ABSTRACTO

Los lípidos se vuelven rancios como resultado de la oxidación, y esta rancidez oxidativa es
una causa importante de deterioro de los alimentos. La aceptabilidad de un producto
alimenticio depende del grado en que este deterioro haya ocurrido. Por lo tanto, se
requiere algún criterio para evaluar el grado de oxidación. Este artículo revisa las técnicas
experimentales para la medición de la oxidación de lípidos. El espectro de pruebas abarca
desde simples evaluaciones organolépticas hasta métodos químicos y físicos. No existe un
método químico ideal que se correlacione bien con los cambios en las propiedades
organolépticas de los lípidos oxidados durante todo el curso de la autooxidación. Los
métodos discutidos proporcionan información sobre etapas particulares del proceso
autoxidativo, y algunos son más aplicables a ciertos sistemas de lípidos que otros. El
método de elección depende de una serie de factores que incluyen la naturaleza y
historial de la muestra oxidada, el tipo de información requerida, el tiempo disponible y
las condiciones de prueba. Claramente, existe la necesidad de una evaluación más
exhaustiva de los métodos disponibles para que los métodos poco confiables y engorrosos
puedan descartarse y se realicen modificaciones en los métodos restantes para maximizar
la información obtenida. El último criterio para la idoneidad de cualquier prueba es su
acuerdo con la percepción sensorial de sabores y olores rancios.

INTRODUCCIÓN

Los lípidos pueden volverse rancios como consecuencia de la oxidación, y esta rancidez
oxidativa es una de las principales causas del deterioro de los alimentos. Mientras que
otras reacciones de deterioro tales como el ataque microbiano o enzimático pueden
controlarse en gran medida reduciendo la temperatura, esto no es particularmente útil
para prevenir la oxidación ya que se involucran umbrales de energía bajos. Tampoco la
exclusión de oxígeno es prácticamente posible. El deterioro oxidativo de los lípidos
alimentarios implica, principalmente, reacciones autoxidativas que están acompañadas
por diversas reacciones secundarias que tienen carácter oxidativo y no oxidativo. Desde el
punto de vista de la oxidación de los alimentos, los lípidos importantes son los restos de
ácidos grasos insaturados, particularmente el oleato, el linoleato y el linolenato, los
principales en los alimentos (1). La susceptibilidad y la tasa de oxidación de estos ácidos
grasos aumentan de una manera algo geométrica en relación con su grado de
insaturación. La oxidación de ácidos grasos insaturados ha sido bien informada (1-5) y a
menos que esté mediada por otros oxidantes o sistemas de enzimas, procede a través de
un mecanismo de cadena de radicales libres que implica etapas de iniciación, propagación
y terminación. Estos pueden ser formulados como:

RH se refiere a cualquier ácido graso insaturado en el que H es lábil debido a estar en un

átomo de carbono adyacente a un doble enlace. R. se refiere a un radical libre formado
por la eliminación de un hidrógeno lábil.
Los hidroperóxidos (ROOH) son la principal reacción inicial
productos de ácidos grasos con oxígeno. Las reacciones posteriores controlan tanto la
velocidad de reacción como la naturaleza de los productos formados (figura 1). Estos
compuestos pueden ser responsables del desarrollo de sabores extraños o de reacciones
posteriores con otros constituyentes de los alimentos, como las proteínas.
La aceptabilidad de un producto alimenticio depende del grado en que se haya producido
el deterioro. Los investigadores también están interesados en determinar los efectos de
ciertos procesos o antioxidantes en la estabilidad de un producto. Por lo tanto, se requiere
algún criterio para evaluar el grado de oxidación. Aunque el análisis sensorial es uno de los
métodos más sensibles disponibles, no es práctico para los análisis de rutina y
generalmente carece de reproducibilidad. En consecuencia, muchos métodos químicos y
físicos se han desarrollado para cuantificar el deterioro oxidativo con el objeto de
correlacionar los datos con el desarrollo de mal sabor. Al evaluar la utilidad de una prueba
o procedimiento en particular como una medida del grado de oxidación, ciertas preguntas
deben ser respondidas:

1. ¿La propiedad que se mide surgirá bajo cualquier circunstancia que no sea la oxidación?
2. ¿La propiedad que se mide se encuentra en todos los sistemas oxidantes?
3. ¿Es el método específico para esa propiedad en particular?
4. ¿La propiedad que se mide adecuadamente representa
¿Hasta qué punto ha ocurrido la oxidación?
El objetivo de esta discusión es revisar las técnicas experimentales para la medición de la
oxidación de lípidos. El espectro de pruebas abarca desde simples evaluaciones
organolépticas hasta métodos químicos y electroanálisis. Se discuten las ventajas y
limitaciones asociadas con cada método.
Antes de comenzar un examen detallado, se debe hacer una distinción entre las pruebas
de susceptibilidad y los métodos para medir el grado de oxidación de los lípidos. Las
pruebas de susceptibilidad miden la estabilidad de un lípido en condiciones que favorecen
la ranciedad oxidativa e incluyen pruebas como la prueba del horno Schaal, el método de
oxígeno activo y los métodos de adsorción de oxígeno. Por lo tanto, se basan en pruebas
que miden el grado de oxidación para proporcionar una indicación del punto en el que se
produce la ranciedad. En este documento, es únicamente este aspecto, el método de
evaluación, que se considera sin referencia a una prueba de estabilidad particular.

EVALUACIÓN ORGANOLÉPTICA
El consumidor usa una evaluación organoléptica para juzgar la calidad de las grasas y los
aceites. Se considera rancidez a los sabores objetables que resultan de la acumulación de
productos de descomposición de la reacción de oxidación. El método de prueba puede ser
tan simple como una prueba individual u oliendo el aceite. Para minimizar el sesgo y el
error humano, se evalúa a un panel multinúcleo para determinar la sensibilidad del olor y
el sabor. Luego se realiza un experimento de muestreo diseñado estadísticamente. Las
desventajas de este tipo de análisis son el tiempo requerido y la baja reproducibilidad. Los
métodos químicos desarrollados intentan mejorar la reproducibilidad, la sensibilidad y la
cuantitatividad. En última instancia, estos resultados deben apoyar las mediciones
sensoriales.
Métodos químicos

Evalución de peróxidos

Los principales productos de la oxidación de lípidos son los hidroperóxidos que

generalmente se denominan peróxidos. Por lo tanto, parece razonable determinar la
concentración de peróxidos como una medida del grado de oxidación. Sin embargo, esta
teoría es limitada debido a la naturaleza transitoria de los peróxidos. Como se muestra en
la Figura 1, los peróxidos son productos intermedios en la formación de compuestos de
carbonilo e hidroxi. La relación entre los grupos funcionales que contienen oxígeno y el
tiempo de oxidación se muestra en la Figura 2 (6). Muestra claramente que el valor de
peróxido pasa a través de un máximo y es muy sensible a los cambios de temperatura.
Numerosos procedimientos analíticos para la medición del valor del peróxido se describen
en la literatura. Los resultados y la idoneidad de la prueba dependen de las condiciones
experimentales y del agente reductor empleado. Como resultado, siempre que la solidez
de un oit se exprese en términos del valor de peróxido, también se debe dar el método
utilizado en la determinación.
Los métodos yodométricos de Lea (7) y Wheeler (8) son ampliamente utilizados, y se
basan en la medición del yodo producido a partir del yoduro de potasio por los peróxidos
presentes en el aceite. Según Mehlenbacher (9), las dos principales fuentes de error en
estos métodos son (a) la absorción de yodo en los enlaces insaturados del material graso,
y (b) la liberación de yodo del yoduro de potasio por el oxígeno presente en la solución a
ser titulado Este último se denomina a menudo error de oxígeno y conduce a resultados
elevados en la determinación del peróxido (10-13). Lea (7) intentó eliminar este error
llenando el tubo de muestra con nitrógeno al comienzo de la prueba y suponiendo que la
evolución del cloroformo evitaría la entrada de oxígeno al tubo. Wheeler (8) utilizó una
solución homogénea en un intento de eliminar la necesidad de agitación, minimizando así
el efecto del oxígeno. También se ha establecido que otras posibles fuentes de error en los
métodos yodométricos incluyen la variación en el peso de la muestra, el tipo y grado de
disolvente utilizado, la variación en las condiciones de reacción como el tiempo y la
temperatura y la constitución y reactividad de los peróxidos. titulado.
Lips et al. (14) sugirieron un método colorimétrico basado en la oxidación de hierro
ferroso a hierro férrico y la determinación de este último como tiocianato férrico. Se ha
encontrado que este método es adecuado para la estimación de los peróxidos grasos en la
leche en polvo, y los valores de peróxido determinados por este método son
considerablemente más altos que los procedimientos yodométricos. Stine et al. (I 5)
utilizaron un agente tensioactivo no iónico para romper la emulsión para la estimación del
valor de peróxido mediante un método de tiocianato férrico modificado. Parece ser un
método muy satisfactorio para fines de control de rutina, como leche, crema, productos
lácteos condensados y secos. Su reproducibilidad y sensibilidad son excelentes, pero no es
adecuado para estimar una muestra de aceite de muestras de fluidos homogeneizados.
Lea (16) determinó los niveles de peróxido utilizando tres métodos: los procedimientos
yodométrico, tiocianato férrico y 2,6-diclorofenolindofenol. Los valores de peróxido se
midieron frente a la absorción de oxígeno. Para el método yodométrico en ausencia de
oxígeno, se demostró que el 91% del oxígeno absorbido por el linoleato de metilo se
convertía en compuestos peroxidados. Se sugirió que el yodo liberado reaccionó con los
ácidos grasos insaturados o los productos de oxidación para explicar el bajo valor. El
procedimiento experimental requería que todo el sistema de reacción
equilibrarse a una temperatura de oxidación de 37ºC, un sustrato graso libre de pro- y
antioxidantes y una exclusión rígida de oxígeno durante la medición del peróxido. Los
otros dos métodos dieron valores de peróxido imposiblemente altos cuando se
correlacionaron con la absorción de oxígeno. Sin embargo, se observó que el método del
tiocianato férrico proporcionaba una excelente reproducibilidad y requería mucha menos
muestra. Se consideró que este método podría tener más potencial en una microescala y
en las primeras etapas de la peroxidación que el método yodométrico. El método del 2,6-
diclorofenolindofeno no tenía ninguna de estas ventajas.

Una variación en el método yodométrico fue informada por Swoboda y Lea (17). Este fue
un ensayo colorimétrico de yodo liberado que se convirtió en un complejo azul de
almidón-yodo. Dado que la cantidad de material requerido para la prueba era de 1 a 50
piezas, este método tiene ventajas para muestras demasiado pequeñas para una
valoración conveniente.
Una comparación reciente de los métodos yodométrico y tiocianato férrico indicó que los
resultados obtenidos varían con las condiciones experimentales y el agente reductor
utilizado (18). Se compararon dos métodos yodométricos: el Sully (I9) y el Wheeler
[modificado por Hadorn et al. (20)] métodos que difieren principalmente en las cantidades
de agente reductor empleado y el hecho de que el primer método implica hervir el
sustrato. Se determinaron los valores de peróxido de cinco aceites y se probaron dos
estados de oxidación diferentes para aceite de girasol y aceite de maíz (Tabla I). Los dos
métodos yodométricos dieron resultados similares para los aceites de avellana, oliva y
maíz, pero el método Sully dio valores más bajos para los aceites como el girasol que
tienen un mayor contenido de ácido linoleico. Un análisis cromatográfico de capa fina de
los productos de yodometría reveló que con el método de Wheeler "frío", la reacción
primaria que tenía lugar era la reducción de los hidroperóxidos a los hidroxiácidos
correspondientes. Sin embargo, las condiciones experimentales más severas del método
Sully alentaron ca. 15% de descomposición de hidroperóxido.
Cuando el sulfato ferroso [Stine et al. (15)] se utilizó como agente reductor, Barthel y
Grosch (18) encontraron que se requería casi el doble de los equivalentes de reducción en
relación con los datos yodométricos. Esto se atribuyó a más reacciones a lo largo de la
cadena de acilo y puede explicar la discrepancia en la investigación de Lea (16).
El método yodométrico oficial AOCS Cd 8-53 (21) para la determinación del valor de
peróxido es aplicable a todas las grasas y aceites normales. Este método se usa
comúnmente, pero es altamente empírico y cualquier variación en el procedimiento
puede dar como resultado una variación en los resultados. Recientemente, el método
oficial ha sido modificado en un intento de aumentar su sensibilidad a bajos valores de
peróxido (22). El método oficial no mide adecuadamente los bajos valores de peróxido
debido a las dificultades con la determinación del punto final de la valoración. La
modificación implica la sustitución del paso de titulación por una técnica electroquímica
en la que el yodo liberado se reduce en un electrodo de platino mantenido a un potencial
constante. Los valores de peróxido que van desde 0.06 a 20 han sido determinados con
este método. Es esencial, por supuesto, durante la determinación de desairear todas las
soluciones ya que la presencia de oxígeno puede conducir a una mayor formación de
peróxidos.
Stamm (23) informó que la rancidez podía detectarse en los aceites por el color rojo que
se desarrollaba cuando dichos aceites se calentaban con 1,5-difenilcarbohidrazida. Una
investigación de H a m m e t al. (24) revelaron que el oxígeno en el solvente entró en la
reacción, pero este factor fue constante. Derivaron una relación matemática para
convertir la absorbancia de difenilcarbazona en un valor de peróxido.

donde F es el factor empírico evaluado a 2.631 para el aceite de soja y W es el peso de la

muestra en gramos. El factor F es empírico y debe determinarse a priori para un aceite
particular en lugar de extrapolarse a nuevas condiciones. Este método es supuestamente
muy sensible a bajas concentraciones de peróxidos y, por lo tanto, podría tener algún
valor para el estudio de las primeras etapas de autoxidación. Sin embargo, es un método
muy empírico, y los cambios en el orden de la adición de reactivos, el tiempo y la
temperatura de calentamiento, la concentración de ácido acético y la polaridad del
disolvente usado tienen todos un efecto sobre los resultados obtenidos. Cualquier ventaja
de este método parece superarse por las muchas desventajas.
Hargrave y Morris (25) midieron la concentración de hidroperóxido utilizando un método
basado en cloruro estannoso como reductor. Notaron que un balance de oxígeno para la
reacción no podía basarse solo en la especie de hidroperóxido. Otros grupos funcionales
que contienen oxígeno se aislaron durante la reacción, y la escisión molecular dio lugar a
compuestos de carbonilo. Un examen del peso molecular de los productos de oxidación
indicó que también se formaron diperóxidos. Estos trabajadores mostraron que los
diperóxidos no se redujeron bajo las condiciones de los ensayos químicos para
hidroperóxidos.
Aunque el valor de peróxido es una medida común de la oxidación de lípidos, su uso se
limita a las etapas iniciales de oxidación. Dado que los peróxidos son vulnerables a una
reacción posterior, la historia oxidativa completa del aceite puede no ser revelada. Sin
embargo, se han reportado buenas correlaciones entre el método oficial de peróxido y los
puntajes de sabor organoléptico para varias grasas comerciales tales como la manteca de
cerdo, el aceite de soja hidrogenado y el aceite de maíz (26).

Prueba de ácido tiobarbitúrico

La prueba del ácido tiobarbitúrico (TBA) es uno de los métodos más comúnmente
utilizados para la detección de la oxidación de los lípidos. Sin embargo, la popularidad de
un método no es en sí misma una prueba suficiente de que el método cumpla todos los
requisitos de una técnica reproducible. Ciertamente, mucha investigación en las últimas
dos décadas se ha dedicado a determinar algunas de las reacciones básicas involucradas
en esta prueba.
Las primeras investigaciones de Sinnhuber et al. (27) ayudaron a aclarar la naturaleza de la
reacción colorimétrica que ocurre durante la prueba TBA. Propusieron que el cromagen se
formó a través de la condensación de dos moléculas de TBA con una molécula de
malonaldehído (Fig. 3). Sin embargo, no se presentaron pruebas de que el malonaldehído
pudiera encontrarse en todos los sistemas oxidantes. Dahle et al. (28) postularon un
mecanismo para la formación de malonaldehído, un producto secundario en la oxidación
de ácidos grasos poliinsaturados. Este mecanismo se basó en investigaciones que
demostraron que no se desarrolló ningún color para linoleato incluso a valores de
peróxido de 2000 o mayores, pero que para ácidos grasos con tres o más dobles enlaces el
rendimiento molar del color TBA aumentó con el grado de insaturación. Estos resultados
indicaron que solo los peróxidos que poseían insaturación, / 3, 7 para el grupo de peróxido
eran capaces de experimentar ciclación con la formación final de malonaldehído. Dichos
peróxidos solo podrían producirse a partir de ácidos grasos que contienen tres o más
dobles enlaces. Por lo tanto, es imprescindible conocer el perfil de ácidos grasos de la
muestra a analizar. Este trabajo también indicó que los resultados significativos de la
prueba TBA solo pueden obtenerse mediante la comparación de muestras de un solo
material en diferentes etapas de oxidación.

La prueba TBA ha sido criticada en varios puntos. Tarladgis y sus colaboradores (29)
consideraron el efecto del ácido, el calor y los agentes oxidantes en el reactivo TBA.
Sugirieron la destilación al vapor del producto para eliminar los componentes volátiles que
se suponía que eran responsables de la ranciedad sensorial. Estos trabajadores
concluyeron que la estructura de TBA se alteró por el tratamiento con ácido y calor así
como por la presencia de peróxidos y recomendaron que las determinaciones en blanco
se llevaran a cabo en conjunto con la prueba. En otra investigación del efecto de las
condiciones de reacción, Yu y Sinnhuber (30) sugirieron las siguientes correcciones a las
conclusiones de Tarladgis et al. (29): a) la interferencia del color fue el resultado de
impurezas en el ácido; (b) peróxido de hidrógeno reaccionado con TBA solo si la
concentración de ácido era alta; y (c) dado que se formaron complejos coloreados cuando
se hizo pasar el reactivo TBA a través de una columna de celulosa, los resultados de la
cromatografía en columna eran sospechosos. Esta investigación enfatizó la importancia de
usar reactivos purificados.
La prueba de TBA se puede realizar de dos maneras, ya sea directamente en un producto
alimenticio seguido de la extracción del pigmento coloreado, o en una porción de un
destilado de vapor del alimento. Ambos métodos tienen en común el uso de ácido y calor.
deKoning y Silk (31) informaron que no pudieron aplicar con éxito la prueba TBA en
cualquiera de sus formas para determinar la rancidez en los aceites de pescado. Se
atribuyeron malos resultados al sistema de dos fases del método directo y a la extracción
ineficaz del malonaldehído con el método de destilación. El método se modificó a un
sistema monofásico de etanol, y se obtuvo una buena correlación entre el número de TBA
y el valor de peróxido. La observación de que ambos valores alcanzaron niveles de
oxidación similares llevó a los autores a concluir que el número de TBA no era más útil
como criterio de ranciedad que el valor de peróxido después de las etapas iniciales de
oxidación. Además, se descubrió que el sistema monofásico era sensible a la luz y causaba
una pérdida de intensidad del pico a 530 nm. Yu y Sinnhuber (32) intentaron mejorar la
confiabilidad de la prueba TBA haciendo modificaciones adicionales. Observaron que
durante el calentamiento del reactivo TBA, se formó una fina película de aceite en los
lados del tubo. Sintieron que esto podría ser una posible fuente de error ya que los
reactivos no estarían en contacto con la película y podría producirse una oxidación
adicional de la película. Este obstáculo se superó cubriendo la superficie del vidrio con
silicona. Se evitó la oxidación adicional de la muestra en las condiciones de la prueba
mediante la adición de antioxidantes. Bajo estas condiciones modificadas, se observó que
el número de TBA de aceites de pescado variaba linealmente con valores de peróxido
hasta un valor de peróxido de 800.

Recientemente, Vyncke realizó una comparación del método directo de TBA con el
método de destilación para la determinación de la ranciedad en la caballa (33). Se observó
una alta correlación entre los dos métodos, aunque el número de TBA según lo
determinado por el método de destilación fue dos veces mayor que el del método de
extracción directa. El autor concluyó que podría utilizarse el método de extracción más
simple y más rápido en lugar del procedimiento de destilación para determinar la rancidez
en la caballa.

El desarrollo del color durante la prueba TBA generalmente se evalúa midiendo la

absorbancia del pigmento rojo a 532 bordes. Sin embargo, se han observado otros
pigmentos, especialmente un pigmento amarillo con una absorbancia máxima a 450 nm.
Usando un sistema de una fase modificado, Jacobson et al. (34) observaron que los
dienales mostraban un pico de absorción a 432 nm mientras que los productos de
reacción de TBA de los aldehídos saturados mostraban un pico a 452 nm. Se encontró que
la ubicación del doble enlace de monoenos influye en el comportamiento espectral de los
productos de reacción de TBA. Marcuse y Johansson (35) también estudiaron la reacción
de TBA con varias clases de aldehídos y encontraron que los alcanales, 2-alquenales y 2,4-
alcadienales producen un pigmento amarillo de 450 nm con TBA, mientras que solo 2,4-
alcadienales y en menor medida, los 2 alquenales producen el pigmento rojo de 532 nm.
Sugirieron que la absorbancia a 450 nm era indicativa de ranciedad así como también del
valor a 532 bordes. Este último generalmente se toma como la absorbancia característica
del complejo TBA-malonaldehído. Dado que los dos pigmentos tienen diferentes
sensibilidades térmicas, las condiciones de desarrollo del color se modificaron para
minimizar el riesgo de interferencia. Patton (36), sin embargo, ha cuestionado el valor de
la absorbancia a 450 nm, ya que puede producirse por la reacción de TBA con aldehídos
que no son productos de oxidación, por ejemplo, gliceraldehído, aldehídos aromáticos,
hidroximetilfurfural. Por lo tanto, puede no ser un verdadero monitor de la rancidez
oxidativa.
La evidencia de que el TBA puede reaccionar con compuestos distintos de los encontrados
en los sistemas oxidantes para producir el pigmento rojo característico ha sido presentado
en la literatura. Dugan (37) informó que la sacarosa y algunos compuestos presentes en el
humo de leña reaccionan con el TBA para dar un color rojo, por lo que las carnes curadas y
ahumadas requieren correcciones para el contenido de azúcar y para el humo en las capas
externas. Baumgartner et al. (38) también encontraron que una mezcla de acetaldehído y
sacarosa cuando se sometía a la prueba TBA producía un pigmento absorbente de 532 nm
idéntico al producido por malonaldehído y TBA. Los autores sugirieron que esta reacción
puede interferir con el ensayo de peroxidación lipídica en órganos tales como el hígado,
donde el etanol puede convertirse en acetaldehído.
En ocasiones se han observado correlaciones deficientes entre los valores de TBA y otros
indicadores de oxidación en materiales biológicos complejos, como los tejidos animales.
Buttkus y Rose (39) exploraron esto aún más preparando varios productos de
condensación con malonaldehído y aminas y observando su efecto sobre el rendimiento
de color en la prueba TBA. Descubrieron que (a) los productos de monoadición de cadena
abierta tales como los formados entre malonaldehído y glicina o metionina y productos
disustituidos no interferían en la prueba; (b) con complejos de cisteína-malonaldehído,
solo el 70% del malonaldehído se recuperó en la prueba; y (c) los complejos en los que se
forma un componente anular, como con la citrulina y la arginina, dieron rendimientos muy
bajos de malon-aldehído. Estos autores razonan que los productos cíclicos en los que se
incorporó malonaldehído eran relativamente estables bajo las condiciones de la prueba
TBA mientras que los productos de cadena lineal se hidrolizaban fácilmente. La
importancia de estos resultados para la prueba TBA es que en tales sistemas oxidantes
donde las proteínas también están presentes, la competencia por el malonaldehído puede
ocurrir, lo que resulta en rendimientos de color reducidos. También se esperaría que estas
reacciones competitivas transcurrieran más rápidamente en sistemas deshidratados o
concentrados ya que el agua también compite por los sitios activos.
A diferencia de Buttkus y Rose (39), Shin et al. (40) encontraron que había poca
reactividad entre el malonaldehído y los grupos sulfidrilo. Sugirieron que la cisteína era un
compuesto pobre para usar para evaluar el efecto del malonaldehído en los grupos
sulfidrilo ya que la cisteína también posee un grupo amino que puede alterar la
reactividad del grupo sulfidrilo. El pH y la temperatura del sistema de reacción y la
concentración de malonaldehído presente tienen todos un efecto sobre las reacciones
que ocurren.
Se han realizado varios intentos para establecer una relación entre el valor de TBA y el
desarrollo de características de sabor indeseables en las grasas. Sin embargo, Pohle et al.
(41) encontraron que el puntaje de sabor no se podía estimar para ninguna grasa dada a
partir del valor de TBA ya que el nivel relativo variaba de un producto a otro. Por lo tanto,
la relación entre el valor de TBA y el cambio en sabores tendría que establecerse para un
aceite dado antes de que el valor de TBA se pueda usar como un índice de sabor. Tales
incidentes reportados de mala correlación entre el valor de TBA y las puntuaciones de
sabor fueron atribuidos por Wyatt y Day (42) a ser el resultado del tipo de evaluación de
sabor empleado y no a ninguna limitación en el método de TBA. Utilizaron una evaluación
basada en la detección de umbrales de sabor. Este tipo de prueba de sabor no requiere
que un juez clasifique las muestras o le asigne un valor numérico, sino simplemente
indicar si las muestras tienen un sabor rancio o no. La concentración de muestra oxidada a
la que el 50% de los jueces detecta la rancidez se conoce como el umbral de sabor
promedio. Cuando se trazó el número de TBA frente al recíproco del umbral de sabor
promedio, se obtuvieron altas correlaciones para los aceites de maíz, semilla de algodón,
cártamo y soya.

Prueba Kreis

La prueba de Kreis (43), una de las primeras pruebas utilizadas para evaluar la oxidación
de las grasas, implica la producción de un color rojo cuando el fliorogiucinol reacciona con
la grasa oxidada en una solución ácida. Gran parte de la literatura sobre grasas y aceites
anterior a 1951, establece sin reservas que los compuestos responsables de la reacción de
color Kreis de las grasas oxidadas son los aldehídos epoxídicos o sus acetales. La mayoría
de estas declaraciones se basan en los hallazgos de Powick (44) que hizo un estudio
exhaustivo de la reacción de Kreis. Sin embargo, Patton et al. (45) presentado
evidencia que sugiere que el aldehído epihidrina (2,3-epoxipropanal) y sus derivados no
son necesariamente los únicos responsables de la reacción de color de Kreis. Mostraron
que el malonaldehído también dio una reacción positiva en la prueba de Kreis y que el
color resultante era espectralmente similar a los colores Kreis obtenidos con 2,3-
epoxipropanal, dietil acetal, acroleína tratada con H202, manteca rancia y grasa de leche
oxidada. Lea (46) sugirió que, dado que el 2,3-epoxipropanal y el malonaldehído son
isoméricos, el 2,3-epoxipropanal se puede formar mediante la reordenación del
malonaldehído en la oxidación de ciertos ácidos grasos insaturados.
La objeción más importante a la prueba de Kreis es que el desarrollo del color no
necesariamente es paralelo al desarrollo de la ranciedad (9). Con demasiada frecuencia,
las muestras totalmente frescas y sin rancidez muestran algún color cuando reaccionan
con el reactivo Kreis. Además, a veces es difícil obtener resultados comparables en
diferentes laboratorios y en manos de diferentes operadores. Aunque la prueba de Kreis
puede servir para indicar cambios leves en la condición de una grasa en diversas
circunstancias, no proporciona un índice satisfactorio de ranciedad.

Compuestos de carbonilo total y volátil

Un enfoque alternativo para la determinación del grado de oxidación de lípidos es medir

los compuestos de carbonilo formados por la degradación de los hidroperóxidos (figura 1).
El método analítico más confiable y ampliamente utilizado es el descrito por Henick et al.
(47) El procedimiento se basa en la formación de 2,4-dinitrofenilhidrazonas de
compuestos de carbonilo en presencia de un catalizador de ácido tricloroacético. Sin
embargo, el método ha sido criticado ya que los hidroperóxidos se descompusieron bajo
las condiciones experimentales (48). Como esto interfería con una determinación
cuantitativa de los productos de oxidación, se han sugerido varias alternativas.
En un método, los hidroperóxidos se redujeron a compuestos no carbonílicos antes de la
determinación del carbonilo. Mizuno y Chipault (49) establecieron que en condiciones
moderadas con un reactivo de cloruro estannoso, no hubo evidencia de reacciones
secundarias ni pérdida de compuestos de carbonilo. Por lo tanto, la determinación estaba
libre de interferencia de hidroperóxidos. Fioriti (50) informó que la reducción no era la
respuesta completa, ya que consume mucho tiempo y también genera algunos
compuestos de carbonilo adicionales. Sugirió que la interferencia de los hidroperóxidos
puede reducirse sacando la reacción a 5 ° C. Sin embargo, en estas condiciones, la
reacción debe llevarse a cabo durante 20 horas.
Holm et al. (51) investigaron un método basado en la reacción de aldehídos saturados e
insaturados con acetato de benzidina. La reacción se produjo en la muestra de grasa sin
alta temperatura o la adición de ácido fuerte, los cuales descomponen los hidroperóxidos.
Sin embargo, debido a las propiedades carcinogénicas de la bencidina, se ha sugerido un
método alternativo pero similar (52) basado en la anisidina (p-metoxianilina). List et al.
(53) informaron una correlación altamente significativa entre los valores de anisidina de
aceites de ensalada procesados a partir de soja no dañada y sus puntuaciones de sabor.
Las correlaciones múltiples entre las puntuaciones de sabor, los valores de anisidina y
peróxido arrojaron una correlación de 0,81 y proporcionaron un método para predecir las
puntuaciones iniciales de sabor de los aceites de ensalada procesados a partir de soja no
dañada.
En un procedimiento alternativo, Johnson y Hammond (54) usaron triclorofenilhidrazina
como reactivo. Aunque consumía demasiado tiempo para un ensayo rutinario de
ranciedad, el método permitió el aislamiento cuantitativo, a nivel de nanogramos, de las
especies de carbonilo de la grasa oxidada.
La reacción entre grupos funcionales de carbonilo e hidrocloruro de hidroxilamina
también se ha utilizado como la base de una prueba para medir la oxidación de lípidos
(55). Esta prueba se basa en las siguientes reacciones:

El ácido liberado se valora luego, y el punto final se puede detectar visualmente o

potenciométricamente. Sin embargo, la principal desventaja de este método es la
inestabilidad de la hidroxilamina. Los hidroperóxidos también pueden interferir en la
reacción y dar resultados variables o resultados que son demasiado altos. Los
hidroperóxidos nuevamente deben reducirse antes de la determinación de los
compuestos de carbonilo. Sin embargo, se ha establecido que éster, carboxilo, aminas
primarias y secundarias, α-glicoles, éter y tipos alílicos de grupos etilénicos no interfieren
con este método. Trozzolo y Lieber (56) afirmaron que los factores interferentes tales
como los efectos estéricos, la ciclación con la formación de isoazoxalonas, la insaturación
conjugada y el enlace de hidrógeno disminuyeron la utilidad de tales métodos. Dado que
las grasas contienen algunos enlaces dobles conjugados después de la oxidación, el
método de la hidroxilamina no es realmente adecuado para las determinaciones de
oxidación.
Los procedimientos discutidos para la determinación de carbonilo miden principalmente
compuestos de carbonilo no volátiles. Aunque estos son probables precursores de
compuestos más volátiles y olorosos, no contribuyen directamente al sabor. Por lo tanto,
parece apropiado tratar de recuperar y estimar el nivel de productos de degradación
volátil.
En una revisión de 1966, Gaddis et al. (57) compararon el aislamiento de carbonil-2,4-
dinitrofenilhidrazonas por destilación al vacío y los procedimientos Girard T y Swartz. Se
recomendó el reactivo Girard T que extrae carbonilos en una fase acuosa. También se
demostró que los precursores se descomponen en compuestos de carbonilo en las otras
dos condiciones experimentales. Lea y Swoboda (58) informaron un sistema de destilación
al vacío mejorado para la recuperación de carbonilos de bajo peso molecular.
Nuevamente el probelem de descomposición de precursores interfirió con una
determinación cuantitativa de productos volátiles.
Una ventaja de estos métodos es que intentan medir productos que contribuyen al sabor
rancio. Estos no están limitados, como lo es la determinación del peróxido, a las primeras
etapas de la oxidación (Fig. 2). Algunos son extremadamente sensibles y cuantitativos. Sin
embargo, es necesario establecer que las condiciones experimentales no descomponen
los precursores de los compuestos de carbonilo que se están ensayando.

Determinación de oxirano

Los compuestos de oxirano que contienen un grupo a-epoxi se forman durante la

autooxidación del material lipídico insaturado (Fig. 2). Los grupos a-epoxi se determinan
habitualmente haciendo reaccionar el compuesto con un exceso de halógeno en un
disolvente adecuado, siendo el halógeno consumido una medida del a-epóxido. La
reacción procede de la siguiente manera:

El método estándar de titulación de HBr, AOCS Método tentativo Cd 9-57 (21) para la
determinación de oxirano se adoptó como resultado de análisis colaborativos realizados
en cinco laboratorios diferentes (59).
Fioriti et al. (60,61) encontraron que el ácido pícrico era el mejor de varios cromóforos
ácidos en su reacción con epóxidos. A pesar de una reacción no cuantitativa, la
concentración del producto siguió la Ley de Beer. Se ha encontrado que este método es
particularmente adecuado para la determinación de epóxidos en grasas calentadas en las
que el nivel de oxirano es a menudo inferior al 0,1%.

MÉTODOS FÍSICOS

Métodos de dieno conjugado

A pesar del reclamo de St. Angelo et al. (62) que el método de conjugación de dieno es
uno de los tres métodos más ampliamente utilizados para determinar el grado de
enranciamiento en los alimentos que contienen grasa, se puede encontrar poca
información que trate específicamente de este método en la literatura.
La oxidación de los ácidos grasos poliinsaturados se acompaña de una mayor absorción
ultravioleta. Los ácidos grasos con insaturación conjugada absorben fuertemente en la
región de 230 a 375 nm, la insaturación de dieno a 234 'nm, y la insaturación de trieno a
268 nm. La magnitud del cambio no se relaciona fácilmente con el grado de oxidación
porque los efectos sobre los diversos ácidos grasos insaturados varían en calidad y
magnitud. Sin embargo, los cambios en el espectro ultravioleta de una sustancia dada se
pueden usar como una medición relativa de la oxidación.
Los aceites que contienen linoleato o ácidos grasos altamente insaturados se oxidan a
sistemas de dieno conjugado que pueden medirse por absorción ultravioleta a 234 nm.
Farmer y Sutton (63) indicaron que la absorción aumentó proporcionalmente a la
absorción de oxígeno y a la formación de peróxidos en las primeras etapas de oxidación.
En la oxidación del linoleato de etilo, el monohidroperóxido que se forma se muestra
mediante mediciones de absorción ultravioleta para contener aprox. 70% de isómeros
conjugados (64). Holman y Burr (65) sugirieron que el desarrollo de cromóforos
ultravioleta no puede tomarse como una medida del consumo de oxígeno (grado de
oxidación) a menos que se conozca la composición de la mezcla de ácidos grasos. Privett y
Blank (66) indicaron que la meseta de la curva ultravioleta siempre ocurría justo antes del
final del período de inducción.
St. Angelo et al. (62) estudiaron la autooxidación de la mantequilla de maní midiendo el
valor del peróxido y el aumento en la absorción a 234 nm debido a la conjugación del
dieno. Concluyeron que el método del hidroperóxido de dieno conjugado (CDHP) se puede
usar como un índice de envejecimiento progresivo en lugar de, o además del, valor de
peróxido. El método CDHP es más rápido que el método del valor del peróxido, es mucho
más simple, no requiere reactivos químicos, no depende de la reacción química o del
desarrollo del color, y puede realizarse en muestras más pequeñas. Este método es
aplicable para el análisis de peróxidos en productos de aceites vegetales que contienen
ácidos grasos poliinsaturados.
Un artículo reciente de Parr y Swoboda (67) describe un nuevo procedimiento analítico
para determinar la oxidación de lípidos en alimentos almacenados. En este ensayo, los
hidroperóxidos de los ácidos grasos polienoicos así como los compuestos hidroxilados y
carbonílicos derivados de ellos se convierten mediante dos pasos de reacción química,
primera reducción y luego deshidratación, en cromóforos más conjugados. Estos
producen "productos de oxidación conjugables" que se miden juntos y se expresan como
el "valor C.O.P." El primer paso del procedimiento analítico, la reducción con borohidruro
de sodio, da como resultado la desaparición de la característica absorción ultravioleta de
los compuestos de carbonilo de los ácidos grasos polienoicos oxidados (oxodienos). La
disminución en la absorbancia a 275 nm se conoce como el valor de oxodieno. Otra
característica de este ensayo es que distingue entre los productos de oxidación derivados
de ácidos grasos dienoicos y los de ácidos grasos polienoicos más altamente insaturados y
esto se mide mediante la "relación C.O.P.". Estos autores aplicaron este ensayo a
alimentos y grasas tanto frescos como almacenados y compararon sus resultados con el
valor de peróxido tradicional. Se concluyó que el valor de peróxido y el C.O.P. valor tenía
el mismo nivel de importancia numérica.

Fluorescencia

Recientemente, se ha mostrado interés en la detección de productos de oxidación

mediante métodos fluorescentes. Estos métodos se han aplicado principalmente como
una medida para determinar el grado de daño por oxidación de lípidos en tejidos
biológicos. Tappel y colaboradores han establecido que los compuestos fluorescentes con
la estructura general de un 1.amino-3-iminopropeno N, N-disustituido (R - N = CH - CH =
CH - NH - R) pueden desarrollarse a través de la interacción de la peroxidación lípidos y
constituyentes celulares tales como ciertos fosfolípidos (68), ácido desoxirribenucleico
(69), ribonucleasa (70) y proteínas que tienen grupos amino libres (71). Se han reportado
varias ventajas del método de fluorescencia como un medio para medir la oxidación de
lípidos (70). El método que es muy sensible puede detectar compuestos fluorescentes a
un nivel de una parte por mil millones y se encontró que era de 10 a 100 veces más
sensible que el ensayo de TBA. El desarrollo de la fluorescencia estrechamente la
absorción de oxígeno parellels incluso en las últimas etapas de la peroxidación, y también
se puede utilizar para evaluar cuantitativamente el daño acumulado en muestras
biológicas.
DiUard y Tappel (71) examinaron la producción de cromóforos fluorescentes que
atribuyen a la reacción de un grupo amino con compuestos de carbonilo, principalmente
malonaldehído. Observaron que el producto monosubstituido no exhibía fluorescencia ya
que esto requería una estructura de base de Schiff conjugada (Fig. 4). Buttkus y Rose (39)
informaron que el desarrollo de fluorescencia dependía no solo de si se formaban
productos de condensación entre malonaldehído y el grupo amino libre de un compuesto,
sino también sobre la naturaleza de los sustituyentes de los grupos amino. También se
observaron diferentes máximos de excitación y emisión con diferentes productos de
condensación.
La investigación en el desarrollo de compuestos fluorescentes a partir de lípidos oxidixed
está en curso y se necesita mucho más trabajo antes de que se pueda evaluar de manera
adecuada el potencial completo de este método. Trombly y Tappel (72) han indicado que
el análisis definitivo de los productos fluorescentes purificados de la oxidación de lípidos
no puede realizarse por medio de la caracterización fluorescente sola. La cromatografía en
capa fina preparativa de los componentes fluorescentes solubles en lípidos para el análisis
por espectrometría de infrarrojos o por cromatografía de gases / espectrometría de masas
podría proporcionar la definición estructural de las principales especies fluorescentes que
resultan del daño peroxidativo de los lípidos. Este método es muy efectivo para el análisis
de los productos de oxidación.

Espectroscopia infrarroja

La espectroscopía infrarroja tiene un valor particular en el reconocimiento de grupos

funcionales inusuales y en el estudio de ácidos grasos con dobles enlaces trans (73). A
medida que los compuestos formados durante la oxidación de las grasas cambian, es
posible utilizar la espectroscopía infrarroja para seguir el curso de la oxidación. El
significado de la espectroscopia de absorción infrarroja fue resumido por O'Connor (74).
Informó que (a) la aparición de bandas a aproximadamente 2.93 / a indicaba la formación
de hidroperóxidos; (b) la desaparición de la banda en 3.2 / a indicó la sustitución del
hidrógeno en un doble enlace con algún otro radical, lo que probablemente indica
polimerización; (c) la aparición de bandas adicionales a aproximadamente 5,72 / a éster C
= O estiramiento indica la formación de aldehídos, cetonas o ácidos, y (d) cambios en las
bandas en la región 10 a 11 / a indica cis, isomerizaciones trans y probablemente
formación de enlaces conjugados.
Henick (75) aplicó análisis infrarrojo para determinar los productos de oxidación en la
grasa láctea. Las características espectrales se detectaron antes de que se desarrollaran
los sabores extraños, y tanto la pérdida de sabor como el desarrollo de sabores extraños
se correlacionaron con bandas de absorción definidas. Aiders y McTaggart (76) indicaron
que los métodos infrarrojos eran simples, de funcionamiento rápido y requerían solo
pequeñas cantidades de muestra (20 mg). Afirmaron que la precisión de cada
determinación era similar a la de los métodos químicos convencionales correspondientes.
Sin embargo, las grasas son materiales complejos, por lo tanto, el método infrarrojo solo
es bueno como índice cualitativo, especialmente en la inducción y en los primeros
períodos de formación de peróxido.

Polarografía

Se han desarrollado métodos polarográficos para la cuantificación de peróxidos de grasas,

éteres e hidrocarburos (77). En las primeras etapas de la oxidación de las grasas, existe
una relación lineal entre la altura de las olas y el valor del peróxido. La precisión de esta
técnica está dentro del 5% para las grasas con un índice de peróxido de 5 o más. Existe
una relación lineal entre el valor de peróxido determinado por un método de Wheeler
modificado y la altura de la ola hasta que el valor de peróxido excede de 250. Después de
eso, la altura de la ola no aumenta tan rápidamente como los valores de peróxido. Este
método parece ser más beneficioso para un estudio de las primeras etapas de la oxidación
de grasas.
Ricciuti et al. (78) compararon el método polargráfico con los métodos químicos Wheeler
yodo y cloruro estannoso. Estos tres métodos dieron resultados que no fueron
significativamente diferentes para el hidroperóxido de alta pureza, pero con productos
impuros, el método polarográfico puede dar valores más confiables porque es más
específico que los procedimientos químicos.
El método polarográfico puede diferenciar entre las estructuras de peróxido, -0-0 y -00H y
dar resultados más precisos que otros métodos para evaluar los peróxidos. Sin embargo,
esta técnica no se usa ampliamente en la industria de control de calidad.

Cromatografía de gases

La cromatografía de gases se ha utilizado más ampliamente en la separación e

identificación de los productos de la oxidación de lípidos en sistemas modelo para
dilucidar los mecanismos de oxidación. Sin embargo, algunos autores han desarrollado
procedimientos de cromatografía de gases para medir la rancidez en aceites vegetales,
carne picada y queso (79-83).
Los estudios de oxidación con linoleato de metilo (84) y aceite de soja (85) revelaron que
los hidrocarburos saturados surgen temprano durante la autooxidación cuando los
aldehídos están ausentes o no son detectables. Evans y col. (86) informaron que el
pentano es el hidrocarburo de cadena corta predominante que surge por la
descomposición térmica. Las correlaciones de las puntuaciones de sabor y la formación de
pentano se han utilizado para determinar la rancidez de los aceites después de inyectar
directamente los aceites en una columna de cromatografía de gases (82,87). Un estudio
posterior de Warner et al. (88) mostraron que se obtuvieron correlaciones significativas
entre la cantidad de pentano desarrollado y el número de descripciones rancias de aceites
vegetales envejecidos y patatas fritas. Las muestras necesitaban solo 0.08 ppm en el
espacio de cabeza para ser descritas como rancias por el 90% del panel. Tanto los aceites
como las astillas fueron más estables para el desarrollo de pentano a medida que
disminuía el contenido de linoleato y el valor de yodo.
Jarvi et al. (82) también diseñó un método para medir el desarrollo de ranciedad en aceite
de soja mediante cromatografía de gases. Informaron que cantidades muy pequeñas de
hidroperóxidos, demasiado pequeñas para ser detectadas por análisis de valores de
peróxido, pueden detectarse visualmente mediante cromatografía de gases. Se desarrolló
una ecuación para correlacionar las puntuaciones del panel de sabor con el valor de
oxidación medido por cromatografía de gases.
La cromatografía de gases puede ser muy útil para determinar el grado de enranciamiento
en mezclas puras, como los aceites vegetales. Sin embargo, en el caso de los sistemas
lipídicos más complejos, como los alimentos, las dificultades de identificación y
estandarización probablemente anularán gran parte de esta utilidad.

Refractrometry

Ayra et al. (89) observaron que un fuerte aumento en el índice de refracción coincidió con
la detección de olores rancios. También afirmaron que el índice de refracción cambia de
acuerdo con las tres etapas conocidas de autooxidación de la grasa. En el período de
inducción cuando la formación de peróxido es baja, el índice de refracción se mantuvo
constante. Durante la etapa secundaria de relativamente más formación de peróxido, el
índice de refracción aumentó bruscamente hasta que el valor de peróxido alcanzó un
máximo. Este aumento en el índice de refracción se atribuyó a la conjugación, que se sabe
que precede a la formación de hidroperóxido. En la etapa terciaria de la descomposición
del peróxido, el índice de refracción continuó aumentando a un ritmo constante, siendo el
aumento menos agudo que en la segunda etapa. Se pensó que la polimerización de las
grasas parcialmente oxidadas era responsable de este cambio en el índice de refracción.