PRODUCCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE JUGO DE CAÑA DE

AZUCAR MEDIANTE FERMENTACION CON Saccharomyces cerevisiae

Madeley Cervantes1, Liseth Strauch2, Laura Montenegro3, Carmen Melissa

Acosta4, Emil Mejia5, StefanyCastro6, Felipe Guzman7

DOCENTE: Juan Guillermo Reales Alfaro*

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 Estudiantes de Ingeniería Agroindustrial

* Ingeniero Agroindustrial.

RESUMEN
En este trabajo se muestra la producción de bioetanol a partir fermentación alcohólica de
azucares derivados del jugo de caña de azúcar filtrado, utilizando la levadura saccharomyces
cerevisiae, a partir de una materia prima potencial de la agricultura colombiana, la caña de
azúcar. Se realizó la selección del proceso más adecuado para la materia prima en el cual se
pasó a enriquecer el medio, luego esta fue llevada a un birreactor por 72 horas haciendo las
respectivas pruebas como recuento de biomasa, cuantificación de etanol, azucares
reductores. Teniendo en cuenta factores económicos.

Palabras claves: saccharomyces cerevisiae, birreactor, bioetanol, fermentación alcohólica

ABSTRACT

This paper describes the production of bioethanol SHOWN from alcoholic fermentation of sugars
derived from cane juice sugar filtering, using the yeast Saccharomyces cerevisiae, from a potential
of Colombian agriculture raw material sugar cane. Selecting the most appropriate process for the
raw material in which it went to enrich the medium was performed, then this was taken to a
bioreactor for 72 hours by the respective tests as count biomass, quantification of ethanol, reducing
sugars. Given economic factors.

Keywords: saccharomyces cerevisiae, twin-engine, bioethanol, alcoholic fermentation

2. INTRODUCCION
Actualmente el biocombustible más
importante es el etanol, producto 100%
renovable obtenido a partir de cultivos
bioenergéticas y biomasa. El etanol
carburante es utilizado para oxigenar la
gasolina, permitiendo una mejor oxidación
de los hidrocarburos y reduciendo las
emisiones de monóxido de carbono,
compuestos aromáticos y compuestos
orgánicos volátiles a la atmósfera [1]. El uso
de alcohol etílico como combustible no
genera una emisión neta de CO2 sobre el
ambiente debido a que el CO2 producido en
los motores durante la combustión y durante
el proceso de obtención del etanol, es
nuevamente fijado por la biomasa mediante
el proceso de fotosíntesis. Entre los cultivos
bioenergéticas más usadas para la
producción de etanol la caña de azúcar es la
materia prima más utilizada en países
tropicales tales como Brasil e India. En
Norte América y Europa el etanol
carburante se obtiene del almidón presente
en el maíz y los cereales [2]. El proceso de
obtención de etanol a partir de caña de
azúcar comprende la extracción del jugo de
caña (rico en azúcares) y su
acondicionamiento para hacerlo más
asimilable por las levaduras durante la
fermentación. Del caldo resultante de la
fermentación debe separarse la biomasa,
para dar paso a la concentración del etanol
mediante diferentes operaciones unitarias y
a su posterior deshidratación, forma en que
es utilizado como aditivo oxigenante.
La fermentación alcohólica es un proceso
biológico de fermentación en ausencia de
oxígeno (figura 1), originado por la
actividad de algunos microorganismos que
procesan los hidratos de carbono (por regla
general azúcares: como por ejemplo la
glucosa, la fructosa, la sacarosa, sirve con
cualquier sustancia que tenga la forma
empírica de la glucosa, es decir, que sea una
Hexosa.) para obtener como productos
finales: un alcohol en forma de etanol (cuya
fórmula química es: CH3-CH2-OH),
dióxido de carbono (CO2) en forma de gas
y unas moléculas de ATP que consumen los
propios microorganismos en su
metabolismo celular energético anaeróbico.
El etanol resultante se emplea en la
elaboración de algunas bebidas alcohólicas,
tales como el vino, la cerveza, la sidra, el
cava, etc. Aunque en la actualidad se
empieza a sintetizar también etanol
mediante la fermentación a nivel industrial
a gran escala para ser empleado como
biocombustible.
Figura 1. Ecuación de fermentación
alcohólica de glucosa
𝐶6𝐻12𝑂6 𝐿𝑒𝑣𝑎𝑑𝑢𝑟𝑎 → 2𝐶2𝐻5𝑂𝐻 + 2𝐶𝑂2
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Curva patrón de glucosa
Para la realización de la curva patrón se
empleó el reactivo DNS (3,5-
dinitrosalicilico).
Se Preparó una solución de glucosa a
0.4g/L. Inmediatamente utilizando tubos de
ensayo se realizó los estándares de glucosa
en las siguientes concentraciones: 0.00,
0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.20, 0.24, 0.28, 0.32,
0.36, 0.40. Posteriormente se agregó a cada
tubo 1 ml de reactivo de DNS.
Se agitaron los tubos en el vortex, después
se llevaron a baño maría a una temperatura
de 90ºC por 5 minutos, seguidamente
enfriamos en un baño de hielo a 4°C y
transferimos el contenido de cada tubo a una
celdilla por separado, finalmente con el
espectrofotómetro leímos las absorbancias
de las muestras a 540nm [1].
3.2. Tratamiento y enriquecimiento del
jugo de caña de azúcar.
Se utilizó 1,5 L de jugo de caña de azúcar,
comercializado en la ciudad de Valledupar
con condiciones iniciales de °Brix 20, pH
5.5; se filtró el jugo de forma manual
utilizando una bayetilla, luego se ajustó pH
a 5,0g con ácido sulfúrico H2SO4 10% V/V,
los °Brix se mantuvieron, luego se procedió
a enriquecer los 1,5 L de jugo en un Beaker
de 2000 ml adicionando: Peptona 10g/L,
(MgSO4*7H2O) 0,5 g/L, (KH2PO4) 1 g/L,
(NH4)2SO4 1g/L, extracto de levadura 5g/L,
Agar 10 g/L. Seguidamente se dividió el
jugo en dos Erlenmeyer, uno de 1000 ml y
otro de 500 ml para su posterior
esterilización.
3.3. Esterilización.
Se llevaron los Erlenmeyer que contenían el
jugo de caña herméticamente cerrados a la
autoclave donde se realizó la esterilización
a 15 psi, 121ºC por 20 minutos, y luego se
bajó la temperatura a 30ºC.
3.4. Activación de la levadura
Saccharomyces cerevisiae.
En Erlenmeyer de 500 ml, se inoculó 2g/L
de levadura, luego se mantuvo con
agitación constante en una plancha
magnética a 120 rpm, 38°C y durante 12
horas.
3.5. Fermentación.
Se vertió el jugo de caña esterilizado
(1000ml) al Birreactor previamente
esterilizado donde se le adiciono el sustrato
de 500 ml en donde ya estaba activada la
levadura, la reacción fermentativa se
mantuvo a 38ºC, 200 rpm por 48 horas, en
ausencia de oxígeno.
3.6. Cuantificación de etanol por
dicromato de potasio
El etanol obtenido por destilación se oxida
cuantitativamente a ácido acético por un
exceso de dicromato de potasio
estandarizado.
3C2H5OH + 2Cr2O7= +
16H + 3CH3COOH +
4Cr++++ + 11H2O
El exceso de K2Cr207 se determina con
solución de sulfato ferroso y amonio
estandarizado. Los tiempos y temperatura
de incubación para oxidar el etanol a ácido
acético son críticos. Debe tenerse especial
precaución con el material de vidrio,
exactitud de las mediciones, calibración de
pipetas, etc. Debe realizarse un blanco.
4. ANALISIS Y DISCUSION DE
RESULTADOS
4.1. Curva patrón
Se tomaron muestras para la determinación
de biomasa, concentración celular (por
cuenta directa en cámara de Neubauer).Esta
es una placa gruesa de cristal como un
portaobjetos, con medidas de 30 × 70 × 4
mm de grosor. Es una cámara simple, cuya
porción central se encuentra dividida en tres
porciones. En la parte superior del
portaobjetos se encuentran cuatro canales
longitudinales y uno transversal central. En
la parte superior e inferior del canal
transversal están grabadas dos rejillas de 9
mm2 de superficie, las cuales están a su vez
subdivididas en una cuadrícula más
pequeña. Por lapsos de 6 o 12 horas se
extrajo con una jeringa 1 mL de jugo de
caña en fermentación adicionándose a 9 mL
de agua peptonada para hacer una dilución
de 10-2. Se llevó al vortex por siete segundos 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑠𝑢𝑠𝑝𝑒𝑛𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 ( )
para homogeneizar. Con la ayuda de una 𝑚𝐿
micropipeta se tomó 1 µL del tubo 10-2 y se 𝑋
= 10000 ( ) ∗ 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
aplicó en la zona de conteo, colocándose un 4
cubreobjetos para ser observado en el Donde:
microscopio con un objetivo a 40X y se
realizó el conteo respectivo de células de la X: Número de células contadas en la
dilución. cámara Neubauer

Finalmente se procedió a realizar la 10000= Volumen = 0,01 cm2 de superficie

respectiva curva de crecimiento para la × 0,1 mm (profundidad) × 0,01 cm = 0.0001
producción de levadura en el proceso de cm3
fermentación.
Factor de Dilución: 10-2 = 0.01.
Se contabilizaron las células que se
encontraron dentro de cada cuadro
subdividido en 16 recuadros pequeños, Tiempo 0
contabilizándose cuatro cuadros en su
totalidad, contabilizándose con la Ecuación Cuadrados
1.
I II III IV
Cuadriculas
6 5 5 6
1

7 7 6 8
2
5 8 8 7
3
3 5 4 7
4
7 6 6 6
5
8 7 7 5
6
7 8 8 9
7
1 6 8 4
8
8 8 6 5
9
12 4 6 6
10
13 5 5 8
11
10 5 4 7
12
7 6 6 6
13
6 5 7 6
14

8 7 8 7
15
 2 4 9 12
16
SUMAS 110 96 103 109

16 24 5 27 40

104,5 SUMAS 418 454 413 407

Promedio
Desviación Estándar 6,45
Coef. Variabilidad 6,17%

Promedio 423
Cálculo de las levaduras / mL:
Desviación Estándar 21,15

Levaduras/mL = 104,5x 10000x =10 Coef. Variabilidad 5,0%

450 levaduras/mL

Tiempo=12 horas Cálculo de las levaduras / mL:

Cuadrados Levaduras/mL = 423x 10000x0,01

=42 300 levaduras/mL
I II III IV
Cuadriculas Tiempo: 18 horas
1 31 60 18 25
2 36 47 24 20 Tabla 1. Número de células de
3 22 31 23 26 levaduras contabilizadas., dilución
1/10
4 47 32 24 30
5 23 35 31 26 Cuadrados
6 22 28 27 27
Cuadriculas I II III IV
7 27 29 27 22
1 26 30 32 39
8 26 31 30 24
2 27 12 32 38
9 22 20 25 19
3 37 29 27 29
10 24 28 33 4 15 30 18 25 34
11 20 19 27 5 17 21 20 30 35
12 30 25 28 6 27 38 30 39 26
13 26 20 19 7 30 23 38 40 42
8 41 37 20 35
14 18 24 20 31
9 26 30 31 34
15 20 20 30 28
10 36 43 24 1424 69 74 67 69
11 23 39 23 1530 54 60 79 81
12 37 35 30 1622 69 73 76 55
13 22 18 18 26 1008 1029 1004 1038
SUMAS
14 30 30 32 30
15 25 28 30 14
16 34 33 31 21
SUMAS 476 470 464 479 Promedio 1019,75
Desviación Estándar 16,37
1,6 %
472,25 Coef. Variabilidad
Promedio
Desviación Estándar 6,65
Coef. Variabilidad 1,4 %

Cálculo de las levaduras / mL:

Cálculo de las levaduras / mL:

Levaduras/mL = 1019,75x 10000x10
=101975 levaduras/mL
Levaduras/mL = 472,25x 10000x0,01
=47225 levaduras/mL

Tiempo: 24 horas Grafica 1. curva de crecimiento de

microorganismo por método de conteo
por Camara Neubauer
Cuadrados

I II III IV
Cuadriculas Curva de Crecimiento (Conteo por camara
1 62 67 68 65 Neubauer)
2 64 57 50 61 120000
3 60 67 58 52
100000
4 55 63 55 71
80000
Células/mL

5 70 70 50 64
6 67 61 67 69 60000

7 60 69 53 59 40000
8 58 52 62 65 20000
9 67 63 48 63 0
10 68 62 70 59 0 5 10 15 20 2
11 51 67 55 70 Tiempo en Horas
12 62 58 60 76
13 62 66 76 79
 4.2. Determinación de azúcares En tubos eppendorf se toma la muestra de
reductores en jugo de caña. aproximandamente 2 ml, se centrifugan a
1200 rpm por 10 minutos, en tubos de
Se preparó una solución de glucosa de 0.4 ensayo de 10 ml se adicionan 0.5 ml de
g/L muestra y 0.5 ml del reactivo de DNS y se
agita en un vórtex. Los tubos se colocan en
Se estableció una escala estándar de 0 a baño de agua a 90 ºC por 5 min. Luego se
0.4g/L a partir de la solución de glucosa enfría a una temperatura 20°C para detener
previamente preparada. la reacción.

Se preparó al 0; 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, Se agita y se realiza la lectura a 540 nm en
0.7, 0.8, 0.9 y 1.0 ml de solución estándar y espectrofotómetro para determinar la
completar hasta 1 ml con agua destilada. absorbancia.

Se adiciono a cada ml de muestra y 1 ml del Muestras Tiempo Absorbancia

reactivo de DNS y agito en un vórtex. 1 0 0.000

Se colocó los tubos en baño de agua a 90 ºC 2 4 0.079

por 5 min. Luego enfrio a una temperatura
20 - 30°C durante 3 min. 3 8 0.266

4 14 ----
Se agito en el vórtex y realizar la lectura a
540 nm en espectrofotómetro para 5 16 0.390
determinar la absorbancia.
6 20 0.450
Tubo ml. de s/n ml. de agua Concentración 7 24 0.681
estándar destilada final (g/L)
glucosa
1 0.0 1.0 0.00
Se Toman los datos de absorbancia y se
2 0.1 0.9 0.04
llevan a la ecuación de la curva de
3 0.2 0.8 0.08
calibración para determinacion la
4 0.3 0.7 0.12 concentración de azucares reductores en las
5 0.4 0.6 0.16 muestras problemas.
6 0.5 0.5 0.20
7 0.6 0.4 0.24 (La ecuación de la curva que se promedió se
8 0.7 0.3 0.28 usa para comparar los datos)
9 0.8 0.2 0.32
4.3. Cuantificacion de etanol por
10 0.9 0.1 0.36 dicromato de potasio
11 1.0 0.0 0.40
Esta técnica consistió en:
4.2.1. Determinación de azucares
Se toma 2 ml del medio de crecimiento de
reductores en muestra problema.
levaduras (centrifugado a 3200rpm durante
30 minutos).
se mezclao con 2 ml de una solución
oxidante de dicromato de potasio
esta solución se mezcla (homogeniza) en
vórtex a 1500 rpm y se calienta en baño
termostatado de 80-85 °C, por 30 min.
Luego Se enfría a temperatura ambiente y
se lee la absorbancia a 440 nm y se realiza
una curva de calibración, reportando el
valor de etanol en g/L.
4.3.1.Preparacion de las soluciones
solución oxidante
Se mezclan 4.165 g de dicromato de potasio
(97%) y 250 ml de ácido sulfúrico (96%) en
un vaso de precipitado de 600mL. Luego
esta solución se para a un balón volumétrico
aforado de 1000 ml y se completa hasta el
aforo con agua destilada, y se deja
reaccionar por 24 horas.
solución de carbonato de potasio
4.3.2. Procedimiento para la realización
de la curva patrón
Se prepararon diferentes concentraciones de
etanol en agua destilada (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8), (% 𝑉⁄𝑉 ), como se muestra en la tabla
siguiente. Se mezclan 2 ml de la solución
final con 2 ml de los diferentes patrones en
un tubo de ensayo homogeneizándose en
vórtex a 1500 rpm durante 10 s.
Seguidamente se realiza un calentamiento
en baño termostatado de 80-85 °C, por 30
min. Se enfría a temperatura ambiente y se
lee la absorbancia a una longitud de onda de
440 nm, ajustando la absorbancia con el
blanco de prueba.
4.3.4. Calculos de las concentraciones
para la curva patron
Se cuenta con etanol al 96%, del cual se
prepara una solución madre al 10%, con la
que se trabajaran diferentes soluciones al 1,
2, 4….8%

Se mezclan de 20 g de carbonato de potasio  solución al 10%

(98%) en un vaso de precipitado de 250mL 𝑐1𝑣1 = 𝑐2𝑣2
hasta que se disuelva. Luego esta solución
se transfiere a un balón volumétrico de 𝑐2𝑣2
𝑣1 =
100mL y se completa con agua destilada 𝑐1
hasta el aforo.
10 × 100
𝑣1 = = 𝟏𝟎, 𝟒𝟏 𝒎𝒍
Después de tener las 2 soluciones anteriores 96
preparadas se realiza la solución final:
 Soluciones del 1-8%
solución final
1×50
Se toman 4 ml de la solución oxidante en un 1. 𝑣1 = = 𝟓 𝒎𝒍
10
tubo de ensayo y luego se adiciona, gota a
gota, 2 ml de solución de carbonato de 2×50
2. 𝑣1 = = 𝟏𝟎 𝒎𝒍
10
potasio hasta finalizar el burbujeo.
3×50
3. 𝑣1 = = 𝟏𝟓 𝒎𝒍
10
 4×50
4. 𝑣1 = = 𝟐𝟎 𝒎𝒍
10 8×50
8. 𝑣1 = = 40 𝒎𝒍
10
5×50
5. 𝑣1 = = 𝟐𝟓 𝒎𝒍
10
 preparacion de la solución patrón
6×50 Se prepara una solución de H2SO4 al
6. 𝑣1 = = 30 𝒎𝒍
10 6N

7×50
7. 𝑣1 = = 3𝟓 𝒎𝒍
10
𝑒𝑞 − 𝑔𝑟
𝑁=
𝑉(𝑙𝑡)

𝑁𝑜 𝑒𝑞 − 𝑔𝑟 = (6𝑁)(0,05𝐿)
= 0,3

𝑤 = (0,3)(49,04)

𝒘 = 𝟏𝟒, 𝟕 𝒈𝒓

𝑀
𝐷=
𝑉

14,7
𝐷= = 𝟖, 𝟏𝟔 𝒎𝒍
1,8

Obtuvimos los siguientes valores:

[] Abs
Blanco 0
1 0,106
2 0,128
3 0,133
4 0,138
5 0,140
6 0,144
7 0,155
8 0,180

Graficamos la curva patrón y

obtenemos el valor de R.
 Concentracion Vs Absorbancia
0.2
5. CONCLUSIÓN
0.18
En esta práctica pudimos experimentar a
0.16 0.138 0.140
0.14 0.128 0.133 escala la elaboración de bioetanol a
0.12 0.106 partrir de la caña de azúcar, en el cual
Abs

0.1 pudimos
y = 0.0151x determinar azucares reductores,
+ 0.0494
0.08 bioma y cuantificación de etanol para al
0.06
final obtener etanol, aunque este no
0.04
0.02
cumple con los requisitos necesarios
0
0 para un bioetanol de uso industrial.
0 2 4
[ ] En la realización de esta práctica se
tuvieron algunos errores en la
elaboración del proceso para obtener
bioetanol, el cual se vio reflejado en el
proceso de la obtención de bioetanol.

TOMA DE MUESTRAS Los costos más altos en la producción de

etanol corresponden en mayor medida a
Se realiza un seguimiento del grado de la materia prima, razón por la cual
alcohol en la fermentación del jugo de actualmente a nivel mundial se realizan
caña, obteniendo los siguientes valores. intensos esfuerzos en la investigación y
desarrollo de tecnologías para el
Muestras Abs Hrs procesamiento de biomasa
1 3,077 4 lignocelulósica, debido a su menor costo
2 3,285 24 y amplia disponibilidad.
3 3,344 30
4 3,397 72 6. RECOMENDACIONES

 Optimizar el proceso con cada

una de las variables que
Absorbancia Vs Horas intervienes que ofrezcan una
80 mayor productividad.
70  Realizar las pruebas por
y = 173.11x - 534.58
60 R² = 0.7207 duplicado para tener un mayor
50 grado de confianza y aceptación
Tiempo en hrs

40 en los datos.
30 24  Realizar la fermentación con un
20 microorganismo que ofrezca
10 4 mejor rendimiento y que
0 consuma menos energía en su
3.05 3.1 3.15 3.2 3.25 mantenimiento y propagación.
-10
absorbancia
 En caso de realizar destilación
usar un método que ofrezca
 obtener etanol anhidro si su uso
será como alcohol carburante.
 Revisar fuentes bibliográficas
donde se obtengan mejores
rendimientos de bioetanol, para
comparar luego con los
resultados obtenidos.

7. BIBLIOGRAFÍA

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the 21st Century. Accessed June 2009.

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