UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA

Curso: Lab. Microbiología

Alumnos:
 Narciso Espinoza Alexis
 Chancahuaña Torres Lizeth
 Valencia Fajardo Felipe
 Cáceres Montesinos Gian Anderson
I. MARCO TEORICO

Aspectos microbiológicos relacionados con el

procesado de frutas y hortalizas

 Los microorganismos son contaminantes naturales de frutas y hortalizas

frescas (medioambientales, cosecha y procesado)

Alteraciones (microorganismos alterantes)

Toxiinfecciones alimentarias (microorganismos patógenos)

 Las toxiinfecciones alimentarias se han relacionado mucho más al consumo

de productos de origen animal
 Los productos frescos enteros poseen barreras naturales ( ej. piel, ceras,...)
mientras que los productos cortados son más susceptibles debidos a los
cambios que soportan los tejidos durante el procesado
A) MICROBIOLOGIA DE FRUTAS

COMPOCICION DE FRUTAS

 Agua (aw > 0.95) (80%, 93% sandía)

 Azúcares: fructosa, sacarosa, glucosa (5-18%)
 Grasas (0.1-0.5%, exc. Aguacate, 15%)
 Ácidos: málico, cítrico, .. (0.5-6%)
 Vitaminas y minerales (C, A, K, Mg,..)
 Fibra (0.7-4.7%, disminuye con el pelado

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 B) VALORES DE PH REPRESENTATIVO CORRESPONDIENTE A LA
FRUTAS FRESCAS

Fruta pH Fruta pH
Limón 2.2-2.6 Naranja 3.0-3.4
Pomelo 2.9-3.4 Albaricoque 3.3-4.4
Frambuesa 2.9-3.5 Piña 3.4-3.7
Manzana 2.9-4.5 Pera 3.4-3.7
Fresa 3.0-3.6 Mango 3.8-4.7
Uva 3.0-4.5 Tomate 4.0-4.5
Cereza 3.2-3.4 Melón* 6.2-6.7

C) MICROBIOTA INICIAL
 Principalmente levaduras y mohos (muy pocas bacterias)
 Origen: campo (tierra, insectos, aire), equipo de recolección y transporte
(cajas, envases) y manipulación
 Partes externas contienen la carga microbiana más importante,
habitualmente el tejido interno se considera estéril.
 Pueden existir microorganismos en el interior que se han introducido
durante el cuajado del fruto

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 D) PRINCIPALES ALTERACIONES EN FRUTAS ENTERAS CAUSADAS
POR MOHOS

Producto Alteración Causante

Cítricos Podredumbre verde Penicillium digitatum
Podredumbre azul P. italicum
Podredumbre negra Alternaria citri
Podredumbre amarga Geotrichum candidum
Fruta de pepita Podredumbre azul P. expansum
Podredumbre gris B. cinerea
Podredumbre blanda R. stolonifer
Fruta de hueso Podredumbre marrón Monilinia spp.
Podredumbre negra Alernaria spp.
Bayas (fresa) Podredumbre gris B. cinerea
Otras podedumbres R. stolonifer
Phytophtora
Tomates Podredumbre gris B. cinerea
Podredumbre acuosa R. stolonifer
Podredumbre amarga G. candidum
Melón Antracnosis Colletotricum lagenarium
Podredumbre negra Alternaria alternata
Frutas tropicales Podredumbre Lasiodiplodia
Antracnosis theobromade,
Phomopsis spp.,
Diplodia spp.
Colletotrichum spp.

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 E) ALTERACION
 Los microorganismos de la alteración pueden encontrarse en la planta o
pueden ser introducidos durante la recolección y transporte.
 En el campo, 1/3 de las pérdidas por alteración son causadas por
bacterias

F) PRINCIPALES ALTERACIONES EN HORTALIZAS CAUSADAS POR

MOHOS

Producto Alteración Causante

Zanahorias Podredumbre negra Alternaria
Lechuga Mildiu Bremia, Phytophtora
Apio Podredumbre blanda Sclerotinia
acuosa
Cebollas Podredumbre negra Aspergillus niger
Antracnosis Colletotrichum
Espárragos Podredumbre por Fusarium
Fusarium
Patatas Podredumbre del Fusarium
tubérculo
Col Podredumbre gris B. cinerea
Coliflor Podredumbre negra Alternaria
Espinacas Mildiu Phytophtora

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 G) PRINCIPALES ALTERACIONES CAUSADAS POR BACTERIAS

Producto Alteración Causante

Hortalizas: lechuga, Podredumbre blanda E. carotovora
zanahoria, col, bacteriana Ps. marginalis
pimientos,.. E. herbicola
Otras podredumbres Corinebacterias
(no blanda) Xantomonas
Pseudomonas
Manchas
Tizones
Agostamiento
Zanahoria cortada Exudación, pérdida de Bacterias ácido-lácticas
textura
Fermentaciones

CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.

 DISPONIBILIDAD DE NUTRIENTES ADECUADOS:

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha
decontener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales
inorgánicas. Enmuchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otra
sustancia inductoras delcrecimiento. Siempre han de estar presentes las
sustancias adecuadas paraejercer de donantes o captadores de electrones
para las reacciones químicas quetengan lugar.Todas estas sustancias se
suministraban originalmente en forma de infusionesde carne, extractos de
carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparaciónde estas

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 sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdidade
los factores nutritivos lábiles.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los
medioses utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente
asequible denitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos,
que no suelenutilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad
de atacar losaminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno
presentes en lapeptona.Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas
específicas por lo que se añade amuchos medios sustancias como suero,
sangre, líquido ascítico, etc. Igualmentepueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio,magnesio, manganeso,
sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,generalmente de
naturaleza vitamínica.Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos
colorantes, bien comoindicadores de ciertas actividades metabólicas o bien
por sus capacidades deejercer de inhibidores selectivos de ciertos
microorganismos
 CONSISTENCIA ADECUADA DEL MEDIO:
Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia
añadiendoproductos como albúmina, gelatina o agar, con lo que
obtendríamos medios enestado semisólido o sólido.Los medios solidificados
con gelatina tienen el gran inconveniente de quemuchos microorganismos no
se desarrollan adecuadamente a temperaturasinferiores al punto de fusión de
este solidificante y de que otros tienen la capacidadde licuarla. Actualmente
los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad ycomodidad,
pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso
estáampliamente extendido en el laboratorio
 PRECENCIA Y AUSENCIA DE OXIGENO Y OTROS GASES
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión
deoxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de
variados.
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se
desarrollaránadecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un
punto intermedio,los microorganismos microaerófilos crecen mejor
en condiciones atmosféricasparcialmente anaerobias (tensión de oxígeno
muy reducida), mientras losanaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera delas citadas condiciones

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 CONDICIONES ADECUADAS DE HUMEDAD
Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas
microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas
condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una
fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
 LUZ AMBIENTAL
La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que
en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso
de los microorganismos fotosintéticos
 PH
La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento
delos microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios
con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos
ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades
que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o
incluso alterar sus procesos metabólicos normales
 TEMPERATURA
Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas
entre 15y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilas a
80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En
líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura
mucho más cortos, alrededor de 37ºC,y los saprofitos tienen rangos más
amplios
 ESTERILIDAD DEL MEDIO
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar
la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso
impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes
inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios
de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente
esterilizante)

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1.1 METODOS DE PREPARACION DE MEDIOS:
 PREPARACION DE UN MEDIO SOLIDO EN PLACA
1. Pesar la cantidad de medio (si el preparado contiene agar debemos
añadirlo a una concentración de 15g/l) y rehidratarlo agua destilado en
una botella
2. Autoclavar la botella sin cerrar totalmente el tapón de rosca
3. Sacar del autoclave, enroscar del todo el tapón e introducir la botella
enun baño a 40ºc al menos durante 30 minutos
4. Distribuir el medio en las placas de petri que están estériles dentro d
e unacampana de flujo laminar o en las proximidades del mechero,
flameando bien la boca de la botella para evitar las contaminaciones.
5. Dejar que el medio solifique.
 PREPARACION DE MEDIO SOLIDO EN TUBO (slant)
1. Pesar el medio que contenga agar y rehidratar con agua destilada e
n un matraz
2. Fundir el medio en un horno microondas o en una placa caliente. el
mediodebe hervir hasta que se vuelve transparente
3. Distribuir rápidamente el medio en los tubos antes de que comience
asolidificar para ello se empleara una pipeta y los tubos no se llenaran
más de un tercio de su volumen
4. Autoclavar
5. Sacar de la autoclave e inclinar los tubos sobre la poyata para obten
er tubos con medio de slant
 PREPARACION DE MEDIO LIQUIDO EN TUBO (CALDO)
1. Pesar y rehidratar el medio
2. Distribuirlo con una pipeta en los tubos (sin llenarlos más de 1/3 de s
uvolumen)
3. Autoclavar.
4. Sacar el autoclave y dejar enfriar.
5. Todos los medios se guarda en nevera a 4°C.

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1.2 REALIZACION DE LA SIEMBRA
1. Siembra en medio liquido:
Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se
toma un inóculo que se lleva al tubo estéril con medio líquido
(agitándola en el seno del medio), tomando las precauciones
mencionadas anteriormente.
2. Siembra en placa:
Dividida la placa en tres partes, sembrar en cada tercio el inóculo
tomado de los cultivos crecidos. Se introduce el asa de siembra en
el tubo con cultivo crecido y se toma una gota de inóculo que se
extiende sobre el agar de la placa deslizando el asa suavemente
por su superficie en zig-zag.
3. Siembra en agar inclinado:
Se introduce el asa de siembra en el tubo con cultivo crecido y se
toma un inóculo que se extiende sobre el agar inclinado deslizando
el asa suavemente por su superficie en zig-zag. En el caso del
medio TSI, la siembra se deberá realizar tanto en superficie
(aerobiosis) como en la profundidad del agar (anaerobiosis).
4. Siembra en laboratorio:
a) por diseminación: sobre la superficie del medio ya gelificado y
secado, contenido en la placa, de volúmenes de 0,1 – 0,2 ml de las
diluciones correspondientes, o
b) en profundidad: incorporando el inóculo en un volumen de medio
fundido, mantenido a temperaturas compatibles con la viabilidad
microbiana (aproximadamente 45 C), que luego se vuelca en una
placa de Petri y se deja gelificar. Los volúmenes inoculados pueden
ser de hasta el 10% del volumen del medio. Luego de la incubación
en las condiciones apropiadas para cada microorganismo, la
concentración de UFCs presentes en una suspensión se calcula
multiplicando el número de colonias por placa, promedio de varias
placas, por la inversa de la dilución de la suspensión, y dividiendo
por el volumen sembrado:

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 Fig 01: Recuento en placa por diseminación en superficie

En la Figura 01 se esquematiza el procedimiento para contar las UFC/mL en

una suspensión bacteriana, utilizando la técnica de siembra por diseminación
en superficie. Si, por ejemplo, un volumen de 0,1 mL de la dilución 1 x 10-4 de
un cultivo origina un promedio de 120 colonias por placa, el número de UFC
por mililitro de cultivo será de 1,2 x 107 (120 UFC / 10-4 x 0,1 mL).

Cuando el número de microorganismos viables presentes en una muestra es

bajo, se puede recurrir a la filtración de la misma a través de filtros de
membrana que retienen bacterias. Luego de filtrar la suspensión que contiene
las bacterias a cuantificar, la membrana se coloca sobre la superficie de un
medio agarizado o sobre una fina almohadilla de papel absorbente (pad)
embebido con medio líquido, se incuba en condiciones adecuadas y se cuentan
las colonias, que representan el número de UFC presentes en el volumen de
muestra filtrado. Tanto para la técnica de “plaqueo” directo como para la de
filtración se pueden utilizar medios especiales, selectivos y/o diferenciales, que
permiten el recuento de bacterias específicas

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2. INCUBACION

De los medios sembrados a 37ºc hasta que haya habido crecimiento

bacteriano.

3. MORFOLOGIA COLONIAL

1. MORFOLOGIA COLONIAL EN PLACA PARA BACTERIAS Y

LEVADURAS.
Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias
separadas debe incluir:
A) TAMAÑO: Diámetro en mm, La mayoría de los microorganismos
forman colonias de tamaño limitado al tiempo de incubación.
B) FORMA: Es la apreciación general de su figura la cual puede ser:

C) ELEVACION: Que puede ser

D) BORDE: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero,

ondulado, Lobulado, crenado, filamentoso o rizado.

E) COLOR: Blanco, amarillo, negro, marrón, anaranjado, etc.

F) ASPECTO: Húmedo o seco
G) CONSISTENCIA: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura. Esta
prueba se realizar con el asa.

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4. MORFOLOGIA COLONIAL EN PLACA PARA MOHOS
A) Tiempo de crecimiento: Los mohos filamentosos, tienen colonias de 2-
3 cm de diámetro y va de 3 a 5 días.
B) Aspecto: puede ser: aterciopelado, pulverulento, velloso y algodonoso.
C) Pigmentación: Al reverso de la colonia se observa el pigmento del
micelio y puede ser de color olivo, verde claro, grises, blancas, rojas,
amarillas.

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Resultados
 Al pasar los 3 dias de dejar reposando la fresa en una placa Petri se
obtuvieron los siguientes resultados

 Al pasar una semana del reposo se obtuvieron los siguientes resultados.

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Conclusiones
 Las medidas de higiene son fundamentales para el control de
microorganismos.
 Resultados microbiológicos

POBREDUMBRE COLOR FORMA

Botrytis cinerea Gris Filamentosa

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Bibliografía
 https://www.idainature.com/podredumbre-gris-en-fresa-sintomas-
consejos-y-soluciones/
 Aspectos Microbiológicos relacionados con el procesado de frutas y
hortalizas. Universidad de Lleida. España (2015).

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