a cabo determinados procedimientos y toma de
decisiones, como el tipo de lavado y eliminación de uniones inespecíficas, si se
podrán reutilizar, el modo de revelado y por supuesto el coste que conlleva la
fabricación del mismo.

En la fabricación de las matrices se pueden distinguir dos procesos claramente

diferenciados.

En el primero de ellos, el material genético es sintetizado con anterioridad a su

incorporación sobre la superficie de la matriz. La fabricación se consigue a través
de unos robots mecanizados que, mediante un brazo con una serie de
cabezales, recogen la muestra desde su ubicación para posteriormente llevarla
y depositarla sobre la superficie de la matriz, a modo de pequeños puntos o
insertos. La otra posibilidad es la fabricación mediante unión química a la matriz,
lo que posibilita, además, la síntesis in situ del material genético. Los métodos
de fabricación son muy variados aunque quizás los más utilizados son los que
recurren a las técnicas de fotolitografía. Otros dispositivos como los Robots
piezoeléctricos y los sistemas “Ping and Ring” también se pueden utilizar. El
principio de funcionamiento de los Robots piezoeléctricos es el mismo que el
utilizado por las impresoras de inyección de tinta. Los reactivos son depositados
en los puntos seleccionados mediante el movimiento de los cabezales que
contienen los inyectores, bajo el control de un robot. Es determinante que los
inyectores depositen la misma cantidad de reactivo en todas las celdas de la
matriz y que el brazo del robot se desplace con movimientos muy precisos.
El sistema Ping and Ring fue desarrollado por la empresa Genetic Microsystems
y utiliza un sencillo mecanismo, fácil de reproducir en el laboratorio, cuyo
principio de operación recuerda al juego de las pompas de jabón. Se trata de un
arrayer provisto de una serie de cabezales, cuyas partes principales son un anillo
y una aguja, con los que se consigue la impresión. El proceso comienza al
introducir el anillo en la muestra, que quedará impregnado con ella debido a las
fuerzas de tensión superficial del líquido. A continuación, la aguja pasará a través

18
del anillo arrastrando el material retenido en el centro de éste, para a
continuación ser depositado sobre la superficie del biochip. Puesto que el
material con las sondas tiene que estar preparado previamente, este método de
fabricación no permite la síntesis in situ.
Chips de ADN

Podemos clasificar estos Biochips en función de la utilidad perseguida con su

utilización. Así, hablaremos de chips de secuenciación, chips de expresión y
chips de hibridación comparativa. Los primeros son los más antiguos y en ellos
se inmovilizan segmentos de ADN de 20 unidades de nucleótidos (mer). Estos
chips están diseñados de tal manera que cubren todas las posibilidades de
combinación de bases, en un esquema que se denomina secuenciación por
hibridación (SBH). La muestra se deposita sobre el chip y se hibrida con sondas
que poseen una secuencia complementaria. La segunda variedad de estos chips
está ideada para determinar el grado de expresión de una secuencia genética,
midiendo la cantidad de ARNm que está produciendo un gen determinado. Los
chips de hibridación comparativa detectan cambios en la expresión génica en un
grupo específico de pares de bases. Los resultados se obtienen determinando el
grado de cambio cuando se compara con una referencia o control, mediante
hibridación competitiva. Este tipo de chips es útil en el diagnóstico y tratamiento
de enfermedades vinculadas a la expresión de genes, como ciertos casos de
cáncer.
Gene chip de Affimetrix

Fue el primer chip de ADN desarrollado. Consiste en un microarray de

oligonucleótidos de secuencias conocidas sobre una superficie de silicio. Su
síntesis se realiza in situ mediante la elongación de las cadenas aplicando
técnicas de química combinatoria y fotolitografía. La ubicación de las cadenas
en lugares específicos del chip posibilita la localización de las zonas hibridadas
mediante detección fluorescente, a través de un escáner.
La síntesis se realiza sobre un soporte mediante la incorporación sucesiva de las
diferentes bases, hasta conformar la secuencia adecuada. Cada nucleótido
contiene un grupo reactivo al que puede unirse otro nucleótido sólo activable por
acción de la luz ultravioleta. Por ello, para realizar la síntesis in situ se utilizan
una serie de máscaras que, gracias a su forma y tamaño, permiten que la luz
incida sobre las posiciones y regiones donde sea necesaria la construcción de
las diferentes cadenas de material genético. Esta máscara, previamente
diseñada, será transparente para una determinada longitud de onda y opaca en
las zonas a proteger del proceso fotolitográfico. En el primer paso, las secuencias
apropiadas de las bases (A, T, G y C) se unirán a los grupos reactivos en el
cristal mediante enlace covalente. Este proceso se repetirá una y otra vez con
sus correspondientes lavados, hasta generar los oligonucleótidos con las
secuencias previstas.

19
Método de Affymetrix para la construcción de chips de ADN.

1) Los puntos reactivos de la superficie del chip se protegen con grupos sensibles
a la radiación.

2) Se realiza la activación de cada punto por la acción de luz, sólo en los sitios
que lo permite una máscara.

3) Se añade una base nitrogenada (deoxinucleósido con un grupo protector

fotolábil en posición que se inmoviliza en los sitios activados de la superficie.

4) El proceso de inmovilización de las bases nitrogenadas continúa, modificando

el patrón de la máscara, activando diferentes sitios y acoplando diferentes bases
para conseguir la construcción de sondas de ADN con una secuencia diferente.
5) El chip es puesto en contacto con el analito que se hibrida en aquellos sitios
donde encuentra la secuencia de bases complementaria.

6) Se lava para eliminar el sobrante que no ha hibridado, se revela y analiza

mediante el patrón de fluorescencia obtenido con un software apropiado.

Construcción de un biosensor amperométrico y su instrumentación usando

microelectrodos de 4 pozos

El objetivo principal consiste en el desarrollo de biosensores amperometricos de

bajo costo y larga durabilidad del material inmovilizado con sensores basados en
micro electrodos. Estos sensores serán usados para asociar concentraciones de
substancias que se desean identificar de forma electroquímica. Otra ventaja de
usar estos dispositivos consiste en que la configuración de los electrodos puede
ser usada para la lectura de otras variables en células o enzimas como
resistencia, impedancia y conductimetría. la figura se muestra el concepto

20
aplicado al MEA. Para esto se mostrará el proceso y la instrumentación
necesaria para la lectura de las señales amperométricas en microelectrodos.

La geometría de este modelo permite utilizar la totalidad del número de

electrodos en la superficie, la figura (2a) muestra la disposición de los electrodos
para producir la amperometría incluyendo rangos y potenciales con el electrodo
externo; la figura (2b), muestra la distribución electrónica de los electrodos de
uno de los pozos del MEA.

El sistema está integrado por la componente bioquímica, la instrumentación y el

tratamiento de la información. En la componente bioquímica se encuentran los
protocolos de extracción, la conservación y la deposición del material. El
instrumento está compuesto así: etapa de acople del sensor MEA, como se
observa en figura (3); la estructura física, el sistema eléctrico que proporciona
las distintas fuentes de alimentación, las tarjetas electrónicas y los periféricos,
como: motores, teclado y display entre otros. En el software están todas las
interfaces como: el firmware para el microcontrolador, la terminal para la
operatividad del instrumento, las bases de datos, el software de adquisición y
presentación de datos y las interfaces que operan en la red de internet.

21
Componente bioquímica: El elemento de reconocimiento biológico para la
aplicación serán las enzimas la tirosinasa y lacasa. El sistema de inmovilización
se lleva a cabo dopando la superficie con una mezcla de la enzima a ser fijada,
agregando el intercambiador iónico nafion, como aditivo protector que
proporciona una buena estabilidad térmica. El método se puede adaptar para el
atrapamiento e inmovilización de distintas sustancias biológicas.

Fabricación y uso del (Mea 4w) Una de las características importantes de este
soporte configurado como sensor de amperometría, radica en la facilidad para
las operaciones en estado estático, y la configuración de los electrodos para
cubrir la superficie como se ve en la figura (4), otra ventaja que ofrece este
sistema es que existe homogeneidad en los contactos en su totalidad en oro.

22
Matriz de micro electrodos (MEA) chip El sensor MEA tiene algunas
características importantes basadas en la homogeneidad del material durante el
proceso de fabricación en este caso oro, la impedancia está comprendida entre
80-150 kΩ, matriz de 4x4 y diámetro de cada electrodo de 40 μm. La
configuración permite obtener 8 electrodos de trabajo y 8 contra electrodos en
los cuales varían las distancias y superficies, para realizar distintas pruebas de
amperometría, como se observa en figura anterior

El circuito básico que conforma el potenciostato para realizar la medición de

corriente amperométrica y se encuentra integrado en la tarjeta de señales, el
funcionamiento y la representación se observan en la figura :

En el siguiente grafico se describen los componentes más importantes para el

manejo y adquisición de señales, también se explicarán algunos componentes y
su funcionamiento. El MPC23016, dispositivo que ofrece 16-bit, de propósito
general, expansión I/O para aplicaciones y usa el bus I2C. Este dispositivo tiene
alta capacidad para manejo de corriente y se usa cuando sirve adquirir más pines
para el control o manejo de periféricos. El AD7734 es un conversor de alta
precisión, tiene 16-bit de resolución y se puede lograr con un tiempo de
conversión total de 500 ms (2 kHz conmutación de canales)

23
Para la inmovilización del material, se ha utilizado el Nafion que proporciona una
buena estabilidad térmica, se ha evaluado la respuesta del biosensor utilizando
la misma enzima en cada sensor, inmovilizando la lacasa y la tirosinasa sobre la
superficie del electrodo.

Materiales y Equipos Utilizados en la fabricación y diseño de

biosensores:
Existen innumerable cantidad de software que pueden modelar los fenómenos
físicos existentes como:

COMSOL Multiphysics (antes conocido como FEMLAB) es un paquete

de software de análisis y resolución por elementos finitos para varias
aplicaciones físicas y de ingeniería, especialmente fenómenos acoplados, o
multifísicos. Permite entrar sistemas acoplados de ecuaciones en derivadas
parciales (EDP). Las EDP se pueden entrar directamente o utilizando la llamada
forma débil (ver el Método de los elementos finitos para una descripción de la
formulación débil).

Kratos Multiphysics Kratos es un marco para construir programas de

elementos finitos multidisciplinarios. Proporciona varias herramientas para la
implementación fácil de aplicaciones de elementos finitos y una plataforma
común que proporciona una interacción sin esfuerzo entre ellas. Kratos tiene una
innovadora interfaz de base variable diseñada para ser utilizada en diferentes
niveles de abstracción e implementada para ser muy clara y extensible. También
proporciona una estructura de datos eficiente y flexible que se puede utilizar para
almacenar cualquier tipo de datos de una manera segura.

24
En cuanto a hadware depende de la utilidad y el propósito del biosensor tal seria
el caso de un biosensor diseñado para medir el colesterol:

Electrodo serigrafiado de carbono (DRP 110) de DropSens

Cable conector usat

Entre otros:

25
 Tendencias futuras
Aunque los biosensores microbianos se han estudiado ampliamente durante
décadas, su comercialización se ha visto limitada por las desventajas intrínsecas
de emplear microorganismos como elementos de reconocimiento (respuesta
lenta, poca sensibilidad, pobre selectividad y escasa estabilidad). De ahí que las
tendencias actuales y futuras vayan encaminadas al desarrollo de tecnologías
que permitan superar o minimizar estas limitaciones y ampliar las aplicaciones
de estos biosensores en el mercado. Afortunadamente, con el desarrollo en los
últimos años de la biotecnología, la micro/nano-tecnología, y estrategias
novedosas de inmovilización, los biosensores microbianos resultan cada vez
más poderosos para la resolución de problemas analíticos prácticos. Con los
avances en biología molecular y la disponibilidad de la secuencia genómica de
más tipos de células, se ha abierto un sinfín de posibilidades de adaptar los
microorganismos para mejorar la actividad de una enzima existente, expresar
proteínas en organismos huésped distintos o en distintas localizaciones,
sobreproducir enzimas microbianas de interés o desarrollar organismos capaces
de trabajar en condiciones extremas de temperatura y resistentes a tóxicos. La
ingeniería genética (metabólica) también puede aplicarse a la mejora de la
selectividad de estos biosensores mediante la activación de ciertas vías
metabólicas de interés y la absorción celular, a la vez que se desactivan otras
rutas indeseables. Desde el punto de vista de la respuesta, otra manera de
mejorar la selectividad es desarrollar redes de sensores microbianos. La
introducción del analito de interés en estas redes genera un patrón de respuesta
característico que, combinado con el análisis de redes artificiales, posibilita su
identificación inequívoca. Por otra parte, con el desarrollo de la nanotecnología,
los materiales nanoestructurados encuentran en estos biosensores una enorme
utilidad, al objeto de mejorar su sensibilidad, debido a su buena
biocompatibilidad, propiedades de transferencia electrónica mejoradas y mayor
área superficial. Además, con el desarrollo de la técnica de Laboratorio-en-un-
chip, la integración de microorganismos en un chip de microfluídica seguramente
proporcionará en el futuro, no sólo aspectos novedosos en la investigación en el
campo de los biosensores microbianos, sino también características analíticas
mejoradas, ya que tales sistemas sólo requerirían cantidades mínimas de
muestra y ofrecerían una mayor rapidez de respuesta y una buena sensibilidad.
Desde el punto de vista comercial, también es deseable la puesta a punto de
nuevas estrategias de inmovilización sencillas que conduzcan a preparaciones
de células inmovilizadas estables, con un mejor almacenamiento y estabilidad
operacional. En este sentido, la inmovilización reversible bioespecífica de
enzimas utilizando lectinas ofrece una alternativa prometedora para la
inmovilización de células microbianas y, por tanto, para la fabricación de este
tipo de biosensores. Sin duda alguna, una fusión fructífera entre las ciencias
biológicas y otras disciplinas contribuirá a aprovechar todo el potencial de esta
tecnología en el futuro.

26
 Referencias Bibliográficas

 Biosensor -Phd Tran Mihn Kan (2007)

Diseño Construcción Y Puesta Control De Puente De Colesterol – Mg

Alba Iglesias Mayor -2015

 Biosensores Y Biochips:Herramientas Para El Diagnóstico Y La

Terapéutica- Dr. Fidel Ortega Ortiz De Apodaca (2006)

 Los Biosensores Electroquímicos: Herramientas De La Analítica Y Del

Diagnóstico Clínico- María Begoña González García, Agustín Costa
García

 Nanochips Y Nanosensores Para El Diagnóstico Temprano De Cáncer

Oral: Una Revisión – Dr. Bryan Aldemar Méndez López (2012)

 Biosensores Microalgales Para La Detección De Contaminantes

Ambientales: Una Revisión - García-Balboa C, Costas E Y López Rodas
V. (2012)

27