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CLASE 4
19 marzo 2018
Contenidos
POLICLONAL MONOCLONAL
Anticuerpos policlonales
Poli: prefijo de varios.
•Suero completo
•Fracción de Ig (contiene ac. específico
contra Ag inoculado, ac. naturales y
cantidad residual de proteínas séricas)
•Fracción de Ig purificada
•Ac. conjugados con moléculas
marcadoras
Se deben esperar 3 semanas.
Por que?
Qué se extrae del animal?
1.
Línea Balb/c
Dependiendo de vía uso o no de adjuvante
3 semanas
bazo
• Cromatografía de afinidad
• Western Blot
• Inmunohistoquímica
• Electroforesis
Entonces…
Ahora??
que viene??
PROPAGACIÓN DEL HIBRIDOMA
1. CULTIVO CELULAR
2. TUMOR ASCÍTICO EN RATÓN
3. BIOREACTOR
Propagación del hibridoma
• Especificidad - inmunógeno
• Clon (monoclonales)
• Forma de obtención y purificación
• Concentración de proteínas totales
• Concentración de inmunoglobulinas
• Aplicaciones indicadas
Información de la hoja de especificaciones del
anticuerpo
• Pre-tratamiento si corresponde
• Establecer dilución óptima a partir de
sugerencias en hoja de especificaciones
• Condiciones de incubación
Dilución óptima de un anticuerpo
Dilución Tinción Tinción
específica inespecífica
1:40 +++ +++
1:80* +++ +
1:160* ++ --
1:320 + --
Condiciones de incubación de un anticuerpo
nuevo
• Temperatura de incubación:
4°C ; TA (20°C) ; 37°C
• Tiempo de incubación:
Toda la noche; 60 min ; 15 min
Presentación de los anticuerpos
• Calor
• Luz
• Ciclos de congelación y descongelación
• Contaminación (química, bacteriana etc.)
• Degradación de las proteínas
• Desecación
Diluyentes de anticuerpos
ESPECIFICIDAD SENSIBILIDAD
Sistemas de detección
inmunoenzimáticos
IHQ Método Directo e Indirecto
¿Cómo se demuestra la reacción
Ag-Ac mediante una enzima?
• La enzima está activa
• Va conjugada al componente del penúltimo
paso de la inmunotinción
• La actividad de la enzima se revela mediante
un sustrato y un cromógeno
Enzima + Sustrato (Enzima – Sustrato)
HRP
H2O2 H2O
CROMÓGENO CROMÓGENO
REDUCIDO OXIDADO
INCOLORO COLOREADO
DADOR DE INSOLUBLE
ELECTRONES
SUSTRATOS CROMÓGENOS
DE PEROXIDASA
DAB INCOLORO
HRP H2O2
Solución
tejido solución Dador de e
HRP
DAB OXIDADO AGUA
1 ml
MUY IMPORTANTE
HIPOCLORITO
DE SODIO
Peroxidasa
Tejidos problemáticos:
Células mieloides: mieloperoxidasa
Eritrocitos: seudoperoxidasa
Bloqueo:
H2O2 3% acuoso o en metanol absoluto
Cromógenos para la HRP
ACTH
CK
EGFP
CRO
HRP
Ventajas Desventajas
• Gran estabilidad • La actividad peroxidasa
• Fácil de conjugar con otras esta presente en
moléculas (Ig, AV, etc.) muchas células.
• Facilidad para detectarla
• Requiere bloqueo de la
por métodos colorimétricos
peroxidasa endógena
• Rapidez de la reacción
• Posee variados sustratos • Su actividad se
• Preparaciones permanentes mantiene después de la
• Gran utilidad en la IHQ
fijación
ultraestructural
Fosfatasa alcalina
• Enzima hidrolítica, que cataliza la hidrólisis de
ésteres de ácido fosfórico.
• PM de 100 Kd
• Actúa a un pH óptimo de 8
• La FA intestinal de origen bovino es la más
comúnmente usada.
• El principal sustrato de la FA es la sal de sodio
monobásica α-naftil fosfato.
Fosfatasa alcalina
Sustratos Cromógenos (sal de diazonio)
Fast Blue RR (soluble)
• α-naftol
Fast Red (soluble)
• Naftol AS-MX (su
acoplamiento con la sal de New Fuchsin (insoluble)
diazonio es más lento)
• bromocloroindolil fosfato NBT (nitro blue
(BCIP) tetrazolium)insoluble
INT (iodonitrotetrazolium
Violeta)
Fosfatasa alcalina
Tejidos problemáticos:
Hueso
Riñón
Hígado
Es más abundante en tejidos frescos
Bloqueo:
Levamisol 1 a 5 mM
Bloqueo de fosfatasa alcalina intestinal:
solución de ácido débil
HMB45-fast red
CD10-NBT
Enzimas y cromógenos como
marcadores en IHQ
Enzima Cromógeno Color Solubilidad
en etanol
• Método indirecto
• Emplea un complejo inmune de
anticuerpos anti-HRP, el cual se
une al sitio de reacción a través
de un anticuerpo puente
Ac secundario
Ac primario
Antígeno
PAP
(Peroxidasa anti-peroxidasa)
3.-Solución Sustrato - Cromógeno
4.-Complejo Anticuerpo
Antiperoxidasa – HRP de conejo
ANTI Fc DE CONEJO
En ratón, perro, caballo… 3.- Anticuerpo 2° de ratón
Anti - conejo PUENTE
4.-Conjugado Anticuerpo
Antifosfatasa Alcalina - AP
3.- Anticuerpo 2°
• Hsu 1981
• Método indirecto
• Emplea la afinidad
natural entre AVIDINA y
BIOTINA, para unir los
marcadores al sitio de
reacción Ag-Ac
• Alta sensibilidad
Complejo avidina-biotina
Técnica que emplea la afinidad
natural entre la biotina y la avidina
AVIDINA ESTREPTAVIDINA
Punto isoeléctrico 10 Punto isoeléctrico 7
Glicoproteína Proteína. No contiene
El conjugado es menos carbohidratos
estable El conjugado es de alta
Fuente: clara del huevo estabilidad
Fuente: Streptomyces
avidinii
LAB (Labelled Avidin Biotin)
LSAB (Labelled Streptavidin Biotin,
ABC con strepto-avidina)
Ensyme-conjugated
Streptavidin
Biotinylated
Secondary Antibody
Primary Antibody
4.-Enzyme-conjugated
Avidin-Biotin Complex
3.-Biotinylated
Secondary Antibody
2.-Primary Antibody
Tejidos problemáticos:
Riñón
Hígado
• Desarrollado en 1995,
mejorado en 1999
• Más de 20 moléculas de
anticuerpos secundarios
mono o poliespecíficos
• Más de 100 moléculas
de enzima activa.
• Sistema libre de biotina
POLÍMERO MONOVALENTE
POLÍMERO UNIVERSAL
Enzima
Dextran (polimero)
Ac secundario
Ac primario
Antígeno
Ventajas del sistema polímero marcado
• Alta sensibilidad y especificidad
• Reduce el número de pasos
• Sistema libre de biotina
• Compatible con sistemas manuales y
automatizados
• Se puede aplicar en biopsias intraoperatorias
• Anticuerpos primarios pueden diluirse más.
Sensibilidad
La sensibilidad hace referencia a la cantidad
mínima de antígeno que una técnica
inmunohistoquímica es capaz de detectar.
Una técnica con alta sensibilidad es capaz de
detectar cantidades muy pequeñas de antígeno.
En los últimos años la sensibilidad se ha
aumentado más de 100 veces respecto a los
métodos tradicionales.
MONTAJE DE UN LABORATORIO
IHQ
Laboratorio de patología básico
• Procesador de tejidos
• Micrótomo
• Baño histológico
• Estufa de secado
• Baterías de tinción
• Insumos
• Reactivos básicos
Laboratorio de patología básico
USO EXCLUSIVO
REACTIVOS
INMUNOHISTOQUÍMICA
HORNO DE INCUBACIÓN
Uso exclusivo para IHQ
Temperatura constante de
37° C +- 0,1° C
NO CALENTAR
PARAFINA
NO SECAR MATERIAL
• HORNO DE MICROONDAS
• VAPORERA
• OLLA A PRESIÓN
• BAÑOS DE AGUA
ACCESORIOS
• Cámaras húmedas
• Bombas de aspiración
• Micropipetas / puntas
– 0,5 – 10 ul
– 10 - 100 ul
– 100 – 1000 ul
• Baterías de hidratación y deshidratación de
uso exclusivo para IHQ
ACCESORIOS
• Portaobjetos pretratados
• Piscetas
• Recipientes para técnicas de recuperación
• VIALES DE DILUCIÓN Y ALICUOTADO tubos
tipo eppendorf de 0,5 a 1,5 ul
• Lápiz hidrófobo
REACTIVOS
• Anticuerpos primarios
• Sistemas de detección
• Soluciones cromógenas
• Reactivos de bloqueo
• Buffer de lavado
• Buffer de dilución
• Soluciones de recuperación de inmunoreactividad
• Contratinciones
ANTICUERPOS PRIMARIOS
• Especificidad
• Clon
• Concentrado / pre diluido
• Dilución de uso
• Volumen
• Pre-tratamientos
¿Qué necesito
• Aplicación diagnosticar?
• Bibliografía
• Etc.
SISTEMAS DE DETECCIÓN
• MÉTODO
– COMPLEJO AVIDINA BIOTINA
– POLÍMERO MARCADO
– TSA
– INDIRECTO SIMPLE
– FLUORESCENCIA
• CONCENTRADO / KIT
• Nº DE DETERMINACIONES (50 - 150 - 1000)
• CROMÓGENO / ENZIMA
ENZIMAS Y CROMÓGENOS
Enzima Cromógeno Color Solubilidad en
alcohol
DAB Marrón No
AEC Rojo Si
BCIP Azul No
Fosfatasa
alcalina BCIP/NBT Púrpura No
New Fucsina Fucsia No
CONTRATINCIÓN
HEMATOXILINA DE MAYER
VERDE METILO
NUCLEAR FAST RED
¡CONOCIMIENTO!
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