Universidad de Santiago de Chile

Departamento de Ingeniería Química

Ingeniería en Biotecnología

Informe de Microbiología II
Estudio de la morfología bacteriana,
comportamiento de crecimiento y los factores
que influyen en este

Nombre: Matias Guerrero

Ivania Valdés
Christian Oporto
Fecha : 8 de mayo de 2014
 1.- Introducción
En los laboratorios realizados en la primera parte del curso de Microbiología II se aplican
técnicas básicas de trabajo de laboratorio y de investigación para la caracterización de
bacterias.

Para comenzar se analizan y aplican procedimientos y se advierten precauciones básicas al

momento de trabajar con microorganismos, como lo es la importancia de la esterilización
de los materiales utilizados, las posibilidades de cultivo y la forma de hacerlos, etc.

A grandes rasgos se estudian los métodos de diferenciación en base a características

específicas que separan grandes grupos de bacterias, como lo son las Gram + y Gram –
empleando protocolos establecidos que tienen como fundamento tanto características
morfológicas específicas de los grupos antes mencionados, como también propiedades
químicas de los reactivos utilizados.

Se emplean también técnicas de uso habitual en laboratorio para determinar unidades

formadoras de colonias UFC en una preparación como lo son el método de plaqueo y el
método de la microgota, como también técnicas de uso industrial como la turbidimetría,
para estudiar el crecimiento bacteriano y su relación a ciertos factores que alteran el
comportamiento de la curva de crecimiento, como lo son la temperatura, la concentración
de nutrientes en el medio, la concentración de oxígeno disponible, etc.

El conocimiento de estas técnicas son fundamentales en la formación del ingeniero en

bioprocesos debido a su estrecha relación con la microbiología y el empleo de esta para el
desarrollo y mejoramiento de procesos industriales de producción a partir de seres vivos.
 2.- Aparatos y accesorios
2.1.- Laboratorio 1: Observación de células vivas y teñidas, cultivo de
microorganismos y separación de colonias en placa.

 Microscopio

Aumento: x10, x40 y x100

 Gotario

Precisión: 2 mL

 Cultivos:

E. Coli.

Pseudomona.

Suciedad

 Porta y cubre objeto

 Aceite
 Pegamento
 Fósforos
 Tubos de ensayo
 Medio de cultivo
 Mechero
 Tapones
 Gradilla
 Asa
 Placas Petri con agar
2.2.- Laboratorio 2: Tinción, Fisiología y movimiento bacteriano.

 Microscopio
Aumento: x10, x40 y x100
 Cultivo:
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Candida albicans
 Porta y cubre objeto
 Aceite de inmersión
 Tubos de ensayo
 Medio de cultivo
 Mechero
 Tapones
 Gradilla
 Asa con punta redonda
 Asa en punta
 Placas Petri
 Micropipeta
 Puntas esteriles
 Tubos Eppendorf
 Campana de Durham
 Reactivos :
Cristal violeta
Solución de yodo
Etanol:agua (2:1)
Safranina
2.3.- Laboratorio 3: Crecimiento Bacteriano.

 Matraz 250ml
 Tapón
 Micropipeta: P1000; P200
 Puntas
 Espectrofotómetro
 Cubetas
 Tubos Eppendorf
 Medio fisiológico o de cultivo
 Gradilla
 Pinzas
 Placas petri con agar
 Torula de algodón
 Sensidiscos
 Mechero
 Fósforos
 Cultivo: E. Coli
 Asa punta redonda o de loop
 3.- Procedimiento experimental
3.1.- Laboratorio 1: Observación de células vivas y teñidas, cultivo de
microorganismos y separación de colonias en placa.
3.1.1.- Preparación de la gota colgante.

Para preparar una gota colgante y poder observar el movimiento de las bacterias en
ella, se necesita una porta objeto en el cual se le deberán pegar con pegamento dos
palos de fósforos de forma trasversal y esperar que el pegamento se seque. Mientras
con una asa tomar una muestra de cultivo bacteriano y depositarlo en el cubre objeto,
el cual tendrá que ser coloco al revés sobre los palos de fósforos que están pegados al
porta objetos de forma que la gota quede colgando. Luego de esto tomar y colocar el
porta objetos en el microscopio encendido, utilizar el aumento x100. Antes de enfocar
con un gotario echar un gota de aceite sobre el cubre objetos y luego acercar y poner
en contacto el lente x100 del microscopio. Luego solo queda enfocar y observar el
movimiento de las bacterias.

3.1.2.- Observar tinciones.

Tomar los porta objetos teñidos con diferentes cultivos de bacterias y colocarlos en el
microscopio. Luego encender el microscopio y aumentar la luz de contraste, luego
elegir el aumento x40 y acercarse con el lente al porta objeto, luego de distinguir algo,
se debe enfocar hasta obtener una imagen nítida.

3.1.3.- Inoculación de cultivos.

Para inocular distintos tipos de cultivos, se necesita trabajar cerca del mechera para
poder tener un ambiente libre de bacterias, primero se debe tomar el asa con la mano
izquierda y calentarla en el mechero hasta el punto en que esta quede rojiza, luego de
esto se debe tomar el tubo que contenga las bacterias con la mano izquierda, y con los
dedos libres de la mano derecha destapar el tubo, al mismo tiempo pasar la abertura
del tubo de ensayo por mechero para flamearlo y eliminar cualquier contaminación
presente. El asa ya calentada debe ser introducida con mucho cuidado al interior del
tubo, sin tocar las paredes de esta, cuando el asa toque el líquido, esperar a q se enfrié
y luego llevarla al fondo del tubo y luego sacarla son mucho cuidado nuevamente sin
tocar las paredes, luego de que esté afuera, flamear el tubo en el mechero y taparlo
con su respectivo tapón.

Luego tomar el tubo de ensayo con el medio de cultivo liquido estéril, es destapado y
flameado en la punta en el mechero, para luego meter el asa con mucho cuidado, para
no tocar las paredes del tubo y de esta forma se lleva el asa hasta el fondo para
inocular la bacteria. Para ultimo el asa se retira del tubo con mucho cuidado, La punta
del tubo se vuelve a flamear y es tapado y colocado en la gradilla y para finalizar el asa
es calentada una vez más en el mechero para descontaminarla. Realizar este
procedimiento inoculando con E.Coli, suciedad y pseudomona, sin olvidar el control.

Luego de inocular todos los cultivos, se deberá esperar 24 horas aproximadamente,

para observar un claro crecimiento bacteriano, de esta forma se verán los resultados y
se anotara el tipo de crecimiento que presenta cada bacteria, turbidez, película,
mucoide o sedimento.

3.1.4.- Técnicas de cultivo puro

Existen diversas de técnicas de cultivo, para la técnica de hagar tendido, se recuerda

que se trabajar cerca del mechero para evitar contaminación, se utiliza una asa para
inocular el cultivo, de la misma forma que en un medio de cultivo líquido, solo que en
este caso, el asa debe llegar hasta el fondo del tubo de ensayo con hagar y desde ese
momento el aza debe ser retirada de forma que esta esté rozando el hagar y al
momento de sacarla se debe realizar un zigzag sobre el este. Al terminar el tubo debe
ser flameado, tapado y rotulado.

3.1.5.- Separación de colonias.

Con el objetivo de poder aislar bacterias, se procede a inocular una placa de Petri con
agar, mediante un asa previamente calentada y que luego toma una muestra de
bacterias. El asa debe ser puesta en contacto con el agar y en ese momento debe ser
esparcida en un extremo de la placa de forma muy compacta, luego el asa debe ser
levantada y flameada en el mechero y vuelta a poner en contacto con el agar en el
lugar en el que las bacterias ya fueron esparcidas de esta forma, el asa es arrastrada en
dirección a otro extremo de la placa arrastrando bacterias de la zona en la que fueron
esparcida y deben ser distribuidas de una forma menos compacta que la anterior.
Luego repetir lo mismo 2 veces más hasta ocupar todo el espacio disponible de la placa
Petri. Todas las placas inoculadas deben ser rotuladas. Luego se debe esperar
aproximadamente 24 horas y observar el tipo de crecimiento que presenta la bacteria y
si se pudo separar las colonias de esta.
3.2.- Laboratorio 2: Tinción, Fisiología y movimiento bacteriano.
3.2.1.- Preparación y fijación de muestras bacterianas para tinción.

Para preparar una muestra de bacterias y observarlas al microscopio es necesario

inocular a partir de un cultivo, ya sea en medio solido o líquido, en el portaobjetos. Si
se hace a partir de medio líquido, se flamea el asa al rojo vivo, y la boca del tubo que
contenga el cultivo de bacterias una vez abierto. Si se hace a partir de un cultivo en
medio solido, es necesario dejar una gota de agua destilada en el portaobjetos, para
luego, con el asa previamente flameada, depositar una cantidad pequeña de celulas
bacterianas en la gota y homogeneizar. Para ambos casos se trabaja cerca del mechero.
Una vez preparadas las muestras, se dejan secar pasandolas por el mechero sin
calentarlas demasiado, con la muestra hacia arriba.

En base a este procedimiento, se preparan muestras de Streptococcus pyogenes, y una

mezcla de E. coli y Staphylococcus aureus. Se observaron también, muestras
previamente hechas.

3.2.2.- Tinción de gram

Para observar células por el método de la tinción Gram, las muestras deben ser teñidas
en en siguiente orden: Primero se aplica cristal violeta al portaobjetos con la muestra
durante aproximadamente 3 minutos. Luego, se lava con una solución de yodo y
nuevamente se deja reposar por un 1 minutos. Después se lava con etanol:agua (2:1) y
agua intermitentemente hasta que la muestra no libere más colorante. Po último se
aplica una tinción de contraste, que en este caso es la Safranina, dejándola reposar
durante 1 min. Finalmente se lava suave con agua y se seca el portaobjetos con papel
absorbente sin restregar la muestra. Para observar al microscopio se emplea el objetivo
de inmersión (100x), que necesita que el portaobjetos tenga una gota de aceita de
inmersión previo al posicionamiento del mismo en el microscopio.

3.2.3.- Fermentación de carbohidratos

Para caracterizar la bacteria es necesario, entre otras variantes, identificar el sustrato

que la bacteria consume, según el siguiente procedimiento:

Se toma una de las bacterias Gram negativa aisladas en placa para resuspenderla en
una solución esteril de suero fisiológico. De esta solución se toma muestra con un asa
en punta y se inocula en un tubo TSI enterrando la muestra en el fondo, y también en la
superficie en zigzag.
Luego se inocula con un asa con argolla en tubos de glucosa y lactosa que contienen
una campana de Durham para así detectar producción de gas.

Para determinar el número de unidades formadoras de colonias (UFC) de una muestra

problema, se pueden realizar tres tipos de procedimientos:

3.2.3.- Determinación del número microbiano

3.2.3.1.- Método de plaqueo

Se debe enumerar 7 tubos eppendorf con 900µL de solución de suero fisiológico

(NaCl 0,85%) desde 10-1 hasta 10-7 y 3 placas desde 10-6 hasta 10-8. Empleando una
micropipeta p200 se agregan 100µL del cultivo líquido problema de Escherichia coli
al tubo marcado con 10-1. Luego de agitar, de este mismo tubo eppendorf, se extrae
100µL y se depositan en el tubo eppendorf marcado con 10 -2, y así sucesivamente
hasta llegar al tubo marcado con 10-7, teniendo siempre la precaución de cambiar las
puntas estériles de la micropipeta entre cada extracción.

Con una nueva punta estéril, se deben depositar 100µL de las tres últimas diluciones
en las placas, distribuyéndolas con un rastrillo de vidrio previamente flameado con
etanol. Una vez listas las placas, se deben incubar a 30°C en posición invertida.
Luego de observar crecimiento se hace un conteo de colonias por placa, a partir del
cual se calculan las UFC del tubo de la muestra problema en base a los factores de
dilución.

3.2.3.2.- Método de la microgota

Se realiza el mismo método de diluciones, con la diferencia de que ahora se debe

elegir entre una muestra A o Z para el desarrollo del mismo. Una vez listas las
diluciones, la placa en dónde se realizaran los cultivos, es marcada dividiéndola en 8
segmentos rotulados desde la dilucion 10-1 hasta 10-8 en la capsula en dónde está el
agar.

Para inocular se debe abrir la palca bajo el mechero y depositar 3 gotas de

aproximadamente 5 µL de los tubos respectivos. Se debe tener especial cuidado de
que las gotas estén los suficientemente separadas para poder diferenciarlas, y bien
secas antes de mover las placas (para secarlas se recomienda dejar las tapas
semiabiertas bajo el mechero).

Una vez listas las placas, se incuban a 37°C durante 24 horas, para posteriormente
contar el número de colonias individuales
 Para el cálculo de la UFC siga las siguiente fórmula UFC = Nc x (1/D) x FD, siendo
UFC igual al número de unidades formadoras de colonias por ml, Nc = número de
colonias, FD = Factor de dilución (1000 ul /5 ul).

3.2.3.3.- Método de turbidimetría

A partir de las suspensiones de bacterias A y Z, se determina la absorbancia a 650

nm de ambas transfiriendo 1mL de cultivo líquido a una cubeta del
espectrofotómetro, usando como blanco 1 mL de medio de cultivo. Si la absorbancia
es muy elevada, esto es, superior a 1, es recomendable diluir 1:2 tomando 0,5mL de
la suspensión bacteriana y 0,5 mL de medio de cultivo.

Después de obtener el número de colonias en las placas de cada una de las

diluciones realizadas en el método de la microgota, se grafica la absorbancia v/s
UFC/mL (unidades formadoras de colonias/mL) para las dos soluciones, A y Z.

3.2.4.- Muestra de suelo por el método de la microgota

Para analizar una muestra de suelo es necesario preparar una solución con 1 g de
muestra de suelo en un tubo Falcon con 9mL de suero fisiológico. Se deja decantar y se
extrae el sobrenadante para preparar las diluciones seriadas de la misma forma que se
realizó para el método de plaqueo y microgota, hasta una dilución de 10 -7. Una vez
listas las diluciones se inoculan 5 gotas de 5µL cada una, a cada segmento de la placa
con agar previamente dividida en 5 partes.

Cuando las gotas ya se hayan secado en la placa ubicada bajo el mechero, se incuban a
27°C por 7 días
3.3.- Laboratorio 3: Crecimiento Bacteriano.
3.3.1.- Protocolo curva control (C):

Primero que todo, se debe tener en cuenta trabajar en todo momento cerca del
mechero para mantener el medio estéril y libre de otras bacterias que puedan interferir
el análisis posterior. Para realizar la curva de control, se deben preparar con
anterioridad 5 matraces rotulados con 50 ml de solución. Esta solución contiene 5
distintos factores a determinar; Agitación (G), concentración de nutrientes (N),
temperatura (T°), ampicilina (A) y curva normal (C). A cada matraz, mediante una
micropipeta P1000 se toma desde un tubo Falcon (se pasa boca del tubo en el mechero
previamente) 1ml de inoculo bacteriano (en este caso E. coli) y se deposita el volumen.
Inmediatamente, se toman 1ml desde cada matraz (se pasa la boca del matraz por el
mechero) por medio de una micropipeta P1000 y se deposita en una cubeta que
posteriormente se lleva a un espectrofotómetro, esto con el fin de determinar la
absorbancia en el tiempo 0 de trabajo. En el espectrofotómetro se utiliza medio de
cultivo como blanco y se mide la absorbancia a 600nm. Esto se realiza para cada factor,
por lo tanto, se deben tener en el registro 5 absorbancias en el tiempo 0 cada uno
correspondiente a (O2), (N), (T°), (A) y (C). Todo lo anterior, es medición de
turbidimetría de la muestra.

En conjunto con las mediciones de absorbancia medidas directamente desde el matraz,

se deben hacer diluciones para una muestra de cada factor. En primer lugar, para la
muestra del matraz (G) se deben preparar en una gradilla, 8 tubos eppendorf
previamente rotulados; cada uno de estos debe contener 900μL de suero fisiológico los
cuales se depositan en los tubos por medio de una micropipeta P1000.
Inmediatamente, se toman mediante una micropipeta P1000 100μL desde el matraz
(G) y se depositan en el primer tubo eppendorf destinado a realizar la dilución de esta
muestra. Luego, desde el tubo 1 que contiene 1000 μL (900μL de suero fisiológico mas
los 100μL de la muestra) se extraen 100μL por medio de una micropipeta P1000; este
volumen se deposita en el tubo 2 y así sucesivamente hasta el tubo 8. Con lo anterior,
se tiene la dilución de la muestra al tiempo 0.

Repetir el mismo procedimiento en el tiempo 0 para cada matraz, esto quiere decir,
que se deben preparar con anterioridad 8 tubos eppendorf para cada factor: (N), (T°),
(A) y (C).

Se deben tomar muestras desde cada matraz al tiempo 0, 30, 60, 90 y 120 minutos, por
lo tanto, se debe repetir el procedimiento anterior descrito para el tiempo 0 para cada
tiempo mencionado. De acuerdo a esto, se deben registrar en total 25 absorbancias; 5
para cada tiempo, las cuales cada una de estas corresponde a los factores descritos.

3.3.2.- Procedimiento microgota

De las diluciones realizadas para cada factor, mencionadas en el punto 1.2.1, se deben
tener en la mesa de trabajo 5 placas petri con agar listas previamente preparadas. Cada
placa se rotula de acuerdo al factor que corresponda, la persona que estará a cargo de
la preparacion de la microgota y la fecha de preparación. Luego de esto, por la parte
posterior de la placa (no la tapa) se divide en 8 por medio de un marcador y se indica el
numero en cada división. Trabajar siempre cerca del mechero para mantener el medio
esteril.

En primer lugar, para las diluciones del factor (G) se toma desde el tubo eppendorf 1,
5μL de dilución por medio de una micropipeta P20 y se deposita en la división 1 de la
placa petri correspondiente a este factor. Repetir el mismo procedimiento 2 veces más;
cada división debe contener 3 gotas de dilución, las gotas en lo posible deben estar lo
más separadas dentro de la división correspondiente. En la misma placa del factor (G),
continuar con la dilución 2 y repetir el procedimiento descrito para la dilución 1. Al
terminar de depositar las gotas de la dilución 8, dejar la placa cerca del mechero hasta
que las gotas estén completamente secas y luego de esto, tapar la placa y sellarla con
papel film.

El procedimiento descrito para la microgota del factor (G) debe repetirse para cada
factor; en total se tienen 5 placas petri trabajadas con el método de la microgota.

3.3.3.- Concentración mínima inhibitoria

Una solución concentrada de 1000μL ampicilina se diluye 8 veces en un tubos

eppendorf previamente rotulados. Los tubos eppendorf deben ser preparador
previamente; cada uno debe contener 900μL de suero fisiológico los cuales fueron
depositados por medio de una micropipeta P1000 a cada uno de los tubos. También,
con una micropipeta P1000 se extraen de la muestra de ampicilina 100μL los cuales se
depositan en el tubo eppendorf 1 y se mezclan. Luego, del tubo 1 que ahora contiene
900μL de suero fisiológico más los 100μL de ampicilina, se extraen 100μL con una
micropipeta P1000 y se depositan en el tubo 2. Este procedimiento debe repetirse
hasta terminar en el tubo eppendorf 8.

Con la ampicilina ya diluida, se preparan 8 tubos Falcon los cuales deben contener una
cantidad suficiente de medio de cultivo. Todos los tubos deben estar previamente
rotulados. En primer lugar, se debe colocar el asa de loop en el mechero hasta que
cambie su color a rojo; posterior a esto se deja enfriar y luego se extrae desde el tubo
(se debe pasar la boca de este tubo por el mechero) que contiene el cultivo una gota de
bacteria. Inmediatamente después de extraer un poco de bacteria, se abre el tubo 1
que contiene medio de cultivo, se pasa la boca de este por el mechero, y se inocula la
bacteria (el tubo debe cerrarse rápidamente). Este procedimiento se repite para cada
tubo hasta el 8, siempre con el cuidado de trabajar cerca del mechero para mantener el
medio estéril.

Con los 8 tubos preparados con el inoculo, se debe transferir un volumen de dilución de
ampicilina a cada uno de estos. Primero, se toma el primer tubo eppendorf
correspondiente a la dilución 1 de la ampicilina y se le extraen 5 μL por medio de una
micropipeta P20. Este volumen se debe depositar en el tubo 1 de inoculo bacteriano.
Este procedimiento se repite para cada una de las diluciones de ampicilina en cada
tubo de inoculo bacteriano. Es importante notar, que cada dilución corresponde al
mismo número en los tubos Falcon con inoculos bacterianos.

3.3.4.- Sensibilidad a antibióticos

En una placa petri con agar previamente rotulada, se deposita una cantidad suficiente
de inoculo mediante una torula de algodón. La boca del tubo Falcon que contiene el
inoculo bacteriano se pasa por el mechero, luego de esto, con la torula se saca inoculo
y se deposita en la placa tratando de que este volumen quede uniformemente en la
placa. Se saca la cantidad necesaria de inoculo hasta que la persona a cargo considere
que la placa está cubierta por completo de bacteria.

Con una pinza, tomar un sensidisco para gram negativa (esto debido a que se está
trabajando con E. coli) y depositarlo sobre la placa previamente sembrada. Tener
cuidado de colocar el sensidisco hacia el lado que corresponda (el plástico debe quedar
hacia arriba).

Los procedimientos 3.2.2, 3.2.3 y 3.2.4 deben mantenerse a 37°C (temperatura óptima
de la E.coli) y se deben registrar los resultados al día siguiente de la realización del
práctico.
 4.- Resultados y discusión
4.1.- Laboratorio 1: Observación de células vivas y teñidas, cultivo de
microorganismos y separación de colonias en placa.
Tabla 4.1.- Resultados de gota colgante

Tipo de movimiento
Célula Protocolo 1 Protocolo 2
Escherichia coli Movimiento Browniano

Pseudomonas aeruginosa

Lo observado en el microscopio, fue un sinfín de bacterias para cada tipo, en la cual

mostraban movimientos aleatorios y sin ningún motivo. De los resultados, podemos
observar que ambos tipos de bacterias presentan un comportamiento browniano, es
decir, que las bacterias Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa presentan un
comportamiento parecido al ser observadas mediandte microscopia utilizando la tecnica
de la gota colgante. Este movimiento al azar, o mas bien browniano, pueder ser producido
por por el movimiento constante de particulas, principalmente de agua, al interior de la
celula en su citoplasma o fuera de el, lo que influyen en el movimiento de los organismo
unicelulares.

4.1.2.- Resultados de observación de tinciones.

Figura 4.1.- Resultado observación de tinción E. coli

4.1.3.- Resultados de inoculación bacteriana.

Tabla 4.2.- Resultados de inoculación bacteriana

Muestra Tipos de crecimiento

Control Nada
Escherichia coli Turbidez y sedimentación
Pseudomonas aeruginosa Turbidez
Suciedad Turbidez y sedimentación

Los tubos de ensayos presentaron un color lechoso en todo el medio de cultivo, a

diferencia de algunos los cuales, mostraron partículas en el fondo del tubo de ensayo. De
los resultados obtenidos en la inoculación de un medio de cultivo líquido, podemos
observar que las bacterias Escherichia coli y las presentes en la muestra de suciedad,
presentan un comportamineto de crecimiento parecido, presentando tubidez y
sedimentacion, por un lado esto nos indica que la bacteria E. Coli crece distribuyendose en
su medio de cultivo liquido y a la vez sedimentando en el fondo de este, po lo tanto,
podemos deducir, que en la muestra de suciedad, se presentan bacterias con el mismo
comportamiento de crecimiento de la bacteria E. Coli. En cambio para la bacteria
Pseudomonas aeruginosa, su comportamiento solo esta carcteriado por la tubidez del
medio de cultivo, pero cabe destacar, que en la muestra de suciedad, tambie es posible de
que se presentan bacterias, son el mismo tipo de crecimiento.

Por otro lado se puede deducir que la tubidez, esta relacionada directamente con que las
bacerias presenten un grado de movilidad, de esta forma, le es posible el movimiento a
traves de todo el medio de cultivo en busca de nutrientes, cosa que es apreciable en las
tres muestras.
4.1.4.- Resultados de tecnica de crecimiento de agar tendido.

Figura 4.2.- En la primera imagen se observa el crecimiento en agar tendido en

Escherichia coli y en la segunda imagen el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa.

En la imagen se puede observar un crecimiento distinto para ambos organismos, lo cual

una vez mas nos perite diferenciarlos segundo ls forma fisica de formacion de colonias.

Observando los resultados del crecimiento en el medio solido de agar tendido en tubos de
ensayos, podemos deducir por un lado que la bacteria Escherichia coli presenteda un
crecimiento difuso en el agar tendido y la Pseudomonas aeruginosa presenta un
crecimiento filiforme. Esta diferencia en el crecimiento se debe a que el metabolismo para
cada organismo es unico y diferente del otro, lo que implica variaciones y diferenciaciones
en el crecimiento y mobilidad de la celula, asi como tambien, de los nutrientes y
ambientes necesarios para desarrollarse.
4.1.5.- Resultados de sepracion de colonias.

Figura 4.3.- En la primera imagen crecimiento de Escherichia coli y en la segunda imagen

crecimiento de Pseudomonas aeruginosa.

En la imagen es aoreciable un claro crecimiento bacteriano en el agar de la placa petri,

donde ambos organismos presentan diferentes caracteristicas, las cuales, es posible
distinguirlos.

Tras desarrollar el procedimiento de separacion de colonias y observar los resultados, es

posbile apreciar diferentes caracteristicas morfologicas presentes en las colonias de
Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Por un lado, la Escherichia coli presenta una
morfologia de su colonia circular, ademas de presentar un borde en algunos casos liso y
en otros curvos, tambien la colonia presenta una elevacion levantada y una superficie
suave y brillante. Analizando el crecimiento de la Pseudomonas aeruginosa podemos
observar varias coincidencias con el crecimiento de la Coli, de la forma en que la
Pseudomona presenta un crecimiento de sus colocinas de forma circular e irregulares, con
bordes curvos y elevaciones y superficie. Estas coincidencias y diferencias a la vez se
pueden deber diferencias en su metabolismo, pero no una diferencia completa, más bien
en algunos procedos, que por un lado los hace organismo unico, pero tambien les
presenta un posible parentesco.
4.2.- Laboratorio 2: Tinción, Fisiología y movimiento bacteriano.
Figura 4.4.- Observaciones de la muestra problema
 Figura 4.5.- Observación de Pseudomona.

Figura 4.6.- mezcla de E. coli y Staphylococcus aureus

 Figura 4.7.- Resultados de campana de durham:

Figura 4.8.- Resultados de Carbohidratos: primera imagen glucosa y seguida de lactosa

Figura 4.9.- Resultados del MIO:

Figura 4.10.- Resultados del LIA:

 Tabla 4.3 resultados muestra Z

Microgota Dilución
Muestra Z 2,00E+09 3,00E+08

Las unidades formadoras de colonias nos indican, la capacidad de formación de colonias

en la caso de la muestra original, antes de diluir. Observando los resultados podemos
determinar la capacidad de formación de colonias del organismo presente en la muestra
Z, de lo que podemos determinar el comportamiento exponencial desbordante respecto
al crecimiento de este organismo y su capacidad clonamiento. Por otro lado podemos ver
una diferencia en la magnitud del valor del UFC, esto se debe al diferente valor obtenido
del numero de coloni, el cual fue menor, pero debido al grado de dilución, el error se
acumula. Cabe destacar que la muestra fue diluida previamente en comparación a la
muestra A, la cual era más concentrada. De esta forma el factor de dilución se en carga de
disminuir las bacterias presentes en la muestra, lo que conlleva a una disminución de las
bacterias presentes, por ende, el factor UFC también se verá disminuido, es decir, que el
valor de UFC de la muestra A teóricamente debería ser mayor
4.3.- Laboratorio 3: Crecimiento Bacteriano.
4.3.1.- Curva de crecimiento bacteriano para cada factor estudiado

1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 20 40 60 80 100 120 140

Agitación Concentracion de N. Temperatura Ampicilina C. normal

Gráfico 4.1.- Curva de crecimiento de E. coli en distintos medios: agitación, concentración de

nutrientes, temperatura, ampicilina y curva normal.

Se observa en el gráfico 3.1, que la curva de crecimiento solo representa la fase lag o
exponencial de la bacteria evaluada en distintos factores. El factor temperatura, es el que
presenta más crecimiento en el tiempo. El factor ampicilina, concentración de nutrientes y
curva normal presenta un comportamiento similar hasta el minuto 30, sin embargo, el
factor agitación es el único que afecto significativamente el crecimiento bacteriano. Lo
anterior, se observa directamente en el gráfico presentado.

Observando el grafico, podemos deducir a simple vista, estamos ante la presencia de la

fase Lag y el comienzo de la fase exponencial en el crecimiento bacteriano. Además cabe
destacar que diferentes factores afectan directamente el crecimiento bacteria Escherichia
coli, uno mas que otros, de esta forma, el crecimiento no solo depende de la bacteria, sino
de su ambiente y los sutratos en el que se encuentra. Por un lado observando los
resultados y comparandolos con la curva normal, podemos ver que el factor temperatura,
corresponde al factor mas influyente en la curva de crecimiento de la bacteria, donde,
permitiendole una temperatura adecuada se le permite un crecimiento mucho mas rapido
y en menos tiempo, esto se puede deber a que el metabolismo de la Escherichia coli es
totalmente dependiente de la afinidad del sustrato, y esto se ve afectado por la
temperatura, ya que la enzima si no esta en su temperatura optima puede disminuir su
actividad o incluso denaturalizarce. Tambien cabe destacar que los factores de la
concentracion de nutrientes o sustrato y la concentracion de antibiotico ampicilina,
presentan un comportamiento parecido en la curva de crecimiento bacteriano, por un
lado la concentracion utilizada de antibiotico,presento una variacion,o mas bien, un
disminucion en el crecimiento bacteriano representado en el grafico, ya que la curva de
ampicilina presenta un comportamiento menor a la curva normal, de esta forma,
podemos deducir, que la ampicilina causo efecto en el metabolismo bacteriano e
impidiendo un crecimiento pleno. De la misma forma se puede discutir con respecto a la
concentracion de sustrato, ya que una diminucion de este factor inhibe el crecimiento, ya
que la bacteria, no posee los elemento necesarios para desarrollar su metabolismo y asi
poder crecer, de esta forma la bacteria es llevada a un ambiente de stres y/o competitivo
con el resto de las bacterias. Por ultimo con respecto al factor agitacion, pordemos
deducir que afecta en gran medida el crecimiento bacteriano de forma inhibitoria, aun
más, que el antibiotico. Esto se puede deber a que la Escherichia coli se ve afecta en un
constante movimiento impidiendole en un posible obtencion de nutrientes.

4.3.2.- Microgota.

Figura 4.11.- Microgota factor: Agitación; 8 diluciones del inoculo bacteriano

Figura 4.12.- Microgota factor: Concentración de nutrientes; 8 diluciones del inoculo bacteriano
Figura 4.13.- Microgota factor: Temperatura; 8 diluciones del inoculo bacteriano

Figura 4.14.- Microgota factor: Ampicilina; 8 diluciones del inoculo bacteriano

Figura 4.15.- Microgota factor: Curva normal; 8 diluciones del inoculo bacteriano
 Tabla 4.4.- Resultados de unidades formadoras de colonias en cada factor analizado

Factor UFC
Agitación 1,00E+08
T° 1,70E+09
Ampicilina 7,00E+08
Nutrientes 3,00E+08
Control 1,10E+09

En cuanto a las unidades formadoras de colonia UFC, se observó que el factor involucrado
en el análisis correspondiente a la temperatura mostró más crecimiento en contraste con
los demás. Esto se debe a que la E. coli posee una temperatura optima de crecimiento a
los 37°C, por lo tanto, este factor es determinante en cuanto a su crecimiento. Esta
metodología de trabajo, es un buen indicador de UFC, por lo cual se puede confiar en
sistemas como este para desarrollar otros trabajos que deseen evaluar un
microorganismo en distintos factores. En contraste con lo anterior, la concentración de
nutrientes es el segundo factor importante a mencionar; este último, pese a poseer 1/5 de
la concentración ideal, dio un valor considerable. Esto puede deberse a que los demás
factores involucrados en el crecimiento aportaron a que la cantidad de unidades
formadoras aumentaran aun sin tener la cantidad de nutrientes ideal. El factor agitación,
es el que entrego una cantidad de UFC menor a los demás factores evaluados, se
considera que a mayor agitación, las moléculas de nutrientes y otros factores tendrán más
contacto y choques con las bacterias en crecimiento, por lo tanto, se espera que la
cantidad de UFC fuera mayor que los demás factores, debido a que los otros carecían de
este factor que favorece el crecimiento. En cuanto a esta diferencia en cuanto a lo
experimental determinado y lo esperado por teoría, se atribuye a una mala eficiencia por
parte de la persona encargada de realizar la metodología, esto puedo darse por: mal
manejo de los aparatos y no mantener el medio estéril de trabajo, lo que permite la
entrada de mas microorganismos que no son parte del estudio.
 4.3.3.- Concentración mínima inhibitoria

Figura 4.7.- Concentración miníma inhibitoria de E. coli en dilución de ampicilina

En este punto del práctico, se deseo evaluar la concentración miníma inhibitoria de la

ampicilina en diluciones de E. coli. Como se observa en la figura 4.7, la turbidez de cada
tubo se ve similiar. Por otro lado, el hecho de que se encuentren las muestras turbias es
por la presencia de bacterias, por lo tanto, la accion de la ampicilina no tuvo lugar en
ninguna de las diluciones analizadas. Este resultado no fue el esperado, y el error se
atribuye a que las diluciones de la muestra bacteriana de E. coli no fueron las correctas; en
último caso, para lograr resultados consisos, se debe hacer una dilucion mayor.

4.3.4.- Sensibilidad a antibióticos

Figura 4.7.- Sensidisco gram negativo en E. coli

 Tabla 4.1.- Halo de inhibición en centimetros del sensidisco en E. coli

Antibiótico Halo de inhibición [cm]

CF 30 1,7
SAM 10/10 1
CAZ 30 1,9
CXM 30 2
SXT 25 2
C30 3,2
CTX 30 3
AK 30 1,8
GE 10 1,2
CIP 5 2,5

En esta parte del práctico se analizó la sensibilidad de la E. coli a distintos antibióticos. De

acuerdo a los halos de inhibición, la bacteria es mas sensible a la C30 debido a que su halo
fue de 3,2 cm. Los halos de inhibición representan la accion del antibiotico frente al
crecimiento de la bacteria, por lo tanto, la bacteria es mas sensible al C30 y menos
sensible al SAM 10/10 debido a que en este ultimo su halo de inhibición fue solo de 1 cm,
por lo tanto, no afecto significativamente a su crecimiento.