TÉCNICAS BÁSICAS PARA

QUANTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS
Alecia Daila Barros Guimarães
Camila Ribeiro Rocha
Larissa Lorrane Rodrigues Borges

Profa Roberta Torres Careli

Prof Eduardo Robson Duarte

Montes Claros/2018
Neste curso será abordado os
principais tipos de técnicas
básicas e procedimentos para
contagem e enumeração de
microrganismos.
Parte Teórica
 Principais técnicas de contagem;
 Aplicações;
 Procedimentos de análises.

Parte Prática
 Realização das técnicas;
 Interpretação de resultados.
Introdução
 As análises microbiológicas  tem como objetivo a
detecção ou a enumeração de microrganismos
viáveis presentes em uma determinada amostra;

 O controle durante o processo analítico, visa à

garantia da confiabilidade do resultado final,
assegurando a sua repetibilidade, precisão, e
exatidão dos procedimentos e nas técnicas e regras
de contagens de microrganismos.
Tipos de ensaios microbiológicos
 Em função da multiplicidade de grupos, gêneros e
espécies que podem estar presentes, um grande número
de ensaios são utilizados:

 Ensaios qualitativos  verificam a presença ou

ausência do(s) microrganismo(s) alvo em uma dada
quantidade da amostra, sem quantificar;

 Ensaios quantitativos  determinam a quantidade

do(s) microrganismo(s) alvo na amostra, geralmente por
unidade de massa ou volume.
Técnicas de detecção
 Cada um desses ensaios segue procedimentos
diferenciados, que dependem do(s) microrganismo(s)
alvo (como por exemplo o tempo e temperatura de
incubação, o meio de cultura);

 Os tipos de técnicas detecção de microrganismos

são:
 Presença/ausência;
 Contagem do número mais provável;
 Contagem padrão em placas.
Contagem em placas
 Contagem padrão em placas  Método mais
comum de contagem de MOS;

 O procedimento básico é a inoculação da amostra

homogeneizada (e suas diluições) em um meio
sólido (ágar), contido em placas de Petri, seguida da
incubação até crescimento visível.

O resultado é expresso como UFC (Unidade

Formadora de Colônia) por unidade (peso, volume,
área etc).
Contagem em placas
 Princípio envolvido na contagem:
 Quando fixada em um meio de cultura sólido
adequado, cada célula microbiana presente na amostra irá
formar uma colônia isolada;

 Variando-se o tipo de meio de cultura (meio de

enriquecimento, meio seletivo, meio diferencial) e as
condições de incubação (temperatura e oxigênio), é
possível selecionar o grupo, gênero ou espécie que se
deseja contar.
Contagem em placas
 Quantificação de grandes grupos microbianos:
Ex.: Aeróbios mesófilos;
Aeróbios psicrotróficos;
Fungos filamentosas e leveduras;
Clostrídios sulfito redutores;
Enterococos;
Bactérias láticas.

 Quantificação de gêneros ou única espécie:

Ex.: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Clostridium
perfringens.
 Contagem em placas

Mesófilos Aeróbios em PCA Escherichia coli em Ágar MacConkey

Fonte:http://stvaranjewptemaodnule.info Fonte: Rocha, 2015
Principais etapas envolvidas na contagem
em placas

 Preparo e diluição da amostra;

 Inoculação e plaqueamento das diluições;
 Incubação das placas em condições ótimas
apropriadas;
 Seleção das placas com colônias desenvolvidas;
 Contagem das colônias;
 Cálculo e expressão dos resultados obtidos.
Tipos de plaqueamento

1) Plaqueamento em Profundidade (Pour Plate);

2) Plaqueamento em Superfície (Spread Plate);

3) Plaqueamento em microgotas (Drop Plate);

4) Filtração em membrana.
1) Plaqueamento em profundidade

 Alíquotas das amostras e/ou diluições são

inoculadas em placas de Petri estéril, com adição do
meio de cultura e posterior homogeneização;

 Limite de detecção  10 UFC/g (produtos sólidos

ou líquidos diluídos) ou 1 UFC/mL (produtos líquidos
pipetados diretamente);
1) Plaqueamento em profundidade

 Principais aplicações  ensaios de contagem de

mesófilos, psicrotróficos, contagem de clostrídios
sulfito redutores, contagem de enterobactérias,
contagem de enterococos e contagem de bactérias
lácticas;

 Limitações  necessidade de fusão do meio de

cultura autoclavado antes do uso.
1) Plaqueamento em profundidade
 Procedimento de análise:

 Preparo das diluições da amostra;

 Inocular de 1 mL de cada diluição em placa de Petri
vazia e estéril (duplicata);
 Acrescentar sobre as diluições o meio de cultura
fundido e resfriado, mantido a temperatura 44-46 °C;
 Homogeneizar com movimentos suaves em forma
de “8” sobre a bancada;
 Após solidificação, as placas são incubadas na
temperatura ótima de crescimento microbiano.
 1) Plaqueamento em profundidade

Incubação em
temperatura controlada
2) Plaqueamento em superfície
 A amostra e/ou suas diluições são inoculadas
diretamente na superfície do meio sólido nas placas;

 Não expõe os microrganismos ao calor do meio fundido;

 Permite a visualização de características morfológicas e
diferenciais de colônias;
 Permite a utilização de meios que não podem ser
fundidos depois de prontos;
 Não exige que os meios sejam translúcidos.

O volume inoculado é limitado à capacidade de

absorção pelo meio de cultura.
2) Plaqueamento em superfície

 Limite de detecção  100 UFC/g (produtos

sólidos) ou 10 UFC/mL (produtos líquidos).

 Principais aplicações  ensaios de contagem

total de aeróbios mesófilos, psicrotróficos, contagem
de fungos filamentosos e leveduras, contagem de S.
aureus, contagem de B. cereus, entre outros.
2) Plaqueamento em superfície
 Procedimento de análise:

 Preparo das diluições da amostra;

 Inoculação de 0,1 mL (100 μL) de cada diluição para
placa de Petri já contendo meio de cultura sólido;
 Posteriormente, a alíquota é espalhada sobre o
meio com auxílio de alça espalhadora (alça de
Drigalsky) até absorção completa pelo meio;
 Após, as placas são incubadas na temperatura
ótima de crescimento microbiano.
 2) Plaqueamento em superfície

Incubação em
temperatura controlada
3) Plaqueamento em microgotas

 Técnica de inoculação em superfície;

 A principal diferença é que o inóculo não é espalhado,
mas sim, depositado no meio de cultura em gotas;
 Como as gotas ocupam um espaço mínimo, é
possível inocular numa mesma placa três gotas por
diluição;
 Economia de meio de cultura, tempo e espaço;
3) Plaqueamento em microgotas
 Micropipeta calibrada  volume de inoculação é
muito pequeno!

 Limite de detecção  1000 UFC/g (produtos sólidos)

ou 100 UFC/mL (produtos líquidos);

 Principais aplicações:
 Técnica muito útil quando se exige a inoculação de
grande número de diluições;
3) Plaqueamento em microgotas
 Procedimento de análise:

 Preparo das diluições da amostra;

´Divisão da placa de Petri em 3 setores (1 por diluição);
 Alíquota de 0,020 mL (20 μL), em gotas, de cada diluição
é transferida para superfície meio de cultura  três gotas
por diluição;
 A placa é deixada em repouso sobre uma superfície
plana até absorção da alíquota pelo meio;
 As placas são incubadas na temperatura ótima de
crescimento microbiano.
3) Plaqueamento em gotas

20 μL

Incubação em
temperatura controlada

>70 >70 39 5 0 0
3) Plaqueamento em gotas

Bacillus cereus em PCA pela técnica de plaqueamento em microgotas.

Fonte: Silva, 2018.
4) Filtração em Membrana
 Análise de amostras líquidas límpidas, sem sólidos em
suspensão;

 Permite a inoculação de maiores volumes da amostra,

concentrando na membrana os microrganismos presentes;
 Indicado para amostras com contagens abaixo do limite de
detecção dos outros procedimentos;

 Limite de detecção  1 UFC/volume inoculado;

 Principais aplicações  contagem total de aeróbios

mesófilos, contagem de bactérias láticas, contagem de
enterococos e contagem de coliformes/Escherichia coli em
água, refrigerantes, outros produtos líquidos.
 4) Filtração em Membrana

Copo
Garra

Funil

Kitasato
Conecta a
mangueira da
bomba à vácuo
Membrana quadriculada 0,45 μm
4) Filtração em Membrana
 Procedimento de análise:

 Conjunto de filtração esterilizado  porta filtro, kitasato e

copo de filtração;
 Ajusta-se a membrana quadriculada estéril 0,45 μm ao
suporte de filtração;
 Com auxílio de uma bomba a vácuo, a amostra é filtrada;
 Após a filtração, a membrana é retirada assepticamente
do suporte e disposta em placas de Petri contendo meio
de cultura;
 As placas são incubadas na temperatura ótima de
crescimento microbiano.
4) Filtração em Membrana

Fonte: Alves, 2013

4) Filtração em Membrana

Contagem de coliformes pelo método de filtração em membrana

Fonte: http://cavadolab.com/?mod=galeria&id=11
Contagem e interpretação dos resultados
 Profundidade e Superfície  número de colônias entre
25 e 250;
 Fungos filamentosos e leveduras  15 a 150 colônias
 S. aureus e Clostrídios Sulfito redutores  20 a 200 colônias

 Microgotas  entre 10 e 70 colônias por gota;

 Duplicata ou triplicata  Considerar como número de
colônias a média aritmética da contagem obtida;
 Fórmula:

UFC/g ou mL = n° colônias x 1/diluição

alíquota plaqueada
Número Mais Provável (NMP)

 Teste de tubos múltiplos

 Permite calcular o número mais provável (NMP) do(s)
microrganismo(s) viáveis na amostra, utilizando tabelas de
probabilidade;
 Estima a densidade de MOS presentes na amostra
baseado na frequência de resultados positivos;
 Não permite a contagem de células viáveis por UFC, os
resultados são expressos em NMP/g ou mL;

 Principais aplicações  Contagem de coliformes e

Escherichia coli em água e alimentos.
Número Mais Provável (NMP)

 É recomendada quando:
 No alimento em análise é esperado baixo número do
microrganismo alvo;
 Devido ao processo tecnológico sofrido pelo alimento, as
células presentes estejam lesadas fisiologicamente
(células estressadas).

 Limite de detecção  < 3,0 NMP/g ou mL.

Análise de coliformes pelo NMP
 Método constituído por duas etapas:

 Teste Presuntivo
• Caldo LST (Caldo Lauril Sulfato Triptose)  Meio de
enriquecimento para MOS fermentadores de lactose 
produção de CO2  coliformes;

 Teste Confirmativo
• Caldo VB (Caldo Verde Brilhante)  meio que mimetiza as
condições intestinais  coliformes a 35 °C;
• Caldo EC (Caldo E. coli)  meio seletivo para o crescimento de
bactérias fermentadoras de lactose que sobrevivem a 44,5 °C.
Análise de coliformes pelo NMP
 Teste presuntivo

 Selecionar três diluições decimais sequenciais da

amostra;
 Inocular uma série de 3 tubos de Caldo LST por diluição,
adicionando 1 mL da diluição por tubo com 10 mL de LST
com tubo de Durhan invertido;
 Incubar os tubos a 35 °C/24 a 48h  produção de gás 
CO2 nos tubos de Durhan (tubos positivos);
 Em caso de tubos positivos, seguir para a etapa
confirmatória.
Análise de coliformes pelo NMP
 Teste confirmativo
 Coliformes a 35 °C
 A partir dos tubos de LST positivos  transferir uma alçada
de cada cultura para tubos com Caldo VB (com tubo de
Durhan invertido);
 Incubar a 35 °C/ 24 a 48 h  produção de gás.

 Coliformes coliformes a 45 °C (termotolerantes)

 A partir dos tubos de LST positivos  transferir uma alçada de
cada cultura para tubos com Caldo EC (com tubo de Durhan
invertido);
 Incubar a 45 °C/ 24 a 48 h  produção de gás.
 Caldo VB. O último tubo está
Tubos LST positivos:
positivo (aprisionamento de CO2).
presença de CO2
Presença de coliformes a 35 °C.

Fonte: http://bioneogenios.blogspot.com/2013/05/tecnica-dos-tubos-multiplos.html
 Número Mais Provável (NMP)
 Interpretação dos resultados  Tabela estatística do NMP
Dúvidas ???
Vamos para a Parte
Prática!