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Espectrofotometrı́a
Biosensores
Alumna: Carreño Castillo Marı́a del Carmen
Docente: Juan de Dios Galindo de la Rosa1
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Universidad Autónoma de Querétaro
La espectrofotometrı́a es uno de los métodos experimentales más usados para la detección de
moléculas especı́ficas, se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un
compuesto y su concentración.
1 se muestran las zonas del espectro según la clasificación representar como una reacción quı́mica y en un diagrama
más aceptada. Como se puede observar la zona del visible de energı́a.
(radiaciones percibidas por nuestro ojo) es muy pequeña Para realizar una identificación generalmente se hace
en comparación con la gran amplitud del espectro. Aun- incidir sobre la sustancia estudiada radiaciones electro-
que hablamos de una radiación determinada (Λ), fı́sica- magnéticas de diferente energı́a. Normalmente se estudia
mente es imposible aislar dicha radiación. Siempre po- un rango de radiaciones y se va aumentando (o disminu-
dremos obtener un rango de radiaciones pequeño según yendo) la longitud de onda de las radiaciones incidentes
la exactitud del dispositivo de selección (difractares de desde un extremo del rango hasta el extremo opuesto. Ası́
radiación y filtros), pero nunca una sola. De la misma se obtiene un espectro de absorción de la sustancia, que
manera que no podemos obtener o aislar un punto de se puede representar gráficamente y este espectro es como
una recta, sino un trozo pequeño. una huella digital de esa molécula en donde se encuentran
registrados todos los enlaces y sus transiciones correspon-
dientes. Entonces, si tenemos el espectro de absorción de
B. Espectrofotometrı́a una molécula podemos identificarla con bastante exac-
titud. La gráfica de la probabilidad de absorción contra
La espectrofotometrı́a es una técnica que mide la inter- longitud de onda se denomina espectro de absorción y la
acción de las moléculas con la radiación electromagnéti- espectroscopı́a de absorción se refiere a la adquisición y
ca. La luz que se encuentra en la luz visible y la luz análisis de los datos de absorción.
ultravioleta de los espectros electromagnéticos presenta La absorción de energı́a de longitud de onda Λ resulta
una energı́a de 150- 400 kJmol-1. La energı́a de la luz es de la diferencia de energı́a entre niveles si
usada para promover electrones de un estado de excita-
ción a otro. Un espectro es obtenido cuando la absorción
de luz es medida en función de una frecuencia o longi- hc
λ=
tud. Moléculas con electrones deslocalizados en sistemas E2 − E1
aromáticos a menudo absorben la luz a 150-400 nm (ul-
travioleta) o en la región visible de 400-800 nm. donde E1 es el nivel de energı́a de la molécula antes
La espectrofotometrı́a de absorción es usualmente usa- de la absorción y E2 es un nivel de energı́a alcanzado
da con moléculas disueltas en un solvente transparente. durante la absorción. En cambio entre niveles de energı́a
La absorbancia de un soluto depende linealmente de la se llamatransición, que representa la energı́a requerida
concentración y por consiguiente la espectrofotometrı́a para mover un electrón de una órbita a otra.
de absorción es ideal para hacer mediciones cuantitativas.
La longitud de absorción y la fuerza de absorbancia de Ley de Lambert-Beer
una molécula no sólo depende de la naturaleza quı́mica, La cantidad de radiación electromagnética absorbida por
si no del ambiente molecular en donde se encuentre el un analito se puede relacionar cuantitativamente con la
cromóforo. La espectrofotometrı́a de absorción es por concentración de dichas sustancias en solución. La trans-
lo tanto una excelente técnica para seguir reacciones mitancia (T) se define como la fracción de radiación inci-
de unión a ligando, catálisis enzimáticas y transiciones dente trasmitida por la disolución. Si la potencia radiante
conformacionales en proteı́nas y ácidos nucleicos. Las que incide sobre la disolución es Po y P la potencia ra-
mediciones espectroscópicas son muy sensibles y se diante que sale.
requieren pequeñas muestras de material para el análisis. Transmitancia
Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P)
Las moléculas absorben radiación electro- por una muestra y la energı́a o luz incidente (Po) sobre
magnética ella. Tanto la energı́a radiante incidente como la trans-
Cuando una onda encuentra a una molécula, puede cam- mitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.
biar la dirección de propagación (dispersión) de esa onda,
o puede ser absorbida. En este último caso, una molécula
absorbe un fotón y su energı́a interna aumenta para en- T = P/P0 = 10−abc %T = 100P/P0 (2.1)
trar a un estado inestable, por lo que rápidamente vuelve
a liberar esa energı́a sobrante y vuelve al estado inicial
que es más estable. El estado inicial se denomina estado Absorbancia
fundamental y el estado más energético se llama estado Se define como la cantidad de energı́a radiante absorbida
excitado. La absorción de radiación produce un paso del por una sustancia pura o en solución. Matemáticamente,
estado fundamental al excitado (excitación) y en el pro- corresponde al logaritmo negativo de la transmitancia,
ceso contrario (llamado relajación) hay una liberación de T, expresada como fracción decimal % T, transmitancia
energı́a. Esta energı́a liberada en la relajación puede ser expresada como porcentaje.
en forma de calor o en forma de radiación electromagnéti-
ca otra vez. Este último proceso de desprendimiento de
radiación se llama de emisión. Estos procesos se pueden A = −logT = 2 − log %T A = abc (2.2)
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C. Espectrofotómetros
A. Materiales y equipo
5 matraces de aforado
Espectrofotómetro
B. Reactivos
Figura 6. Gráfico de calibración de solución violeta, a los 590
nm con lı́nea de tendencia.
Solución morada a 1 ppm
y = 0,14629 − 0,03949x
3δ (3)(0,139079970144)
LOD = = = 2,852142391
b 0,14629
Sustraı́do del gráfico y la lı́nea de tendencia, se tiene
que el coeficiente de correlación al cuadrado (R2 ) es de
0.9141, por tanto:
R = 0,9560857702
VI. CONCLUSIÓN
a0 = 0,14629 − ((0,3825)(0,48571)) = −0,03949
La espectrofotometrı́a es un método de gran utilidad
para calcular la curva de calibración, debido a su rapi-
dez, sensibilidad y especificidad, para poder identificar
y = a1 + a0 x los analitos de una muestra desconocida.
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