Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Produksi Alkaloid oleh Mikroba Endofit yang Diisolasi dari Batang Kina
Cinchona Ledgeriana Moens dan Cinchona Pubescens Vahl (Rubiaceae)
Ermin K. Winarno
Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi BATAN
Pasar Jumat, Jakarta
Email: erminkk@batan.go.id
Abstrak. Telah dilakukan isolasi dan skrining mikroba endofit dari batang C. ledgeriana dan C.
pubescens yang dapat menghasilkan senyawa alkaloid seperti yang dihasilkan pada kulit batang kina.
Hasil isolasi diperoleh 88 isolat kapang. Skrining dilakukan dengan menggunakan media Potato
Dextrose Broth, A dan B untuk memperoleh kondisi optimum produksi alkaloid oleh mikroba endofit.
Analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa alkaloid dilakukan menggunakan kromatografi lapisan tipis
dan kromatografi cair bertekanan tinggi. Dari hasil skrining diperoleh 2 jenis kapang endofit (LMC 19
dan LMC 29) yang dapat memproduksi senyawa alkaloid. Dalam media Potato Dextrose Broth dan B,
LMC 19 dan LMC 29 memproduksi kinin, sedangkan dalam media B LMC-29 juga dapat
memproduksi sinkonin.
Kata kunci: alkaloid, kinin, sinkonin, mikroba endofit, Cinchona ledgeriana Moens, Cinchona
pubescens Vahl, Rubiaceae.
batang kina, masing-masing dikultivasi dalam 20 dihomogenkan sampai halus, lalu diekstraksi
mL media cair B atau PDB dalam erlenmeyer 50 dengan 5 mL CHCl3 sebanyak 3 kali. Fase
mL yang kena cahaya dan tidak kena cahaya kloroform dikumpulkan dan diuapkan, lalu
(erlenmeyer dibungkus dengan karbon). Inkubasi dianalisis kualitatif dengan KLT. Fase gerak yang
dilakukan pada suhu 28-30ºC dan digoyang pada digunakan adalah CHCl3 :MeOH : air = 7:3:1.
kecepatan 115 rpm. Ketiga, LMC-29 yang berasal Penampak bercak digunakan pereaksi Dragendorf
dari kultur agar miring PDA, ditanam dulu dalam 3 untuk melihat adanya alkaloid dengan munculnya
buah tabung reaksi kecil, masing-masing berisi 2 bercak warna jingga. Analisis kuantitatif juga
ml akuades dan potongan (serpihan) kecil batang C. dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi
Succirubra, C. Calisaya, dan C. Ledgeriana, yang (KCKT) 3 dimensi menggunakan kolom Capcell
beratnya masing-masing 100 mg. Setelah 35, 65, PAPC-C18 (250 mm x 4,6 mm), detektor diode
78, dan 97 hari, isolat diambil dan ditanam pada array dan eluen KH2PO4 20 mM pH 2,50:CH3CN
PDA dalam cawan petri. Setelah 13 hari isolat = 9:1, dan kecepatan alir 1,0 mL/menit.
diambil untuk prekultur dalam media cair PDB, A,
Hasil dan Pembahasan
dan B, masing-masing sebanyak 25 mL dalam
erlenmeyer 50 mL. Setelah 1 hari, media dan Isolasi dan Pemurnian Mikroba Endofot.
biomassa dituang ke dalam erlenmeyer 500 mL Jumlah isolat yang diperoleh sebanyak 88 isolat,
yang telah berisi masing-masing 225 ml media dan diberi kode seperti disajikan pada Tabel 1.
tersebut di atas. Pengambilan contoh, ekstraksi, Cinchona ledgeriana dikoleksi dari Gambung
dan identifikasi dengan kromatografi lapisan tipis Quinine Research Center pada tahun 1999 (9
(KLT) dilakukan setelah 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, dan 9 isolat), pada tahun 2000 dari Cibodas (12 isolat),
hari. dari Gunung Mas (25 isolat), pada tahun 2001 dari
Ekstraksi dan Identifikasi Alkaloid. Medium Cibodas (17 isolat) dan Cinchona pubescens dari
sebanyak 5 mL dipipet dan ditambah 1 atau 2 Cibodas (25 isolat ).
buah biomassa kapang, dihancurkan dan
Tabel 1. Isolat-isolat yang telah dimurnikan (belum diidentifikasi)
No. C. ledgeriana C. ledgeriana C. ledgeriana C. ledgeriana C. pubescens
Gambung Quinine (Cibodas, 2000) (Gunung Mas, 2000) (Cibodas, 2001) (Cibodas, 2000)
Research Center, 1999
1. Cib.5-1(CMM) COLC-1 COLG-1 LCC-1(CMM) COPC-1
2. Cib.5-1(WA) COLC-2 COLG-2 LCC-2(CMM) COPC-2
3. Cib.5-1(WA) NOLC-1 COLG-3 LCC-3(CMM) COPC-3
4. QRC-233-1(CMM) NOLC-2 COLG-4 LCC-4 (CMM) COPC-4
5. QRC-233-1(WA) NOLC-3 COLG-5 LCC-5(CMM) COPC-5
6. QRC-233-1(NA) NOLC-4 COLG-6 LCC-6(CMM) COPC-6
7. QRC-233-1(CMM) NOLC-5 COLG-7 LCW-1(WA) COPC-7
8. QRC-233-1(WA) WOLC-1 COLG-8 LCW-2(WA) COPC-8
9. QRC-233-1(NA) WOLC-2 COLG-9 LCW-3(WA) COPC-9
10. WOLC-3 COLG-10 LMC-11(CMM) COPC-10
11. WOLC-4 COLG-11 LMC-17(CMM) COPC-11
12. WOLC-5 COLG-12 LMC-19(CMM) COPC-12
13. COLG-13 LMC-23(CMM) COPC-13
14. NOLG-1 LMC-29(CMM) NOPC-1
15. NOLG-2 LMN-1(NA) NOPC-2
16. NOLG-3 LMW-1(WA) NOPC-3
17. NOLG-4 CMC-8(CMM) NOPC-4
18. NOLG-5 NOPC-5
19. NOLG-6 NOPC-6
20. WOLG-1 NOPC-7
21. WOLG-2 WOPC-1
22. WOLG-3 WOPC-2
23. WOLG-4 WOPC-3
24. WOLG-5 WOPC-4
25. WOLG-6 WOPC-5
Keterangan: CMM = Corn Meal Medium; NA = Nutrient agar; WA = Water agar
61
Ermin K Winarno
Analisis Kualitatif Produksi Alkaloid oleh bercak warna jingga hasil KLT LMC-19 dan
Isolat. Seluruh isolat sebanyak 88 yang telah LMC-29 ditunjukkan pada Gambar 3. Pada
dimurnikan, satu persatu ditumbuhkan dalam 3 Gambar 3a terlihat hasil KLT kapang dalam 250
jenis media cair, yaitu PDB, medium A dan ml medium PDB. Dalam medium ini kapang
medium B. Hasil skrining awal dari 88 isolat yang LMC-19 pada hari ke-3 baik asal agar miring (no.
diuji dalam ketiga jenis media tersebut, diperoleh 2 1) maupun yang berasal asal dari serpihan batang
kapang endofit yang menghasilkan senyawa C. ledgeriana (inkubasi pada selama 65 hari, no.2)
alkaloid, yang ditunjukkan dengan adanya bercak menghasilkan bercak jingga. Rf senyawa yang
oranye pada KLT dengan penampak bercak dihasilkan sesuai dengan Rf 0,49 senyawa kinin
pereaksi Dragendorf (Gambar 2). sebagai standar. Pada KLT no. 3 kapang LMC-29
Hasil KLT ekstrak CHCl3 dari LMC-19 pada pada hari ke-7 baik yang berasal dari agar miring
agar miring yang ditumbuhkan dalam media cair maupun yang berasal dari serpihan batang C.
ditunjukkan pada Gambar 2(a) menghasilkan ledgeriana (inkubasi selama 78 hari, no. 4),
bercak warna oranye dengan jarak migrasi Rf 0,49 masing-masing memberikan bercak warna jingga
sama seperti standar kinin. Hal ini menunjukkan pada Rf 0,49 yang sesuai dengan Rf standar kinin.
bahwa kapang tersebut dapat menghasilkan kinin Hal ini menunjukkan bahwa kedua kapang tersebut
dalam media cair PDB setelah 3 hari. Demikian dalam medium PDB dapat menghasilkan kinin
juga LMC-29 asal agar miring dalam media PDB baik asal agar miring maupun yang diinkubasi
setelah 7 hari (Gambar 2b) dan dalam media B terlebih dahulu pada serpihan batang C.
setelah 2 hari (Gambar 2c), masing-masing Ledgeriana.
menghasilkan kinin (Rf 0,49) sama dengan Rf Selanjutnya pada Gambar. 3b dari no. 5 sampai
standar kinin. dengan no. 10 merupakan hasil KLT dari kapang
Pada percobaan kedua kapang endofit ini LMC-19 dan LMC-29 masing-masing
ditumbuhkan dalam erlenmeyer berisi ketiga ditumbuhkan dalam 250 mL medium B. KLT no. 5
macam media cair seperti di atas, namun dan no. 7 adalah hasil KLT pada hari ke-2 dari
erlenmeyer dibungkus dengan karbon selama kapang LMC-19 dan LMC-29 yang berasal dari
inkubasi, supaya tidak mendapat cahaya. Hasil serpihan batang C. ledgeriana (inkubasi selama 78
percobaan terhadap endofit tanpa adanya cahaya hari), senyawa alkaloid yang dihasilkan sama,
tersebut memberikan hasil negatif pada KLT yaitu kinin (Rf 0,49). Pada hari ke-3 LMC-29 yang
dengan penampak bercak yang sama. Hal ini berasal dari serpihan batang C. calisaya (inkubasi
menunjukkan bahwa produksi alkaloid oleh selama 62 hari, no. 8) juga menghasilkan kinin
kapang endofit membutuhkan cahaya. dengan Rf 0,49. Selanjutnya pada Gambar 3b KLT
Pada percobaan ketiga, inkubasi kapang no. 10 pada hari ke-6 LMC-29 (dalam medium B)
dilakukan dalam air yang mengandung serpihan dari serpih batang C. Succirubra (inkubasi selama
batang kina. Berdasarkan uji kualitatif dengan 65 hari) dapat menghasilkan senyawa alkaloid lain
KLT diperoleh hasil seperti disajikan pada Tabel 2. dengan jarak migrasi Rf 0,47 sesuai dengan standar
Terjadinya produksi alkaloid ditunjukkan adanya sinkonin.
P D B = P o ta to D e x tr o s e B r o th
B = m e d ia P h o m a
Qn = k in i n
Cn = s i n k o n in
1 = L M C -1 1
2 = L M C -2 3
3 = L M C -2 9
4 = L M N -1
. . . . . . . . . . . . . 5 = C M C -8
PDB Qn Cn 7 PDB 1 2 3 4 5 6 Qn B Qn Cn 3 6 = L C W -3
(a ) (b ) (c) 7 = L M C -1 9
Gambar 2. (a). Hasil skrining awal KLT kapang LMC-19 (PDB), dan (b). LMC-29 (PDB) dan (c). LMC-29 (B)
Tabel 2. Hasil pewarnaan (pereaksi Dragendorf) KLT ekstrak CHCl3 dari kapang dalam media uji
. . . . . . . . . . . . . . . .
PD B Qn Cn 1 2 3 4 B Qn Cn 5 6 7 8 9 10
(a ) (b )
1 = LM C -1 9 a g a r m i r in g 5 = L M C -1 9 pd s e r p ih b a ta n g C. le d g e r ia n a 7 8 h a r i
2 = LM C -1 9 p d s e r p ih b a t a n g C . le d g e r ia n a 6 5 h a r i 6 = L M C -2 9 pd s e r p ih b a ta n g C. le d g e r ia n a 6 2 h a r i
3 = LM C -2 9 a g a r m i r in g 7 = L M C -2 9 pd s e r p ih b a ta n g C. le d g e r ia n a 7 8 h a r i
4 = LM C -2 9 p d s e r p ih b a t a n g C . le d g e r ia n a 7 8 h a r i 8 = L M C -2 9 pd s e r p ih b a ta n g C. c a l is a y a 6 2 h a r i
9 = L M C -2 9 pd s e r p ih b a ta n g C. s u c c iru b r a 3 5 h a ri
10 = L M C -2 9 pd s e r p ih b a ta n g C. s u c c iru b r a 6 5 h a ri
Gambar 3. (a) LMC-19 dan LMC-29 media PDB, (b) LMC-19 dan LMC-29 dalam B
Hasil uji kualitatif KLT produksi kapang yang LMC-19 dalam media PDB setelah 8 hari. Waktu
dinduksi pada media air yang mengandung retensi senyawa yang dihasilkan 12,00 menit
masing-masing serpih batang C. Ledgeriana, sesuai dengan waktu retensi standar kinin (Gambar
C.succirubra, dan C. calisaya cukup menjanjikan 4b). Spektrum kinin ditunjukkan pada insert
untuk produksi alkaloid oleh kapang endofitik. sebelah kanan Gambar 4b.
Sementara kapang yang dikultivasi pada agar Kromatogram pada Gambar 5a menunjukkan
miring dengan berjalannya waktu penyimpanan bahwa kapang LMC 29 dapat memproduksi
dan berganti ke generasi selanjutnya, produksi alkaloid dalam media PDB setelah 2 hari dengan
alkaloid makin berkurang dan akhirnya tidak waktu retensi 12,99 menit dengan konsentrasi yang
memproduksi alkaloid lagi. tinggi. Setelah diencerkan (Gambar 5b) waktu
Analisis Kuantitatif Kinin dengan KCKT. retensinya alkaloid tersebut sesuai dengan waktu
Kromatogram hasil KCKT ekstrak CHCl3 dari retensi standar kinin (12,28 menit, Gambar 5c).
LMC-19 (medium PDB) dan LMC-29 (media PDB Berdasarkan pola spektrum uv, senyawa tersebut
dan B) ditunjukkan pada Gambar 4, 5 dan 6. Pada identik dengan spektrum kinin (insert pada
Gambar 4a terlihat kromatogram KCKT kapang Gambar 5c).
63
Ermin K Winarno
Gambar 4. Kromatogram hasil KCKT ekstrak CHCl3 dari LMC-19 (dari serpihan batang C. ledgeriana) dalam
media PDB (a), kromatogram dan spektrum standar kinin 0,1 mg/L (b). Eluen KH2PO4 20 mM pH 2,50 : CH3CN =
9 : 1, dan kecepatan alir 1 mL/menit dan = 210 nm.
Serapan (AU)
W a k tu (m e n it)
Serapan (AU)
S p e k tru m k in in
P a n ja n g g e lo m b a n g (n m )
Gambar 5. Kromatogram hasil KCKT ekstrak CHCl3 dari LMC-29 (dari serpihan batang C. ledgeriana) dalam
media B (a), kromatogram dan spektrum standar kinin 0,1 mg/L (b). Eluen KH2PO4 20 mM pH 2,50 : CH3CN = 9 :
1, dan kecepatan alir 1 mL/menit dan = 210 nm.
Kapang LMC-29 juga dapat memproduksi Pada penelitian lanjut terhadap LMC-19 dan
senyawa alkaloid lain, yaitu sinkonin dalam LMC-29, menunjukkan bahwa kedua kapang
medium B setelah 6 hari (Gambar 6a). Waktu tersebut menghasilkan kinin masing-masing dalam
retensi senyawa tersebut 9,47 menit sesuai dengan media B dan PDB ditunjukkan pada Gambar 7.
waktu retensi senyawa standar sinkonin 9,48 menit. Kapang LMC-19 dapat menghasilkan kinin
Berdasarkan pola spektrum uv, senyawa tersebut maksimal pada hari ke-6 sebesar 0,117 mg/L
identik dengan spektrum sinkinin (insert pada dalam medium B, sedangkan LMC-29
Gambar 6b). menghasilkan kinin sebesar 0,610 mg/L pada hari
ke-7 dalam medium PDB.
Serapan (AU)
9.47
Waktu (menit)
Sinkonin
Spektrum
9.48
standar
Sinkonin
Gambar 6. Kromatogram hasil KCKT ekstrak CHCl3 dari LMC-29 (dari serpihan batang C. succirubra) dalam
media B (a), kromatogram dan spektrum standar sinkonin 0,046 mg/L (b). Eluen KH2PO4 20 mM pH 2,50 : CH3CN
= 9 : 1, dan kecepatan alir 1 mL/menit dan = 210 nm.
65
Ermin K Winarno
1.2
Kesimpulan
1.0
Berdasarkan hasil pemurnian mikroba endofit
Medium B dari batang kina Cinchona ledgeriana Moens
[Kinin] mg/L
0 .4
Penghargaan. Penulis menyampaikan terima
kasih sebesar-besarnya kepada Prof. Dr. H.
Shibuya yang telah memberikan bimbingan dan
0 .3
le d g /7 8
c a li/7 8
s u c c /3 5
kesempatan kepada penulis untuk melakukan
s u c c /6 5 penelitian ini dalam rangka Training “Search for
[Sinkonin] mg/L
0 .2
Bioactive Substances from Tropical Medicinal
Plants” di Laboratorium Kimia Bahan Alam,
Fakultas Farmasi dan Ilmu Kefarmasian di
0 .1
Universitas Fukuyama, Hiroshima, Jepang
Pustaka
0 .0
1 2 3 4 5 6 7 1. Stierle, A.; Stierle, D.; Strobell, G.; Bignami, G.;
H a ri k e -
Grothaus, P. Endophytic fungi of Pacific yew (Taxus
Gambar 10. Produksi sinkonin oleh kapang LMC-29 brevifolia) as a source of Tacol, Taxanes, and other
yang lebih dulu diinkubasi pada serpihan batang kina C. pharmacophores in Bioregulators for Crop
calisaya, C. succirubra dan C. ledgeriana dalam media Protection and Pest control. American Chemical
B. Society, 1994, 64-77.
2. Li, J.; Strobel, G.; Sidhu, R.; Hess, W.M.; Ford, E.J.
Pada Gambar 9 ditunjukkan produksi kinin oleh Endophytic taxol-producing fungi from bald cypress,
kapang LMC-19 paling tinggi dalam medium PDB, Taxodium distichum. Microbiology,1996, 142, 2223-
yaitu sebesar 0.978 mg/L pada hari ke-8. Dalam 2226.
media B, LMC-19 dapat juga memproduksi kinin 3. Wijnsma, R.; Verpoorte,R. Quinoline alkaloids of
dan mencapai maksimum pada hari ke-5, sebesar Cinchona, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of
0,105 mg/L. Kapang LMC-29 yang diinkubasi Plants, 1988, 5, 335-355.
pada serpihan kina C. ledgeriana selama 78 hari 4. Smit, E. Analysis of Cinchona alkaloids by high-
dan ditumbuhkan dalam media cair B dapat performance liquid chromatography. Application to
the analysis of quinidine gluconate and quinidine
menghasilkan sinkonin setelah 1 sampai 7 hari, dan
sulphate and their dosage forms. J. Chromatography,
mencapai maksimum pada hari ke-3 yaitu sebesar 1984, 299, 233-244.
0,312 mg/L (Gambar 10). Inkubasi pada serpihan 5. Scragg, A.H.; Allan, E.J. The potential of plant cell
batang kina C. calisaya selama 78 hari dan culture for the production of quinine. Acta Leidensia,
ditumbuhkan dalam media cair B, LMC-29 dapat 1987, 55, 45-51.
menghasilkan sinkonin setelah hari pertama 6. Chatterjee, S.K.; Vegetative propagation of high
sampai 7 hari, mencapai maksimum pada hari ke-3 quinine yielding Cinchona. Indian J. Hortic, 31,
yaitu sebesar 0,225 mg/L. Sedangkan pada 174-177.
serpihan batang C. succirubra selama 35 hari, 7. Stowe, B.B.; Yamaki, T. Ann. Rev. Plant. Physiol.
dalam media cair B setelah hari ke-2 produksi 1957, 8, 181.
8. Yang, X.; Strobel, G.; Stierle, A.; Hess, W.M.; Lee,
mencapai maksimum yaitu sebesar 0,227 mg/L,
J.; Clardy, J. A fungal endophyte-tree relationship:
sedangkan inkubasi selama 65 hari produksi Phoma sp. in Taxus wallachiana. Plant Science,
sinkonin mencapai maksimum pada hari ke-2 1994, 102, 1-9.
sebesar 0,160 mg/L.