UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

ICBS - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

SETOR DE MICROBIOLOGIA

Disciplina Microbiologia
Professora responsável: Profa. Dra. Fernanda Maranhão

Coloração de GRAM e ZIEHL-NEELSEN

Objetivo: Conhecer e manejar o microscópio óptico; Conhecer os princípios das técnicas de

coloração básicas (Gram e Ziehl-Neelsen), que utilizam preparações a fresco para visualização em
microscópio óptico; Executar os procedimentos de colorações de Gram.

1. Coloração de Gram
A coloração de Gram é diferencial, através da qual as bactérias são classificadas como Gram
positivas ou Gram negativas, dependendo da retenção ou não do corante cristal-violeta de acordo
com as características da parede celular.

Reagentes Material

- Solução de cristal violeta - Suspensão bacteriana

- Solução de lugol (Iodeto de potássio; KI) - Lâminas e lamínulas; lápis
- Solução álcool absoluto - Swab; Alça de inoculação
- Solução de safranina/fucsina - Bico de Busen; pinças; papel absorvente
- Microscópio óptico; óleo de imersão

· Preparo (observando as precauções de assepsia)

a) Limpar bem uma lâmina de vidro, (algodão com álcool).

b) Ao manipular cultura em meio líquido, captar uma pequena porção com alça de
inoculação, e colocá-la sobre a lâmina espalhando-a.
c) Fixar o esfregaço passando a lâmina 3x sobre a chama. Esfriar

· Método de coloração de Gram

a) Cobrir o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta: 1 minuto.

b) Remover o excesso da solução de cristal violeta da lâmina, em pouca água corrente.
c) Cobrir o esfregaço com solução de lugol: 1 minuto. Remover excesso com água.
d) Descorar o esfregaço usando uma solução de álcool – acetona (gotejar a solução até
que não saia mais o corante, ou deixar sobre a lâmina por 30 segundos).
e) Cobrir o esfregaço com solução de safranina ou fucsina: 30 segundos.
f) Lavar levemente com água corrente. Secar com papel absorvente (ou ar livre) e
cobrir com lamínula. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100x).

· Resultados

As bactérias Gram positivas se coram de roxo, enquanto àquelas Gram negativas se

coram de rosa.
 UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS
ICBS - INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
SETOR DE MICROBIOLOGIA

Disciplina: Microbiologia
Professora responsável: Profa. Dra. Fernanda Maranhão
.

2. Coloração de Ziehl-Neelsen
É a coloração utilizada para identificar micobactérias, bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) como
o agente da tuberculose, Mycobacterium tuberculosis. Tais microrganismos possuem a parede celular
rica em lipídeos (cerca de 60% de ácido micólico).

CORANTES E REAGENTES

Carbolfucsina Álcool-ácido Solução de Azul de Metileno

Fucsina básica 3 g HCl 3 mL Azul de Metileno 0,3 g

Etanol 10 mL Etanol 97 mL H2O 100 mL
Fenol (5%) 90 mL

· Preparo (observando as precauções de assepsia) e coloração de Ziehl-

Neelsen

a. Cobrir o esfregaço, seco e fixado pelo calor, com a fucsina de Ziehl (carbolfucsina).
b. Aquecer a lâmina durante 3 a 5 minutos, até à emissão de vapores. Cuidado para não
secar o corante.
c. Enxaguar a lâmina com água e deixar escorrer.
d. Descorar com álcool-ácido até que o corante não seja mais removido.
e. Enxaguar a lâmina com água corrente e deixar escorrer.
f. Efetuar a coloração de contraste com azul de metileno por 30 segundos.
g. Enxaguar a lâmina com água corrente, deixar escorrer e secar ao ar.
h. Examinar ao microscópio usando objetiva de 100x, com imersão em óleo.

· Resultados

O calor altera os lipídeos de membrana e os bacilos álcool-ácido resistentes se coram de

rosa/avermelhado. Deve haver contagem bacilar por campo para determinar nível de
infecção no afetado.

Número total de Número de bacilo álcool-ácido resistente Resultado

campos observados observado por campo

100 Não foram encontrados Negativo

100 Menos de 1 BAAR por campo Positivo (+)
50 De 1 a 10 BAAR por campo Positivo (++)
20 Mais de 10 BAAR por campo Positivo (+++)