TECNOLOGÍA DEL ADN

RECOMBINANTE

Blga. Maribel Huatuco Lozano

 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

Aislamiento y manipulación de fragmentos

de ADN de un organismo para introducirlo
en otro (ADN recombinante)

Nathans D., Arber W., y Smith H.

(premio Nobel de Fisiología y Medicina
en 1978 por el descubrimiento de las
enzimas de restricción y su aplicación en
Genética Molecular).
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
Preparación de la secuencia del ADN para su clonación
 Preparación de un vector de clonación

• Una pequeña secuencia de ADN fácil de aislar, como un plásmido, también

puede usarse un cósmido, un virus.
Formación del ADN Recombinante

Introducción del ADN recombinante en la célula anfitriona

Propagación del cultivo

Detección y selección de los clones recombinantes
1

Plásmido

gen de resistencia
a la ampicilina

2 3
Plásmidos
Extremos cohesivos

Molécula de ADN recombinante

1

Virus
2 3
Molécula A Molécula B

Digestión de ambas moléculas con la

misma enzima de restricción, BamHI

Extremos
cohesivos

Mezclar

Tratar con ADN-ligasa

ADN recombinante
BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
TRANSGÉNICOS

Blga. Maribel Huatuco Lozano

 PRINCIPALES TÉCNICAS DE BIOTECNOLOGÍA
VEGETAL

 Las técnicas empleadas en la generación de

plantas transgénicas son diferentes si se
pretende expresar genes exógenos en la planta o
si, por el contrario, se busca alterar la expresión
de genes del organismo.
 Para conseguir una transformación eficiente de
un tejido vegetal es preciso satisfacer los
siguientes requisitos:
 TÉCNICAS PRINCIPALES DE BIOTECNOLOGÍA
VEGETAL

 Debe existir un método eficiente de introducción

de ADN en el tejido vegetal.
 Debe existir un marcador que permita seleccionar
eficazmente los tejidos transformados.
 Debe ser técnicamente posible la propagación y la
regeneración del tejido diana, y posteriormente
de plantas fértiles a partir del tejido transgénico.
Cultivo in vitro.
 Proceso de transformación simple, eficaz,
reproducible, económico e independiente del
genotipo del organismo utilizado.
 Proceso corto en el tiempo para evitar en lo
posible la variación somaclonal y la esterilidad.
 ADN EXÓGENO

 Preparación del ADN exógeno

Requiere los siguientes

componentes:
 Transgen
 Promotor
 Marcador de selección
 Marcador testigo
 MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN

A.- Métodos de Transformación Biológica

Transformación con Agrobacterium:
 Agrobacterium tumefaciens

 Agrobacterium rhizogenes
Otro método que se desarrolló, esta basado en una estrategia para
el control de plagas.
El objetivo esta en proveer resistencia a las plantas, incorporando
genes de la toxina natural de la bacteria Bacillus Thuringiensis
(Bt).
Esta toxina proteica afecta a ciertas larvas que tienen aparato
bucal masticador y producen graves daños a los cultivos, causando
su parálisis y muerte.
Cuando la planta posee ese gen, produce la toxina y, de esta forma,
se protege ante el ataque de los insectos.

Este es el porqué al
maíz modificado
genéticamente se le
llama maíz Bt.
 MÉTODOS DE TRANSFORMACIÓN

B.- Métodos Físicos de Transformación

Transformación de Protoplastos:
Los protoplastos son células desnudas que han perdido la
pared celular. Pueden aislarse generalemnte de cultivos de
callos. La entrada de ADN exógeno en el protoplasto puede
conseguirse utilizando diversos métodos:
 Electroporación
 Tratamiento con Polietilenglicol
 Transformación con Liposomas
 Biolística
 Transformación mediada por láser
 Femtoinyección
 Abrasión con fibras
TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM

 Transformación de la célula vegetal con el

plásmido Ti de A. tumefaciens
TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM

Agrobacterium tumefaciens es patógena de plantas. Produce tumores

Agrobacterium
núcleo
Plásmido Ti
inductor de tumores cromosoma
contiene oncogenes
(genes onc)

cromosoma

célula
Ingeniero vegetal
genético natural
tras sutitución de
genes onc por tumores
genes de interés Proliferación de
hormonas crecimiento.
Se forman tumores en
las zonas de la lesión
TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM
TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM
TRANSFORMACIÓN BIOLÓGICA CON AGROBACTERIUM

Transformación de la célula vegetal con el

plásmido Ti de A. rhizogenes

A. rhizogenes es un patógeno vegetal que da lugar a una

proliferación radicular anormal en las plantas
infectadas.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN
o Electroporación

Se basa en la aplicación de pulsos

eléctricos cortos y de alto voltaje
en la membrana celular, esto
hace que aparezcan de forma
temporal poros que van a
permitir la entrada en el interior
de la célula de macromoléculas
presentes en la solución
extracelular. Este proceso
permite a las células suspendidas
en un tampón con plásmidos de
DNA incorporar al interior
celular el ADN tras la
electroporación, resultando en
una trasformación transitoria o
estable.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN

 Tratamiento con Polietilenglicol (PEG)

Un agente fusagénico que modifica químicamente

las membranas al interaccionar con los fosfolípidos
que las componen, permite la entrada del ADN
exógeno en suspensión presente en el medio. El
mecanismo de la captación de DNA implica la
contracción del volumen del protoplasto debido a la
alta presión osmótica originada por el PEG, seguido
de la creación de vesículas endocíticas que
incorporan el complejo catión/DNA.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN
 Biolística
La técnica consiste en bañar
partículas esféricas de oro o tungsteno
(aproximadamente de 0,4-1,2
micrómetros de diámetro, o del
tamaño de algunas células
bacterianas) con DNA, el cual ha sido
precipitado con CaCl2, espermidina o
polietilenglicol. Las partículas
bañadas con DNA son aceleradas a
altas velocidades (300-600 metros /
segundo) con un equipo especial
llamado pistola de partículas (o pistola
de genes).
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN
 Biolística
Los proyectiles acelerados van a
penetrar la pared celular y la
membrana de la célula, aunque
la densidad de partículas
utilizadas no va a resultar
significativamente dañina para
la misma. El alcance de la
penetración de las partículas en
las células vegetales puede ser
controlada variando la intensidad
del estallido, alterando la
distancia que las partículas han
de atravesar para alcanzar la
célula o utilizando partículas de
diferentes tamaños.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN

 Transformación con liposomas

Se emplean liposomas artificiales en cuyo interior
viaja la suspensión de moléculas de ADN.
 Transformación mediada por láser
Esta técnica supone la apertura de microorificios
mediante un haz de láser, por los que se facilita
la penetración de ADN desnudo en el interior de
la célula.
 Abrasión con fibras
Consiste en la apertura de entradas permanentes en
las paredes y membranas celulares mediante la
mezcla a alta velocidad de células vegetales y fibras
abrasivas, generalmente de carburo de silicona,
recubiertas de ADN.
 MÉTODOS FÍSICOS DE TRANSFORMACIÓN

 Femtoinyección
La transferencia del transgén es mediante una
microinyección de ADN con una femtojeringa de
expansión con galinstano, que consiste en un
microcapilar de borosilicato o cuarzo sellado y cuya
punta tiene un diámetro de tan solo 0.1 µm.
ADN ENDÓGENO

 Silenciamiento génico
Son técnicas capaces de impedir la expresión de un gen
endógeno.
Pueden destacarse las siguientes:

 ARN antisentido.- Consiste en la síntesis de ARNm

complementario al del gen cuya expresión se desea inactivar.
Apartir del ARN antisentido se generan moléculas de ARN
bicatenario que son escindidas y actúan como ARNm que no
pueden ser traducidos.

 Ribozimas.-Por ingeniería genética se sintetiza ribozimas

especificas capaces de degradar ARNm de cualquier gen que se
desea silenciar en forma especifica.
Blga. Maribel Huatuco Lozano
Según la OMS son organismos en los
cuales el material genético a sido alterado
de un modo artificial por medio de
biotecnología que permite transferir genes
seleccionados de un organismo a otro ,
incluso entre especies no relacionadas
 Los alimentos transgénicos son
semillas, cultivos o ingredientes
modificados por medio de ingeniería
genética
 En 1990 se inicia la
transformación del
maíz usando el
bombardeo
de macropartículas

Se crea el primer
algodón tolerante al
herbicida Bromoxynil
1995 la FDA aprueba el primer
producto GM para consumo humano:
el tomate de maduración retardada

Flavr
Savr
¿PORQUE SE PRODUCEN LOS ALIMENTOS TRANSGÉNICOS?

Esto tiene como objetivo traducirse en un

producto con un menor precio, mayores
beneficios (en términos de durabilidad o
valor nutricional) o ambos.
Los cultivos GM tienen
como objetivo principal
aumentar el nivel de
protección de los cultivos
mediante la
introducción de
resistencia a
enfermedades causadas
por insectos o virus a los
vegetales o mediante
una mayor tolerancia a
los herbicidas.
El Herbicida glifosfato es
efectivo a muy bajas
concentraciones, no es tóxico
para humanos y los
microorganismos del suelo lo
degradan rápidamente.

El gliofosfato mata las plantas

inhibiendo la acción de la
enzima de los cloroplastos
denominada EPSP sintetaza
Para producir una planta resistente a glifosfato:

Las plantas GM que producían

EPSP sintetasa crecieron y
desarrollaron, mientras que las
plantas control se marchitaron
• Aisló el gen EPSP.
• Este gen se clonó en un vector
1

• Se transfirió a en la bacteria Agrobacterium

tumefaciens
2

• Se infectaron células en discos cortados de la planta y

se hizo crecer en presencia de glifosfato, rociandolas
3 con cantidades hasta 4 veces mayores de glifosfato
Muchos cultivos son
deficientes en algunos de
los nutrientes requeridos
en la dieta humana, y se
esta usando la
biotecnología para
producir cultivos que
cumplan con estos
requisitos dietéticos.
Un ejemplo es la producción
de «arroz dorado» con
niveles incrementados de β-
caroteno, un precursor de la
vitamina A.

La deficiencia de vit A se da
en muchas áreas de Asia y
África, provocado ceguera en
niños.
Los tres temas principales debatidos son
las tendencias a provocar una reacción
alérgica (alergenicidad), la transferencia
de genes y el cruzamiento lejano
(outcrossing).
Alergenicidad
Los cultivos GM pueden introducir
nuevos compuestos que produzcan
alergias. Cuando se transfiere a una
planta ADN de una especie con
propiedades alergénicas, existe riesgo de
que el consumo de la variedad GM
provoque alergias.
Alergenicidad
Lo grave es que también pueden
producirse reacciones alérgicas a nuevas
proteínas procedentes de una especie que
no tenga un historial de efectos
alergénicos. Hay que tener en cuenta que
se están introduciendo proteínas
derivadas de bacterias, virus, insectos,
etc, de otras especies que nunca han
formado parte de la alimentación humana
La transferencia genética de alimentos
GM a células del organismo o a bacterias
del tracto gastrointestinal causarían
preocupación si el material genético
transferido afectara en forma adversa a la
salud humana. Esto sería relevante si
fueran a transferirse genes de resistencia
a antibióticos usados para crear GM.
El desplazamiento de genes de vegetales
GM a cultivos convencionales o especies
silvestres relacionadas (“outcrossing”), así
como la combinación de cultivos
provenientes de semillas convencionales
con aquellos desarrollados usando
cultivos GM, puede tener un efecto
indirecto sobre la inocuidad y la
seguridad de los alimentos.
Este riesgo es real, como se demostró
cuando aparecieron rastros de un tipo de
maíz que sólo fue aprobado para
alimentación animal en productos del
maíz para consumo humano en los
Estados Unidos de América.
Muchos países han adoptado estrategias
para reducir la combinación, incluyendo
una clara separación delos campos dentro
de los cuales se desarrollan cultivos GM y
cultivos convencionales.

Este entrecruzamiento con plantas

silvestres, nos puede resultar con una
perdida de las especies naturales.
¿QUÉ TIPO DE REGULACIONES EXISTEN?
Regulación Normativa internacional

Declaración de Río de Janeiro (1992)

• Principio Precautorio

Convenio sobre Diversidad Biológica

• Conservación y cuidado del medio ambiente

Protocolo de Cartagena

• Marco Regulador específico $

Regulación Normativa internacional
Protocolo de Cartagena

Principio de Precaución

Bases de legislación internacional

Etiquetado: “puede contener…”

Regulación Normativa internacional

Evaluaciones que
incluyen la
identificación de niveles
de nutrientes, anti
nutrientes y posibles
toxinas y alérgenos en
todo tipo de plantas de
cultivo.
Regulación Normativa internacional

Iniciativa Europea

La alteración genética debe ser necesaria

y útil

Seguros para la salud

Que sus características se mantengan en

el tiempo

Etiquetado identificativo