Curso de Electroforesis

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TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS Y SUS APLICACIONES
Presentación:
En el presente curso teórico-práctico se discutirán las técnicas electroforéticas, las

cuales han sido utilizadas ampliamente como herramientas fundamentales para la
identificación, purificación y cuantificación de diversas macromoléculas, así como la
separación de células y la orientación y manipulación de nanopartículas. En la
mayoría de las técnicas electroforéticas, la separación se fundamenta en la
movilidad diferencial de las moléculas cargadas presentes en un medio de soporte,
cuanto estas son sometidas a la influencia de un campo eléctrico. La movilidad, es
una propiedad fundamental de una macromolécula, y su valor depende de la
magnitud de su carga, su peso molecular y su forma. Debido a que la mayoría de
los polímeros, tales como las proteínas, los ácidos nucleicos y los polisacáridos,
están cargados, ellos pueden ser separados y cuantificados por los métodos
electroforéticos. Adicionalmente, en las técnicas dielectroforéticas, en las cuales se
aplica un campo eléctrico no-uniforme pueden ser separadas partículas no
cargadas, moléculas de bajo peso molecular, iones, nanopartículas y células.
En la actualidad, diversas técnicas electroforéticas son utilizadas como

herramientas rutinarias por los sectores académicos, clínicos e industriales. Las
industrias agropecuarias, de procesamiento de alimentos, farmacéutica y
biotecnológica, y las áreas biomédicas, incluyendo medicina forense,
investigaciones clínicas, farmacología, ciencias veterinarias, así como la química de
proteínas (metabolómica, proteómica) y las áreas de investigación medioambiental.
En estas, la electroforesis es esencial para: 1) Purificación, identificación y
caracterización de iones, moléculas de bajo peso molecular, macrómoléculas;
moléculas neutras y células; 2) Control de calidad de fármacos y bioanálisis; 3)
Análisis de proteínas intactas; 4) Autentificación y control de calidad de alimentos y
bebidas; 5) Análisis forense; 6) Análisis de microorganismos patógenos; 7) Análisis
de contaminantes; 8) Secuenciación de ácidos nucleicos; entre otras aplicaciones.
Durante la parte teórica de este curso se discutirán procedimientos y técnicas

básicas, como la electroforesis SDS-PAGE y la electroforesis en geles de agarosa
para DNA, como otros de nivel algo más avanzado, como la electroforesis capilar,
la electroforesis en gel en campo pulsado, la dielectroforesis y la electroforesis por
microfluídica. Estas últimas técnicas proporcionan resoluciones extremadamente
elevadas, en especial para el análisis farmacéutico y de alimentos, lo cual ha
permitido que los límites de detección desciendan al nivel de cuantificación de
zeptomoles. Asimismo, se discuten diferentes métodos para la detección de
proteínas después del proceso electroforético.
En lo que corresponde a la parte práctica, el objetivo principal es que los

participantes puedan preparar las soluciones y buffer necesarios para los ensayos
de electroforesis, y puedan realizar diferentes variantes de las técnicas
electroforéticas de SDS-PAGE para la separación de proteínas, electroforesis en
geles de agarosa para la separación de ácidos nucleicos y la visualización de
2
proteínas en los geles y membranas, a fin de que los participantes logren realizar
las metodologías de manera consistente, reproducible y segura, obteniendo
resultados de altísima calidad.
LUGAR DONDE SE DICTARÁ EL CURSO:
Unidad de Biotecnología, Piso 1 de la Facultad de Farmacia, Universidad Central

de Venezuela.
CARGA HORARIA Y EVALUACIÓN:
El curso teórico-práctico tendrá una duración de 50 horas. En total serán 20 horas

teóricas y 30 horas prácticas (por grupo). Horario a convenir con la Empresa
EspromedBio C.A. Al finalizar el curso, se realizará una evaluación, cuya aprobación
le permitirá acceder al certificado de aprobación de curso correspondiente si así lo
desea.
NÚMERO DE CURSANTES: Se sugiere un máximo de 25 participantes en la parte

teórica y 10 personas por grupo en la parte práctica.
PERFIL DE LOS CURSANTES: Para el mayor aprovechamiento del curso se

recomienda que los cursantes sean graduados o cursantes en carreras técnicas o
profesionales del área de la salud y o afines (Farmacia, Biología, Medicina,
Bioanálisis, Enfermería, Odontología, Veterinaria, Química, Ingeniería).
OBJETIVOS:
 Conocer los principales métodos utilizados para la obtención, extracción,

enriquecimiento y purificación de proteínas y ácidos nucleicos.
 Discutir los fundamentos teóricos de las diferentes técnicas electroforéticas

y sus aplicaciones en la identificación y purificación de ácidos nucleicos,
polisacáridos y proteínas.
 Conocer los diferentes métodos de detección de proteínas y ácidos nucleicos

en geles y membranas.
 Discutir los métodos dielectroforeticos y sus aplicaciones en la identificación,

cuantificación y purificación de ADN y células.
 Aplicar las técnicas electroforéticas y de detección para la identificación de

proteínas y ácidos nucleicos en el laboratorio.
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PROGRAMA TEÓRICO:
 Principios para el estudio de proteínas.
o Métodos de obtención, extracción, purificación y enriquecimiento de

proteínas.
o Métodos de cuantificación de proteínas: Lowry, Bradford, ácido

bicinchoninico (BCA).
 Principios para el estudio de ácidos nucleicos.
o Métodos de obtención, extracción, purificación y enriquecimiento de

ADN y ARN.
o Métodos de cuantificación de ADN: Ácido diamino benzoico (DABA),

difenilamina (DPA), espectroscopía con luz ultravioleta y visible. Uso
de sondas fluorescentes. electroforesis, PCR.
o Métodos para la cuantificación de ARN: Ensayo de orcinol,

espectroscopía con luz ultravioleta y visible. Uso de sondas
fluorescentes. electroforesis, PCR.
 Fundamentos de las técnicas electroforéticas.
o Teoría de la electroforesis.
o Métodos de electroforesis. Electroforesis en disolución libre.

Electroforesis con medios de soportes (electroforesis zonal).
 Electroforesis en papel.
 Electroforesis en gel en columna y en placa. Sistemas continuo y

discontinuo.
o Tipos de geles: agar, almidón, poliacrilamida, agarosa, agarosa-

poliacrilamida.
o Instrumentación para la electroforesis en geles. Fuentes de poder.

Cámaras de separación. Sistemas verticales. Sistemas horizontales.
Transiluminador. Otros.
 Fundamentos y aplicaciones de las técnicas electroforéticas para la

separación de ácidos nucleicos en geles de agarosa y poliacrilamida.
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o Aplicaciones de la electroforesis de ácidos nucleicos en geles de

agarosa.
o Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de poliacrilamida.
o Métodos de detección de ácidos nucleicos: Técnicas de hibridación y

sondas génicas. Northern y Southern blot.
o Técnica de huella digital de ADN.
 Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).
o Fundamento de la PFGE. Electroforesis de campo eléctrico

homogéneo restringido al contorno. Electroforesis en gel de campo
alternante ortogonal. Electroforesis en gel de inversión de campo.
Otros tipos de PFGE.
o Uso de la PFGE para el monitoreo y control de enfermedades

bacterianas.
o Electroforesis en gel de campo pulsado en el estudio de la

epidemiología molecular de Listeria monocytogenes.
o Aplicaciones de la PFGE para el genotipaje de bacterias patogénicas

en alimentos.
 Fundamentos y aplicaciones de las técnicas electroforéticas en geles de

poliacrilamida para la separación de proteínas.
o Separación electroforética de proteínas nativas. Blue Native PAGE.
o Electroforesis en geles de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida(SDS-

PAGE).
o Electroforesis con detergentes catiónicos, cetiltrimetilamonio (CTAB-

PAGE).
o Separación electroforética de proteínas de elevado peso molecular en

geles de SDS y agarosa.
o Tinción y detección de las bandas electroforéticas: Tinción con amido

black, azul de Coomassie brillante, azul de Coomassie brillante
coloidal, plata coloidal, plata amoniacal y nitrato de plata. Marcaje
fluorescente.
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o Transferencias de proteínas a membranas de nitrocelusosa y PVDF.

Western blotting. Stripping y Reprobing.
 Enfoque isoeléctrico y electroforesis en dos dimensiones.
o Fundamentos del isoelectroenfoque. Geles para isoelectroenfoque.

Detección de proteínas.
o Electroforesis en geles de poliacrilamida en dos dimensiones (2D-

PAGE).
o Electroforesis en geles de agarosa de dos dimensiones.
o Electroforesis en gel diferencial de dos dimensiones (2D-DIGE).
 Electroforesis capilar.
o Fundamento. Electroósmosis. Muestra y componentes para su

elución. Detectores de electroforesis capilar.
o Electroforesis capilar zonal (CZE).
o Electroforesis capilar en geles de poliacrilamida (CE-PAGE).
o Enfoque isoeléctrico capilar (CIEF).
o Aplicaciones de la electroforesis capilar en los procesos de PCR en

tiempo real y secuenciación de nueva generación.
o Electroforesis capilar acoplado con espectrometría de masas en el

análisis de: Fármacos, bioanálisis, proteínas intactas, alimentos,
foodómica, toxicología forense, metabolómica, proteómica y
metabolómica clínica.
o Métodos de electroforesis por microfluídica. Desarrollos recientes de

electroforesis capilar de Microchip acoplado con espectrometría de
masas.
 Dielectroforesis (DEP).
o Fundamentos y propiedades. Fuerza dielectroforética. Dielectroforesis

celular.
o Aplicaciones de la dielectroforesis.
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o Dielectroforesis en la tecnología de la microfluídica. Aplicaciones para

la caracterización, manipulación, separación y modelado de células.
o Ensayo cometa (ensayo de electroforesis en gel de células

individuales o electroforesis unicelular en gel).
 Inmunoelectroforesis.
o Fundamentos y tipos de las técnicas inmunoelectroforéticas.

Electroforesis zonal/inmunodifusión.
o Contrainmunoelectroforesis.
o Análisis inmunoelectroforético (Inmunoelectroforesis de una

dimensión).
o Inmunoelectroforesis cruzada (Inmunoelectroforesis cuantitativa en

dos dimensiones).
o Inmunoelectroforesis en cohete y métodos relacionados.
 Isotacoforesis o electroforesis de desplazamiento
o Principio de la isotacoforesis.
o Aplicaciones. Migración de todos los iones con la misma velocidad.
o Separación de los componentes como un “tren de iones”.
o Isotacoforesis capilar (CITP).
o Microchips basados en isotacoforesis.
 Electroforesis de afinidad.
o Antecedentes y fundamentos.
o Electroforesis de afinidad capilar (CAE).
o Electroforesis en geles de poliacrilamida con trampa de afinidad (AT-

PAGE).
o Electroforesis de afinidad de sacáridos y lectinas. Caracterización de

glicoproteínas por electroforesis de afinidad.
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o Electroforesis de afinidad de fosfatos.
o Isotacoforesis de afinidad en membranas porosas.
o Aplicaciones clínicas de la electroforesis de afinidad.
 Evaluación del desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA).
o Fundamento. Evaluación de la interacción entre proteínas y ácidos

nucleicos. Interacción ARN-ARN.
o EMSA en geles de poliacrilamida. EMSA en geles de agarosa.
PROGRAMA PRÁCTICO:
 Práctica 1: Preparación de soluciones buffer y demás reactivos utilizados en

las técnicas electroforéticas y de detección.
 Práctica 2: Cuantificación de proteínas por el método de Bradford y el

método del BCA.
 Práctica 3: Preparación de geles de SDS-PAGE y agarosa.
 Práctica 4: Electroforesis en geles de SDS-PAGE. Secado de geles.
 Práctica 5: Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida utilizando azul de

Coomassie brillante y nitrato de plata.
 Práctica 6: Transferencia electroforética de proteínas desde los geles de

SDS-PAGE a membranas de nitrocelulosa y difloruro de polivinilideno
(PVDF). Análisis de western blotting.
 Práctica 7: Electroforesis de ADN en geles de agarosa.
Análisis y discusión final.

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FACILITADORES:
 Dr. Michael Mijares, Unidad de Biotecnología, Facultad de Farmacia UCV.

Instituto de Inmunología, Facultad de Medicina UCV.
 Dra. Gricelis Martínez, Facultad de Farmacia UCV.
 Dra. Carmen Duque, Unidad de Biotecnología, Facultad de Farmacia UCV.

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TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS Y SUS APLICACIONES

En el presente curso teórico-práctico se discutirán las técnicas electroforéticas, las

En la actualidad, diversas técnicas electroforéticas son utilizadas como

Durante la parte teórica de este curso se discutirán procedimientos y técnicas

En lo que corresponde a la parte práctica, el objetivo principal es que los

LUGAR DONDE SE DICTARÁ EL CURSO:

Unidad de Biotecnología, Piso 1 de la Facultad de Farmacia, Universidad Central

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El curso teórico-práctico tendrá una duración de 50 horas. En total serán 20 horas

NÚMERO DE CURSANTES: Se sugiere un máximo de 25 participantes en la parte

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 Conocer los principales métodos utilizados para la obtención, extracción,

 Discutir los fundamentos teóricos de las diferentes técnicas electroforéticas

 Conocer los diferentes métodos de detección de proteínas y ácidos nucleicos

 Discutir los métodos dielectroforeticos y sus aplicaciones en la identificación,

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 Fundamentos de las técnicas electroforéticas.

o Métodos de electroforesis. Electroforesis en disolución libre.

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 Enfoque isoeléctrico y electroforesis en dos dimensiones.

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