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ANALISIS TISULAR III

CLASE 4
19 marzo 2018
Contenidos

• Anticuerpos mono y policlonales


• Concepto de especificidad y sensibilidad
• Sistemas de detección inmunoenzimáticos
Soluciones de anticuerpos usados en IHQ

POLICLONAL MONOCLONAL
Anticuerpos policlonales
Poli: prefijo de varios.

Poli clonales: varios clones


Los anticuerpos policlonales, se obtienen por
extracción del suero de un animal previamente
inmunizado con el antígeno que se quiere
estudiar.
Anticuerpos policlonales
Generación: el antígeno (purificado) se inyecta
al animal, en cual produce Ig contra diferentes
epitopos del mismo. El suero contiene una
mezcla de Ig con diferentes especificidades,
sintetizadas por
diferentes clones
de células plasmáticas
(de ahí, policlonal).
Anticuerpos policlonales: fuentes
Soluciones de anticuerpos policlonales

•Suero completo
•Fracción de Ig (contiene ac. específico
contra Ag inoculado, ac. naturales y
cantidad residual de proteínas séricas)
•Fracción de Ig purificada
•Ac. conjugados con moléculas
marcadoras
Se deben esperar 3 semanas.
Por que?
Qué se extrae del animal?
1.
Línea Balb/c
Dependiendo de vía uso o no de adjuvante
3 semanas
bazo

Mieloma no productor de la misma especie animal.


Fusión celular:
Polietilenglicol (PEG) (disminuye las fuerzas eléctricas de repulsión entre células determinadas por la presencia de ácido
siálico en las membranas celulares.)
La fusión espontánea???
Los hibridomas se cultivan en un medio selectivo que contiene hipoxantina, aminopterina
y timidina (HAT) ya que en la suspensión celular posterior a la fusión encontraremos también
células de mieloma sin fusionar o fusiones de mielomamieloma, así como también linfocitos
no fusionados.
Estos últimos no ocasionan problema ya que mueren espontáneamente a los pocos días.
Selección de una clona.
Esto se logra mediante el método de dilución terminal basado en diluir las células suspendidas
hasta una concentración de 0,5 a 2 células por pocillo.
Hibridoma

• Línea celular híbrida obtenida mediante la


fusión de un linfocito B productor de
anticuerpos específico, con una línea celular
de mieloma (de la misma especie).
cultivo con “restricciones”

Sembrar hibridoma en placa de


cultivo, cada célula forma una
colonia o clona independiente que
produce Ig específicas para cada
uno de los epitopos del Ag inoculado
cada clona se aisla, se cultiva
separadamente y se selecciona
aquella que produce el Ab de interés
SCREENING Y SELECCIÓN DE HIBRIDOMAS

• Cromatografía de afinidad
• Western Blot
• Inmunohistoquímica
• Electroforesis
Entonces…

Tengo seleccionado que clon produce lo que


busco…

Ahora??
que viene??
PROPAGACIÓN DEL HIBRIDOMA

1. CULTIVO CELULAR
2. TUMOR ASCÍTICO EN RATÓN
3. BIOREACTOR
Propagación del hibridoma

• Cultivo: se utiliza el sobrenadante del medio de cultivo.


Poseen menor concentración de Ac que los provenientes de
liquido ascítico; pero presentan menos tinción inespecífica en
IHQ debido a su pureza.

MENOR CONCENTRACIÓNDE ANTICUERPOS

MENOR CONCENTRACIÓN DE CONTAMINANTES


Propagación del hibridoma
• Tumor ascítico: se inocula el hibridoma en la
cavidad peritoneal de un ratón para producir un
tumor ascítico. En líquido peritoneal se encontrarán
altas concentraciones de anticuerpos.

MAYOR CONCENTRACIÓN DE ANTICUERPOS

MAYOR CONCENTRACIÓN DE CONTAMINANTES


Biorreactor: sistema de
Ambiente biologicamente
Activo, en este caso
empleado para crecer
células. Mantención
controlada de pH,
temperatura,
Oxígeno, nutrientes, etc.
Soluciones de Ac. Monoclonales:

Sobrenadante de medios de cultivo


Sobrenadante de medios de cultivo
concentrado
Líquido ascítico de ratón
Líquido ascítico de ratón purificado
Biorreactor
Comparación
Anticuerpos policlonales Anticuerpos monoclonales

• Mayor costo de producción


• Menor costo de producción
• Mayor requerimiento de tecnología
• Menor requerimiento de
• Mayor tiempo de producción
tecnología en producción
• Puede producir altas cantidades de
• Producción de mayores anticuerpos específicos
cantidades de anticuerpo
• Mayor especificidad
• Reconocimiento de múltiples • Reconocen sólo un determinante
determinantes antigénicos de un antigénico de un antígeno
solo antígeno
• Una vez que un hibridoma se genera; es
• Puede presentarse variación una fuente constante y renovable.
entre diferentes lotes Todos los lotes serán idénticos
(producidos por una clona de LB)
Sustancias adicionales presentes en las
soluciones de anticuerpo
MONOCLONALES POLICLONALES
• Elementos séricos en • Elementos séricos
líquido ascítico • Buffer
• Medio de cultivo + • Azida de sodio 15mM
Suero Fetal Bov.
• Buffer
• Azida de sodio 15mM
Información de la hoja de especificaciones del
anticuerpo

• Especificidad - inmunógeno
• Clon (monoclonales)
• Forma de obtención y purificación
• Concentración de proteínas totales
• Concentración de inmunoglobulinas
• Aplicaciones indicadas
Información de la hoja de especificaciones del
anticuerpo

• Forma de uso (dilución recomendada, pre-


tratamiento, etc.)
• Fecha de expiración y/o lote
• Presentación
• Condiciones de almacenamiento
• Referencias bibliográficas
Estandarización de técnica IHQ con un
anticuerpo nuevo

• Pre-tratamiento si corresponde
• Establecer dilución óptima a partir de
sugerencias en hoja de especificaciones
• Condiciones de incubación
Dilución óptima de un anticuerpo
Dilución Tinción Tinción
específica inespecífica
1:40 +++ +++

1:80* +++ +

1:160* ++ --

1:320 + --
Condiciones de incubación de un anticuerpo
nuevo

• Temperatura de incubación:
4°C ; TA (20°C) ; 37°C

• Tiempo de incubación:
Toda la noche; 60 min ; 15 min
Presentación de los anticuerpos

• Conjugados o sin conjugar


• Concentrados o pre diluidos
• Líquidos
• Liofilizados
• Solos o como parte de un kit
• Volumen variable
Cuidados de los anticuerpos

• Transporte y cadena de frío


• Recepción
• Registro
• Almacenamiento
Factores que pueden alterar la reactividad

• Calor
• Luz
• Ciclos de congelación y descongelación
• Contaminación (química, bacteriana etc.)
• Degradación de las proteínas
• Desecación
Diluyentes de anticuerpos

• Reconstitución de anticuerpos liofilizados:


Agua bi-destilada estéril

• Dilución de anticuerpos antes de usar:


PBS o TBS
PBS o TBS + BSA 1%
PBS o TBS + BSA 1% + Detergente
Registro de información
Mantener un registro de:

• Anticuerpo. Clon. Lote.


• Concentrado –Pre diluido.
• Validación.
• Fecha llegada y vencimiento.
• Factura.
• Costo
ANTICUERPOS SISTEMAS DE
PRIMARIOS DETECCIÓN

ESPECIFICIDAD SENSIBILIDAD
Sistemas de detección
inmunoenzimáticos
IHQ Método Directo e Indirecto
¿Cómo se demuestra la reacción
Ag-Ac mediante una enzima?
• La enzima está activa
• Va conjugada al componente del penúltimo
paso de la inmunotinción
• La actividad de la enzima se revela mediante
un sustrato y un cromógeno
Enzima + Sustrato (Enzima – Sustrato)

(Enzima – Sustrato)+ Cromógeno

Enzima + Producto + molécula coloreada e insoluble


Requisitos para que una enzima se emplee como
marcador en inmunohistoquímica

1. Que este disponible en forma altamente


purificada
2. La conjugación no disminuya su actividad
3. Cuando esté conjugada debe ser estable en
solución
4. “Económica”
… continuación

5. La actividad endógena interfiera lo menos


posible en la coloración de la técnica.
6. Que los productos de reacción coloreados sean
fácilmente detectables y estables.
Enzimas utilizadas
 Peroxidasa de rábano picante, HRP
(Horse Radish Peroxidase)
 Fosfatasa alcalina intestinal (AP)
 Beta galactosidasa de Escherichia coli
 Glucosa oxidasa de Aspergillus niger
Peroxidasa
(HRP, horse radish peroxidase)

• Enzima obtenida de la raíz de rábano picante


• Glicoproteína de 40 KD
• Es una oxidoreductasa, que cataliza
reacciones bisustrato de carácter redox.
• La cantidad de HRP presente influencia
directamente la cantidad de producto
coloreado formado.
Reacción de la HRP

HRP
H2O2 H2O

CROMÓGENO CROMÓGENO
REDUCIDO OXIDADO
INCOLORO COLOREADO
DADOR DE INSOLUBLE
ELECTRONES
SUSTRATOS CROMÓGENOS
DE PEROXIDASA
DAB INCOLORO
HRP H2O2
Solución
tejido solución Dador de e

HRP
DAB OXIDADO AGUA

DAB OXIDADO DAB OXIDADO DAB OXIDADO DAB OXIDADO


POLIMERIZADO POLIMERIZADO POLIMERIZADO POLIMERIZADO
COLOREADO COLOREADO COLOREADO COLOREADO

PRECIPITADO COLOREADO INSOLUBLE


1
gota

1 ml
MUY IMPORTANTE

HIPOCLORITO
DE SODIO
Peroxidasa
Tejidos problemáticos:
 Células mieloides: mieloperoxidasa

 Eritrocitos: seudoperoxidasa

Bloqueo:
H2O2 3% acuoso o en metanol absoluto
Cromógenos para la HRP

• 3,3’ diaminobenzidina (DAB) , precipitado café

• 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina (TMB), precipitado azul


(uso limitado, precipitado semisoluble en agua)

• 3 amino-9-etilcarbazol (AEC), produce un precipitado


color rojo, soluble en solventes orgánicos.
Novared (VectorLabs.). Sensible a la luz.
Cromógenos para la HRP

• 4-cloro-1-naftol, produce un precipitado azul


negruzco. Difunde (no recomendable para
IHQ)
• Tiramida
• Otros disponibles en variados colores
ER

ACTH
CK
EGFP

CRO
HRP
Ventajas Desventajas
• Gran estabilidad • La actividad peroxidasa
• Fácil de conjugar con otras esta presente en
moléculas (Ig, AV, etc.) muchas células.
• Facilidad para detectarla
• Requiere bloqueo de la
por métodos colorimétricos
peroxidasa endógena
• Rapidez de la reacción
• Posee variados sustratos • Su actividad se
• Preparaciones permanentes mantiene después de la
• Gran utilidad en la IHQ
fijación
ultraestructural
Fosfatasa alcalina
• Enzima hidrolítica, que cataliza la hidrólisis de
ésteres de ácido fosfórico.
• PM de 100 Kd
• Actúa a un pH óptimo de 8
• La FA intestinal de origen bovino es la más
comúnmente usada.
• El principal sustrato de la FA es la sal de sodio
monobásica α-naftil fosfato.
Fosfatasa alcalina
Sustratos Cromógenos (sal de diazonio)
Fast Blue RR (soluble)
• α-naftol
Fast Red (soluble)
• Naftol AS-MX (su
acoplamiento con la sal de New Fuchsin (insoluble)
diazonio es más lento)
• bromocloroindolil fosfato NBT (nitro blue
(BCIP) tetrazolium)insoluble
INT (iodonitrotetrazolium
Violeta)
Fosfatasa alcalina
Tejidos problemáticos:
 Hueso
 Riñón
 Hígado
Es más abundante en tejidos frescos
Bloqueo:
Levamisol 1 a 5 mM
Bloqueo de fosfatasa alcalina intestinal:
solución de ácido débil
HMB45-fast red

CD10-NBT
Enzimas y cromógenos como
marcadores en IHQ
Enzima Cromógeno Color Solubilidad
en etanol

Peroxidasa DAB CAFE INSOLUBLE


AEC ROJO SOLUBLE

Fosfatasa BCIP-NBT AZUL INSOLUBLE


Alcalina BCIP-NBT-INT CAFE SOLUBLE
N. FUCHSIN ROJO INSOLUBLE
FAST RED ROJO SOLUBLE
METODOS INDIRECTOS
1. Peroxidasa anti peroxidasa
2. Fosfatasa alcalina anti fosfatasa alcalina
3. Complejo Avidina Biotina (LAB/ABC)
4. LBSA (ABC modificado)
5. Polímero marcado
6. TSA/CSA; CSA II
MÉTODO PEROXIDASA
ANTI-PEROXIDASA
• 1970 Sternberger

• Método indirecto
• Emplea un complejo inmune de
anticuerpos anti-HRP, el cual se
une al sitio de reacción a través
de un anticuerpo puente

• PM del complejo 400 – 430 kD


Ac PAP

Ac secundario

Ac primario

Antígeno
PAP
(Peroxidasa anti-peroxidasa)
3.-Solución Sustrato - Cromógeno

4.-Complejo Anticuerpo
Antiperoxidasa – HRP de conejo

ANTI Fc DE CONEJO
En ratón, perro, caballo… 3.- Anticuerpo 2° de ratón
Anti - conejo PUENTE

2.-Anticuerpo primario específico de


conejo

1.-Antígeno que se investiga en


tejido o célula
MÉTODO DE LA FOSFATASA ALCALINA ANTI
FOSFATASA ALCALINA APAAP
• Método indirecto
• Emplea un complejo inmune de
anticuerpos anti-AP, el cual se
une al sitio de reacción a través
de un anticuerpo puente
• PM del complejo 560 kD
APAAP
(Fosfatasa alcalina anti fosfatasa alcalina)
3.-Solución Sustrato - Cromógeno

4.-Conjugado Anticuerpo
Antifosfatasa Alcalina - AP

3.- Anticuerpo 2°

2.-Anticuerpo primario específico

1.-Antígeno que se investiga en


tejido o célula
Sistema avidina-biotina
 Las avidinas son proteínas con fuerte
afinidad por la biotina
 Tienen 4 sitios de unión para biotina
 En la práctica, por razones estéricas se
unen 3 moléculas de biotina por cada
avidina
COMPLEJO AVIDINA BIOTINA

• Hsu 1981
• Método indirecto
• Emplea la afinidad
natural entre AVIDINA y
BIOTINA, para unir los
marcadores al sitio de
reacción Ag-Ac
• Alta sensibilidad
Complejo avidina-biotina
Técnica que emplea la afinidad
natural entre la biotina y la avidina
AVIDINA ESTREPTAVIDINA
Punto isoeléctrico 10 Punto isoeléctrico 7
Glicoproteína Proteína. No contiene
El conjugado es menos carbohidratos
estable El conjugado es de alta
Fuente: clara del huevo estabilidad
Fuente: Streptomyces
avidinii
LAB (Labelled Avidin Biotin)
LSAB (Labelled Streptavidin Biotin,
ABC con strepto-avidina)
Ensyme-conjugated
Streptavidin

Biotinylated
Secondary Antibody

Primary Antibody

Antigen presenting Cell Substrate-chromogen


solution
ABC (Avidin Biotin Complex)

Solución Sustrato – Cromógeno

4.-Enzyme-conjugated
Avidin-Biotin Complex

3.-Biotinylated
Secondary Antibody

2.-Primary Antibody

1.Antigen presenting Cell


Ventajas del método ABC
• Rápido
• Complejo avidina-biotina-HRP , es más
estable que complejos inmunes solubles
como el PAP
• Más sensible en la práctica que el PAP y
posee un mayor potencial para amplificar la
señal.
• La avidina puede ser conjugada con distintos
marcadores
Desventajas del sistema ABC
 Cuando se utilizan enzimas con o sin
biotina en los sistemas marcadores, su
presencia en forma endógena en los
tejidos puede interferir provocando
tinción inespecífica.

Tejidos problemáticos:
 Riñón

 Hígado

Bloqueo: Avidina + biotina


Sistema del polímero marcado
(en dos pasos)
• Sistema de detección y amplificación basado en
un polímero de dextrano (polisacárido) marcado con
HRP, al cual están conjugados anticuerpos
secundarios y enzimas.
• Pueden conjugarse hasta 70 moléculas de
enzima al polímero y 10 moléculas de
anticuerpo, anti conejo, anti ratón o ambos.
Sistema del polímero marcado
(en dos pasos)
• Puede utilizarse anticuerpos primarios de
conejo o ratón. Es decir mono o policlonal
(polímero dual)

• Puede utilizarse en cortes incluidos en parafina,


de criostato y preparaciones celulares.
POLÍMERO MARCADO

• Desarrollado en 1995,
mejorado en 1999
• Más de 20 moléculas de
anticuerpos secundarios
mono o poliespecíficos
• Más de 100 moléculas
de enzima activa.
• Sistema libre de biotina
POLÍMERO MONOVALENTE
POLÍMERO UNIVERSAL
Enzima

Dextran (polimero)

Ac secundario

Ac primario

Antígeno
Ventajas del sistema polímero marcado
• Alta sensibilidad y especificidad
• Reduce el número de pasos
• Sistema libre de biotina
• Compatible con sistemas manuales y
automatizados
• Se puede aplicar en biopsias intraoperatorias
• Anticuerpos primarios pueden diluirse más.
Sensibilidad
La sensibilidad hace referencia a la cantidad
mínima de antígeno que una técnica
inmunohistoquímica es capaz de detectar.
Una técnica con alta sensibilidad es capaz de
detectar cantidades muy pequeñas de antígeno.
En los últimos años la sensibilidad se ha
aumentado más de 100 veces respecto a los
métodos tradicionales.
MONTAJE DE UN LABORATORIO
IHQ
Laboratorio de patología básico
• Procesador de tejidos
• Micrótomo
• Baño histológico
• Estufa de secado
• Baterías de tinción
• Insumos
• Reactivos básicos
Laboratorio de patología básico

• Equipamiento de inclusión histológica


• Refrigerador
• Microscopio de luz
• ¿Microscopio de fluorescencia?
EQUIPOS
REFRIGERADOR CON FREEZER
Uso exclusivo para reactivos
2 – 8° C -18 a –30°C

USO EXCLUSIVO
REACTIVOS
INMUNOHISTOQUÍMICA
HORNO DE INCUBACIÓN
Uso exclusivo para IHQ
Temperatura constante de
37° C +- 0,1° C

NO CALENTAR
PARAFINA

NO SECAR MATERIAL
• HORNO DE MICROONDAS
• VAPORERA
• OLLA A PRESIÓN
• BAÑOS DE AGUA
ACCESORIOS
• Cámaras húmedas
• Bombas de aspiración
• Micropipetas / puntas
– 0,5 – 10 ul
– 10 - 100 ul
– 100 – 1000 ul
• Baterías de hidratación y deshidratación de
uso exclusivo para IHQ
ACCESORIOS
• Portaobjetos pretratados
• Piscetas
• Recipientes para técnicas de recuperación
• VIALES DE DILUCIÓN Y ALICUOTADO tubos
tipo eppendorf de 0,5 a 1,5 ul
• Lápiz hidrófobo
REACTIVOS
• Anticuerpos primarios
• Sistemas de detección
• Soluciones cromógenas
• Reactivos de bloqueo
• Buffer de lavado
• Buffer de dilución
• Soluciones de recuperación de inmunoreactividad
• Contratinciones
ANTICUERPOS PRIMARIOS
• Especificidad
• Clon
• Concentrado / pre diluido
• Dilución de uso
• Volumen
• Pre-tratamientos
¿Qué necesito
• Aplicación diagnosticar?
• Bibliografía
• Etc.
SISTEMAS DE DETECCIÓN
• MÉTODO
– COMPLEJO AVIDINA BIOTINA
– POLÍMERO MARCADO
– TSA
– INDIRECTO SIMPLE
– FLUORESCENCIA
• CONCENTRADO / KIT
• Nº DE DETERMINACIONES (50 - 150 - 1000)
• CROMÓGENO / ENZIMA
ENZIMAS Y CROMÓGENOS
Enzima Cromógeno Color Solubilidad en
alcohol

DAB Marrón No

Peroxidasa DAB + Níquel Gris /Negro No

AEC Rojo Si

BCIP Azul No
Fosfatasa
alcalina BCIP/NBT Púrpura No
New Fucsina Fucsia No
CONTRATINCIÓN
HEMATOXILINA DE MAYER
VERDE METILO
NUCLEAR FAST RED
¡CONOCIMIENTO!
Contenidos

• Anticuerpos mono y policlonales


• Concepto de especificidad y sensibilidad
• Sistemas de detección inmunoenzimáticos