Biotecnologia Aplicada A La Medicina PDF

BIOTECNOLOGÍA APLICADA
A LA MEDICINA
Jesús A. F.-Tresguerres
Catedrático. Dpto. de Fisiología
Fac. Medicina. Univ. Complutense. Madrid
Vicente Martínez Fernández
Víctor Navas Serrano
Dpto. Médico. Laboratorios Serono. Madrid
BIOTECNOLOGÍA APLICADA
A LA MEDICINA
ERRNVPHGLFRVRUJ
DIAZ DE SANTOS
Reservados todos los derechos.
«No está permitida la reproducción total o parcial de este libro,

ni su tratamiento informático, ni la transmisión de ninguna
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por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso
previo y por escrito de los titulares del Copyright.»
© Jesús A. F.-Tresguerres, 2003
Ediciones Díaz de Santos, S. A.

Doña Juana I de Castilla, 22 28027 Madrid
España
Internet: http://www.diazdesantos.es/ediciones
E-Mail: ediciones@diazdesantos.es
ISBN: 84-7978-543-8
Depósito legal: M. 43.358-2002
Diseño de cubierta: Ángel Calvete

Fotocomposición: FER, S. A.
Impresión: Edigrafos, S. A.
Encuadernación: Rústica-Hilo
Impreso en España
Directores
Jesús A. F.-Tresguerres. Catedrático. Vicente Martínez Fernández. Dpto.
Dpto. de Fisiología. Facultad de Medi- Médico. Laboratorios Serono. Madrid.
cina. Universidad Complutense de Ma-
drid. Víctor Navas Serrano. Dpto. Médico.
Laboratorios Serono. Madrid.
Autores
Elvira Álvarez García. Dpto. Bio- Begoña Ezquieta. Serv. Bioquímica.
química. Facultad de Medicina. Uni- Hospital «Gregorio Marañón». Madrid.
versidad Complutense. Madrid.
Fco. Javier Fernández. Servicio de
Jesús Argente. Unidad de Endocri- Bioquímica. Hospital La Paz. Madrid.
nología Pediátrica. Hospital del Niño
Jesús. Madrid. M.a Cruz García Martín. Dpto.
Bioquímica y Biología Molecular. Facul-
Enrique Blázquez Fernández. Dpto. tad de Medicina. Universidad Complu-
Bioquímica y Biología Molecular. tense. Madrid.
Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid. Josefa P. García-Ruiz. Dpto. Biología
Molecular. Facultad de Ciencias. Uni-
Antonio Campos del Olmo. Dpto.
versidad Autónoma. Madrid.
Biotecnología. Laboratorios Serono.
Trescantos. Madrid.
M.a Luisa Gaspar. Serv. Inmunología.
José Casatorres Hernández. Dpto. C. N. Biología Fundamental. Instituto
Biotenología. Laboratorios Serono. Salud Carlos III. Madrid.
Trescantos. Madrid.
Carlos Jariego. Servicio de Bioquí-
Julie Chowen. Unidad de Endocrinolo- mica. Hospital La Paz. Madrid.
gía Pediátrica. Hospital del Niño Jesús.
Madrid. M.a Jesús Lorenzo-Benayas. Dpto.
Bioquímica Biología Molecular y
Elena Cueva. Servicio de Bioquímica. Genética. Facultad de Veterinaria.
Hospital La Paz. Madrid. Universidad de Extremadura. Cáceres.
VIII BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
Alfredo Martínez Mogarra. Dpto. Isabel Roncero. Dpto. Bioquímica y

Biotecnología. Laboratorios Serono. Biología Molecular. Facultad de Medici-
Trescantos. Madrid. na. Universidad Complutense. Madrid.
David Martínez-Selva. Unidad de Juan Miguel Ruiz Albusac. Dpto.

Investigación Biomédica. Hospital Ma- Bioquímica y Biología Molecular. Fa-
terno Infantil Vall d’Hebron. Barcelona. cultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid.
Oscar Martínez-Tirado. Unidad de
Investigación Biomédica. Hospital Ma- Ángel Santos Ruiz. Dpto. Bioquímica y
terno Infantil Vall d’Hebron. Barcelona. Biología Molecular. Facultad de Medi-
cina. Universidad Complutense. Madrid.
Ruth Millán González. Dpto. de Inmu-
nología. Facultad de Medicina. Univer- Pilar Santisteban. Instituto de In-
sidad Complutense. Madrid. vestigaciones Biomédicas. CSIC. Madrid.
Francina Munell. Unidad de Inves- Bernat Soria Escoms. Instituto de

tigación Biomédica. Hospital Materno Bioingeniería. Universidad Miguel
Infantil Vall d’Hebron. Barcelona. Hernández. Elche. Alicante.
Tomás Pino. Unidad de Investigación Elena Vara. Dpto. Bioquímica y Bio-

Biomédica. Hospital Materno Infantil logía Molecular. Facultad de Medicina.
Vall d’Hebron. Barcelona. Universidad Complutense. Madrid.
José Regueiro. Dpto. Inmunología. José Manuel Varela. Servicio de Bio-

Facultad de Medicina. Universidad química. Hospital La Paz. Madrid.
Complutense. Madrid.
Esther Velázquez Sánchez. Dpto. Bio-
Jaume Reventós. Unidad de Inves- química y Biología Molecular. Facultad
tigación Biomédica. Hospital Materno de Medicina. Universidad Complutense.
Infantil Vall d’Hebron. Barcelona. Madrid.
Presentación
La biotecnología es la ciencia que se ocupa de la utilización de procesos bioló-

gicos más o menos espontáneos para obtener productos de interés industrial.
En realidad, es un proceso que viene utilizándose, desde la antigüedad para ela-
borar una serie de alimentos que como el pan, el vino, la cerveza, el vinagre, el
yogur y el queso, forman parte de nuestro acervo alimentario, desde hace miles de
años. No es, pues la biotecnología una metodología moderna.
Si lo es, sin embargo, el hecho de utilizar esas mismas técnicas pero modifica-
das según los avances aportados por la genética molecular.
En 1944 Avery, McLeod y McCarty en la Universidad Rockefeller descubrieron
que la información genética se albergaba en las moléculas de ADN. Nueve años más
tarde Watson y Crick desentrañaron la estructura de dicho compuesto, lo que abrió
las puertas a la comprensión de los procesos de replicación, transcripción y traduc-
ción del ADN y por ende a explicar el código genético.
A partir de ese momento, se introdujo la distinción entre el material genético y
el producto de su expresión, conceptos que permanecieron implícitos en toda la bio-
logía posterior.
En un corto periodo de tiempo, una nueva ciencia empezó a desarrollarse,
pasando de la investigación de una serie de sustancias protéicas de interés biomé-
dico al estudio de los mecanismos de su producción y a las posibles alteraciones en
los mismos. Había nacido la biología molecular. La posibilidad de influir en los pro-
cesos de síntesis de las sustancias de interés terapéutico a través de las técnicas de
ADN recombinante abría nuevas posibilidades de la«vieja biotecnología» y la hacía
brillar de nueva con luz propia hasta el punto que para muchos y de forma errónea
constituía un nuevo concepto.
Lo que sí eran nuevos eran toda una serie de elementos que venían de la mano
de las nuevas tecnologías. La genética molecular, conjuntamente con la terapia
génica y la ingeniería genética, formaban los tres pilares de la nueva biotecnología.
X BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
Genética molecular, con un interés clínico diagnóstico e ingeniería genética, con

una serie de productos muy importantes para la industria farmacéutica y la terapéu-
tica se han desarrollado de manera espectacular, mientras la terapia génica todavía
está en sus comienzos, absolutamente experimentales.
Este libro es el resultado final de un curso sobre introducción a la biotecnología,
patrocinado por la Cátedra Serono de Avances de Medicina que tuvo lugar en la
Facultad de Medicina de la Universidad Complutense, en Noviembre de 2000.
En el mismo se pretende hacer una puesta al día de los conceptos básicos de la
«nueva biotecnología» para los profesionales biosanitarios, dada la importancia cre-
ciente que está adquiriendo esta ciencia. Como estos profesionales necesitan refrescar
y poner al día toda una serie de conocimientos, se realiza primeramente un repaso a
la bioquímica de los procesos que conducen a la síntesis proteica, con un breve recuer-
do a las bases de la información genética, con especial hincapié en el ADN y su repli-
cación, a la estructura del ARN, la traducción del mensaje genético y la regulación del
mismo. Ésta parte es necesaria para entender el lenguaje del resto del contenido.
Para completar la primera parte del libro, hay un capítulo sobre el reconoci-
miento de antígenos y los genes que los regulan, otro sobro oncogenes y genes
mutadores, otro sobre apóptosis y su regulación génica y finalmente, uno sobre las
bases de la terapia génica, que aunque en sus comienzos presenta grandes expecta-
tivas. Todos los autores de ésta parte, son profesores de bioquímica y biología mole-
cular de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense y de la
Universidad Autónoma de Madrid.
En la segunda gran parte del libro, se hace una introducción a la biotecnología.
Hay dos lecciones sobre ingeniería genética y otras dos más sobre la producción
industrial de fármacos recombinantes. Estas lecciones están escritas por los res-
ponsables de la planta de producción de GH, por técnicas de ADN recombinante en
células de mamíferos de Laboratorios Serono, en Madrid, con sobrada experiencia
pesonal en los temas que tratan.
La tercera parte del libro aborda las bases moleculares de las enfermedades
endocrinas y abarca, desde las técnicas generales para crear ratones transgénicos o
KO (aquellos en los que se elimina selectivamente algún gen de su genoma) que
permiten la constatación de las actividades potencialmente pleyotrópicas de los
mismos, a la descripción individualizada de los aspectos genéticos de una serie de
enfermedades endocrinas que comprenden desde las alteraciones del crecimiento a
la Hiperplasia Suprarrenal Congénita, la Diabetes Mellitus, los pseudohermafrodi-
tismos, las Neoplasias Endocrinas Múltiples (MEN) y el hipotiroidismo congénito.
Con todo ello, éste libro pretende ser el primero de una serie, que aborde las
bases moleculares de distintos tipos de enfermedades y que pueda suponer una
ayuda para todos aquellos que quieran profundizar en el mejor diagnóstico y trata-
miento de muchas de ellas.
Jesús A. F.-Tresguerres
Vicente Martínez Fernández
Víctor Navas Serrano
Índice
Autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . VII
Presentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX
1. Concepto de información genética. Ácidos nucleicos, estructura

del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
E. Blázquez Fernández
Flujo de la información génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
El ADN como molécula portadora de la información genética . . . . . . . 6
La estructura tridimensional del ADN muestra una doble hélice con
cadenas complementarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Conformaciones del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Desenrrollamiento y superenrollamientos del ADN . . . . . . . . . . . . . . . 8
Aspectos estructurales y funcionales de la cromatina . . . . . . . . . . . . . . 10
Aspectos estructurales y funcionales del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
ADN mitocondrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2. Replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

M.a C. García Martín
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Características generales de la replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
XII BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
Replicación en procariotaes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1. Iniciación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2. Elongación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3. Terminación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
4. Regulación de la replicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Replicación en eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Estructura de la cromatina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Papel de las polimerasas eucarióticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
Orígenes de replicación en eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Replicación en los extremos de los cromosomas lineales . . . . . . . . . 25
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3. Estructura y procesamiento del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

I. Roncero
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Estructura del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Estructura primaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Estructura secundaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Estructura terciaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Clases de ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Procesamiento del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
ARN mensajero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Procesamiento del ARNm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Adición del casquete 5’ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Adición de la cola de poli(A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Eliminación de intrones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
ARN de transferencia (ARNt) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Procesamiento del ARNt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
ARN ribosómico (ARNr) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Procesamiento del ARNr . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Transporte del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Degradación del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4. Mecanismo de la transcripción: regulación de la iniciación . . . . . . . 41

A. Santos
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
ARN polimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
ÍNDICE XIII
Iniciación: Promotores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Promotor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
Eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Regulación de la iniciación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Procariotas: Factores m. Operación lactosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
Eucariotas: Regulación de la expresión génica por hormonas
tiroideas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
5. Síntesis de proteínas: Traducción y transporte . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

E. Álvarez García
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
El código genético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Activación de los aminoácidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Etapas de la síntesis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Iniciación de la biosíntesis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Elongación de la biosíntesis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Terminación de la biosínesis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Antibióticos que inhiben la síntesis proteica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Destino y transporte de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
Importación al núcleo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Importación a las mitocondrias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Importación al ER y distribución desde el aparato de Golgi . . . . . . . 65
Importación a los lisosomas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
6. Fundamentos de regulación de la expresión génica. Diferenciación

celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
E. Velázquez Sánchez y J. M. Ruíz Albusac
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
Niveles de control de la expresión génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
Visión general del control de la transcripción: regiones reguladoras . . . 70
Principales motivos de unión al ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Motivo hélice-giro-hélice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Proteínas con homeodominio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
Dedos de zinc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Cremallera de leucina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Motivo hélice-bucle-hélice (HBH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
Dimerización de proteínas. Control combinatorio. Importancia en la ex-
presión génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
XIV BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
Regulación de la actividad de las proteínas reguladoras . . . . . . . . . . . . 75

Control de la expresión génica en la diferenciación celular: Miogénesis 75
Etapas de la miogénesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
a) Etapa de Determinación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
b) Etapa de Proliferación/Migración . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
c) Etapa de Diferenciación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Proteínas reguladoras de la miogénesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
Factores Musculares Reguladores (FMR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
MEFs (Muscle Enhancer Binding Factors) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
Estructura de los FMR y MEFS. Control combinatorio en la miogénesis 78
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
7. Genes para la presentación y el reconocimiento de antígenos . . . . 81

R. Millán González y J. R. Regueiro
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
La inmunidad y la autotolerancia innatas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
La inmunidad adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
Linfocitos B y su receptor para el antígeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
Linfocitos T y su receptor para antígeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
El TCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
El sistema HLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
Fases de la inmunidad adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
Tolerancia adaptativa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
Deleción clonal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
Tolerancia B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Enfermedades autoinmunes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
Diabetes mellitus tipo I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Enfermedad de Graves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
8. Oncogenes. Proteínas tumorales. Mecanismos de activación de

proto-oncogenes. Genes supresores de tumores. Genes mutadores . 99
J. M. Ruíz Albusac y E. Velázquez Sánchez
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Etapas del desarrollo del cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Sistemas de señalización celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
Genes y cáncer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Oncogenes. Proteínas tumorales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Retrovirus transformantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
ÍNDICE XV
Funciones de los proto-oncogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

I. Factores de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
II. Receptores de factores de crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
III. Transductores intracelulares de señal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
IV. Factores de transcripción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
V. Reguladores de la muerte celular programada (proteínas
antiapoptóticas) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
VI. Proteínas que controlan el ciclo celular . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
Activación de proto-oncogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105
Genes supresores de tumores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
El gen Rb . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
El gen APC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
El gen p53 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
Genes mutadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
9. Apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
E. Vara
Muerte celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

Cambios bioquímicos y estructurales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
Genes implicados en la apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Acoplamiento entre estímulo y apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
Papel del p53 en la apoptosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
Papel de la apoptosis en los procesos fisiopatológicos . . . . . . . . . . . . . 124
Modulación de la apoptosis por óxido nítrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
Efectos proapoptóticos del NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Efectos antiapoptóticos del NO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Resumen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
10. Terapia génica en células somáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

Josefa P. García-Ruíz
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
Elementos de los genes eucarióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130
Inicio de la transcripción de un gen codificante para una proteína . . . . 130
Transferencia de un gen a una célula somática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
Vectores derivados de oncorretrovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
Vectores derivados de los lentivirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
Células diana de la terapia génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
XVI BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
Logro de la terapia génica en la inmunodeficiencia severa combinada

(SCID)-X1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
11. Introducción a la Biotecnología y generalidades sobre cultivos

celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
A. Martínez Mogarra
Definición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
Reseña histórica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
Producción de fármacos por Biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Cultivo in-vitro de células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Medida de crecimiento bacteriano . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147
Cultivo de células eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
Células inmortalizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149
Contaminación y prevención . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
Tipos de cultivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151
Cultivo discontinuo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
Cultivo continuo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
12. La ingeniería genética I. Herramientas y Metodología . . . . . . . . . . . 155

J. Casatorres Hernández
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155
Técnicas de ADN recombinante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
Herramientas de la ingeniería genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Nucleasas de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
ADNasa I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Exonucleasa III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
h Exonucleasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Nucleasa S1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157
Nucleasa Bal31 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Ribonucleasa A (ARNasa A) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Ribonucleasa H (ARNasa H) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Enzimas de restricción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158
Enzimas de restricción Tipo II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
Polimerasas de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160
ADN polimerasa I (ADNpol I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
Fragmento Klenow de la ADNpol I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161
ADN polimerasa de T7 (ADNpol T7) y Secuenasa® . . . . . . . . . . . 161
Polimerasas termorresistentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
ÍNDICE XVII
Transcriptasas reversas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162

Transferasa terminal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162
ARNpolimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Poli-A polimerasas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Enzimas de modificación de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Ligasas de ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163
Quinasas de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
Fosfatasas de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
Procedimientos de ingeniería genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
Métodos de obtención purificación de AN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164
Métodos de detección de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167
Métodos de detección-cuantificación directos . . . . . . . . . . . . . . . 167
Métodos de detección por hibridación: Southern y Northern . . . . 168
Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
Secuenciación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Métodos de secuenciación automática del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . 174
Secuenciación del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175
Aplicaciones de la secuenciación de ácidos nucleicos . . . . . . . . . . . 176
Reacción en cadena de la polimerasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
13. La ingeniería genética II. Proteínas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 181

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
Aislamiento del gen. (Clonaje y subclonaje) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181
Inserción del gen en un vector adecuado: Vectores de ADN . . . . . . . . . 183
Transferencia del vector de recombinante al hospedador . . . . . . . . . . . 186
Métodos de Transferencia del ADN a células hospedadoras . . . . . . 186
Elección de las células hospedadoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
Hospedadores procarióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188
Hospedadores eucarióticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189
Selección de los organismos que expresan el gen de interés . . . . . . . . 190
Caracterización del producto y células productoras . . . . . . . . . . . . . . . 191
Caracterización del producto clonado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
Caracterización de las células productoras (bancos celulares) . . . . . 192
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
14. Producción industrial de fármacos recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 195

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
Cultivos procariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 195
El medio de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
XVIII BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
Parámetros de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

Control de temperatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196
Control del pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Aporte de oxígeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Agitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Volumen de los cultivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Cultivo de células eucariotas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Biorreactores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
Control de pH y aireación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198
Biorreactores airlift . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199
Células en suspensión y células dependientes de anclaje . . . . . . . . . 199
Cultivo en microcarriers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200
Biorreactores de lecho fluido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Monitorización de procesos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
¿Qué controlar? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
El medio de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
El agua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
Los materiales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
Las células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
El cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
Equipos de control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
Utilities y Layout . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203
Autoridades reguladoras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
Tipo de proceso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
Consideraciones ambientales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
Principales agentes causantes de contaminaciones . . . . . . . . . . . 205
Prevención de la contaminación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206
Impacto ambiental y bioseguridad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206
Clasificación y prevención de riesgos en las industrias biotecnológicas. 208
Riesgos biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Riesgos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Exposición a la radiación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Gestión de residuos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Residuos biológicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Residuos químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Residuos radiactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
Purificación de proteínas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
Cromatografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210
Filtración molecular (Size Exclusión) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
Cromatografía de adsorción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
Garantía de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
GMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
Documentación de procesos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
ÍNDICE XIX
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
15. Presente y futuro de la Biotecnología en las ciencias de la salud:
productos obtenidos mediante biotecnología . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
A. Campos de Olmo
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
Productos obtenidos mediante biotecnología en ciencias de la salud . . 215
Producción industrial de hormona de crecimiento recombinante
(r-hGH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
Upstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217
Downstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
Producción industrial de r-hFSH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
Upstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
Downstream . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
Modificación genética en animales. Transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
El concepto de transgén . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
Técnica de generación de animales transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
Microinyección pronuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223
Transgénicos Knock Out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224
Mutagénesis condicional. Sistema Cre/lox P . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224
Los transgénicos en la industria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
Producción de órganos para xenotrasplantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 227
16. Biología molecular y endocrinología: El ejemplo de los animales

transgénicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
J. Reventos, D. Martínez-Selva, O. Martínez-Tirado, T. Pino, F. Munell
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229
Métodos utilizados para generar animales transgénicos . . . . . . . . . . . . 230
Métodos clásicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
Transferencia mediada por espermatozoides . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
Recombinación homóloga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230
Eliminación de una alelo en un animal: el ejemplo de los ratones
knock-out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234
Animales transgénicos de expresión inducible . . . . . . . . . . . . . . . . . 234
Ejemplos de utilización de los animales transgénicos en biomedicina . 235
Oncología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236
Creación de animales con enfermedades genéticas . . . . . . . . . . . . . . 237
Ratones transgénicos como modelos para terapia por genes . . . . . . . 237
Endocrinología . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
Conclusiones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238
XX BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 239
17. Bases moleculares de la deficiencia y resistencia a la acción
de la hormona de crecimiento: Entidades sindrómicas . . . . . . . . 243
J. A. Chowen y J. Argente
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243
Bases moleculares del hipocrecimiento armónico . . . . . . . . . . . . . . . . 244
I. Hipocrecimiento por deficiencia genética de hormona de crecimiento. 244
A. Deficiencia aislada de GH familiar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
DAGH IA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
DAGH IB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247
DAGH II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247
DAGH III . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
B. Deficiencia combinada de hormonas hipofisarias . . . . . . . . . . . . 248
C. Alteraciones embriológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
Holoprosencefalia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
Síndrome de Rieger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
Displasia septo-óptica o síndrome de Morsier . . . . . . . . . . . . . . . 250
Síndrome de ectrodactilia-displasia ectodérmica-labio leporino . 250
Anemia de Franconi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
Síndrome de Bloom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
Síndrome de Aarskog . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
II. Hipocrecimiento por resistencia genética a la hormona de
crecimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 251
Anomalía Post-receptor de GH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 252
Deleción del gen de IGF-I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
Pigmeos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
Resistencia a IGF-I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253
III. Hipocrecimiento por anomalía en genes de los gonosomas . . . . 253
IV. Hipocrecimiento de origen prenatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
Consideraciones finales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
18. Patología molecular de la hiperplasia suprarrenal congénita . . . . . 263

B. Ezquieta, E. Cueva, FJ. Fernández, JM. Varela y C. Jariego
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Pacientes y métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
Sujetos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
Métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
Análisis directo del gen de la esteroide 21-hidroxilasa . . . . . . . . . . 269
Análisis indirecto de CYP21B mediante microsatélites en la
región HLA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269
Resultados y discusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
ÍNDICE XXI
Análisis del gen de 21-OH en población española . . . . . . . . . . . . . . 270

Correlación genotipo-fenotipo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272
Aportaciones del análisis genético molecular en la deficiencia de
21-OH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274
Diagnóstico prenatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277
19. Terapia celular de la diabetes mellitus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279

B. Soria Escoms
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279
¿Qué es la ingeniería celular? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
Obtención de células beta artificiales mediante técnicas de
bioingeniería . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
Ingeniería de células de origen tumoral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 280
Producción de insulina en otros tejidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
Ingeniería celular de precursores. Estímulo y control de crecimiento,
regeneración y neogénesis de islotes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
Clonación terapéutica y diferenciación in vitro de células betas . . . . 284
Trasplante de células beta obtenidas a partir de células madre
embrionaria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287
20. Aproximación genética a los pseudohermafroditismos . . . . . . . . . . 289

M. L. Gaspar
Determinación y diferenciación sexual. Pseudohermafroditismos . . . . 289
Déficit de respuesta testicular a la gonadotropina coriónica y a la
hormona luteinizante: mutaciones del gen de su receptor . . . . . . . . . 291
Déficit enzimáticos en la biosíntesis de andrógenos . . . . . . . . . . . . . . . 292
Anomalías en la acción de los andrógenos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
a) Defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona:
mutaciones del gen de la 5_ reductasa-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
b) Resistencia a la acción de los andrógenos: mutaciones del gen
de su receptor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 295
Mutuaciones de los genes implicados en la acción de la hormona
antimulleriana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 297
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298
21. Patología molecular de la neoplasia endocrina múltiple

(MEN-1, MEN-2A, MEN 2B) y del Carcinoma medular
de tiroides . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
XXII BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
M.a J. Lorenzo-Benayas
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 301
Neoplasia endocrina múltiple de tipo 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302
Características clínicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302
Bases moleculares del MEN 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 302
La proteína MENIN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
Detección del MEN 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303
Neoplasia endocrina múltiple de tipo 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304
Características clínicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304
Bases moleculares del MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
Efectos de las mutaciones de ret en el MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306
Detección del MEN 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307
22. Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo

congénito, Terapia génica en enfermedades tiroideas . . . . . . . . . . 309
P. Santisteban
.
Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo congénito . . 309
Factores de transcripción específicos de tiroides . . . . . . . . . . . . . . . . . 310
Factor de transcripción TTF-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 310
Factor de transcripción TTF-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 311
Factor de transcripción Pax-8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 311
Desarrollo de la glándula tiroidea y expresión de TTF-1,
TTF-2 y Pax-8 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312
Función de los factores de transcripción tiroideos: Generación
de ratones knock-out . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312
Factores de transcripción tiroides en el hipotiroidismo congénito . . . . 314
Terapia génica en enfermedades tiroideas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316
Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318
ÍNDICE ANALÍTICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

1
Concepto de información genética.
Ácidos nucleicos, estructura
del ADN
E. Blázquez Fernández
Flujo de la información génica
La vida tiene un fundamento químico y los procesos que la hacen posible están
protagonizados por biomoléculas, que para llevar a cabo sus efectos biológicos uti-
lizan entre otros, sistemas capaces de generar, transmitir o perpetuar una informa-
ción. Entre ellos destacan la transmisión del impulso nervioso, la recepción y trans-
ducción de señales generadas por hormonas, factores de crecimiento y
neurotransmisores, el funcionamiento del sistema inmune, los mecanismos impli-
cados en la muerte celular programada o apoptosis, y en la transmisión de la heren-
cia y perpetuación de las especies. La expresión de la información genética permi-
te que un organismo pueda replicarse dentro de unos cánones preestablecidos. En
las células la información necesaria para ello se encuentra codificada en una molé-
cula conocida como ácido desoxirribonucleico o ADN (1), la cual es transferida a una
molécula de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) mediante un proceso conocido
como transcripción del ADN (Fig. 1.1). Los ARNm transcritos son traducidos en
proteínas específicas. Otras formas de ARN son los de transferencia (ARNt) impli-
cados con el aporte de los diferentes aminoácidos para la síntesis de proteínas, y los
que forman parte de los ribosomas o ARN ribosomal (ARNr).
Las unidades de información son conocidas como genes, localizados dentro de
los cromosomas y que son controlados en su expresión por proteínas reguladoras,
que se unen a sitios específicos presentes en regiones cercanas a las zonas codifi-
cantes. Aparte de su especificidad en la expresión génica, ésta tiene un efecto ampli-
ficador ya que a partir de un solo gen se pueden producir miles de ARN transcritos,
y a partir de una molécula de ARNm pueden ser traducidas miles de copias de una
cadena polipeptídica, con lo que la información presente en un gen puede generar
millones de copias de una proteína específica.
2 BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
CÉLULA EUCARIOTA
CÉLULA PROCARIOTA
NÚCLEO
Exón Intrón
ADN ADN
Transcripción
Transcripción
preARNm
ARNm
Procesamiento
Traducción ARN
ARNm
Proteína
ARNm
Traducción
Proteína
CITOPLASMA
Figura 1.1. Características de la transferencia de información desde ADN a proteínas en célu-

las procariotas y eucariotas.
La transferencia de la información génica es un proceso más sencillo en las

células procariotas que en las eucariotas (Fig. 1.1). Las células bacterianas carecen
de núcleo y organelas y la información genética está codificada de forma ininte-
rrumpida en el ADN, mientras que en las células eucariotas que son ricas en orga-
nelas, tienen un núcleo celular donde ocurren la replicación y transcripción del
ADN. En esta molécula existen las secuencias codificantes conocidas como exo-
nes, que están separados por los intrones o segmentos de ADN no codificantes.
Para la síntesis de una proteína en las células eucariotas, el gen completo con sus
exones e intrones es expresado en una molécula de ARN conocido como transcri-
to primario o pre ARNm, que en una etapa posterior es procesado por enzimas que
cortan y empalman los exones liberando de esta forma los intrones. El ARNm
resultante abandona el núcleo para en el citoplasma dirigir la síntesis de una pro-
teína específica.
Ácidos nucleicos
Aunque a finales del siglo XIX se sabía que la información ligada a los caracte-
res hereditarios estaba presente en los cromosomas, hasta mediados del siglo XX no
se supo que el ADN era la molécula que guardaba dicha información. En 1869
Meischer obtuvo núcleos celulares a partir de leucocitos obtenidos de los vendajes
CONCEPTO DE INFORMACIÓN GENÉTICA 3
de pacientes intervenidos quirúrgicamente, a los que trató con ácido clorhídrico. El

tratamiento posterior de los núcleos con una solución alcalina produjo un sedimen-
to que contenía fósforo, carbono, nitrógeno, hidrógeno y oxígeno al que llamó
nucleína, y más tarde al conocerse su carácter ácido denominó ácido nucleico. El
conocimiento de la estructura de esta molécula se consiguió a través de un proceso
muy lento, que necesitó más de 60 años hasta que se demostró que la nucleína era
el ADN. Los estudios químicos pertinentes revelaron que la subunidad repetitiva del
ADN era un nucleótido que contenía 2’-desoxi-D-ribosa, un grupo fosfato y una de
las cuatro bases nitrogenadas heterocíclicas, de las cuales la adenina y guanina son
bases púricas, y las otras dos citosina y timina son bases pirimidínicas (Fig. 1.2).
Tanto el ADN como el ARN son ácidos nucleicos constituidos por polímeros de
nucleótidos que se diferencian en que el ARN tiene ribosa en vez de desoxirribosa,
la base uracilo en vez de la timina, y que se manifiesta como una sola hebra mien-
tras que el ADN lo hace en forma de doble hélice.
Con posterioridad se encontró que las bases están unidas al C-1’ de la pentosa
mediante un enlace -N-glicosídico, constituyendo lo que se conoce como nucleósi-
do, así como que el fosfato puede unirse al C-3’ o al C-5’ del azúcar, en cuyo caso
se forma un nucleótido (Fig. 1.3). También se descubrió que los nucleótidos se
unen por un enlace covalente fosfodiéster entre el grupo hidroxilo de un nucleótido
y el grupo fosfato de otro nucleótido, que unen los carbonos 5’ y 3’ de los residuos
de la pentosa formando enlaces 5’-3’ fosfodiéster, que de esta forma facilitan la for-
mación de una cadena polinucleotídica. En consecuencia el ADN es un polímero
lineal de residuos de 2’-desoxirribonucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster 5’-3’,
que contienen cuatro residuos de nucleósidos distintos dA, dT, dC y dG. El prefijo
d indica que la pentosa es la desoxirribosa y sirve para distinguirlo de los ARN que
poseen como azúcar la ribosa. Los números con prima (‘) indican que el átomo per-
tenece al carbono, mientras que los números que no los llevan pertenecen al anillo
púrico o pirimidínico. Las cadenas polinucleotídicas son direccionales, partiendo
del C-5’ de la pentosa y con el siguiente fosfato unido al C-3’ del azúcar. Por ello
los extremos de las cadenas polinucleotídicas se denominan 5’ y 3’ para indicar su
dirección.
Cuando a finales de los años cuarenta se hicieron valoraciones de la composi-
ción de bases en el ADN de distintos organismos, se encontró que el número de
moles A y T por una parte eran iguales y el de G y C por otra también eran iguales,
lo cual no se entendió en aquel momento pero actualmente sabemos que se debe al
apareamiento de bases entre las dos hebras del ADN. No obstante las cantidades de
C+G y de A+T para una molécula de ADN no suelen ser iguales, con oscilaciones
del 35 % al 70 % entre las diferentes especies. De acuerdo con lo representado en la
Figura 1.3, los componentes presentes en la cadena polinucleotídica pueden mos-
trarse de una forma simplificada utilizando líneas verticales y diagonales, y aún más
abreviadamente se designa al polinucleótido como G-T-A-C.
Determinadas bases del ADN de procariotas y eucariotas (a excepción de leva-
duras e insectos) están metiladas, las cuales son reconocidas por proteínas implica-
das en funciones del ADN, tales como la iniciación de la síntesis y recombinación
A
PIRIMIDINAS
NH2 O O
C C C
N CH HN C — CH3 HN CH
O C CH O C CH O C CH
N N N
H H H
Citosina Timina Uracilo
PURINAS
NH2 O
C C
N N
N C HN C
CH CH
HC C 2HN —C C
N N N N
H H
Adenina Guanina
CH3 CH3
H
C C
N
H H…O C CH …H C CH
N O
N NH …N NH
C C H
N C N C
C N…H C N
HC HC
O H… O
C CH C C
N Timina N N
H N H N H Citosina
Adenina Guanina
Figura 1.2. Estructuras de las bases púricas y pirimidínicas (A) y emparejamiento por puentes
de hidrógeno de las bases adenina con timina y citosina con guanina (B).
A O
NH2
C
C
N HN C — CH3
N C
CH O C CH
HC C O O O
O O O N
N N
– O
– O O — P — O — P — O — P — OCH2
O — P — O — P — O — P — OCH2
O– O– O– H H
O– O– O– H H H H
H H
HO H
HO H
Desoxiadenosina-5’-trifosfato (dATP) Desoxiadenosina-5’-trifosfato (dTTP)
B O–
Extremo 5’ –
O—P O G T A C
O
3’ 3’
CH2 O G
P P P P
H H OH
H H
5’ 5’ 5’ 5’
O H
–
O—P O
–
O
CH2 O T
H H
H H
5’ — G — T — A — C 3’
O H
–
O—P O
O–
CH2 O A
H H
H H
O H
–
O—P O
O–
CH2 O C
H H
Extremo 3’ H H
HO H
Figura 1.3. Estructuras de nucleósidos trifosfato (A) y de una cadena polinucleotídica con sus
correspondientes abreviaciones (B). G: guanina. T: timina. A: adenina. C: citosina.
del ADN. Después de la síntesis de ADN las metilasas Dam y Dem llevan a cabo su
actividad catalítica, utilizando la S-adenosilmetionina como donador de grupos
metilo; la metilasa Dam actúa sobre los residuos de adenina de la secuencia GATC,
mientras que la metilasa Dem actúa sobre los residuos citosina de la cadena opues-
ta de la citada secuencia. A veces una base puede ser metilada antes de ser incorpo-
rada al ADN.
El ADN como molécula portadora

de la información genética
El conocimiento que el ADN contiene la información genética es una adqui-

sición relativamente reciente, ya que hasta 1944 se consideraba que las proteínas
cromosómicas tenían esa información, mientras que el ADN jugaba un papel
secundario. No obstante la utilización experimental de neumococos de la cepa S
(del inglés smooth) llamados de esta forma por su apariencia lisa consecuencia de
la presencia de una cápsula responsable de su patogenicidad, y de los neumo-
cocos de la cepa R (del inglés rough) carentes de la cápsula y de actividad pató-
gena, fue de gran ayuda para obtener nuevos horizontes. En efecto, cuando se
inyectó a ratones neumococos R vivos y neumococos S muertos por calor la mez-
cla fue letal, mientras que cada uno de ellos por separado no lo fueron. Curio-
samente los ratones muertos contenían neumococos S vivos, lo que sugirió que
los neumococos S muertos habían transformado a los neumococos R vivos en
neumococos S vivos. También se observó que este fenómeno ocurría in vitro,
mediante la transformación de células en cultivo de la cepa R en otros de la cepa
S por la adición de un extracto libre de células S muertas por calor. Todo ello dio
lugar al concepto de principio transformador. En 1944, O. Avery, C. McLeod y
M. McCarthy (2) descifraron la naturaleza química de este principio considerán-
dolo un ácido nucleico del tipo desoxirribosa. Esta demostración fue un hito tras-
cendental en la historia de la Biología, que posteriormente fue confirmada por los
estudios de la infección del bacteriofago T2 en la bacteria E. coli. Para ello el
ADN del virus fue marcado radiactivamente con 32P mientras que las proteínas de
su cubierta se marcaron con 35S. A continuación el E. coli fue infectado con el
fago doblemente marcado que se unió a la bacteria, procediéndose inmedia-
tamente después a la homogenización de la preparación para proceder a la sepa-
ración de virus y bacterias. La centrifugación posterior de la suspensión permitió
sedimentar las bacterias en el fondo del tubo y localizar las vesículas pequeñas en
el sobrenadante. De esta forma se encontró que la mayor parte del ADN del fago
se encontraba en la bacteria mientras que la inmensa mayoría de la proteína del
virus permanecieron en el sobrenadante. Estudios realizados más tarde mostraron
que el 30 % del 32P parental aparecían en los descendientes mientras que sólo el 1 %
del 35S fue transferido desde el fago a la progenie. Todo ello mostró el papel del
ADN como material genético.
La estructura tridimensional del ADN muestra una

doble hélice con cadenas complementarias
En 1953, James Watson y Francis Crick (3) describieron la estructura tridi-

mensional del ADN basados en los estudios de difracción de rayos X. Por este
trabajo pionero que inició el desarrollo de la Biología Molecular, Watson, Crick
y Wilkins recibieron el premio Nobel, que quizás hubieran compartido con R.
Franklind si ella no hubiese muerto víctima de cáncer antes de la concesión de
ese galardón.
El ADN es una doble hélice, donde cada una de las dos hebras se enrolla alre-
dedor del eje central, generalmente en forma de hélice dextrógira. Las dos hebras
avanzan en dirección opuesta, por lo que se las considera antiparalelas. En ellas las
unidades de fosfato y desoxirribosa se encuentran en el exterior formando ángulos
casi rectos con las bases (Fig. 1.3), y éstas se encuentran en el interior en planos que
son perpendiculares al eje de la hélice. El diámetro de ésta es de 20 Å, estando las
bases adyacentes separadas 3,4 Å a lo largo del eje de la hélice y desplazadas por
una rotación de 36 grados. Dado que la estructura helicoidal en cada hebra se repi-
te cada 34 Å, en ellas tienen cabida 10 residuos. Ambas hebras del ADN permane-
cen unidas por puentes de hidrógeno entre determinados pares de bases. Las inte-
racciones hidrofóbicas y de van de Waals entre las bases apiladas adyacentemente
también contribuyen a la estabilidad de la estructura del ADN. La geometría de la
estructura doble helicoidal se mantiene por el apareamiento de una purina que es
una molécula más grande con una pirimidina. En el ADN nativo la adenina se une
siempre a la timina por dos puentes de hidrógeno, y la guanina lo hace siempre con
la citosina mediante tres puentes de hidrógeno (Fig. 1.2). Este emparejamiento o
complementariedad de las bases es el aspecto más importante de la doble hélice del
ADN. Por otra parte la secuencia precisa de bases transmite la información genética
y sugiere un mecanismo para la replicación del ADN. De hecho Watson y Crick (4)
propusieron que una de las cadenas de cada molécula hija del ADN se sintetiza de
nuevo, mientras que la otra procede de la molécula de ADN parental. Por ello esta
forma de replicación se denomina semiconservativa.
Los enlaces glicosídicos entre las pentosas y las bases de un par de nucleótidos
del ADN no se encuentran directamente opuestas entre sí, de manera que pueden
reconocerse alrededor de la hélice dos surcos de distinta anchura: como conse-
cuencia de elllo el saliente de la hélice con más de 180° desde un enlace glicosídi-
co a otro se denomina vértice mayor y da lugar al surco mayor, mientras que el que
forma menos de 180° da lugar al surco menor.
Conformaciones del ADN
La conformación B-ADN descubierta por Watson y Crick (3) y citada en el párra-

fo anterior es la más frecuente en la naturaleza, pero dependiendo de la composición
de bases y bajo diferentes condiciones físicas se pueden encontrar las conforma-

ciones A-ADN y Z-ADN (5,6). Los cambios de conformación del ADN no modifican
la información contenida en el ADN, pero si pueden alterar la regulación de la
expresión génica ya que los cambios conformacionales pueden afectar la unión de
proteínas al ADN.
Cuando disminuye el contenido de agua y sales en los cristales de B-ADN, la
apariencia fina de esta molécula se transforma en otra gruesa y corta correspon-
diente al A-ADN, con un surco mayor más profundo y ancho y un surco menor
superficial y ancho. También en comparación con el B-ADN, que tiene un paso de
hélice de 3,4 nm y un número de bases por vuelta de 10,4, la molécula de A-ADN
tiene respectivamente 2,46 nm y 11 bases. Aunque esta forma es poco frecuente se
encuentra en las hélices ARN-ARN y ARN-ADN. En las conformaciones B-ADN
y A-ADN la pentosa y la base se sitúan en lados opuestos al enlace glicosídico, o en
conformación anti, con una repulsión mínima entre ambos grupos. Pero con altas
concentraciones de cationes algunos nucleótidos experimentan una rotación que
sitúan a la pentosa y a la base en el mismo lado del enlace glicosídico, constituyen-
do lo que se conoce como conformación sin. Así en una cadena de nucleótidos con
guanina y citosina alternantes, la conformación del enlace glicosídico con más posi-
bilidades es anti para la citosina y sin para la guanina. Este efecto zig-zagueante de
las conformaciones anti y sin es lo que se denomina como Z-ADN. Esta forma es
más larga y estrecha que el B-ADN, con 12 pares de bases por vuelta, una vuelta de
hélice de 4,56 nm y un diámetro de hélice de 1,84 nm frente a los 2,37 nm del B-
ADN. Asimismo en el Z-ADN el surco mayor prácticamente desaparece por el
desarrollo de una superficie convexa, y el surco menor se convierte en una hendi-
dura profunda que gira alrededor de la estructura.
Desenrollamiento y superenrollamientos del ADN

Localmente la doble hélice del ADN se desenrolla durante la recombinación
génica, replicación y transcripción del ADN, como consecuencia de la ruptura de
los puentes de hidrógeno que unen las bases. Un desenrollamiento completo o des-
naturalización del ADN puede ocurrir in vitro tras la elevación de la temperatura por
encima de un punto determinado. La desnaturalización del ADN puede medirse
espectroscópicamente, ya que esta molécula tiene el máximo de absorción de la luz
ultravioleta a 260 nm, pero ello aumenta un 37 % cuando está totalmente desenrro-
llado. Con la representación gráfica de los cambios de la absorción frente a las tem-
peraturas a las que se somete una muestra de ADN, se obtiene una curva sigmoidea
llamada curva de fusión del ADN, que refleja las interacciones entre los pares de
bases unidos por puentes de hidrógeno y los efectos cooperativos del apilamiento
de bases. La temperatura de fusión del ADN está condicionada por la composición
de bases, dado que el par adenina-timina tiene un enlace de hidrógeno menos que
el par citosina-guanina, y por tanto son menos estables. Todo ello indica que los seg-
mentos ricos en adenina-timina serán los primeros en desenrollarse y tienen una Tm
(temperatura de fusión) más baja que los poseedores de fragmentos ricos en cito-
sina-guanina que tienen las propiedades opuestas. Tras la separación de las dos
hebras y con las condiciones apropiadas de temperatura se pueden renaturalizar
adquiriendo con ello el enrollamiento previo.
Muchas moléculas de ADN son circulares, como las presentes en el genoma de
los procariotas y de bastantes virus, así como el ADN presente en las mitocondrias
y cloroplastos. Como en el caso del ADN lineal la elevación de la temperatura y del
pH destruyen los enlaces de hidrógeno y otros tipos de interacciones que estabili-
zan la doble hélice de las moléculas de ADN circular. Sin embargo las dos hebras
del ADN circular no se pueden desenrollar o separarse, a menos que una de las
hebras sea cortada y después se las someta a desnaturalización. La ruptura de un
ADN circular puede ocurrir durante la replicación del ADN, y se puede inducir en
el laboratorio mediante la ruptura de un enlace fosfodiéster con el uso de concen-
traciones bajas de desoxirribonucleasa. Tras un desenrollamiento local del ADN se
genera una tensión que se contrarresta con un superenrollamiento (7) del ADN res-
tante. Desenrollamientos y superenrollamientos ocurren durante la replicación,
transcripción, unión de proteínas al ADN circular, o por fijación de grandes hebras
de ADN dentro de los cromosomas. Los superenrollamientos son reconocidos y
regulados por enzimas llamadas topoisomerasas (8).
Los superenrollamientos pueden ser negativos y positivos, encontrándose los
primeros in vivo y los segundos in vitro. El grado de superenrollamiento de una
molécula de ADN se puede verificar cuantitativamente, mediante el número de
veces que una cadena de ADN circular cruza a la otra cadena, lo cual define el
número de superenrollamientos topológicos (9). Este número puede modificarse sólo
por la ruptura de un enlace fosfodiéster en una o dos cadenas con reenrrollamiento
y cierre del nuevo círculo. Las enzimas que realizan estos procesos reciben el nom-
bre de topoisomerasas, y son responsables de la introducción o eliminación de supe-
renrollamientos. La topoisomerasas I rompen una cadena de ADN y relaja el supe-
renrollamiento negativo, mientras que la topoisomerasa II rompe ambas cadenas de
ADN y añade superenrollamientos negativos. Ambas enzimas son importantes para
la replicación del ADN.
Estas topoisomerasas han sido tenido en cuenta como dianas de moléculas con
acciones antimicrobianas o antitumorales, tales como la camptotecina, antraciclina
y amioacridina. Estos agentes actúan inhibiendo parcialmente la actividad enzimá-
tica impidiendo la unión de las hebras de ADN, con lo que convierten a las topoi-
somerasas en agentes rompedores de ADN, que finalmente producen la muerte
celular. En este sentido se ha podido demostrar una correlación entre la actividad
antitumoral de varios derivados de la camptotecina y sus capacidades para inhibir
la actividad de la topoisomerasa I. Asimismo los altos niveles de topoisomerasa I
encontrados en el cáncer de colon y otros tumores humanos han contribuido al
efecto terapéutico de la camptotecina sobre estas neoplasias. Por otra parte distin-
tos agentes antitumorales como las antraciclinas y los derivados de la acridina ejer-
cen su efecto terapéutico actuando sobre la topoisomerasa II. Neoplasias como las
leucemias linfocíticas y no linfocíticas, enfermedad de Hodgkin y linfomas no
Hodgking se tratan con uno o más inhibidores de la topoisomerasa II acompañados

o no de agentes citotóxicos (10).
Aspectos estructurales y funcionales de la cromatina

La denominación de cromatina procede de las observaciones con el micros-
copio óptico de núcleos correspondientes a células eucariotas teñidos con dis-
tintos colorantes, en los que se encontraron zonas bandeadas, llamándose cro-
matina a las que estaban coloreadas. Más tarde, se encontró que la cromatina al
igual que la nucleína se comportaba de una forma semejante con las soluciones
ácidas y alcalinas, por lo que se asumió que se trataba de la misma sustancia.
Esta conclusión resultó ser parcialmente cierta, ya que la cromatina contiene
ADN, que además está fuertemente unido a proteínas. En los estadios de reposo
celular, la cromatina tiene una estructura amorfa y dispersa por el núcleo con
estructuras de 30 nm de espesor. Sin embargo antes de la división celular la cro-
matina se perfila en estructuras más compactas en forma de fibras conocidas
como cromosomas.
La presencia de la cromatina es muy importante para el empaquetamiento del
ADN eucariótico, ya que en ella es decisivo la interacción del ADN con las prote-
ínas histonas y no histonas. Estas últimas se encuentran en pequeñísimas cantida-
des y constituyen un grupo de varios centenares de proteínas íntimamente relacio-
nadas con la organización del cromosoma, replicación y expresión génica. No
obstante el componente proteico mayoritario está constituido por las cinco histo-
nas: H1, H2A. H2B, H3 y H4, que son proteínas básicas ricas en arginina y lisina,
cuyas cargas positivas se unen inmediatamente con las cargas negativas del ADN.
La cromatina se presenta en forma muy condensada, organizada como un módulo
repetitivo cada 10 nm constituido por ADN e histonas. Cuando la cromatina se
trata con disoluciones de ClNa de gran fuerza iónica sus componentes se distor-
sionan, observándose al microscopio electrónico imágenes que recuerdan a un
collar de cuentas llamado polinucleosoma, en el que la unidad elemental o nucle-
osoma se repite regularmente. El hilo de ese collar es ADN libre y las cuentas son
el ADN enrollado sobre las histonas. Estos últimos complejos de ADN-proteínas
constituyen los nucleosomas formados por dos copias de cada histona H1, H2A,
H2B, H3 y H4, y por un segmento de 200 pares de bases de ADN. La digestión
parcial con nucleasas produce la hidrólisis de una cuarta parte del ADN y la libe-
ración de H1, lo que da lugar al nucleosoma límite que contiene 146 pares de
bases de ADN y dos copias de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, que reciben el
nombre de octámero de histonas. Los nucleosomas son fibras de 10 nm de diáme-
tro, que cuando producen un triple empaquetamiento dan lugar a fibras de 30 nm
de diámetro, que se mantienen unidas por las interacciones cooperativas de la his-
tona H1. El empaquetamiento del ADN en el nucleosoma y luego en las fibras de
30 nm, reduce su longitud en un factor de 50, pero antes de la división celular esta
reducción alcanza un factor de 8.000.
Aspectos estructurales y funcionales del ADN

Existen grandes diferencias en los tamaños del ADN, desde varios millares
de pares de bases en los virus pequeños hasta millones en el ADN cromosómico
de bacterias y miles de millones de pares de bases en el ADN cromosómico de los
animales. En humanos el genoma haploide contiene 3,5 × 109 pares de bases, con
120 × 106 pares de bases por cromosoma, y aunque se creía que tenían 100.000
genes, tras la información que se está obteniendo con el programa del genoma
humano se cree que son 35.000 genes los presentes en células humanas. Salvo
excepciones la cantidad de ADN por célula aumenta con la complejidad de la fun-
ción celular. En ocasiones algunas células de anfibios, peces y plantas tienen
mayores cantidades de ADN que las células de mamíferos, pero ello es debido a
la reiteración de secuencias de nucleótidos y no representan un aumento real del
tamaño en términos de secuencias únicas.
Las endonucleasas de restricción cortan las cadenas de ADN en secuencias espe-
cíficas que hacen posible la ruptura del ADN en fragmentos más pequeños. Son
auténticos bisturís químicos que han facilitado la secuenciación de bases del ADN.
Estas enzimas producen un corte en cada hebra del ADN y reconocen secuencias de
cuatro o seis nucleótidos de longitud, conocidas como palíndromes y caracterizadas
por una completa simetría de repetición invertida.
También el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por
K. Mullis en 1984, con capacidad para amplificar secuencias específicas de ADN (11),
ha sido determinante en el progreso conseguido en la secuenciación y clonación del
ADN. También este proceder tiene una gran aplicabilidad en medicina, como en la
detección temprana de cánceres mediante el estudio de las mutaciones de genes
implicados en el control del crecimiento, en el seguimiento de la quimioterapia
aplicada a pacientes con cáncer, o en la detección temprana del virus de la inmuno-
deficiencia adquirida (HIV-1) en personas en las que aún no se ha detectado los
correspondientes anticuerpos, y en la identificación de Mycobacterium tuberculosis
en muestras de tejido, que es un proceder muy lento y laborioso por los métodos
convencionales. Asimismo en Medicina Forense y Legal, esta técnica es de gran uti-
lidad para determinar el parentesco en casos de disputa de paternidad, o mediante
el análisis del PCR de cabellos, manchas de sangre y semen suministran informa-
ción acerca de casos de crímenes o violaciones.
Con la ayuda de la técnica del PCR se han podido descifrar genes de muestras
muy antiguas (12) correspondientes a momias egipcias y restos arqueológicos de
hace 7.500 años (13), o de una termita fosilizada en ámbar (14) del período del Mioceno
con 30 millones de años, con lo cual se ha obtenido información enriquecedora
sobre la evolución de determinadas especies.
También las sondas de ADN son de gran utilidad diagnóstica en la clínica médi-
ca. Estas sondas son oligonucleótidos cortos monocatenarios complementarios de
secuencias específicas de interés en un ADN genómico. Las sondas tienen una lon-
gitud mínima de 15 nucleótidos, porque fragmentos más pequeños podrían ser com-
plementarios a secuencias que de una forma aleatoria estén presentes en un ADN
genómico. La utilización de sondas es un procedimiento de gran valor en el diag-

nóstico de tumores o de alteraciones genéticas como por ejemplo la anemia falci-
forme, la enfermedad de la hemoglobina C, y la fenilcetonuria. También se utilizan
para el diagnóstico selectivo de infecciones por bacterias, como ciertos tipos de sífi-
lis, identificación de microorganismos responsables de la lepra, o neumonías pro-
ducidas por Clamydia pneumoniae entre otras.
En procariotas, un elevado porcentaje del ADN cromosómico codifica proteí-
nas específicas, en contraposición con el ADN eucariótico donde gran parte no es
codificante y se considera de «relleno» porque no se ha podido asignar alguna fun-
ción. Actualmente se piensa que podría desempeñar un papel importante en la
regulación de la expresión génica durante el desarrollo. Por otra parte los genes
eucarióticos están separados por una media de 40 kb, y dentro de ellos están inte-
rrumpidos por secuencias nucleotídicas interpuestas o intrones (Fig. 1.1) que se
eliminan con el procesamiento del preARNm, con lo que la expresión génica sólo
se realiza a través de los exones. La función de los intrones no está clara, aunque
su presencia en las células eucariotas parece que está relacionada con la evolución
génica, ya que ellos no se encuentran en los procariotas ni en los eucariotas infe-
riores como las levaduras.
Otra diferencia importante entre el ADN de células procariotas y eucariota, es
que en las primeras las repeticiones de secuencias de ADN son escasas mientras que
en las eucariotas el ADN repetitivo puede constituir en el genoma de los vertebra-
dos entre el 25 %-35 % del total. Las secuencias pueden ser de copia única, mode-
rada y altamente reiteradas, y de repeticiones invertidas. Aunque aproximadamen-
te la mitad del genoma humano está compuesto de secuencias únicas, sólo una
pequeña fracción codifica proteínas. Ello se debe a que una parte importante del
ADN son pseudogenes, o secuencias que presentan analogías con el gen funcional,
pero tienen mutaciones que impiden su expresión. Estos pseudogenes que se pre-
sentan con una frecuencia elevada contribuyen significativamente al tamaño del
genoma eucariótico pero no a su expresión.
En determinadas enfermedades humanas como, la distrofia miotónica, la enfer-
medad de Huntington, la ataxia espinocerebelar, el síndrome de Kennedy relacio-
nado con la atrofia muscular bulbar y espinal ligada al cromosoma X frágil y el
cáncer de colon, se han observado secuencias de ADN reiterado en forma tres
pares de bases (15). Estas enfermedades se encuentran asociadas a la expansión de
algunas repeticiones de tripletes que están representadas en exceso en el genoma
humano. De esta forma la ataxia espinocerebelar I se caracteriza por la expansión
del triplete CAG, y el síndrome del cromosoma X frágil por la expansión del tri-
plete GCC. Las enfermedades asociadas con un incremento de estos tripletes se
caracterizan por un aumento de la gravedad a lo largo de las sucesivas genera-
ciones. Por ejemplo, en el síndrome del cromosoma X frágil, se encuentran 30
copias del triplete CGG asociados con el gen de la enfermedad FMR-1, las cuales
se pueden incrementar a 300 en los portadores de mutaciones del gen, e incluso
pueden presentarse con varios millares de copias en los individuos que manifies-
tan la enfermedad.
ADN mitocondrial
Una estructura circular de doble cadena, con 16569 pb y 37 genes constituye el
ADN mitocondrial. De ellos 24 genes codifican para 2 ARN ribosomales y 22 ARN
de transferencia específicos para la mitocondria, y los 13 genes restantes codifican
proteínas que son esenciales para la formación del ATP mitocondrial.
Dado que las mitocondrias de los espermatozoides no penetran en el huevo fer-
tilizado los genes mitocondriales sólo tienen herencia materna. Las mutaciones son
más frecuentes en el ADN mitocondrial que en el genómico, como consecuencia
de una baja fidelidad en la replicación del ADN, menor capacidad reparadora del
mismo, y el efecto masivo de radicales libres generados por la mitocondria. Esas
mutaciones producen desequilibrios en la fosforilación oxidativa, y se cree que
pueden estar implicadas en el envejecimiento y en el desarrollo de las enfermeda-
des degenerativas (16). De hecho durante el envejecimiento de humanos y ratones se
han descrito cinco deleciones diferentes del ADN mitocondrial que no se mani-
fiestan en individuos jóvenes. También en pacientes con miopatías mitocondriales
con frecuencia se observa la deleción de grandes fragmentos del ADN, lo cual tam-
bién ocurre en los tejidos sanos de ancianos. Ya que el ADN mitocondrial muta con
facilidad y es reparado escasamente, y que en los tejidos de ancianos se acumulan
mayor cantidad de radicales libres que pueden actuar sobre el ADN mitocondrial,
se ha propuesto que el envejecimiento puede estar relacionado con la acumulación
de mutaciones en el ADN mitocondrial (17). Sin embargo no sólo estos factores
deben tenerse en cuenta sino que otros genéticos y ambientales deben ser conside-
rados.
La epilepsia mioclónica se manifiesta con contracciones musculares incontrola-
bles, fibras rojas deshilachadas, y con una mutación en el gen de un ARNt mito-
condrial. También mutaciones en el ADN mitocondrial causan la neuropatía óptica
hereditaria de Leber, entidad nosológica transmitida por vía materna y caracteriza-
da por la pérdida de visión en la vida adulta por degeneración del nervio óptico. Esta
enfermedad puede aparecer por una mutación en el gen de la NADH deshidrogena-
sa del complejo I, que produce la sustitución de una arginina por una histidina, y
como consecuencia de ello a mitocondrias con una capacidad limitada para el trans-
porte electrónico y la síntesis de ATP. También esta enfermedad puede ser la con-
secuencia de un solo cambio de bases en el gen mitocondrial que codifica para el
citocromo b.
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2
Replicación del ADN
M.a C. García Martín
Introducción
La replicación del ADN es el proceso mediante el cual el ADN se utiliza como
molde para su propia síntesis. En este proceso juegan un papel importante las ADN
polimerasas, enzimas capaces de alargar o extender cadenas de ADN en crecimien-
to. Estas enzimas catalizan la incorporación de unidades de desoxiribonucleósidos
5’ trifosfato, de forma consecutiva, al grupo hidroxilo 3’ terminal de dichas cadenas,
de forma que sólo pueden crecer en la dirección 3’-5’. La identidad de los nucleó-
tidos que se incorporan está determinada por la necesidad de aparearse con la
correspondiente base del molde.
La exactitud de este proceso es muy elevada, sólo se produce un error cada
10 8-10 9 pares de bases. Esta fidelidad de la replicación es consecuencia de las
características especiales de las polimerasas. La mayor parte de estas enzimas, ade-
más de la actividad polimerizante 3’-5’, poseen actividad exonucleásica en direc-
ción 3’-5’, opuesta a la dirección de síntesis, que les permite eliminar los nucleóti-
dos introducidos de forma errónea. Con esta actividad «correctora de pruebas» las
ADN polimerasas pueden comprobar el resultado de cada polimerización antes de
catalizar la incorporación del siguiente nucleótido (1-5).
En E. coli se han aislado tres formas distintas, las polimerasas I, II y III que
desempeñan diferentes papeles en la célula. La ADN polimerasa I consiste en una
única cadena polipeptídica con tres actividades enzimáticas, una actividad polime-
rizante de nucleótidos 3’-5’, una actividad exonucleasa correctora de pruebas, que
elimina los nucleótidos desapareados a partir del hidroxilo 3’ terminal, y una acti-
vidad exonucleasa 5’-3’ capaz de actuar sobre un ADN de doble hebra (o un seg-
mento ADN-ARN) que contenga una mella. Esta última actividad, coordinada con
la actividad polimerasa, permite a la enzima sustituir regiones de una hebra de ADN
por material de nueva síntesis y tiene dos funciones: participa en la reparación del
ADN dañado y elimina los cebadores durante la replicación del ADN.
Las tres actividades de la ADN polimerasa I se localizan en dos regiones dife-
rentes de su cadena polipeptídica: un fragmento mayor (o fragmento de Klenow)
contiene los dominios polimerasa y 3’ exonucleasa y un fragmento menor contiene
el dominio 5’ exonucleasa. La forma en que se disponen estos tres lugares catalíti-
cos en el espacio es importante para comprender cómo actúa cada una de las acti-
vidades exonucleasas en coordinación con la polimerasa (1-4).
La polimerasa II actúa en mecanismos de reparación del ADN dañado.
La ADN polimerasa III es un complejo enzimático formado al menos por 10
subunidades distintas, tres de ellas (designadas como _, ` y e) forman el núcleo
catalítico, en el que residen las actividades polimerasa y exonucleasa correctora de
pruebas. La asociación de dos núcleos catalíticos en presencia de dos subunidades
o forman un dímero, al unirse a las otras subunidades (`, a, b, b’, r y s) forman un
dímero asimétrico conocido como holoenzima de la ADN polimerasa III. Estas pro-
teínas accesorias aumentan la procesividad de la enzima, es decir, su capacidad de
mantenerse unido al molde-cebador durante sucesivas etapas de polimerización.
Estudios estructurales de estas proteínas accesorias muestran que la subunidad
` es la responsable directa del aumento de la procesividad de la enzima, dos subu-
nidades ` forman un anillo cerrado que rodea el molde de ADN y actúa como una
«pinza» permitiendo a la polimerasa deslizarse sobre el molde sin disociarse de él.
Las otras subunidades, que componen el complejo a, se han identificado como
«igualadores moleculares» que utilizan la energía de la hidrólisis de ATP para unir
el ADN a la «pinza deslizante» (6).
Las células eucariotas contienen cinco polimerasas (_, `, a, b y ¡) con diferen-
te localización y función celular. Las polimerasas _, b y ¡ intervienen en la replica-
ción del ADN nuclear, la polimerasa a participa en la replicación del ADN mito-
condrial (8,9), mientras que las polimerasas ` y ¡ intervienen en mecanismos de
reparación.
Características generales de la replicación

La replicación del ADN presenta varias características comunes en sistemas
procariotas y eucariotas.
Es un proceso semiconservativo, en el que cada hebra de ADN parenteral se uti-
liza como molde para la síntesis de una nueva hebra complementaria.
La replicación transcurre de forma ordenada y secuencial. Es un proceso bidi-
reccional que se inicia en puntos fijos del cromosoma, con dos horquillas de repli-
cación que parten de esos orígenes. Cada horquilla está formada por dos hebras
hijas que se extienden sobre sus moldes originales de manera simultánea al desen-
rollamiento de la doble hélice parenteral.
Las ADN polimerasas no pueden iniciar la síntesis de nuevas cadenas y necesi-
tan una molécula cebadora con un extremo 3’hidroxilo libre sobre el que las poli-
REPLICACIÓN DEL ADN 17
merasas puedan adicionar nuevos nucleótidos. Los cebadores son en general cortos
segmentos de ARN sintetizados por enzimas especializadas o primasas, aunque en
algunos casos también pueden actuar las ARN polimerasas.
La replicación del ADN es semidiscontinua, pues debe de extender las dos
hebras de ADN antiparalelas en la misma dirección siguiendo el movimiento de la
horquilla de replicación. La hebra de ADN que se sintetiza de forma continua
siguiendo el movimiento de la horquilla, se llama hebra conductora, mientras que la
hebra retardada, es la que crece en sentido contrario al movimiento de la horquilla
y se sintetiza de forma discontinua, en forma de pequeños fragmentos, llamados
fragmentos de Okazaki, que luego se unen para formar una hebra continua (1-4).
Aunque de forma general el proceso de replicación es común a todos los seres
vivos, existen diferencias importantes entre procariotas y eucariotas.
Replicación en procariotas
Estudios realizados en E. coli han permitido proponer un modelo de replicación
que, con algunas excepciones, puede considerarse un esquema básico para la repli-
cación del ADN en muchas otras células.
1. Iniciación
La síntesis de ADN comienza en un punto específico del cromosoma, denomi-
nado origen de la replicación (OriC en E. coli). El OriC consiste en una secuencia
de 245 pares de bases, que contiene cuatro repeticiones de una secuencia de nueve
nucleótidos, que une la proteína de iniciación dnaA, y tres repeticiones directas de
una secuencia de 13 nucleótidos, ricas en pares de bases A-T fácilmente desnatura-
lizables. Además, el origen contiene 11 sitios de metilación reconocidos por la enzi-
ma metilasa Dam y varios sitios de unión a proteínas básicas (HU e IHF) que faci-
litan que el ADN se doble, un paso importante en la secuencia que conduce a la
iniciación de la replicación.
En la iniciación de la replicación participan seis proteínas diferentes (dnaA,
dnaB,dnaG, HU, topoisomerasa II y proteínas SSB). El proceso se inicia con la
unión de una molécula de dnaA a cada una de las cuatro dianas de nueve nucleóti-
dos siempre que estas dianas estén completamente metiladas. A continuación, varias
moléculas adicionales de dnaA (entre 20-40) se añaden consecutivamente por un
proceso cooperativo formando un complejo al que también se unen las proteínas
HU e IHF. La formación de este complejo dobla el ADN de manera bastante brus-
ca y crea una tensión superhelicoidal negativa que desenrolla el ADN en las regio-
nes de 13 pares de bases, con la apertura de un corto bucle de hebra sencilla. A
continuación, un complejo formado por seis monómeros de la proteína dnaC y un
hexámero dnaB es guiado por la dnaA hacia la región abierta donde la proteína
dnaB, que es una enzima con actividad helicasa, continúa desenrollando esta estruc-
tura y crea una «burbuja» de inicio de unos pocos centenares de pares de bases. La
Molde
superenrollado
ori C
Segmentos de 9 bp
Segmentos
de 13 bp HU
1 ATP • DnaA
Complejo
inicial
Insensibles a P1
2 20° 38° 5 mM ATP
Complejo
abierto
Sensibles a P1
38°
3
DnaB
DnaC
ATP
Complejo
pre-iniciador
Sensibles a P1 4
Iniciación
y réplica
Figura 2.1. Inicio de la replicación del ADN.

energía para la formación de la burbuja se obtiene del ATP a través de una reacción
catalizada por la topoisomerasa II (Fig. 2.1).
La síntesis de un ARN cebador comienza con la adición de la primasa dnaG al
dnaB para formar el primosoma. El primosoma interacciona con un molde de ADN
en cada una de las dos horquillas creadas por la burbuja de iniciación y empieza la
síntesis de los ARN cebadores en las dos hebras conductoras. A continuación, el
dnaB interacciona con la ADN polimerasa III formando el replisoma.
Para que tenga lugar la formación de las nuevas cadenas es imprescindible la
separación previa de las hebras del ADN parenteral. Las helicasas, son enzimas que
separan las hebras de ADN al frente de la horquilla de replicación. Su efecto es el
de desestabilizar la interacción entre pares de bases complementarias utilizando la
energía del ATP. Se mueven con una polaridad definida a lo largo de una u otra
hebra de ADN. En E. coli la principal helicasa implicada en el mecanismo de repli-
cación es la proteína dnaB que se mueve a lo largo del molde de la hebra retardada.
Una topoisomerasa II alivia la tensión torsional creada por la helicasa.
5’ 3’
Topoisomerasa
Doble hebra de ADN original
Helicasa de la hebra
conductora
Proteína de Primosoma
unión a hebra
sencilla ARN cebador
Molde Molde de la hebra retardada

de la hebra
conductora
ADN
polimerasa I
ADN de la
hebra
conductora
recién sintetizado Fragmento de
Okazaki ADN
ADN polimerasa ligasa
replicativa dimérica ADN de la hebra
retardada
3’ 5’
Figura 2.2. Horquilla de replicación del ADN.
Cuando se han separado las hebras de ADN, las regiones de hebra sencilla gene-
radas se estabilizan mediante su unión a proteínas específicas, llamadas proteínas
fijadoras de monohebra (SSB), que se unen al ADN de forma cooperativa (1,4).
2. Elongación
Una molécula de la holoenzima de la ADN polimerasa III cataliza la formación

de las hebras conductora y retardada. La síntesis de ambas hebras se produce de
forma coordinada pues en el molde de la hebra retardada se crea un bucle, origina-
do por un giro de 180˚, que sitúa ambas hebras en la misma orientación. Cuando el
extremo 5’ de un fragmento de Okazaki naciente alcanza el extremo 3’ de un frag-
mento sintetizado previamente, se rompe el bucle y se libera la hebra retardada,
entonces, la subunidad de la polimerasa III de la hebra retardada, que es poco pro-
cesativa, se disocia de su «pinza» deslizante que la une al molde de ADN, y se une
a la «pinza» en otro punto de la hebra retardada, donde la primasa ha sintetizado ya
un nuevo cebador. Finalmente los segmentos de ARN cebador de los distintos frag-
mentos de Okazaki son eliminados y reparados por la ADN polimerasa I y la unión
de los mismos catalizada por una ADN ligasa da lugar a hebras de ADN intactas.
(Fig. 2.2), (2,4,6).
3. Terminación
La replicación del ADN en el cromosoma circular de E. coli termina cuando las
dos horquillas de replicación se encuentran en una región terminal, que contiene
varias copias de una secuencia de 23 pares de bases llamada ter. Estas secuencias ter
detienen el movimiento de la horquilla de replicación pues proporcionan un sitio de
unión a las proteínas Tus que actúan como contrahelicasas, interfiriendo la acción
de la dnaB.
Las proteínas Tus son asimétricas y sólo pueden detener el avance de los repli-
somas que alcanzan el complejo Ter-Tus desde una dirección específica, pues de lo
contrario desplazarían la proteína Tus de su unión a la secuencia ter. Cada repliso-
ma debe traspasar todos los sitios que están orientados en la dirección opuesta antes
de llegar a un sitio Tus que presenta la orientación adecuada para la terminación, lo
que impide que el replisoma se disocie del ADN hasta que se encuentre con otro
replisoma que entra en región ter por el extremo opuesto. De esta manera se asegu-
ra la replicación completa del cromosoma y se evita la sobrerreplicación.
Los productos resultantes de la replicación son dos cromosomas hijos concate-
nados, que son separados por acción de una topoisomerasa tipo II (7).
4. Regulación de la replicación
La regulación de la replicación tiene lugar en la etapa de iniciación. En E. coli
el origen de replicación contiene 11 copias de una secuencia susceptible de ser
metilada por la enzima metilasa Dam y el grado de metilación del OriC regula la
disponibilidad de los sitios de unión a dnaA, así como la concentración de dnaA.

Una vez iniciada la replicación, el OriC hemimetilado, interacciona con la mem-
brana plasmática impidiendo el acceso de la dnaA a sus sitios de unión. Además, la
unión del ADN cercano al OriC a la membrana celular secuestra el gen dnaA que
esta situado cerca del OriC, como resultado se inhibe la síntesis de dnaA, disminu-
yendo su concentración celular (2,3).
Replicación en eucariotas
La replicación del ADN en eucariontes es un proceso esencialmente parecido al

que se da en procariontes. La formación de una horquilla de replicación, síntesis de
cebadores, creación y maduración de fragmentos de Okazaki son paralelos a las eta-
pas correspondientes que se dan en procariontes, sin embargo el proceso en general
es bastante más complejo, debido fundamentalmente al mayor tamaño del ADN y
a su diferente empaquetamiento en la cromatina.
Estructura de la cromatina
El ADN se encuentra asociado con varias tipos de proteínas formando la cro-

matina. El componente proteico de la cromatina, que constituye algo más de la
mitad de su masa, se compone de dos tipos de proteínas: las histonas, conjunto de
pequeñas proteínas básicas, muy ricas en Lys y Arg, que participan en el plega-
miento del ADN eucariótico y las proteínas cromosómicas no histonas. La croma-
tina contiene también un pequeño porcentaje de ARN.
En todos los organismos eucariotas se han encontrado cinco tipos de histonas:
las histonas nucleosómicas H2A, H2B, H3 y H4 responsables del plegamiento del
ADN en los nucleosomas (unidades estructurales básicas de la cromatina) y la his-
tona H1. Las histonas nucleosómicas son proteínas muy conservadas, mientras que
las histonas H1 son proteínas más grandes, de carácter más básico y más específi-
cas de especie y tejido. En vertebrados existe una histona adicional, la histona H5,
que tiene una función similar a la H1.
Las histonas se diversifican aún más mediante algunas modificaciones post-
translacionales de algunos aminoácidos, como reacciones de acetilación, fosforila-
ción, ADP-ribosilación o metilación.
Las proteínas no histonas constituyen un grupo de proteínas muy heterogéneo.
Muchas de las proteínas no histonas son enzimas o proteínas reguladoras, otras
están implicadas en la organización del cromosoma.
En la cromatina, el ADN y las histonas se organizan en unidades repetitivas lla-
madas nucleosomas. Cada nucleosoma (o partícula central del nucleosoma) es una
estructura en forma de disco, compuesta por dos unidades de cada una de las histo-
nas H2A, H2B, H3 y H4 y una cadena de ADN de 146 pares de bases que se enro-
lla alrededor de este octámero de histonas como una superhélice negativa. Las his-
tonas están en contacto con el surco menor de ADN, dejando libre el surco mayor
para posibles interacciones con proteínas reguladoras. Los nucleosomas incorporan
una molécula de histona H1 que interacciona con ambos extremos del ADN a la
entrada y a la salida del nucleosoma para formar el cromatosoma.
Las fibras de cromatina están constituidas por una larga cadena de nucleosomas
unidos por una región de ADN de longitud variable (de aproximadamente 15-55
pares de bases) denominado ADN de unión.
La formación de los polinucleosomas representa el primer nivel de estructura-
ción o empaquetamiento del ADN eucariótico, dando lugar a la denominada fibra de
10nm. Sin embargo, gran parte de la cromatina del núcleo esta todavía más com-
pactada. La histona H1 juega un papel clave en el siguiente nivel de compactación
al servir como puente de unión entre nucleosomas adyacentes para formar una héli-
ce solenoidal con 6 o 7 nucleosomas por vuelta que constituye la fibra de 30 nm.
Se cree que el siguiente nivel de organización ocurre cuando los filamentos de
cromatina de la fibra de 30 nm se organizan en dominios condensados en forma de
bucles de tamaño variable según los organismos. Estos bucles están anclados en su
base a un andamiaje de proteínas (matriz nuclear), compuesto por histona H1 y
otras proteínas no histonas incluyendo una topoisomerasa tipo II que podría regu-
lar posibles superenrollamientos. La condensación de los cromosomas mitóticos
resulta probablemente de la disposición de la fibra de 30nm en forma de enrolla-
mientos helicoidales estrechamente apilados (10,11).
Parece probable que la estructura de la cromatina sea dinámica, con cambios
locales a medida que el ADN se replica o se transcribe. Los cambios en el empa-
quetamiento y por tanto, la transición entre las diferentes formas de la cromatina,
parecen estar controladas por medio de modificaciones covalentes en las histonas.
Las histonas H3 y H4 pueden experimentar una acetilación reversible dependiente
del ciclo celular en el grupo ¡-amino de los restos de Lys, mediante dos enzimas
diferentes, una histona acetilasa y una histona desacetilasa. El grupo hidroxilo del
residuo N-terminal Ser de la histona H4 puede ser fosforilado mediante una quina-
sa. La acetilación y fosforilación cambian la carga de la región N-terminal de estas
histonas de positiva a negativa y promueve la descondensación de la cromatina. La
fosforilación de la histona H1 en los grupos de hidroxilo de restos de Ser está corre-
lacionada con la condensación de la cromatina para dar lugar a los cromosomas
metafásicos (11,12).
Para que el ADN eucariótico sea accesible a la ADN polimerasas, los nucleoso-
mas deben desensamblarse, a medida que avanza la horquilla de replicación y luego
reensamblarse en las moléculas de ADN hijas, según una de las hipótesis propues-
tas cada nucleosoma se dividiría durante la replicación en dos «medios nucleoso-
mas» permitiendo el acceso de la ADN polimerasa al ADN nucleosómico desenro-
llado. Además, en base al mayor contenido en ADN de las células animales y a la
menor actividad de sus ADN polimerasas, el ciclo de replicación de la célula euca-
riótica tardaría mucho tiempo en completarse si no entraran en acción factores de
compensación.
Las células eucarióticas contienen un gran número de moléculas de ADN poli-

merasas en comparación con las bacterias. Además las polimerasas inician la sínte-
sis bidireccional no en uno, sino en varios puntos de iniciación a lo largo del cro-
mosoma. Los segmentos de ADN situados entre dos puntos de iniciación se
denominan replicones.
Papel de las polimerasas eucarióticas
A diferencia de lo que ocurre en procariotas, en los que la síntesis de ADN está

catalizada por dos subunidades diferentes de la ADN polimerasa III, en eucariotas
este proceso es realizado por enzimas diferentes (polimerasas _ y b).
La ADN polimerasa _ es una proteína tetramérica, la subunidad mayor tiene
actividad polimerizante 5’-3’ y en algunos tipos celulares también dispone también
de actividad exonucleásica 3’-5’, otras dos subunidades de menor tamaño confieren
a la enzima actividad primasa. El complejo ADN polimerasa _/primasa parece ini-
ciar la síntesis en ambas hebras de ADN al sintetizar un segmento de ARN-cebador
cuyo extremo 3’-hidroxilo es extendido por la actividad polimerasa para formar una
corta secuencia de ADN llamada ADN i. La ADN polimerasa _, a diferencia de
otras polimerasas más complejas, no puede catalizar la síntesis procesativa de ADN
y se disocia del molde después de la síntesis del cebador. Los segmentos de ARN-
ADN serán luego extendidos por la ADN polimerasa b (o ¡).
La ADN polimerasa b es una polimerasa de alta procesividad que cataliza la
elongación de las hebras conductora y de los fragmentos de Okazaki de la hebra
retardada. Esta enzima contiene una subunidad de mayor tamaño dotada de activi-
dad polimerizante 5’-3’ y exonucleásica 3’-5’ correctora de pruebas.
La elevada procesividad de la ADN polimerasa b se atribuye a la presencia de
un factor accesorio conocido como antígeno de proliferación nuclear (PCNA), pues
se encuentra en grandes cantidades en los núcleos de las células proliferativas. Tres
moléculas de PCNA estrechamente asociadas forman un anillo cerrado en torno al
ADN que actúa como una «pinza deslizante» impidiendo la disociación de la enzi-
ma. Esto sugiere que en los eucariotas el PCNA es el equivalente funcional de la
subunidad ` de la ADN polimerasa III de E. coli.
El factor de replicación C (RFC) es otra proteína accesoria que parece inter-
accionan con la ADN polimerasa b favoreciendo su asociación al PCNA.
Alternativamente, el RFC podría participar en el establecimiento de un enlace entre
las ADN polimerasas _ y b. La síntesis del ADN eucariótico requiere la partici-
pación del factor de replicación A que es el equivalente funcional de las proteínas
procariotas (SSB). En eucariotas, las helicasas no parecen estar relacionadas con la
actividad primasa, sino que se asocian a la ADN polimerasa (1,2,8,9).
En la maduración de los fragmentos de Okazaki, el ARN cebador es elimina-
do por la acción consecutiva de dos endonucleasas: ARNasa I y FEN1.
Alternativamente, podría actuar primero una helicasa, la Dna2, desplazando el ARN
cebador, para crear una estructura en forma de fleco sobre la que puede actuar la
A. ARNasa H1/FEN1 B. Dna2/FEN1
ARN
primer
ADN
5’ 3’ 5’
3’ 5’ 3’
ARNasa H1 5’
3’
3’ 5’ 3’
Dna2 helicasa
FEN1 FEN1
3’
3’ 5’ 3’
Figura 2.3. Mecanismos de eliminación del ARN cebador por acción de la ARNasa H1 (A) y la
ADN helicasa (B).
endonuclesa FEN1 (Fig. 2.3). También se ha sugerido que la helicasa Dna2 podría
desplazar toda la secuencia ARN-ADNi sintetizada por la ADN polimerasa, para ser
sustituida por nuevos desoxirribonucleótidos, lo que representaría una ventaja sig-
nificativa para el mantenimiento de la integridad de genoma, pues la ADN polime-
rasa _ no parece presentar actividad correctora de pruebas (8).
La ADN polimerasa ¡ es una proteína monomérica grande dotada de actividad
polimerasa, exonucleasa 3’-5’ correctora de pruebas y exonucleasa 5’-3’, que podría
participar en la reparación del ADN y el relleno de los fragmentos de Okazaki, de
forma análoga a la polimerasa I de E. coli.
Orígenes de replicación en eucariotas
Los orígenes de replicación en eucariotas han sido identificados en levaduras y

reciben el nombre de secuencias de replicación autónoma (ARS). Los ARS tienen
entre 100 y 120 pares de bases y constan de una región central A y tres elementos
B. La región central A contiene varias secuencias de consenso de 11 pares de bases
que parecen análogas a las secuencias de 13 nucleótidos del OriC.
La unión de proteínas a estas secuencias forma el complejo de replicación
(ORC) que promueve la apertura de las hebras de ADN en las secuencias centrales
ricas en A-T. La región abierta de ADN se estabiliza por proteínas de unión a mono-
hebra RPA y una helicasa extiende la región abierta permitiendo el acceso de las
polimerasas. Cerca de la región A, los elementos B1 y B2 ayudan a la formación del

ORC mientras que los elementos B3 están asociados al factor de transcripción
ABF1 (2,13).
En eucariotas la replicación tiene lugar durante la fase sintética (fase S) del
ciclo celular. Se produce bidireccionalmente a partir de múltiples orígenes creando
«burbujas» de replicación que crecen de manera independiente hasta que se fusio-
nan copiando todo el cromosoma. No todos los orígenes inician la replicación al
mismo tiempo, el proceso de copia empieza en centenares de orígenes, algunos de
los cuales son activados al principio de la fase S mientras otros son activados al final
de la misma. Coordinar la síntesis de ADN en células eucarióticas significa coordi-
nar la copia de millares de pares de bases, distribuidos en numerosos cromosomas
y sólo en el momento adecuado del ciclo celular. Resultados recientes indican que
el complejo ORC no actúa sólo en el control de la iniciación, una o más proteínas
adicionales, que podrían estar implicadas en el control del ciclo celular, pueden inte-
raccionar en los orígenes de replicación al final de la mitosis y permanecer unidas
a ellos, inhibiendo la formación de un nuevo complejo ORC hasta el inicio de la
fase S. Otra hipótesis alternativa sugiere que proteínas iniciadoras o «factores per-
misivos» necesarios para la replicación, podrían unirse débilmente a los orígenes de
replicación y serían destruidos o inactivados por el paso de la horquilla de ini-
ciación (13,14).
Replicación en los extremos de los cromosomas lineales
Los cromosomas lineales necesitan una serie de pasos adicionales que permitan
la replicación de sus extremos. En eucariotas existe un mecanismo para la replica-
ción de los telómeros que implica la participación de la enzima telomerasa. Esta
enzima reconoce la cadena rica en G de una secuencia telomérica repetida y la alar-
ga en dirección 5’-3’. En ausencia de una cadena de ADN complementario, la telo-
merasa sintetiza una copia de la secuencia repetida empleando un molde de ARN
que es componente de la propia enzima. Después de varios ciclos de extensión por
la telomerasa, se puede completar la replicación empleando dichas extensiones
como molde para la síntesis de la cadena complementaria por la ADN polimerasa.
El proceso de recorte y recuperación está equilibrado solo aproximadamente, cada
extremo de cromosoma contiene un número variable de repeticiones en tándem de
varios cientos de pares de bases de longitud (15).
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3
Estructura y procesamiento del ARN
I. Roncero
Introducción
El proceso global de transferencia de la información en la célula puede represen-
tarse mediante el esquema:
ADN A ARN A PROTEÍNAS
La expresión de la información genética contenida en un segmento de ADN,
siempre tiene lugar a través de una molécula de ARN. Con la excepción de los geno-
mas de ARN de ciertos virus, todas las moléculas de ARN se forman a partir de la
información contenida en el ADN. Mediante un proceso llamado transcripción, un
sistema enzimático convierte la información genética contenida en un segmento de
ADN en una cadena de ARN con una secuencia de bases complementaria a una de
las cadenas de ADN.
Estructura del ARN

Estructura primaria
El ARN es un polímero lineal de ribonucleósidos 5´monofosfato. Las bases que

forman el ARN son: adenina (A), guanina (G), citosina (C) y uracilo (U). El azúcar
que forma los nucleósidos en el ARN es la ribosa, en lugar de la 2´ desoxirribosa
que aparece en el ADN. Los nucleósidos están unidos entre sí por enlaces 3´, 5´ fos-
fodiéster originando una cadena a partir de la cual se extienden las bases.
Químicamente el ARN es muy similar al ADN, con las únicas diferencias del
grupo OH en la posición 2´ del azúcar y la sustitución de la base timina por uraci-
lo. Sin embargo, estas pequeñas diferencias confieren al ARN una mayor diversidad
estructural y funcional que el ADN. Las moléculas de ARN no sólo transportan y
expresan información sino que también actúan como catalizadores. Por otra parte,
el ADN está diseñado para ser estable, mientras que las moléculas de ARN han de
variar a lo largo del desarrollo celular, por lo tanto, estas pequeñas diferencias
estructurales podrían ser también marcadores que permitan a enzimas específicos
reconocer y degradar selectivamente el ARN. La longitud de las moléculas de ARN
en eucariotas varía desde unos 65 hasta unos 200.000 nucleótidos.
Estructura secundaria
A diferencia del ADN, el ARN es una molécula monohebra que está presente en
la célula predominantemente como una cadena simple. Una cadena sencilla de ARN
puede plegarse de forma que las bases formen pares semejantes a los del ADN,
dando lugar a una estructura secundaria como resultado de la presencia de peque-
ñas regiones de apareamientos intramoleculares entre bases.
En el ARN existe una cantidad considerable de estructura helicoidal, incluso en
regiones sin apareamientos moleculares de Watson y Crick, debida sobre todo a
fuerzas de apilamiento de bases entre residuos de A, G y C.
Aunque el ARN bicatenario forma una hélice dextrógira parecida a la del ADN,
las estructuras helicoidales del ARN son en general del «tipo A», una hélice más
compacta que la del «tipo B», con más pares de bases por vuelta y en la que los
pares de bases están inclinados con respecto al eje de la hélice. Las regiones de
doble hélice en el ARN se denominan «horquillas» y las regiones sin emparejar
«bucles». La estructura de las horquillas es variable al igual que el tamaño y el
número de bucles.
Estructura terciaria
Las estructuras funcionales reales del ARN son más complejas que las hélices
por apareamiento o apilamiento de bases antes mencionados. Además de la estruc-
tura secundaria, las moléculas de ARN se pliegan sobre sí mismas, dando lugar a
una estructura terciaria en la que se establecen un gran número de enlaces por puen-
tes de hidrógeno y otros tipos de interacciones débiles. Los brazos y bucles se plie-
gan en conformaciones específicas que se mantienen no sólo por los empareja-
mientos de bases tradicionales de Watson y Crick, sino también por interacciones
entre bases que implican a más de dos nucleótidos. El grupo 2´-OH de la ribosa es
un dador y aceptor de hidrógeno, contribuyendo de forma importante al manteni-
miento de la forma plegada de la molécula de ARN.
Clases de ARN
Según la función que cumplen, existen tres clases principales de ARN:
ESTRUCTURA Y PROCESAMIENTO DEL ARN 29
ARN mensajero (ARNm): Es el portador de la secuencia de bases que codifican

la secuencia de aminoácidos de uno o más polipéptidos especificados en un gen o
conjunto de genes. Las moléculas de ARNm sirven como molde para la síntesis de
proteínas y llevan la información desde el ADN hasta los ribosomas.
ARN de transferencia (ARNt): El ARNt actúa como un adaptador que lee la
información codificada en el ARNm y transfiere el aminoácido adecuado a la cade-
na polipeptídica en crecimiento durante la síntesis de proteínas. Los ARNst trans-
fieren los aminoácidos específicos desde los «pools» de aminoácidos solubles a los
ribosomas y aseguran el ordenamiento de estos aminoácidos en la secuencia ade-
cuada antes de la formación del enlace peptídico. Existe, al menos, un ARNt espe-
cífico para cada uno de los 20 aminoácidos que forman las proteínas.
ARN ribosómico (ARNr): Los ARNsr forman, junto con proteínas la compleja
maquinaria que cataliza la síntesis proteica: los ribosomas. Los ribosomas son par-
tículas subcelulares formados por, al menos tres moléculas diferentes de ARNr y de
70 a 80 proteínas ribosómicas.
Procesamiento del ARN

Gran parte de las moléculas de ARN en procariotas y virtualmente todas las
moléculas de ARN de eucariotas son modificadas en mayor o menor grado después
de su síntesis. Una molécula de ARN recién sintetizada se llama transcrito primario
y éste debe ser modificado posteriormente para dar una molécula de ARN madura,
funcionalmente activa.
Las reacciones que dan lugar a las formas maduras del ARN comprenden:
— Adición de secuencias o nucleótidos no codificados por los genes corres-
pondientes.
— Modificación covalente de determinadas bases o residuos de ribosa.
— Separación de diferentes secuencias por acción de nucleasas específicas.
— Transporte del ARN desde el núcleo al citoplasma.
— Degradación completa del ARN para ser reemplazado por ARN recién sinte-
tizado.
El procesamiento del ARN está relacionado con la estabilidad. Generalmente
niveles elevados de procesamiento se corresponden con ARNs muy estables, si bien
la estabilidad depende también del grado de estructura secundaria. En este sentido,
las moléculas estables de ARNt y ARNr con vidas medias del orden de horas a días,
constituyen un caso extremo. Estas moléculas, como se verá más adelante, presen-
tan estructuras secundarias con alto grado de apareamiento de bases y estructuras
terciarias que les confieren resistencia a nucleasas celulares ubicuas. Tanto en pro-
cariotas como en eucariotas, estas especies de ARN resultan de un procesamiento
extenso de los transcritos primarios. En el extremo opuesto están las moléculas de
mARN procariótico que tienen vidas medias de minutos. Estas moléculas carecen
de una estructura secundaria particular y raramente son procesadas. Entre estos dos
extremos están las moléculas de ARNm eucariótico, cuyas vidas medias son del
orden de horas. Aunque carecen de estructura secundaria definida, estas moléculas
sufren un proceso extenso de maduración.
La inclusión del procesamiento entre la transcripción del ARN y la actividad
completa del mismo supone para la célula un punto importante de regulación de la
expresión génica. El procesamiento del ARN tiene lugar en el núcleo de la célula y
sólo cuando este proceso se ha completado el ARN es transportado al citoplasma.
Estudiaremos a continuación la estructura y el procesamiento de cada uno de las
tres clases principales de ARN.
ARN mensajero
Los ARNm son los portadores directos de la información genética desde el
núcleo a los ribosomas. Son productos de la transcripción del ADN genómico, con
unas características especiales que los destinan a unirse a los ribosomas.
Cada ARNm eucariótico contiene información para una sola cadena polipeptí-
dica, por lo que se llaman monocistrónicos, mientras que las especies de ARNm
policistrónicas de procariotas pueden codificar más de una proteína.
Los ARNm eucarióticos maduros tienen rasgos estructurales únicos que no apa-
recen en las moléculas de ARNt ni en las de ARNr (Fig. 3.1A). El extremo 5´ del
ARNm de eucariotas comienza con una estructura llamada casquete o caperuza
(cap) formado por una base nitrogenada metilada, generalmente 7 metil guanosina
(m7G), unida al primer nucleótido del transcrito mediante enlaces 5´,5´-fosfotriés-
ter en lugar de los enlaces 3´,5´-fosfodiéster habituales. El primer nucleótido trans-
crito es generalmente una purina y está metilado en el 2ÓH de la ribosa. A conti-
nuación del casquete viene una secuencia que no se traduce, llamada secuencia
conductora o «leader», seguida de la secuencia o codón de iniciación, que general-
mente es AUG y a continuación el mensaje que se ha de traducir o región codifica-
dora. Al final de la región codificadora se encuentra una secuencia o codón de ter-
minación (UAG, UGA o UAA) que señala el final de la síntesis del péptido. Sigue
una secuencia no traducida, secuencia remolque (trailer) que termina con una serie
de ácidos adenílicos, llamada cola de poli(A) que constituye el extremo 3´ de la
molécula de mARN y puede tener una longitud de 20 a 200 nucleótidos.
Procesamiento del ARNm
Los rasgos estructurales que acabamos de describir para las moléculas de

ARNm maduro de eucariotas no están presentes en los transcritos primarios, éstos
los adquieren en el núcleo durante el proceso de maduración que comprende:
— Adición del casquete 5´.
— Adición de la cola de poli(A) 3´ terminal.
A
Transcrito primario
5’ 3’
AUG UAG
Procesamiento
RNAm
5’ 3’
7
m Gppp AUG UAG (AAAA)n
CAP Secuencia Secuencia codificadora Secuencia final no
conductora traducida traducida
no traducida
B
3’ 3’
5’
3’ OH 3’
G 3’ OH G
G
A
P G P
A G 5’
G G
G A A P + P A
G
A
G U
P
OH-A P A A A
G 5’ G A
U U G
A A U
A A
G G
U U 5’
Figura 3.1. Estructura y procesamiento del ARNm. (A) Estructura del ARNm eucariótico.
(B) Mecanismo de eliminación de intrones.
— Modificación covalente de nucleótidos.

— Eliminación de secuencias no codificantes (splicing).
Adición del casquete 5´
El extremo 5´ de los transcritos primarios del ARNm eucariótico, es modifica-

do covalentemente antes de que finalice completamente la transcripción. A medida
que el complejo de transcripción se desplaza a lo largo del ADN, las enzimas encar-
gadas de la unión del casquete modifican el extremo 5´ del ARNm naciente. La
modificación tiene lugar de la siguiente forma:
— El grupo a-fosfato del nucleósido trifosfato terminal se escinde por acción de
una fosfohidrolasa.
— El grupo 5´-difosfato resultante reacciona con el fosfato en posición _ de una

molécula de GTP para generar un enlace 5´,5´-trifosfato. Esta reacción está
catalizada por la guanililtransferasa que junto con la fosfohidrolasa de la
reacción anterior, forman una enzima dimérica que está asociada al extremo
C-terminal de la ARN polimerasa II.
— En la mayoría de los eucariotas los ARNms son metilados en el nitrógeno en
posición 7 de la guanina recién añadida a expensas de S-adenosil metionina
como dadora del grupo metilo. El casquete puede a su vez ser modificado de
diferente forma según la especie de que se trate. Así, puede metilarse el
grupo 2´-OH del último nucleótido del transcrito original o los grupos 2´-OH
de los dos últimos nucleótidos.
La función del cap es importante ya que interviene en diferentes procesos. Así:
1) protege al ARNm de las actividades 5´ exonucleolíticas al bloquear el extremo 5´
de la molécula; 2) convierte a los precursores del ARNm en sustrato de las siguien-
tes etapas de procesamiento; 3) constituye un sitio de reconocimiento por factores
de iniciación de la traducción; 4) se une a proteínas nucleares que dirigen el trans-
porte de las moléculas de ARNm maduras desde el núcleo al citoplasma; y 5) sirve
de centro de anclaje a los ribosomas.
Adición de la cola de poli(A)
Los precursores del ARNm eucariótico son también modificados en el extre-

mo 3´. Una vez que la ARN polimerasa II ha sobrepasado el extremo 3´ terminal de
la región codificadora del ADN, el ARN es escindido por una endonucleasa cerca
de un sitio específico cuya secuencia consenso es AAUAAA. La escisión tiene
lugar a unos 15-20 nucleótidos hacia el extremo 3´ del sitio de reconocimiento
AAUAAA y depende tanto de secuencias adicionales como de la estructura secun-
daria del precursor del ARNm. La escisión endonucleolítica genera un nuevo extre-
mo 3´ que puede ser utilizado como cebador para la adición de residuos de adeno-
sina en reacción catalizada por la poli A polimerasa. Este proceso, que requiere ATP
y puede añadir hasta 250 nucleótidos, puede representarse:
ARNm precursor + nATP A ARN(AMP)n + nPPi
El proceso de poliadenilación no suele estar acoplado a la terminación de la

transcripción, que puede continuar cientos de nucleótidos detrás del sitio de rotura
3´ terminal. La longitud de la cola de poli(A) varía desde 50 a 250 nucleótidos,
dependiendo de la especie y de otros factores, como el tipo de ARNm y el estado de
desarrollo de la célula. También depende de la edad del ARNm, ya que la cola se va
acortando con el tiempo, de hecho se acorta en 50-100 nucleótidos en el tiempo que
transcurre hasta que el ARNm maduro alcanza el citoplasma. Esta reducción se
debe a la acción de exonucleasas específicas del extremo 3´ terminal del ARN. Así
la cola de poli(A) retrasa la llegada de estas exonucleasas a la región codificadora
del ARNm, protegiéndole de su degradación enzimática. La colas de poli(A) se aso-

cian con una proteína de 78 kD formando un complejo que posiblemente contribu-
ye a la estabilidad del ARNm.
Eliminación de intrones
En eucariotas, los ARNm citoplasmáticos son más cortos que sus transcritos
primarios, los cuales tienen secuencias internas y terminales adicionales. Un trans-
crito primario de un ARNm eucariótico contiene generalmente secuencias que
abarcan un gen. Sin embargo, las secuencias que codifican un polipéptido no son
contiguas. En la mayoría de los transcritos primarios, las secuencias codificantes,
llamadas exones, están interrumpidas por secuencias no codificantes llamadas
intrones (Fig. 3.1). En el proceso llamado de corte y empalme (splicing) se elimi-
nan los intrones del transcrito primario y se unen los exones para formar una
secuencia contigua que codifica un polipéptido.
El descubrimiento de los intrones a mediados de los años setenta, cambió la idea
que se tenía sobre la organización de los genes. Hasta entonces, se asumía que el
ARNm maduro era una copia exacta de la hebra molde del ADN, y era traducido de
un extremo a otro íntegramente. Este concepto se basaba en experimentos realiza-
dos con bacterias, en los que el orden y la distancia entre mutaciones en un gen eran
idénticos al orden y la distancia entre los aminoácidos modificados en la proteína
correspondiente. Así, las secuencias de aminoácidos en las proteínas parecían estar
codificadas por el ADN sin interrupción. Hoy día está bien establecido que esto ocu-
rre sólo en bacterias y en unos pocos eucariotas, en los que la secuencia de ADN que
codifica una proteína es continua.
Los intrones se cortan del transcrito primario y se empalman los exones for-
mando el ARN maduro funcional, en un proceso que tiene lugar mediante reaccio-
nes sucesivas de transesterificación y en el que algunas de las enzimas que inter-
vienen están constituidas por ARN y no por proteína. Además algunas de estas
moléculas de ARN están localizadas en los propios intrones, donde autocatalizan su
eliminación.
¿Cómo reconoce la célula las secuencias pertenecientes a los intrones y que por
tanto debe eliminar y las que deben permanecer en el ARN maduro? Los sitios de
corte de las moléculas precursoras de ARNm contienen secuencias consenso rela-
cionadas entre sí. Además, a una distancia de entre 10 y 40 nucleótidos del extremo
3´ terminal del intrón, existe una secuencia consenso, denominada sitio de ramifi-
cación, que tiene un papel muy importante en el proceso de corte y empalme.
Estas secuencias se representan en el esquema siguiente:
Sitio de ramificación
5´––––AGGUAAGU–––––––––––AY–––––YYYYYYYYYAGG––––3´
Å––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––Æ
exón5´ intrón exón3´

y tienen como características: 1) en todos los genes eucarióticos aparece la secuen-

cia GU en el punto en el que el extremo 5´ del intrón se une al exón 5´. 2) la secuen-
cia AG marca el punto de unión del extremo 3´ terminal del intrón con el exón 3´;
y 3) un residuo de adenosina situado entre 10 y 40 nucleótidos más arriba del sitio
de corte 3´ forma parte del sitio de ramificación. En el esquema anterior, Y puede
ser cualquier nucleótido de pirimidina.
La importancia de estas secuencias se manifiestan por los efectos que su altera-
ción produce en el proceso de corte y empalme, que se ve afectado cuando en ellas
se sustituye algún nucleótido sobre todo en AG y GU. En muchas especies el pro-
ceso es alterado por mutaciones espontáneas en estas secuencias. Así, en el hombre,
pueden aparecer mutaciones que alteran el patrón de procesamiento normal de los
genes de las globinas _ y `, dando lugar a cadenas anormales en la hemoglobina
(talasemias). Por ejemplo, una mutación de G a A en la secuencia GU por la que
empiezan todos los intrones, implica que la maquinaria de empalme no la recono-
cerá como tal secuencia y pasará por alto la unión exón-intrón, dando como resul-
tado la aparición de secuencias adicionales en el ARNm de la ` globina o la elimi-
nación de secuencias en el mismo. En cualquier caso, la cantidad de ` globina
funcional estará reducida.
En los precursores de los ARNm eucarióticos, los intrones son eliminados
mediante dos reacciones de transesterificación, una entre el sitio de corte 5´ del
intrón y un resto de adenilato del sitio de ramificación y otra entre el exón 5´ y el
sitio de corte 3´ del intrón. Los productos de estas reacciones son los dos exones
ligados entre sí y el intrón separado en forma de lazo (Fig. 3.1B). Estas reacciones
están catalizadas por un complejo de proteína y ARN de gran tamaño (3.103 kD)
y complejidad denominado complejo de splicing o espliceosoma. Las moléculas de
ARN que forman este complejo pertenecen a una clase de ARN eucariótico llama-
do ARN nuclear pequeño (ARNsn) y se asocian con proteínas dando lugar a com-
plejos denominados ribonucleoproteínas nucleares de pequeño tamaño (RNPsn).
En las reacciones de corte y empalme intervienen cinco tipos de moléculas de
ARNsn: U1, U2, U4, U5 y U6 (U es la abreviatura de uracilo, una base muy fre-
cuente en este tipo de moléculas). Cada una de las moléculas U1, U2, U5 consti-
tuyen el núcleo de una RNPsn determinada. U4 y U6 forman parte conjuntamente
de la estructura de otra RNPsn. Además cada RNPsn contiene proteínas que son
comunes a todas las snRNPs y otras que son exclusivas de cada complejo snRNP
particular (Tabla 3.1).
Mecanismo del corte y empalme: El proceso empieza con la unión del comple-
jo RNPsnU1 al sitio de corte 5´ del intrón. ARNsnU1 contiene una secuencia com-
plementaria a la secuencia consenso del extremo 5´ del intrón y la unión se realiza
mediante el apareamiento entre estas secuencias complementarias en el ARNU1 y
el ARNm precursor. Este apareamiento convierte al intrón en diana del mecanismo
subsiguiente de eliminación. A continuación, RNPsnU2 se une al sitio de ramifica-
ción del intrón y U1 y U2 se asocian acercando entre sí los extremos 5´ y 3´ del
intrón, lo que permite que U1 se aparee también con el centro de empalme 3´. El
complejo U4 U5 U6 previamente formado, se une al formado por U1 U2 y el pre-
Tabla 3.1. Moléculas de ARNsn y RNPsn que forman el espliceosoma.
ARNsn RNPsn Función

U1 snRNPU1 Unión al centro de empalme 5ý
después al centro de empalme 3´
U2 snRNPU2 Unión al sitio de ramificación
U5 snRNPU5 Unión al centro de empalme 5´
U4 SnRNPU4U6 Enmascarar la actividad catalítica de U6
U6 Catalizar el empalme
cursor del ARNm, dando lugar al espliceosoma completo pero inactivo. La ruptura
del apareamiento entre U4 y U6, libera la actividad catalítica de U6, que junto con
los demás componentes del espliceosoma llevarán a cabo la reacción completa de
corte y empalme. Así pues, U4 actúa como un inhibidor que enmascara a U6 hasta
que todos los centros específicos de empalme están perfectamente alineados. El
resultado de la reacción es el corte preciso del intrón y la unión de los exones para
dar lugar al ARNm maduro. El proceso requiere ATP, aunque parece que éste es
necesario para el ensamblaje del espliceosoma pero no para las reacciones de corte
y empalme del ARN. En este proceso, las moléculas de snARN juegan un papel
clave en el alineamiento de los centros de empalme y en la catálisis. Por otra parte,
la escisión de cada intrón comporta el ensamblaje y desensamblaje de un espliceo-
soma.
En eucariotas, los transcritos primarios pueden tener señales moleculares para
dos o más rutas alternativas de maduración, de modo que se pueden producir uno o
más mARN según la ruta escogida. La maduración diferencial del ARN da lugar a
múltiples productos a partir de un gen: Una única secuencia de ADN puede dar
lugar a diferentes proteínas debido a cortes y empalmes alternativos en el transcri-
to primario. La regulación del proceso de splicing puede generar diferentes versio-
nes de una proteína en diferentes tipos celulares, de acuerdo con las necesidades de
la célula.
ARN de transferencia (ARNt)

El ARNt transporta los residuos de aminoácidos para ser adicionados a las cade-
nas polipeptídicas crecientes durante la síntesis de proteínas. El ARNt reconoce las
secuencias de tres bases que codifican para un aminoácido (codones) en el ARNm
transfiriendo el aminoácido correcto a la cadena polipeptídica en formación. Desde
el punto de vista estructural, las moléculas de ARNt presentan dos centros activos:
la secuencia CCA en el extremo 3´, a la cual se une enzimáticamente el aminoáci-
do específico y una secuencia de tres bases (anticodón) que se aparea específica-
mente con el codón correspondiente en el ARNm. Cada ARNt puede transferir un
solo tipo de aminoácido.
A pesar de las diferencias en sus estructuras primarias, todas las moléculas de

ARNt tienen una estructura secundaria común con apariencia de hoja de trébol,
que se divide en varios lazos y brazos (Fig. 3.2). El triplete del anticodón se
encuentra en una de las «hojas del trébol», mientras que la secuencia aceptora del
aminoácido, CCA, se encuentra en el «tallo». Las moléculas de ARNt se pliegan
sobre sí mismas dando lugar a una estructura terciaria en forma de L, como con-
secuencia de apareamientos de Watson y Crick entre bases y de otras interacciones
débiles. Aunque las estructuras de todos los ARNt son muy similares, presentan
diferencias estructurales sutiles que permiten que cada ARNt sea reconocido por
una aminoacil ARNt sintetasa específica que cataliza la unión de un determinado
aminoácido a su extremo 3´.
Procesamiento del ARNt

Los precursores del ARNt se modifican por corte, adición y modificación de
bases. Los ARNt proceden de precursores más largos por eliminación enzimática
de nucleótidos en los extremos 5´ y 3´. En algunos casos, los transcritos primarios
de ARNt tienen también intrones en la región del anticodón que deben ser elimi-
nados.
En primer lugar, el transcrito primario es recortado de forma inespecífica para
dar lugar a un precursor con extensiones en los extremos 3´ y 5´ relativamente cor-
tas. A continuación una endonucleasa llamada ribonucleasa P (ARNasa P), que es
una ribozima, elimina los nucleótidos extra del extremo 5´ mediante un corte endo-
nucleolítico y los del extremo 3´ son eliminados por una o más nucleasas entre las
que se encuentra una exonucleasa, llamada ARNasa D. Tras la eliminación de la
extensión 3´, se realiza la síntesis del extremo CCA, catalizada por la ARNt nucle-
otidil transferasa, que utiliza como sustratos ATP y CTP. Los intrones se eliminan
5’ 3’ A 3’ A 3’
C C
ARNasa D C C
ARNasa P ATP 5’ 5’ Brazo aceptor
CTP
Nucleotidil- Endonucleasa
transferasa Ligasa
Bucle del
ATG anticodón
Intrón tARN maduro
Transcrito primario
Figura 3.2. Estructura y procesamiento del ARNt.

por un sistema enzimático de dos componentes, uno es una endonucleasa que eli-
mina el intrón y el otro una ligasa, resella la cadena nucleotídica.
Los nucleótidos de los ARNt son los que se encuentran más modificados de
todos los ácidos nucleicos. En todos los ARNt se encuentran bases poco frecuentes
que se forman por modificación enzimática de los nucleótidos normales. La mayo-
ría de las modificaciones consisten en metilación, desaminación o reducción y se
llevan a cabo por enzimas que son específicas para un determinado sitio o para una
secuencia de nucleótidos, pero no para una determinada molécula de ARNt. Todas
las modificaciones se producen postranscripcionalmente y la mayor parte se com-
pletan antes de que los precursores sean procesados a ARNt maduros.
ARN ribosómico (ARNr)

La síntesis de proteínas tiene lugar en los ribosomas, que son complejos supra-
moleculares formados por proteínas y ARN.
Los ribosomas de procariotas, con un coeficiente de sedimentación de 70S,
están formados por dos subunidades de tamaño diferente (Fig. 3.3). La subunidad
mayor (50S), contiene una molécula de ARNr 5S, una de 23S y 34 proteínas. La
subunidad menor (30S), está formada por una molécula de ARNr de 16S y 21 pro-
teínas. Las proteínas se designan L1 a L34 las de la subunidad mayor y S1 a S21 las
de la subunidad menor.
Los ribosomas en eucariotas (80S) son mayores y más complejos que los de pro-
cariotas. También constan de dos subunidades cuyo tamaño varía según las espe-
cies, pero que por término medio tienen un coeficiente de sedimentación de 60S y
40S respectivamente. La subunidad pequeña tiene un ARNr 18S y la grande una
molécula de cada uno de los ARNr de 5S, 5,8S y 28S. En conjunto, los ribosomas
eucarióticos contienen más de 80 proteínas diferentes, con excepción de los de las
mitocondrias y los cloroplastos que son más sencillos. Tanto en procariotas como en
eucariotas las dos subunidades tienen forma irregular y se encajan de manera que
entre ellas queda una hendidura, a través de la cual pasa el ARNm a medida que el
ribosoma se desplaza a lo largo de dicho ARNm durante la traducción y de la que
emerge la cadena polipeptídica recién sintetizada.
Los ARNr constituyen el 80 % del ARN celular total y son metabólicamente
estables. Esta estabilidad, necesaria para el funcionamiento repetido del ribosoma,
se ve aumentada por su estrecha asociación con las proteínas ribosómicas.
Procesamiento del ARNr

El procesamiento del ARNr tiene lugar en el nucleolo e incluye rotura del pre-
cursor para obtener el tamaño funcional, emparejamiento interno de bases, modifi-
cación de determinados nucleótidos y asociación con proteínas ribosómicas para dar
una conformación terciaria estable.
Ribosoma procariótico Ribosoma eucariótico
70S 80S
50S
60S
ARNr 5S ARNr 5S
ARNr 23S ARNr 28S
34 proteínas ARNr 5,8S
49 proteínas
30S 40S
ARNr 16S ARNr 18S

21 proteínas 33 proteínas
Figura 3.3. Estructura de los ribosomas.
Tanto en bacterias como en eucariotas, los ARNr se forman a partir de precur-

sores más largos llamados ARNs prerribosómicos, que incluyen también secuencias
de entre una y cuatro moléculas de ARNt. En bacterias, los ARNr de 16S, 23S y 5S
surgen de un único precursor de 30S. Durante la síntesis del precursor se aparean
bases de regiones distantes de la molécula, de manera que los fragmentos de 16S,
23S y 5S del ARNr aparecen formando parte de grandes lazos. EL corte en regio-
nes de doble hebra del precursor por la ARNasa III, produce precursores más peque-
ños, cada uno de los cuales contiene una única molécula de ARNr de 16S y 23S y
es probable que ocurra igual con el ARNr 5S. Los precursores individuales son aún
demasiado grandes y deben experimentar un procesamiento posterior en ambos
extremos 5´ y 3´. Este procesamiento depende de proteínas ribosómicas concretas
que empiezan a ensamblarse en los ARNrs precursores mientras la transcipción
continúa aún realizándose.
En eucariotas, el producto inicial de la transcripción es un ARN prerribosómico
de 45S que contiene las secuencias de los ARNrs de 28S,18S y 5,8S. El ARNr 5S
de la mayoría de los eucariotas se forma como un transcrito separado. Al igual que

en el ARNm, la maduración de precursores de ARNr se lleva a cabo mediante gran-
des complejos multiméricos de ARN y proteínas. Para la maduración son impres-
cindibles al menos tres tipos de ARN en forma de complejos pequeños de ribonu-
cleoproteína nucleolar (snoRNP). Una serie de cortes enzimáticos libera los ARNr
18S, 28S y 5,8S, mientras que el ARNr 5S aparece de forma separada.
Transporte del ARN

En eucariotas, todos los ARNs sintetizados en el núcleo deben ser exportados al
citoplasma para que puedan intervenir en la síntesis de proteínas. El transporte tiene
lugar a través de los poros de la membrana nuclear y constituye otro de los niveles
de regulación de la expresión génica.
En el caso del ARNm, las moléculas maduras son probablemente reconocidas
por proteínas receptoras en el poro nuclear y transportadas activamente al citoplas-
ma. En el transporte participan proteínas que forman complejos con el ARNm
(RNPms) y que contienen una señal de exportación del núcleo que estimula su
transporte activo. Un complejo nuclear se asocia con el casquete 5´ de la molécula
de ARNm y conduce al ARNm al citoplasma. Mediante un mecanismo no bien
conocido, en el citoplasma las proteínas se separan del ARNm y son reemplazadas
por proteínas citosólicas. Las proteínas nucleares son transportadas de nuevo al
núcleo por un mecanismo análogo al de salida.
Otros ARNs, como ARNt y ARNr, que carecen del casquete 5´, deben asociar-
se también con proteínas y ser transportados al citoplasma como parte de estos
complejos. La señal de exportación se encuentra probablemente en estas proteínas
y se activa después de la unión con las moléculas de ARN, pero se desconoce hasta
el momento la naturaleza de estas señales.
Degradación del ARN

La degradación del ARNm es un punto importante de regulación de la expresión
génica. Los procesos de degradación aseguran que las moléculas de ARNm no se
acumulen en la célula y se produzca la síntesis de proteínas no necesarias. Las tasas
de degradación varían, así cuando el producto de un gen se necesita solo puntual-
mente, la vida media de su ARNm puede ser sólo de minutos o incluso segundos.
Los productos de genes que se necesitan de forma constante, tienen ARNms esta-
bles durante generaciones. En bacterias, la vida media de las moléculas de ARNm
es de 1-2 minutos, lo que les permite adaptarse rápidamente a los cambios ambien-
tales. La degradación del ARNm en bacterias se lleva a cabo en un primer paso por
endonucleasas que reconocen secuencias diana para el ataque endonucleolítico
como consecuencia del cual se liberan fragmentos que son degradados a continua-
ción hasta nucleótidos por acción de exonucleasas que generalmente actúan en
dirección 5´ A 3´. Dado que la traducción también se realiza en la dirección 5´ A 3´,

se asegura que el ARNm no se degradará antes de haber sido traducido. Entre las
enzimas que intervienen en el proceso de degradación del ARNm se encuentran la
ribonucleasa E, la polinucleótido fosforilasa (PNPasa) y una helicasa. La estabilidad
del ARNm en eucariotas está regulada por la presencia o ausencia de elementos
desestabilizantes, tales como la secuencia repetida AUUUA, que promueve la desa-
denilación y degradación consecutiva del ARNm.
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4
Mecanismo de la transcripción:
regulación de la iniciación
A. Santos
Introducción
La transcripción se define como el proceso de síntesis de ARN dirigido por una
molécula de ADN. En la inmensa mayoría de los seres vivos la información gené-
tica esta codificada en moléculas de ADN de doble cadena, siendo el proceso de
transcripción el primer paso en la lectura de dicha información, es decir, el primer
paso en la expresión génica. Es un proceso fuertemente regulado, particularmente a
nivel de la etapa de iniciación, constituyendo por tanto, un punto esencial de la
regulación de la expresión génica. La regulación de la expresión génica es la clave
de procesos como la diferenciación y el desarrollo. Los organismos multicelulares
complejos, entre los que se incluye el ser humano, están formados por miles de
millones de células que incluye muchos tipos celulares diferentes. Sin embargo
todas ellas, con la excepción de algunas células inmunitarias, poseen la misma
información genética. ¿Por qué células con la misma información genética tienen
morfologías tan diferentes y son capaces de desarrollar funciones tan diversas? La
respuesta es que leen partes diferentes de la información genética, siendo la trans-
cripción el primer paso en dicha lectura.
La transcripción es un proceso asimétrico, ya que en cada gen únicamente se
copia una de las dos cadenas de ADN, la denominada hebra codificadora. Lo llevan
a cabo los enzimas ARN polimerasas-ADN dependientes o simplemente ARN poli-
merasas. Se divide en tres etapas: iniciación, elongación y terminación. En la ini-
ciación se selecciona la secuencia de ADN donde se va a empezar la transcripción
y se sintetizan los primeros enlaces fosfodiéster entre nucleótidos, originándose
una pequeña cadena de ARN complementario de la cadena de ADN que le sirve de
molde o templete (hebra templete, sin sentido o hebra –) y que tiene la misma
secuencia de bases, pero en nucleótidos de ribosa, que la otra hebra (hebra codifi-
cadora, con sentido o hebra +). En este capítulo nos vamos a centrar en la iniciación
de la transcripción, y estudiaremos su regulación mediante ejemplos en organismos

procariotas y eucariotas que nos permitan comprender los aspectos más básicos de
este proceso.
ARN polimerasas
Son las enzimas (1,2) que catalizan la reacción de polimerización de ribonucleó-
tidos trifosfato utilizando como molde una molécula de ADN:
(ARN)n + NTP = (ARN)n+1 + PPi.
Requieren para llevar a cabo su función: un molde, una molécula de ADN de
doble cadena normalmente, ribonucleótidos 5’-trifosfato (ATP, GTP, CTP y UTP) y
Mg++. Siempre sintetizan el ARN en la dirección 5’-3’ y por tanto, leen la hebra
molde en la dirección 3’-5’. Seleccionan el nucleótido adecuado, de entre los cua-
tro posibles, por complementaridad de bases con el correspondiente nucleótido de
la molécula molde.
Procariotas
Como ejemplo utilizaremos la eubacteria Escherichia coli. Este microorganis-

mo tiene una única ARN polimerasa que interviene en la transcripción, además
tiene otras ARN polimerasas implicadas en otros procesos, como por ejemplo la
replicación. Dicha enzima está formado por cuatro cadenas polipeptídicas diferen-
tes, y que se denominan _, `, `’ y m, en una estequiometría de dos subunidades _
y una de cada una de las otras tres. El complejo 2_``’m se denomina holoenzima y
es competente para llevar a cabo correctamente y de forma eficiente todas las eta-
pas de la transcripción: iniciación, elongación y terminación. Tras la iniciación y
para poder abandonar el sitio de iniciación en la molécula de ADN, «promotor», el
holoenzima pierde su subunidad _, siendo la enzima 2_``’, enzima núcleo, la que
realmente lleva a cabo el trabajo de síntesis del ARN. La velocidad de síntesis de la
enzima núcleo es de aproximadamente 40 nucleótidos por segundo a 37° C. La fun-
ción de la subunidad m es permitir a la enzima encontrar el sitio en la molécula de
ADN donde ha de empezar la transcripción, tarea que es incapaz de conseguir la
enzima núcleo por sí sola. Las subunidades ` y `’ forman el centro activo de la enzi-
ma y _ es necesaria para ensamblar todo el complejo. La holoenzima tiene un tama-
ño de 465 kDa y un canal de 2,5 nm de anchura y 5,5 nm de longitud donde se aloja
una parte del ADN que se asocia con la enzima y donde reside el centro activo. La
enzima en realidad protege 75-80 pares de bases (pb) indicando que el ADN se
dobla al estar unido a la holoenzima ya que por su longitud, 16 nm, sólo podría pro-
teger 45-50 bp de ADN estirado. Inicialmente la enzima se une a la doble hebra de
ADN en conformación nativa formando un «complejo cerrado», posteriormente la
enzima separa ambas hebras del ADN en el punto de iniciación formando lo que se
MECANISMOS DE LA TRANSCRIPCIÓN: REGULACIÓN DE… 43
denomina un «complejo abierto», paso que es crítico para el inicio de la transcrip-

ción. La separación de las dos hebras de ADN para constituir la denominada bur-
buja de transcripción, se produce en el canal de la enzima que hemos descrito y se
pone de manifiesto por la acción de agentes químicos que son capaces de alterar las
bases del ADN, pero únicamente cuando ambas hebras están separadas. En función
del agente químico utilizado se estima que la región separada, burbuja de trans-
cripción, fluctúa entre 10 y 20 pb.
En los organismos procarióticos también se pueden encontrar formas de ARN
polimerasas más simples, formadas por una sola cadena polipeptídica, que son muy
eficientes pero muy limitadas en cuanto carecen de flexibilidad o posibilidades de
regulación y actúan sobre un número de promotores muy limitados. Tal es el caso
de las ARN polimerasas virales, algunas de las cuales son de gran utilidad en el
laboratorio.
Eucariotas
En las células animales hay 3 ARN polimerasas diferentes en el núcleo y una en

la mitocondria. La ARN polimerasa mitocondrial es una enzima simple de una sola
cadena polipeptídica y las nucleares son multiméricas. Las nucleares se denominan
ARN polimerasa I, que es la encargada de transcribir los genes que codifican para
el ARN ribosómico (ARNr) y se concentra por tanto en el nucleolo. La ARN poli-
merasa II, que transcribe la inmensa mayoría de los genes incluidos todos aquellos
que codifican una proteína y algunos que codifican para ARN de pequeño tamaño.
Finalmente la ARN polimerasa III, que transcribe el ARNr 5S, los ARN de transfe-
rencia y los restantes ARN de tamaño pequeño. A partir de este momento, siempre
que hablemos de transcripción en eucariotas nos referiremos a la transcripción rea-
lizada por la ARN polimerasa II.
La ARN polimerasa II esta formada por al menos 10 cadenas polipeptídicas
diferentes. Las dos cadenas polipeptídicas de mayor tamaño se denominan RPB1 y
RPB2 y tienen homología respectivamente con las subunidades `’ y ` de la enzima
procariota. La subunidad RPB1 se caracteriza por tener un dominio carboxilo ter-
minal (CTD) muy especial, que está formado por repeticiones del siguiente hepta-
péptido rico en el aminoácido serina: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. El número de
repeticiones es de 52 en los mamíferos y este CTD es esencial ya que células cuyo
gen rpb1 carece de este dominio no son viables. RPB3 tiene homología con la subu-
nidad _ de procariotas y RPB5, 6 y 8 son subunidades comunes a las tres polime-
rasas nucleares. A pesar de su mayor complejidad, la ARN polimerasa eucariótica
no es capaz de encontrar el promotor e iniciar la transcripción con una mínima
eficiencia, es decir, no es el equivalente a la holoenzima de los procariotas.
A pesar de las similitudes, las ARN polimerasas de eucariotas y procariotas son
diferentes, permitiendo que drogas que bloquean la función de la enzima procario-
ta no sean capaces de inhibir el enzima eucariota. Algunas de estas sustancias se uti-
lizan consecuentemente como antibióticos para combatir ciertas infecciones.
Ejemplo de ello son las rifamicinas naturales y sus derivados sintéticos las rifampi-
cinas.
Iniciación: Promotores
Una vez formado el complejo abierto, se produce la formación de los primeros
enlaces fosfodiéster, siendo seleccionados los nucleótidos que participan en función
de su complementaridad con las bases de la hebra templete. Los enlaces fosfodiés-
ter se forma por un ataque nucleofílico del OH 3’ del nucleótido anterior al fosfato
_ del siguiente nucleótido 5’-trifosfato. Una vez que se ha sintetizado un fragmen-
to de ARN de aproximadamente 17 nucleótidos en procariotas y de 30-40 nucleóti-
dos en los eucariotas termina la iniciación y comienza la elongación que lleva implí-
cita algunos cambios en la enzima. Estos cambios como hemos comentado
consisten en la pérdida de la Subunidad m en los procariotas y cambios más com-
plejos en los eucariotas. El ARN sintetizado permanece unido a la ARN polimera-
sa y al ADN, formando una hélice ARN-ADN de aproximadamente 7 pb con la
hebra molde.
Promotor
Procariotas
El promotor es aquella región o secuencia del ADN en la que se asienta la ARN

polimerasa y se inicia la transcripción. En la eubacteria E. coli, el promotor es una
región pequeña del ADN, de aproximadamente 45 nucleótidos. Dado que el geno-
ma de E. coli contiene aproximadamente 2.000 promotores, esto supone que el
ADN que hace de promotor es únicamente un 0,02 % del ADN del cromosoma de
esta bacteria. Esta pequeña fracción del ADN es la que la ARN polimerasa debe
encontrar con eficacia y precisión rastreando todo el genoma de la bacteria. En el
caso de las células eucariotas la tarea de encontrar el promotor es mucho más
compleja. La estructura del promotor (nos referimos siempre a la secuencia de la
hebra codificadora) reconocido por la holoenzima que porta la subunidad m70
estándar es la siguiente: La posición correspondiente al nucleótido +1 es siempre
una purina (A o G) y por tanto será una A o una G el primer nucleótido en el ARN.
Entre los 45 nucleótidos del promotor hay dos secuencias cortas conservadas, que
contienen los nucleótidos con los que contacta la ARN polimerasa y son necesarios
por tanto para que esta enzima reconozca dicho punto como el sitio donde ha de
iniciarse la transcripción. Son la caja Pribnow y la secuencia -35. La caja Pribnow
está en la posición -10 (recordemos que la numeración es negativa en la dirección
5’ y positiva en la dirección 3’ a partir del primer nucleótido transcrito) y es una
secuencia muy rica en pares de bases A/T. La secuencia consenso en la posición
-35 es TTGACAT (Fig. 4.1).
PROMOTOR PROCARIOTA (E. Coli m70)
–35 –10 +1
TTGACAT 17±1 TATAAT 5/8 CA/GT

Conservación (%) 84 82 79 64 53 45 41 79 95 44 59 51 96 55 51/42 48
Secuencia –35 Caja Pribnow
PROMOTOR EUCARIOTA (RNA polimerasa II)
CTF
Sp1
–200 CBF… –40 –25 +1 +40
…
ccatt gggcgg TATAAAA Pyr2 CA Pyr5
82 97 93 85 63 83 58 Conservación (%)
ESTIMULADOR Caja TATA Inr
PROMOTOR PROXIMAL PROMOTOR NÚCLEO

Figura 4.1. Esquema de la región promotora en organismos eucariotas y procariotas.
Un promotor determinado es tanto más eficiente cuanto más se ajusta a esta

secuencia consenso, sería lo que denominamos un promotor fuerte y puede iniciar
la transcripción con una frecuencia de una vez cada 1-2 segundos. Por el contrario
los promotores débiles, presentan numerosas variaciones con respecto a la secuen-
cia consenso e inician la transcripción con una frecuencia tan baja como una vez
cada 10 minutos (recordemos que el ciclo vital de E. coli es de 20 minutos). De esta
forma tan sencilla se logra que unos genes, de los que se requiere mayor concen-
tración de proteína, se expresen más que otros de los que se requiere menor con-
centración de proteína.
Eucariotas
El concepto de promotor en los eucariotas es más complejo (Fig. 4.1), y sus ele-
mentos están peor definidos (3). Nosotros consideraremos las siguientes partes:
1. El promotor núcleo que incluye el sitio de iniciación de la transcripción y la
región del ADN donde se une la ARN polimerasa. Comprende una región que va de
aproximadamente de la posición -40 a +40, que es aproximadamente la región del
ADN protegida por la unión de la polimerasa.
2. Región proximal hasta -200 aproximadamente.
3. Estimuladores o potenciadores (enhancers) (4).
Además de estos elementos hay regiones silenciadoras (silencers) (5) que blo-
quean la transcripción y elementos frontera o aislantes (boundary) (6) que básica-
mente delimitan la región del ADN sobre el que pueden actuar los demás elemen-
tos ennumerados. Estos elementos están peor definidos y el número de ejemplos de
los mismos es muy limitado por lo que no hablaremos de ellos.
1. El promotor núcleo es el elemento mínimo para que se pueda iniciar la trans-

cripción con precisión in vitro. La ARN polimerasa eucariota a diferencia de la pro-
cariota no es capaz de iniciar la transcripción ella sola y requiere la participación de
otras proteínas que en su conjunto reciben el nombre de factores generales de la
transcripción ya que son necesarios para la iniciación en la inmensa mayoría de los
genes. Con el concurso de estos factores, la ARN polimerasa ya es capaz de iniciar
con precisión y eficiencia in vitro. En el caso de la ARN polimerasa II, elementos
característicos de este promotor núcleo son: la caja TATA que está en posición -25;
el elemento de reconocimiento del factor general de transcripción TFII-B (BRE); el
iniciador (Inr) que es una secuencia rica en pirimidinas; y el elemento 3’ del pro-
motor o DPE (Downstream Promoter Element). En combinaciones apropiadas
dichos elementos dirigen la transcripción, aunque sólo pueden dar cuenta de un
nivel mínimo in vivo, requiriéndose por lo menos el promotor proximal para obser-
varse actividad promotora. Muchos autores consideran que en eucariotas lo que
debiéramos denominar promotor sería la suma del promotor núcleo y el promotor
proximal.
El promotor mejor conocido es aquel que posee una caja TATA o caja Goldberg-
Hogness e iniciador y es el que vamos a utilizar como modelo de iniciación en euca-
riotas (7,8) (Fig. 4.2). La secuencia consenso de la caja TATA es 5’-TATAAA-3’ y se
sitúa a 25-30 nucleótidos del sitio de iniciación (Fig. 4.1). El primer paso de la ini-
ciación sería el reconocimiento de esta secuencia por el factor de transcripción
general de la ARN polimerasa II, el TFII-D (Fig. 4.2). Este factor es un multímero
formado por la proteína TBP (TATA Binding Protein) y las proteínas TAFs (TBP
TFII-D
Complejo de
TFII-B
TATA TFII-A PREINICIACIÓN
Inr
F
D B
A ARN pol II
TATA CTD
Inr
ARN pol II
E H
B II D B F II
D
A A
TATA Elongación TATA
Inr P Inr
P CTD
P
TD
P ARN 30-50
C
P
P nucleótidos
D B F II
TF II E
A E H TF II H
TATA
P Inr
P
P
TD
P
C
P
P
Complejo de
INICIACIÓN
Figura 4.2. Mecanismo de acción de los factores generales en el inicio de la transcripción.

Associated Factors). La TBP reconoce la secuencia de la caja TATA y se une a ella

orquestando todo el proceso de iniciación. Al complejo caja TATA-TFII-D se unen
consecutivamente los factores TFII-A y TFII-B formando el complejo de preini-
ciación. TFII-A estabiliza la unión de TFII-D al ADN y es necesario particularmente
in vivo donde hay numerosos elementos que se opondrían a la unión de TFII-D a
TATA. El factor TFII-B también estabiliza este complejo de preiniciación, pero
sobre todo sirve de puente para unir la ARN polimerasa a dicho complejo. A conti-
nuación, se une la ARN polimerasa que lleva asociado el factor TFII-F, que actúa de
puente entre la polimerasa y los factores TFIID y TFIIB unidos a la caja TATA. El
factor TFII-F es un dímero formado por las cadenas polipeptídica RAP30 y RAP74
(RNA polymerase Associated Protein) que son capaces de asociarse a la ARN poli-
merasa y a los factores TFII-D y TFII-B, labor realizada fundamentalmente por
RAP30. RAP74 induce un cambio conformacional que favorece los contactos entre
la RNA polimerasa y el ADN. Finalmente se unen TFII-E y TFII-H completándose
la formación del complejo de iniciación. TFII-H es un complejo multimérico que
tiene actividad helicasa y quinasa. Específicamente fosforila, en el complejo de ini-
ciación, el dominio CTD de la subunidad mayor de la ARN polimerasa, paso que es
imprescindible para que la enzima una vez iniciada la transcripción pueda abando-
nar el promotor y elongar. Este factor, junto con los otros unidos a la polimerasa, se
separa de la misma una vez sintetizados los primeros 30-50 nucleótidos de ARN.
Una vez terminada la iniciación la ARN polimerasa se libera del complejo de
preiniciación (Fig. 4.2) y es capaz de llevar a cabo la elongación. El complejo
de preiniciación podría quedar unido al ADN y reiniciar la transcripción.
2. La información presente en el promotor núcleo, a diferencia de lo que ocu-
rre in vitro, es muy poco eficaz para iniciar la transcripción in vivo. Ello se debe a
que in vivo el ADN está asociado a las histonas, formando la cromatina, y el com-
plejo de iniciación tiene que competir con ellas para unirse al ADN. En consecuen-
cia, para que la iniciación sea eficaz se necesita el concurso de al menos la región
promotora proximal. Esta secuencia de ADN tiene sitios de unión para otras pro-
teínas que se denominan factores de transcripción específicos o simplemente facto-
res de transcripción y son capaces de unirse a secuencias específicas del ADN y
regular el inicio de la transcripción. Estos factores de transcripción tienen un domi-
nio de unión al ADN, del que existen diversos tipos, y uno o varios dominios de
transactivación, que son básicamente dominios que les permiten a estas proteínas
interaccionar con otras y estimular el inicio de la transcripción. También pueden
reprimir la transcripción en cuyo caso, se denominan represores.
3. Los estimuladores, son elementos originalmente definidos en el estudio del
promotor del virus SV40. Son secuencias del ADN capaces de aumentar la trans-
cripción, cuando se unen a un promotor núcleo, de forma independiente de su orien-
tación, es decir, las podemos unir 5’-3’ o 3’-5’ con respecto al sitio de iniciación, y
de su distancia, pudiéndose poner en situación 5’ o 3’ con respecto al sitio de ini-
ciación. Son secuencias de 50 pb a 1.5 kbp que frecuentemente aparecen diseñados
como para llevar a cabo una función específica, como por ejemplo, activar un gen
en un determinado tipo celular o en un momento determinado del desarrollo. La
expresión de un gen puede estar regulada por muchos estimuladores diferentes.

Estos elementos, al igual que lo indicado para el promotor proximal, contienen
secuencias o sitios de unión de factores de transcripción, a veces los mismos que se
unen al promotor proximal, que influyen en la iniciación de la transcripción. Se si-
túan a una distancia y orientación muy variable con respecto al sitio de iniciación,
pero siempre distal con respecto al promotor núcleo por lo que frecuentemente se
les llama elementos distales. Como ejemplo tenemos: un estimulador, importante
para el gen de la cadena del receptor de células T, se sitúa a 69kb en la dirección 5’
del sitio de iniciación y en contraste el estimulador núcleo de locus de ratón de la
inmunoglobulina H se localiza en el segundo intrón. Lo más usual sin embargo, es
que estos elementos se sitúen en dirección 5’ a pocas kb de distancia del sitio de ini-
ciación. Debemos recordar, que los elementos frontera impiden que el rango de
acción de los estimuladores, algunos de los cuales son enormemente potentes, se
extiendan más alla de los límites deseados.
Regulación de la iniciación
En este apartado introduciremos algunos de los conceptos básicos de la regula-
ción de la iniciación de la transcripción en procariotas y eucariotas (9,10) a través
de algunos ejemplos bien caracterizados.
Procariotas: Factores m. Operón lactosa

Dada la relativa simplicidad de la ARN polimerasa procariota y la función tan
claramente definida de su subunidad sigma, es obvio que una forma muy sencilla de
regulación sería el disponer en el genoma de varios genes que codifiquen subuni-
dades sigma capaces de unirse a promotores diferentes. De esta forma, se pueden
poner en marcha diversos programas genéticos en función de las necesidades de la
célula, ya que las distintas subunidades sigma dirigirían la polimerasa núcleo a
diferentes grupos de genes. Esto es lo que ocurre en E. coli, su genoma codifica ade-
más de m70 las subunidades m32 y m54, que son la subunidad de choque térmico y
de deficiencia en nitrógeno respectivamente. En condiciones normales el contenido
de estas proteínas es muy bajo y no son capaces de competir con m70 por la unión
a la enzima núcleo por lo que los genes que están bajo su control no se transcriben.
Sin embargo, en caso de un aumento de temperatura o falta de las fuentes usuales
de nitrógeno respectivamente la expresión de estos genes se induce y como conse-
cuencia de ello, la expresión de otra serie de genes que le permitirán a la bacteria
combatir eficazmente estas situaciones. El promotor de m32 es muy diferente del de
m70, particularmente en lo que se refiere a la secuencia de la caja Pribnow. La
secuencia -10 para m32 es CCCATNT (N es cualquiera de los cuatro nucleótidos del
ADN) en claro contraste con la caja Pribnow de m70: TATAAT.
El Operón lactosa esta formado por tres genes estructurales que se transcriben
juntos a partir de un único promotor y que codifican para tres proteínas que le per-
miten a la bacteria utilizar el disacárido lactosa como fuente de carbono. También

forma parte de él el gen que codifica para el represor lac, proteína fundamental en
la regulación de este operón. El represor lac es una proteína de 37kDa de tamaño
que forma un tetrámero y es capaz de unirse a secuencias específicas de ADN. En
el promotor de los genes estructurales hay una secuencia de 28pb a la que se une el
represor lac y que se denomina operador, y que está situada entre -5 y +25. La unión
del represor lac impide que la ARN polimerasa pueda iniciar la transcripción. Es
necesario quitar esta proteína del operador para que los genes estructurales puedan
transcribirse, y esto es lo que ocurre cuando hay lactosa en el medio de cultivo, ya
que el represor lac se une a un derivado de la lactosa y pierde su afinidad por el
ADN. Esto es un paso necesario para que se puedan transcribir los genes estructu-
rales, pero no es muy eficiente, ya que el promotor de los genes estructurales se
aleja del consenso y es poco activo. El aumento en la expresión de estos genes
estructurales sólo por la presencia de lactosa no es por tanto muy grande. Sin embar-
go, cuando la presencia de lactosa se combina con una disminución o ausencia de
glucosa en el medio, se produce un importante aumento de la expresión de los
genes estructurales. Ello se debe a que también interviene la proteína CAP
(Catabolite gene Activator Protein), que se une al ADN en una secuencia muy cer-
cana al promotor de los genes estructurales, situada entre -71 y -53, e induce la
transcripción. El funcionamiento de la proteína CAP depende de la eliminación del
represor lac unido al operón y de la presencia del nucleótido cíclico adenosina 5’,3’
monofosfato cíclico, AMPc. En presencia de concentraciones de glucosa adecuadas,
los niveles de AMPc son bajos en la célula, insuficientes para formar complejos
CAP-AMPc y en consecuencia CAP no se une al ADN y por tanto no tienen ningún
efecto sobre la transcripción. Cuando disminuye la glucosa sube la concentración de
AMPc que se une a CAP y el complejo AMPc-CAP se une a su sitio de unión del
ADN y favorece de forma muy eficiente la iniciación de la transcripción por el
holoenzima de la ARN polimerasa estándar. Con este modelo tan sencillo definimos
una parte de los elementos que intervienen en la regulación de la transcripción y que
tienen sus elementos paralelos en situaciones mucho más complejas como es la
regulación de la transcripción en eucariotas. Hay, por tanto, señales que son secuen-
cias específicas en el ADN (frecuentemente denominados elementos cis), y tene-
mos, aparte de la maquinaria basal de la transcripción, otras proteínas que recono-
cen estas señales y regulan el inicio de la transcripción (elementos trans). De esta
forma, es perfectamente posible que dos células con la misma información genéti-
ca hagan cosas diferentes en función de la dotación de proteínas lectoras de estas
señales. Tal es el caso de células E. coli cultivadas en medios de diferente compo-
sición, en nuestro caso uno con glucosa y otro sin glucosa y con lactosa.
Eucariotas: Regulación de la expresión génica por hormonas tiroideas

La situación es mucho más compleja en los eucariotas y particularmente en los
organismos pluricelulares complejos como es el caso del ser humano. Este apartado
lo limitaremos a describir el mecanismo de acción de la hormona tiroidea, que den-
tro de las limitaciones que ello supone nos permitirá familiarizarnos con algunos
conceptos muy importantes como es el papel de la cromatina en la regulación de la
expresión génica. El receptor de hormona tiroidea (3,5,3’-triiodotironina, T3) es un
factor de transcripción dependiente de ligando y que está codificado por dos genes
en los vertebrados diploides: NR1A1 y NR1A2 según la nomenclatura de la «super-
familia de receptores nucleares» (11) a la que pertenecen estos dos genes o genes _
(T3R_) y ` (T3R`) como nomenclatura más familiar y más frecuentemente en la
literatura científica. En el genoma humano T3R_ y T3R` están situados respectiva-
mente en el cromosoma 17 y 3. A partir del gen T3R_ se originan al menos dos pro-
teínas diferentes por corte y empalme alternativo que son la isoforma T3R_ 1 y
T3R_ 2, que se diferencian en el extremo carboxilo terminal (C-t). Como conse-
cuencia de la sustitución de los 40 aminoácidos C-t, T3R_ 2 ha perdido su capaci-
dad de unir T3 y por tanto no actúa como un receptor de dicha hormona y su función
es desconocida. Del gen T3R` se originan dos proteínas a partir de dos promotores
diferentes T3R` 1 y T3R` 2, que se diferencian en la región amino terminal y unen
T3 actuando ambas como receptores. T3R` 2 se expresa de forma abundante sólo en
la hipófisis y las restantes isoformas se expresan de forma ubiquista. Todas estas
proteínas tienen un dominio central que es el de unión al ADN (DBD, DNA Binding
Domain), que es prácticamente igual para todas ellas y que se corresponde con el
dominio mejor conservado en la superfamilia de los receptores nucleares. Un domi-
nio amino terminal en el que T3R` 1 difiere de T3R` 2 y ambas isoformas de las
isoformas _, no estando conservada esta región en la superfamilia. Finalmente está
la región o dominio carboxilo terminal que es el más grande y complejo, en el se
incluyen entre otros el dominio de unión a la hormona (LBD, Ligand Binding
Domain) que se distribuye a lo largo de la mayor parte de esta región y que está rela-
tivamente conservado en la superfamilia, el dominio de dimerización y el dominio
más importante de transactivación denominado AF2. A la superfamilia de los recep-
tores nucleares también pertenecen los receptores de hormonas esteroideas, ácido
retinoico, vitamina D3, el protooncogen v-erbA del virus de la eritroblastosis aviar
(que es una forma mutada del receptor T3R_ 1 de pollo) y otras proteínas con o sin
ligando conocido. Los miembros de la superfamilia sin ligando conocido frecuente-
mente se denominan «receptores huérfanos» (12), que es una denominación confusa
ya que implicaría que han de tener un ligando y ser receptores. Sin embargo, muchas
de ellas son factores de transcripción normales, pertenecientes a esta superfamilia
por homología de secuencia, y que no actúan como receptores. Los receptores de T3
se encuentran en el núcleo, muchos de ellos unidos a las secuencias de ADN que
reconocen y que se denominan TREs o T3REs (Thyroid receptors Responsive
Elements) ya que no requieren de la hormona para ello. Los TREs están formados
por repeticiones de la secuencia hexamérica 5’-AGGTCA-3’, siendo la forma más
frecuentemente encontrada en los genes regulados por hormona tiroidea aquel que
está formado por dos secuencias de este tipo separadas por cuatro nucleótidos (DR4,
Direct Repeat 4). Se unen al ADN en forma de un heterodímero con otro factor de
transcripción de la misma superfamilia, el RXR, que es un receptor de retinoides,
aunque también es capaz de unirse al ADN como homodímero o monómero, no
estando clara la importancia funcional de estos dos últimos. En ausencia de T3 el

T3R unido al ADN está en una conformación que le permite unirse a una serie de
proteínas denominadas correpresores (13), que son capaces de unirse a otras proteínas
para formar un complejo cuya función va a ser compactar la cromatina en el área
donde están concentrados y hacerla más inaccesible a la maquinaria basal de la
transcripción, complejo represor (Fig. 4.3). Tras la unión de T3, la conformación del
receptor cambia de forma que se expone el dominio de transactivación AF2, que se
corresponden con los últimos aminoácidos de la proteína y que forman parte de una
hélice _ y se esconde el dominio de unión a los correpresores. Como consecuencia
de ello, el receptor pierde su capacidad de unión a los correpresores y se une a otras
proteínas que se denominan coactivadores (14), que a su vez interaccionan con otras
proteínas formando un complejo, complejo activador, que es capaz de modificar la
cromatina originando una forma de la misma más abierta y accesible a la maquina-
ria basal de la transcripción (Fig. 4.3). Finalmente el receptor unido al ADN y al
ligando es también capaz de unirse a otros grandes complejos multiméricos de unas
16 cadenas polipeptídicas y que reciben nombres como TRAP (Thyroid hormone
receptor Associated Proteins), DRIP (vitamine D Receptor Interacting Proteins), o
ARC (Activator-Recruited Cofactor) cuya composición y actividad está peor carac-
terizada, pero parece que actuaría básicamente como moléculas puentes entre T3R
y la maquinaria basal de la transcripción, ya que interaccionan con el complejo de
preiniciación, facilitando el acceso de la ARN polimerasa II al promotor núcleo. En
resumen, el mecanismo de acción del receptor de hormona tiroidea se ajustaría a un
modelo de dos pasos propuestos por Roeder et al. (15) en el que tras la unión de la hor-
mona al receptor, éste se disociaría del complejo represor y se asociaría con un
complejo activador a través de proteínas coactivadoras o con los complejos puente.
En la (Fig. 4.3) hemos esquematizado este modelo y debemos añadir que la acción
de los dos tipos de complejos, el que denominamos activador y los complejos puen-
te (TRAP/DRIP/) podrían actuar de una forma secuencial, combinatoria, o paralela.
Una idea importante, es que el receptor sin ligando no es una proteína inactiva, como
ocurre con muchos receptores de hormonas esteroideas, sino que tienen una activi-
dad represora y tras la unión de la hormona cambia hacia una actividad fundamen-
talmente activadora de la transcripción.
En la formación del complejo represor juegan un papel destacado los correpre-
sores, de los que se conocen y han clonado varios, entre ellos N-CoR (Nuclear
Receptor Corepressor) y SMRT (Silencing Mediator of Retinoic acid and Thyroid
hormone receptors). Estas dos proteínas son proteínas grandes y modulares, es
decir, que poseen diversos dominios. La actividad de estos dominios es la de recono-
cer otras proteínas y unirse a ellas. Tienen dos dominios carboxi-terminal que reco-
nocen a los receptores nucleares y al menos dos dominios amino-terminal que se
denominan dominios de represión y que les permiten reclutar otras proteínas como
Sin 3, histonas deacetilasas y otras ensamblando finalmente un complejo represor.
Los dominios de interacción con los receptores nucleares reconocen en el T3R la
región Visagra (hinge o dominio D) que está expuesta cuando el receptor no está
unido a la hormona. El nombre de dominio Visagra es debido a que inicialmente
52
Figura 4.3.
Complejo Acetilación CROMATINA
activador histonas ABIERTA
HD
RXR TR
TRANSCRIPCIÓN
Complejo Desacetilación CROMATINA Complejo
represor histonas COMPACTA represor
TRE TATA
HD HD
RXR TR
TRANSCRIPCIÓN
TRAP/
TRE TATA Complejo DRIP/ TRANSCRIPCIÓN
T3 activador ARC
HAT RXR TR B F
D
A
TRE TATA
II
BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA MEDICINA
Esquema del mecanismo de regulación de la transcripción por hormona tiroidea.

esta región del T3R era simplemente una región flexible que unía los dominios de
unión al ADN y de unión al Ligando.
El número de coactivadores conocidos y clonados es mayor y entre ellos están:
SRC-1/NcoA-1 (Steroid Receptor Coactivator-1/Nuclear receptor Coactivator-1),
TFI-2/GRIP-1/NcoA2 (Transcriptional Intermediary Factor-2/Glucocorticoid
Receptor Interactin Protein-1/Nuclear receptor Coactivator-2) y pCIP/ACTR/-
AIB1(p300/CBP co-Intergator-Protein/Activator of the Thyroid and Retinoic acid
receptors/Amplified in Breast Cancer). Son también proteínas modulares, que reco-
nocen el dominio de transactivación AF-2 en el complejo T3-T3R a través de unas
secuencias cortas situadas en la región central de dichas proteínas y que se deno-
minan cajas NR y cuya secuencia es Leu-XX-Leu-Leu (X es cualquiera de los 20
aminoácidos). A su vez poseen otros dominios denominados de activación que reco-
nocen proteínas como la CBP y p300 que además de poseer actividad acetilasa de
histona (HAT) tienen dominios de unión a otras proteínas como p/CAF (p300/CBP
Associated Factor) que también poseen HAT y son capaces de interaccionar con la
maquinaria basal de la transcripción.
Finalmente la complejidad y el número tan grande de cadenas polipeptídica que
participan en la regulación de la iniciación de la transcripción en los eucariortas, y
que a primera vista podría antojársenos excesiva, constituye probablemente la
manera de lograr que la transcripción funcione en estos organismos con la flexibi-
lidad, gradación y capacidad de integración necesarias para lograr el grado de ajus-
te entre sus células en organismos multicelulares complejos.
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5
Síntesis de proteínas:
Traducción y transporte
E. Álvarez García
Introducción
Las proteínas son los productos finales de la mayoría de las rutas de transmisión
de la información genética. Las células las sintetizan en función de los requeri-
mientos fisiológicos y posteriormente se transportan al lugar donde van a desem-
peñar su función.
La síntesis de proteínas es el mecanismo biosintético más complejo. En este pro-
ceso la información codificada en un ARN mensajero (ARNm) se traduce median-
te la maquinaria de síntesis de proteínas de las células que incluye los ribosomas
—complejos de ARN y proteínas—, las enzimas necesarias para activar los amino-
ácidos precursores uniéndolos a los ARN de transferencia (ARNt) y factores pro-
teicos específicos que participan en las distintas fases de este proceso: inicio, elon-
gación y terminación.
Esta ruta biosintética es muy importante para las células, en ella se consume hasta
el 90 % de la energía química utilizada en procesos biosintéticos. A pesar de su com-
plejidad las proteínas se sintetizan a gran velocidad. Una célula de E. coli a 37° C
puede sintetizar una cadena polipeptídica completa de 100 residuos en cinco segundos.
El código genético
Durante el proceso de síntesis de proteínas, la maquinaria que lleva a cabo la tra-
ducción se desplaza a lo largo de una molécula de ARNm en dirección 5’ A 3’ y
lee la secuencia de nucleótidos de tres en tres. Cada triplete de nucleótidos (codón)
en la molécula de ARNm específica para un aminoácido y durante la síntesis de pro-
teínas un codón se aparea con la secuencia del extremo anticodón de una molécula
de ARNt unida covalentemente a un aminoácido, de esta forma el codón determina
qué aminoácido será añadido a la cadena polipeptídica en crecimiento.
El ARN contiene cuatro nucleótidos diferentes que permiten 4 × 4 × 4 = 64 posi-

bles tripletes del ARNm para codificar los 20 aminoácidos. Tres de estos 64 triple-
tes (UAA, UAG y UGA) no codifican ningún aminoácido sino que se utilizan como
señales que especifican la terminación de la síntesis proteica y se denominan como
señales de terminación. Los 61 codones restantes especifican para los 20 aminoáci-
dos que forman parte de las cadenas polipeptídicas. La mayoría de los aminoácidos
están determinados por más de un codón, por esta razón se dice que el código gené-
tico está degenerado.
La degeneración del código genético indica que tiene que existir mas de un
ARNt para transportar cada aminoácido o que la secuencia del anticodón de una
molécula de ARNt puede reconocer más de un codón del ARNm. Ambas opciones
son ciertas, algunos aminoácidos pueden ser transportados por diferentes molécu-
las de ARNt y los anticodones de muchas moléculas de ARNt pueden reconocer
más de un codón. El apareamiento descrito por Watson y Crick tiene lugar sólo en
las dos primeras posiciones de un codón y existe una mayor libertad de aparea-
miento en la tercera posición, esta libertad en el emparejamiento de la 3.a base del
codón se conoce como «balanceo». Algunas bases del anticodón están modificadas.
La presencia del nucleótido inosina (I), cuya base hipoxantina procede de la desa-
minación de adenina, permite también apareamientos alternativos en la tercera posi-
ción de un codón. Por ello, los apareamientos posibles entre la primera base del
anticodón y la 3.a del codón son los siguientes:
primera base del tercera base del
anticodón codón
C G
A U
U AoG
G UoC
I U, C, o A
Así, el anticodón del ARNt para la alanina cuya secuencia es 5’-IGC-3’ recono-
ce tres codones GCU, GCC y GCA.
anticodón 3’—CGI—5’ anticodón 3’—CGI—5’ anticodón 3’—CGI—5’
ARNm 5’—GCU—3’ ARNm 5’—GCC—3’ ARNm 5’—GCA—3’
Sin embargo, los codones UUA y CUA que codifican leucina son leídos por
diferentes ARNts.
De este modo, en general, los codones alternativos para un mismo aminoácido
difieren sólo en la tercera base (GCA, GCC, GCG y GCU especifican alanina,
GGA, GGC, GGG y GGU especifican glicina).
Sólo dos aminoácidos están determinados por un solo codón: metionina (AUG)
y triptófano (UGG). El codón AUG funciona también como señal de iniciación
para la síntesis proteica además de codificar metionina en posiciones internas de la
cadena polipeptídica.
SÍNTESIS DE PROTEÍNAS: TRADUCCIÓN Y TRANSPORTE 57
Activación de los aminoácidos

Uno de los requisitos previos a la incorporación de un aminoácido a una cade-
na polipeptídica es su activación. Este proceso tiene lugar tras la unión de cada
uno de los 20 aminoácidos a su ARNt específico para formar el aminoacil-ARNt
(aa-ARNt). Las moléculas de ARNt cuya estructura tridimensional tiene forma de
L, unen por uno de sus extremos el aminoácido específico y en el otro extremo, que
contiene los tres nucleótidos del anticodón, reconoce y se aparea con un codón de
la molécula de ARNm. La formación de estos complejos tiene dos funciones. Una
de ellas es unir el aminoácido con el ARNt que posee el anticodón complementario
al codón del ARNm que especifica para este aminoácido y que permite que duran-
te la síntesis de proteínas, las secuencias de nucleótidos se conviertan en la secuen-
cia de aminoácidos de una proteína. Otra de las funciones de estos complejos es la
activación del extremo carboxílico del aminoácido, es decir, la formación de un
enlace rico en energía que permita la formación de un enlace peptídico al reaccio-
nar con el grupo amino del aminoácido situado a continuación en la cadena que se
está sintetizando.
El acoplamiento entre los aminoácidos y ARNts está catalizado por enzimas
específicas denominadas aminoacil-ARNt sintetasas, cada una de las cuales reco-
noce un aminoácido concreto y su ARNt adecuado. Esta reacción tiene lugar en dos
etapas y la energía para la activación proviene de la hidrólisis de ATP. En la prime-
ra etapa se forma un aminoacil-adenilato, que en el ejemplo elegido sería la activa-
ción de glicina:
+
H3N–CH2–COO– + ATP A +H3N–CH2–CO–AMP + PPi
En la segunda etapa el aminoácido se transfiere al extremo 3’ de una molécula

de tARN.
+
H3N–CH2–CO–AMP + ARNt A +H3N–CH2–CO–ARNt + AMP
Las aminoacil-ARNt sintetasas, altamente específicas, son capaces de discrimi-

nar entre las distintas cadenas laterales de los aminoácidos y entre varias moléculas
de ARNt.
Etapas de la síntesis de proteínas
Todos los demás acontecimientos de la síntesis de proteínas están catalizados

en los ribosomas y se pueden diferenciar tres etapas: iniciación, elongación y ter-
minación de la cadena, de acuerdo con lo representado esquemáticamente en la
Figura 5.1. El proceso de traducción es muy parecido en células eucariotas y pro-
cariotas. Por ello aquí lo describiremos a continuación en células procariotas des-
tacando al final de cada una de las etapas las diferencias con células eucariotas.
A) Iniciación sitio P
sitioA
sitio E
fMet-tARNi Ribosoma
fMet
5’ AUG GAU ACU CCA GGA GAG GUA CUA GCA UGA 3’ ARNm
B) Elongación
fMet Asp
5’ AUG GAU ACU CCA GGA GAG GUA CUA GCA UGA 3’
Thr
fMet Asp
C) Terminación
Factordeterminación
Cadena polipeptídica
fMet Asp Thr Pro Gly Glu Val Leu Ala
Figura 5.1. Representación esquemática de las etapas de la síntesis de proteínas:

(A) Iniciación, (B) Elongación y (C) Terminación.
Iniciación de la biosíntesis de proteínas
En esta etapa se forma un complejo de iniciación formado por un ribosoma

unido al ARNm y al ARNt iniciador cargado (fMet-ARNti). La etapa de iniciación
requiere además la presencia de tres factores de iniciación (IF1, IF2 e IF3). Los fac-
tores IF1 e IF3 facilitan la disociación del ribosoma 70S. El ARNm se une a la sub-
unidad ribosómica pequeña 30S.
Ribosoma 70S + IF1 + IF3 A Subunidad 30S-IF1-IF3 + Subunidad 50S

Subunidad 30S-IF1-IF3 + ARNm + GTP-IF2-fMet-ARNti A Complejo
de iniciación 30S + IF3
El factor de iniciación IF2 tiene un sitio de unión para GTP y es capaz de reco-
nocer el ARNt iniciador; este metionil-tARN es un sustrato de una transformilasa.
De este modo, todas las proteínas procariotas empiezan con N-formilmetionina y
también las sintetizadas en las mitocondrias de células eucariotas.
El aminoacil-ARNt iniciador se aparea con el codón de iniciación frecuente-
mente AUG o en algunos casos GUG que señala el principio de la cadena polipep-
tídica. La posición correcta para comenzar la lectura depende también de una
secuencia situada en el extremo 5’ del ARNm, secuencia de Shine-Dalgarno, que es
complementaria a un fragmento del ARNr 16S que forma parte de la subunidad
pequeña 30S.
Una vez formado el complejo de iniciación 30S, se libera el factor IF3 y se une
la subunidad 50S. Esta subunidad tiene tres lugares para la unión del ARNt denomi-
nados: sitio P (peptidilo) donde normalmente se une el ARNt unido a la cadena poli-
peptídica que se está sintetizando, sitio A (aminoacilo) donde se une el ARNt porta-
dor del nuevo aminoácido que se va a incorporar a la cadena polipeptídica y el sitio
E (salida) donde se unen ARNts vacíos antes de abandonar el ribosoma (Fig. 5.1). Al
unirse la subunidad 50S el codón AUG con su fMet-ARNti se sitúa en el sitio P. En
este momento el GTP unido al IF2 se hidroliza y el factor IF2-GDP se libera. El com-
plejo de iniciación 70S formado está preparado para aceptar un segundo ARNt car-
gado y pasar a la etapa de elongación (Fig. 5.1 A).
Complejo de iniciación 30S + Subunidad 50S A Complejo de iniciación 70S +

IF1 + IF2 + GDP + Pi
El proceso de traducción en células eucariotas es en general muy parecido al que

ocurre en procariotas. Las diferencias más destacables ocurren a nivel de la ini-
ciación. En las células eucariotas existen al menos nueve factores de iniciación y los
ARNms se unen al ribosoma formando un complejo con varias proteínas. Algunos
factores facilitan la disociación de las subunidades 60S y 40S del ribosoma.
Ribosoma 80S + eIF6 + eIF3 + eIF4C A Subunidad 60S +

Subunidad 40S-eIF3-eIF4C
El ARNm se asocia con varios factores de iniciación uno de ellos se denomina

proteína de unión al casquete (CBPI).
ARNm + CBPI + eIF4A + eIF4B + eIF4F A Complejo de ARNm
El complejo de mARN se une a la subunidad ribosómica 40S y al ARNt inicia-

dor que va acompañado también por el factor eIF2, una proteína que une GTP
(GTP-eIF2-Met-ARNti) y a continuación se realiza un barrido del ARNm para loca-
lizar el primer codón AUG que indica el inicio de la lectura del ARNm. Este pro-
ceso es dependiente de la hidrólisis de ATP.
Complejo de ARNm + Subunidad 40S-eIF3-eIF4C + GTP-eIF2-Met-ARNti + nATP

A Complejo de iniciación 40S + nADP + nPi
El factor de iniciación eIF5 induce la liberación de otros factores. Una vez que
ocurre el emparejamiento entre el Met-ARNti y el codón AUG tiene lugar la hidró-
lisis del GTP unido al factor eIF2 que se libera, y la subunidad 60S se une al com-
plejo formado por el ARNt iniciador, el ARNm y la subunidad 40S.
Complejo de iniciación 40S + eIF5 + Subunidad 60S A Complejo de iniciación

80S + eIF2-GDP + Pi + eIF3 + eIF4C + eIF5
Elongación de la biosíntesis de proteínas
La cadena polipeptídica se alarga mediante unión covalente de unidades de ami-

noácidos transportados al ribosoma por los aminoacil-ARNts y posicionados
correctamente por apareamiento de bases del anticodón del ARNt con el corres-
pondiente codón del ARNm. En esta etapa participan también factores de elonga-
ción (EF-Tu, EF-TS y EF-G).
Al comienzo de cada ciclo la cadena polipeptídica está unida a un ARNt en el
lugar peptidilo y los otros lugares están vacíos.
El factor de elongación Tu (EF-Tu), al igual que eIF2, está unido a un nucleóti-
do de guanina y acompaña al aminoacil-ARNt al sitio A del ribosoma; a continua-
ción el GTP se hidroliza y la forma EF-Tu-GDP se libera del ribosoma.
–sitio P peptidil-ARNt
Ribosoma + GTP-EF-Tu-aa-ARNt
–sitio A vacío
–sitio P peptidil-ARNt
A Ribosoma + GDP-EF-Tu
–sitio A aa-ARNt
La hidrólisis del GTP unido al factor de elongación Tu desempeña una función

importante en la fidelidad de la síntesis de proteínas. Mientras el EF-Tu no se diso-
cie no se puede formar un nuevo enlace peptídico y la disociación requiere la hidró-

lisis del GTP. El tiempo que transcurre hasta que se hidroliza el GTP permitiría que
un aminoacil-ARNt incorrecto unido en el sitio A abandonara el ribosoma.
Una vez liberado el EF-Tu-GDP, éste tiene baja afinidad por un aminoacil-ARNt
pero posee alta afinidad por otro factor de elongación Ts (EF-Ts) que facilita la libe-
ración del GDP y la asociación con GTP dando lugar a la forma de alta afinidad para
todos los aminoacil-ARNts excepto el ARNt iniciador.
EF-Tu-GDP + EF-Ts A EF-Tu-EF-Ts + GDP

EF-Tu-EF-Ts + GTP A EF-Tu-GTP + EF-Ts
EF-Tu-GTP + aminoacil-tARN A EF-Tu-GTP-aminoacil-tARN
Una vez formado el complejo en el que el aminoacil-ARNt ocupa el sitio A y la

cadena polipeptídica unido al último ARNt que se ha incorporado ocupa el sitio P
tiene lugar la formación de un nuevo enlace peptídico. La actividad enzimática que
cataliza la formación del enlace peptídico (peptidiltransferasa) es parte de la subu-
nidad grande del ribosoma y juega un papel importante el ARNr 23S que actúa
como una ribozima. El grupo amino del aminoacil-ARNt en el sitio A ataca al enla-
ce éster que une la cadena polipeptídica en crecimiento a la molécula de ARNt en
el sitio P y la cadena polipeptídica es transferida al grupo amino del aminoacil-
ARNt situado en el sitio A (Fig. 5.1 B).
Sitio P Sitio A Sitio P Sitio A
|
N–H
|
R1–C–H
|
O=C
| |
N–H N–H2 A N–H
| | |
R1–C–H R2–C–H R2–C–H
| | |
O=C O=C O=C
| | |
O O OH O
| | | |
tARN tARN tARN tARN
peptidil-ARNt aa-ARNt ARNt vacío peptidil-ARNt

El paso siguiente del ciclo de elongación se denomina translocación. El riboso-

ma se desplaza la distancia de un codón hacia el extremo 3’ del ARNm. Este des-
plazamiento traslada al peptidil-ARNt desde el sitio A al sitio P mientras que el
ARNt descargado pasa al sitio E y después se libera. El movimiento del ribosoma
requiere también la presencia del factor de elongación G (EF-G) también llamado
translocasa, que une GTP. La hidrólisis del GTP permite que EF-G-GDP se libere
del ribosoma. Después de la translocación, el sitio A está vacío y se puede iniciar un
nuevo ciclo de elongación.
El ciclo de elongación en eucariotas es parecido, con tres factores de elongación
eEF1_, eEF1à y eEF2 que tienen funciones análogas a los factores EF-Tu, EF-Ts
y EF-G.
Terminación de la biosíntesis de proteínas
Todo el proceso se repite hasta que en el sitio A del ribosoma está ocupado por
uno de los tres codones de terminación; ningún aminoacil-ARNt se une al riboso-
ma cuando uno de los codones UAA, UGA o UAG ocupan este sitio. Estos codo-
nes son reconocidos por proteínas denominadas factores de terminación o libera-
ción. El factor RF1 reconoce los codones UAA o UAG y el factor RF2 reconoce
UAA o UGA. La unión de un factor de liberación en el sitio A a un codón de ter-
minación cambia y activa la actividad peptidiltransferasa y se transfiere la cadena
polipeptídica a una molécula de agua (Fig. 5.1 C). El factor RF3 une GTP y tiene
actividad GTPasa que parece estimular el proceso mediante hidrólisis de GTP.
Finalmente se liberan también los factores de terminación, el ARNm y el ribosoma
se disocia en las subunidades 30S y 50S.
–sitio P peptidil-tARN
Ribosoma + GTP-RF + H2O A cadena
–sitio A codón de terminación
polipeptídica + GDP+ Pi + RF+ ARNm + Subunidad 50S + Subunidad 30S
En eucariotas un único factor de terminación, eRF, reconoce los tres codones de

terminación.
Antibióticos que inhiben la síntesis proteica

La síntesis de proteínas es una de las rutas fisiológicas vitales para las células y
muchos antibióticos actúan inhibiendo este proceso. Algunos de estos antibióticos
aprovechan diferencias estructurales y funcionales que existen entre los ribosomas
de procariotas y eucariotas, de esta forma, algunos resultan específicos para los
ribosomas bacterianos entre ellos: estreptomicina, eritromicina, cloranfenicol y
tetraciclina.
Estreptomicina: es un trisacárido muy básico que interfiere con la unión del

fMet-ARNt iniciador y también provoca errores de lectura originando proteínas
aberrantes.
Eritromicina: se une a un lugar específico en el ARNr 23S de la subunidad
grande e inhibe la translocación.
Cloranfenicol: impide la actividad peptidiltranferasa de la subunidad 50S.
Tetraciclina: se une a la subunidad pequeña y bloquea la unión de las molécu-
las de aminoacil-ARNt al ribososma. In vitro puede inhibir también síntesis de pro-
teínas en ribosomas eucariotas.
Puromicina: tiene una estructura parecida al extremo 3’ de un aminoacil-ARNt
lo cual facilita que se pueda unir al sitio A y la cadena polipeptídica en crecimiento
se transfiere a la puromicina provocando la terminación precoz de la misma. Este
antibiótico inhibe la síntesis de proteínas en células procariotas y eucariotas.
Destino y transporte de proteínas

Las células eucariotas contienen diferentes orgánulos cada uno de los cuales
poseen sus propias proteínas. La síntesis de la mayoría de las proteínas (excepto las
codificadas por el ADN mitocondrial) se inicia en los ribosomas libres en el cito-
plasma. Su destino final está determinado por señales de clasificación presentes en
la estructura de la propia proteína que dirigen su transporte hasta otros orgánulos.
En la Figura 5.2 aparecen las secuencias que dirigen las proteínas hacia el núcleo,
las mitocondrias, los peroxisomas, o la señal que dirige los ribosomas hacia el re-
tículo endoplásmico (ER) y desde el ER las proteínas pasan al complejo de Golgi y
otros destinos como los lisosomas, membrana plasmática y vesículas de secreción.
También aparecen diferenciados los tres mecanismos mediante los cuales las pro-
teínas se desplazan entre los diferentes compartimentos celulares: a) el transporte
entre el citoplasma y el núcleo (Fig. 5.2, flecha ) tiene lugar a través de poros
nucleares que actúan de forma selectiva permitiendo la difusión de moléculas de
pequeño tamaño y siendo necesario un mecanismo de transporte activo para molé-
culas de mayor tamaño, denominado también transporte regulado; b) el transporte
de proteínas desde el citoplasma a otros orgánulos (mitocondrias, peroxisomas y
ER) implica en todos los casos que las proteínas tienen que atravesar una bicapa
lipídica, se conoce como transporte de transmembrana (Fig. 5.2, flechas )y
son necesarios translocadores proteicos y el mantenimiento de las proteínas en una
conformación desplegada. c) el transporte vesicular (Fig. 5.2, flechas )
mediante el cual se mueven las proteínas desde el ER al complejo de Golgi y desde
donde son clasificadas bien en vesículas de secreción o destinadas a los lisosomas
y membrana plasmática fundamentalmente. Estas vesículas se producen en un orgá-
nulo por gemación transportando tanto fragmentos de membrana como moléculas
del lumen del compartimento. Las vesículas después de ser transportadas a su des-
tino descargarán su contenido mediante fusión con la membrana del otro comparti-
mento.
64
CITOPLASMA
NÚCLEO PEROXISOMAS
-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val -Ser-Lys-Leu-
MITOCONDRIAS +H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Leu-Leu-
Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-
+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg- Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln
Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-
Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu
RETÍCULO ENDOPLÁSMICO
-Lys-Asp-Glu-Leu-COO–
APARATO DE GOLGI
Man 6-P LISOSOMAS

VESÍCULAS
SECRETORAS
ENDOSOMAS
SUPERFICIE CELULAR
Figura 5.2. Destino y transporte de proteínas. Secuencias que dirigen su transporte a los diferentes compartimientos. Mecanismos de transporte:
transporte regulado (flecha ), transporte de transmembrana (flechas ), y transporte vesicular (flecha ).
Importación al núcleo
Las proteínas destinadas al núcleo tiene péptidos señal en el interior de la cade-

na polipeptídica que constan de cinco residuos aminoacídicos cargados positiva-
mente (Fig. 5.2). Estas secuencias son reconocidas por proteínas que se mueven
entre el citoplasma y el núcleo. Las importinas _ y ` actúan como un dímero recep-
tor para estas señales. El complejo formado es translocado a través del poro con la
participación de una GTPasa; en el núcleo este complejo se disocia y las proteínas
transportadoras salen de nuevo al citoplasma.
Importación a las mitocondrias
Las proteínas destinadas a la mitocondria contienen en el extremo amino termi-

nal un péptido señal de 20 a 35 aminoácidos en el que se alternan residuos cargados
positivamente y residuos hidrofóbicos (Fig. 5.2). Estos residuos se pliegan en forma
de hélice alfa anfipática. La cadena polipeptídica se mantiene desplegada mediante
interacción con proteínas chaperonas (Hsp-70). En las membranas mitocondriales
existe complejos que reconoce la hélice alfa y facilita el transporte a través de las
membranas. El transporte a través de la membrana interna depende del gradiente
electroquímico y de la hidrólisis de ATP. Una vez en la matriz mitocondrial la
secuencia señal se elimina y tiene lugar el plegamiento de la proteína.
Importación al ER y distribución desde el aparato de Golgi
Las proteínas que contienen una secuencia señal hidrofóbica (5-10 residuos) en
el extremo amino terminal (Fig. 5.2) dirigen estos ribosomas hacia el ER. Los ribo-
somas unidos a membranas sintetizan fundamentalmente tres tipos de proteínas:
proteínas lisosómicas, proteínas de secreción y proteínas de membrana. Este pépti-
do señal es reconocido por un complejo denominado partícula de reconocimiento de
la señal (SRP) que consta de un ARN de 300 nucleótidos (7SL-ARN) y seis pro-
teínas diferentes una de estas subunidades une e hidroliza GTP. La unión de SRP
detiene la síntesis proteica y el complejo ribosoma-SRP se dirige hacia la membra-
na del ER donde existen receptores de SRP localizados en la cara citoplasmática. La
cadena polipeptídica pasa a un complejo de translocación, posteriormente se hidro-
liza GTP y la SRP se disocia del ribosoma permitiendo que se reanude la síntesis de
proteínas. Si no existen más señales el polipéptido completo atraviesa la membra-
na pasando a la luz del ER donde una peptidasa elimina la secuencia señal. En el
caso de proteínas transmembrana pueden existir varios tipos, uno de los más sim-
ples son aquellas que además de la secuencia señal ya descrita contienen otro seg-
mento hidrofóbico adicional (secuencia de anclaje). Esta secuencia de anclaje detie-
ne el proceso de translocación originando proteínas con una única región de
transmembrana y el extremo amino terminal situado en la cara externa de la mem-
brana plasmática. Las proteínas que contienen más de una región de transmembra-
na necesitan señales adicionales que inician y detienen de nuevo la translocación de

la cadena polipeptídica.
En la luz del ER las proteínas recién sintetizadas se pliegan y muchas son modi-
ficadas mediante N-glucosilación (oligosacáridos unidos al nitrógeno de los grupos
amida de residuos de asparagina). Después las proteínas correctamente plegadas
son transportadas mediante vesículas al aparato de Golgi donde los oligosacáridos
previamente unidos pueden ser modificados y se pueden añadir nuevos. Los oligo-
sacáridos añadidos en el Golgi pueden estar unidos al oxígeno de los grupos hidro-
xilo de residuos de serina o treonina (O-glucosilación).
Proteínas que contienen la secuencia KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) en el extremo
C-terminal se unen a receptores específicos en la región de cis Golgi y son devuel-
tas al ER.
Importación a los lisosomas
Las hidrolasas destinadas a los lisosomas durante su paso por las distintas cis-
ternas del Golgi son modificadas. Estas proteínas son reconocidas por una gluco-
siltransferasa que transfiere una N-acetilglucosamina fosfato a un residuo de mano-
sa. Posteriormente una glucosidasa elimina el residuo de N-acetilglucosamina
originando un oligosacárido con grupos de manosa 6-fosfato. La presencia de resi-
duos modificados de manosa-6-fosfato permite que estas hidrolasas sean reconoci-
das por proteínas receptoras en membranas del complejo trans Golgi donde se for-
man vesículas que se dirigen a los lisosomas. Durante el transporte el receptor y las
hidrolasas se disocian, tanto por efecto de la disminución del pH como por la pre-
sencia de fosfatasas que eliminan los grupos fosfato, facilitando el reciclaje de los
receptores al complejo de Golgi mientras que las vesículas con las hidrolasas fina-
lizan fusionándose con lisosomas.
Las proteínas que son destinadas a la membrana plasmática no necesitan seña-
les específicas cualquier proteína que pase del ER al Golgi será dirigida hacia la
superficie celular (vía por defecto) a menos que contenga señales que la envíen
hacia los lisosomas o a vesículas de secreción.
No se conocen cuáles son las señales que determinan que las proteínas sean diri-
gidas a vesículas de secreción. Estas señales de clasificación en algunos casos puede
estar en regiones de estas proteínas que son procesadas proteolíticamente durante su
transporte. Estas proteínas forman agregados en la región trans del complejo de
Golgi y posteriormente se forman vesículas de secreción que permanecen cerca
de la membrana hasta que se produce una señal de liberación.
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6
Fundamentos de regulación de la
expresión génica.
Diferenciación celular
E. Velázquez Sánchez y J. M. Ruíz Albusac
Introducción (1,2)
Los organismos pluricelulares contienen una gran cantidad de células que se
organizan de una forma precisa para conformar los diferentes tejidos y órganos. Los
distintos tipos presentan tantas diferencias, en la forma y en su actividad biológica,
que cuesta trabajo pensar que los cromosomas de todas ellas contengan la misma
información genética. Por esta razón, y dado que la diferenciación celular suele ser
un proceso irreversible, se llegó a creer que este proceso se producía como conse-
cuencia de la pérdida selectiva de genes. En cambio, hoy se sabe que lo que dife-
rencia a una célula de otra es la cantidad y calidad de las proteínas que contiene, lo
cual viene condicionado por el patrón de expresión génica que cada una de ellas
posee. Por este motivo, la diferenciación celular se produce como consecuencia de
modificaciones en la expresión génica y no como consecuencia de la pérdida
secuencial de genes.
El genoma de una célula contiene, en la secuencia de su ADN, la información
necesaria para sintetizar millares de proteínas diferentes. De todos los genes que
constituyen el genoma de los diversos organismos, sólo se expresa una fracción de
ellos, al menos durante un periodo de tiempo determinado. Atendiendo a la forma
de expresión de las distintas proteínas en los diferentes tipos celulares, se pueden
distinguir los siguientes tipos:
a) Proteínas sintetizadas por todos los tipos celulares de un organismo. Éstas,

a su vez, pueden estar presentes en altas concentraciones, como las proteínas
del citoesqueleto, o las histonas, etc.; o en bajas concentraciones, como las
enzimas implicadas en la reparación de ADN.
b) Proteínas presentes en determinados tipos de células especializadas y ausen-
tes en las demás. Quizás el ejemplo más característico sea la hemoglobina,
que se encuentra presente solo en los eritrocitos y, además, a elevadas con-

centraciones.
c) Proteínas sintetizadas en muchos tipos celulares por un periodo de tiempo
limitado. A este tipo pertenecen las proteínas reguladoras implicadas en el
desarrollo embrionario y en la diferenciación celular.
Niveles de control de la expresión génica (1,2,3)

El coste energético de la síntesis de proteínas es muy elevado, tanto si una pro-
teína se expresa durante toda la vida de la célula, como si lo hace durante un perio-
do de tiempo limitado. Por ello, el control de la expresión génica es un proceso
esencial que permite a las células aprovechar al máximo la energía metabólica dis-
ponible. Este control se puede ejercer, en todas las etapas del proceso que, desde el
ADN, conduce a las proteínas:
a) Control de la transcripción. Regula el tiempo y el número de veces que un
gen, o un conjunto de genes, debe ser transcrito.
b) Control del procesamiento postranscripcional. Regula las reacciones que
producen la transformación de los transcritos primarios del ARN, en los
correspondientes ARN mensajeros maduros.
c) Control del transporte de los ARN mensajeros. El ARN mensajero es sinte-
tizado en el núcleo: sin embargo, sus lugares de actuación se encuentran en
el citoplasma, por lo que previamente han de ser transportados a través de los
poros nucleares.
d) Control traducional. Selección de los ARN mensajeros citoplasmáticos que
deben ser traducidos por los ribosomas.
e) Control de la degradación de los ARN mensajeros. Algunos ARN mensaje-
ros presentes en el citoplasma son inactivados de forma selectiva.
f) Control de la actividad proteica. Las proteínas sintetizadas son convertidas
de manera selectiva en las correspondientes formas activas o inactivas.
De todos los niveles posibles en los que puede ser regulada la expresión génica,
la regulación a nivel del inicio de la transcripción es la más importante y la mejor
caracterizada para la mayoría de las células. Este nivel de control es el que tiene
lugar preferentemente en el proceso de la diferenciación celular.
Visión general del control de la transcripción:

regiones reguladoras (1,4)
La transcripción génica está regulada por una o varias regiones situadas a lo
largo de la molécula del ADN y que precisamente reciben el nombre de regiones
reguladoras. Las regiones reguladoras actúan a la manera de «interruptores mole-
FUNDAMENTOS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA 71
culares», más o menos complejos, cuya función es la activación o la represión de la

expresión génica. Estos interruptores moleculares que controlan la transcripción
están constituidos por dos elementos esenciales: Secuencias específicas en el ADN
y proteínas reguladoras que se unen a él.
a) Secuencias específicas de ADN. El ADN posee un gran número de segmen-

tos de pequeño tamaño (menos de 20 pares de bases) cuya secuencia posee
una composición definida, que son reconocidos por una proteína reguladora
única o por un conjunto de proteínas relacionadas. La interacción de una pro-
teína reguladora con su correspondiente secuencia diana en el ADN deter-
mina la activación o la inactivación (represión) de uno o de varios genes. El
fundamento de la regulación de la expresión génica viene representado por
la naturaleza de la interacción entre las proteínas reguladoras con sus res-
pectivas secuencias diana en el ADN. Las proteínas reguladoras contactan
con el surco mayor del ADN mediante interacciones no covalentes. Aunque
la energía de interacción de cada uno de estos contactos es en sí débil, la
existencia simultánea de entre 18 y 22 contactos asegura una unión fuerte y
altamente específica.
b) Proteínas reguladoras. Una proteína reguladora reconoce una secuencia de
ADN porque las superficies de contacto de ambas moléculas son comple-
mentarias. Cada proteína reguladora presenta una secuencia de aminoácidos
característica y, por tanto, los motivos de reconocimiento proteína-ADN son
típicos en sus detalles. Sin embargo, el estudio de los complejos proteína-
ADN, mediante cristalografía de rayos X o por espectroscopia de resonancia
magnética nuclear, ha determinado, que la mayoría de las proteínas regula-
doras conocidas, se puede agrupar en alguno de los tipos de motivos estruc-
turales de unión al ADN que se describen a continuación.
Principales motivos de unión al ADN
Motivo hélice-giro-hélice (6,7)
Este motivo, descrito originalmente en proteínas bacterianas, se encuentra pre-

sente en un gran número de proteínas reguladoras, tanto de procariotas como de
eucariotas. Está formado por dos hélices a unidas por una corta cadena de aminoá-
cidos que forman el giro. La hélice más cercana al extremo carboxilo se denomina
«hélice de reconocimiento» y se adapta al surco mayor del ADN.
Proteínas con homeodominio (8,9,10)
Este motivo está constituido por tres hélices a conectadas por dos bucles. Fue
primeramente descrito en las proteínas reguladoras denominadas «homeóticas»,
codificadas, a su vez, por los genes homeóticos cuya expresión es esencial para el
desarrollo de la mosca del vinagre (Drosophila). Este motivo se halla también pre-
sente en las proteínas reguladoras de los organismos superiores.
Dedos de zinc (11,12)
La característica principal de este motivo, del que se han descrito varios tipos
diferentes, es que todos ellos contienen, al menos, un átomo de zinc. Hoy se cono-
cen varios tipos distintos, en unos, el átomo de zinc conecta una hélice a con una
lámina `, en otros, como en la familia de receptores para hormonas tiroideas, el
átomo de zinc conecta dos estructuras a helicoidales. En ambos casos la interacción
de la proteína con el ADN tiene lugar por sus regiones _ hélice.
Cremallera de leucina 5,13,14
Es una hélice _ en donde se distinguen dos dominios funcionalmente diferentes:

a) Dominio de dimerización. Se forma a partir de una región a helicoidal que
contiene un mínimo de cuatro leucinas, separadas cada una de ellas por seis
aminoácidos. La estructura primaria es: Leu-X6-Leu-X6-Leu-X6-Leu, en
donde X puede ser cualquier aminoácido. Puesto que hay 3,6 aminoácidos
por vuelta de hélice, las leucinas se alinean en un margen de la hélice, lo que
les permite establecer interacciones hidrofóbicas con otra proteína que pre-
sente un motivo estructural similar.
Las proteínas con cremallera de leucina pueden unirse a otra proteína idén-
tica para formar un homodímero, o a una proteína diferente, pero que pre-
sente ese mismo motivo estructural, y formar así un heterodímero.
b) Dominio de unión al ADN. Se sitúa a continuación de la cremallera de leu-
cina, presenta estructura de _ hélice y contacta con el surco mayor del AND.
Motivo hélice-bucle-hélice (HBH) (4,15)
Este motivo está constituido por dos hélices _ anfipáticas conectadas por un
bucle de longitud variable. A través de una de las hélices se produce la interacción
con el ADN, la segunda hélice permite la interacción con un motivo semejante
perteneciente a una proteína igual o diferente; las proteínas que contienen este moti-
vo pueden formar por tanto dímeros: homodímeros o heterodímeros. La capacidad
para formar dímeros depende de la naturaleza de la hélice _ y es común a todas las
proteínas que contienen el motivo HBH. La mayoría de las proteínas que contienen
el motivo HBH presentan además una secuencia con alto contenido en aminoácidos
básicos. Esta región básica se sitúa en una posición adyacente al motivo HBH y es
de capital importancia para la interacción con el ADN. Este motivo se denomina
hélice bucle hélice básico (HBHb).
Dimerización de proteínas. Control combinatorio.

Importancia en la expresión génica (1,3,4)
La dimerización de proteínas es de gran importancia para el control de la expre-
sión génica durante la diferenciación celular. Los heterodímeros se forman median-
te interacción de proteínas con diferentes especificidades de unión al ADN; puesto
que hay varias proteínas diferentes (con motivos estructurales «complementarios»)
éstas pueden combinarse de varias maneras, en función de la «combinación» esta-
blecida en un momento preciso el resultado sobre la expresión de un gen o de un
conjunto de genes puede ser muy diferente. Del control combinatorio se deducen
varios aspectos fundamentales (Fig. 6.1): en primer lugar, que el control de un solo
gen puede requerir la presencia de varias proteínas reguladoras, en segundo lugar,
que una misma proteína reguladora puede estar implicada en la expresión de varios
genes diferentes y en tercer lugar, que la misma proteína reguladora puede formar
parte de un complejo regulador activador o represor, dependiendo del resto de las
proteínas que formen parte del complejo.
Una consecuencia importante del control combinatorio es que unas cuantas pro-
teínas reguladoras, combinadas de forma adecuada, pueden formar varios tipos
celulares diferentes, a lo largo del desarrollo. En la Figura 6.2 puede verse como,
mediante la combinación de cinco proteínas, cuya expresión ha sido inducida de
PROTEÍNAS REGULADORAS
COMPLEJOS ADN-PROTEÍNA
A
Gen activo
Gen inactivo
Figura 6.1. Efecto de la combinación de proteínas reguladoras unidas a su ADN diana sobre la
transcripción génica. (A) Combinación activadora de la transcripción. (B) Combinación inhibidora
de la transcripción.
Célula embrionaria
1.a DIVISIÓN
2.a DIVISIÓN
3.a DIVISIÓN
Figura 6.2. Importancia del control combinatorio para la diferenciación celular. La decisión de
sintetizar una proteína (escogida de entre un par) se toma después de cada división celular aten-
diendo a criterios posicionales (las células hijas situadas a la derecha del embrión expresan úni-
camente la proteína representada a ese lado de la flecha, y las de la izquierda, las representa-
das a ese mismo lado). Cuando una generación inicia la expresión de una proteína, las
generaciones sucesivas la expresan también. En el ejemplo se representa la formación de ocho
tipos celulares con cinco proteínas reguladoras diferentes (triángulos ’ y », círculo k, corazón
♥ y media luna z).
forma secuencial a lo largo de tres divisiones celulares, y teniendo en cuenta la posi-

ción ocupada por cada célula en el embrión, se han formado ocho tipos diferentes
de células.
Otra consecuencia del control combinatorio es que el efecto de añadir una nueva
proteína a una célula depende de la historia anterior de la misma, puesto que esta
historia determina qué proteínas reguladoras se encuentran ya en la célula. Así,
durante el desarrollo, una célula acumula una serie de proteínas que pueden no
modificar su expresión génica, pero en un momento determinado, cuando se expre-
sa el último miembro de la combinación requerida, se completa el mensaje regula-
dor, y en consecuencia se producen grandes cambios en la expresión génica. Esto
puede explicar por qué los fibroblastos pueden ser convertidos en células muscula-
res por efecto de la expresión inducida de un gen denominado mioD, como veremos
después.
El control combinatorio puede también explicar el proceso de la determinación

celular por la cual una célula queda determinada a seguir una cierta ruta de diferen-
ciación y un destino, y el proceso de la diferenciación celular, mediante el cual una
célula expresa su carácter diferenciado.
Regulación de la actividad de las proteínas reguladoras (1,3,4)

La combinación de las proteínas reguladoras para activar la expresión génica
no se produce al azar, sino que está, a su vez, regulada por señales extracelulares
que combinan su mensaje mediante receptores situados en la membrana plasmáti-
ca o en el interior celular. La señal externa es transducida hasta el núcleo celular y
la consecuencia es la activación/inactivación de una o de varias proteínas regula-
doras.
Control de la expresión génica en la diferenciación celular.

Miogénesis (1,3,4)
El proceso mediante el cual un huevo es transformado en un organismo multi-
celular requiere la ejecución de un complejo programa de desarrollo. Para que este
programa pueda llevarse a cabo, es necesaria la activación de una serie de genes.
Esta activación debe producirse en el momento preciso, en una secuencia determi-
nada y en una localización exacta.
Son varios los mecanismos y procesos implicados en la regulación de la expre-
sión génica durante el desarrollo. Como resultado de esos controles, las células res-
ponden a los cambios producidos en su entorno y así los diferentes tipos celulares
pueden producir sus proteínas características. La mayoría de los mecanismos impli-
cados en la regulación de la expresión génica durante la diferenciación celular
requieren la participación de una gran cantidad de proteínas reguladoras que actúan
de forma combinada. El resultado de su actuación es la activación/represión de la
transcripción de uno o de varios genes. Uno de los ejemplos más representativos y
mejor caracterizados sobre el control de la expresión génica en la diferenciación
celular lo constituye la miogénesis, algunos de cuyos aspectos se describen a con-
tinuación.
Etapas de la miogénesis (3,15)
Las células musculares se forman en los organismos superiores a partir de los

somitos (bloques de células mesodérmicas localizadas a ambos lados del tubo neural)
mediante tres etapas: Determinación, Proliferación/Migración y Diferenciación
(Fig. 6.3).
Somito
Determinación
Proteínas MioD/Myf5
Mioblastos
Proliferación-
Migración
Células musculares
indiferenciadas
Miogenina
Diferenciación Proteínas Mrf4
Miotubo
Figura 6.3. Esquema representativo de las tres etapas principales que intervienen en la mio-
génesis. Influencia de las proteínas miogénicas. De acuerdo con el modelo representado, las pro-
teínas MioD y Myf5 actuarían fundamentalmente en la etapa de determinación, mientras que,
Miogenina y Mrf4, lo harían en el transcurso de la diferenciación.
a) Etapa de Determinación
Una célula está determinada cuando ha tomado una decisión sobre su desarro-
llo; es decir, cuando ha experimentado un cambio que la diferencia, a ella y a sus
descendientes, de las otras células del embrión y que la obliga a tomar una vía de
desarrollo determinada. En este caso, algunas células concretas de los somitos se
determinan, convirtiéndose así en mioblastos; precursores de las células muscula-
res, que carecen todavía de grandes cantidades de las proteínas propias de la célula
madura.
b) Etapa de Proliferación/Migración
Después de la determinación, una subclase de mioblastos (los destinados a con-
vertirse en músculo) migran desde los somitos hacia las regiones en donde se for-
marán las extremidades, aquí proliferan y se funden para formar un sincitio.
c) Etapa de Diferenciación
En esta etapa los precursores se convierten en células musculares maduras (mio-
tubos). Se emplea el término diferenciación para designar la especialización celular
manifiesta; es decir, la manifestación de un carácter celular muy evidente (expre-
sión de actina, miosina, troponina, receptor de acetilcolina, etc.).
Las señales extracelulares que inducen la determinación de cada grupo de mio-
blastos proceden de las células vecinas, principalmente del tubo neural y del ecto-
dermo lateral, y se expresan sólo de forma transitoria. Estas señales disparan la
expresión de numerosos factores intracelulares que mantienen el programa miogé-
nico en ausencia de las señales inductoras.
Durante el proceso de la miogénesis se produce un gran aumento de la expresión
de los genes necesarios para el desarrollo del músculo y para su función biológica:
genes miogénicos.
Proteínas reguladoras de la miogénesis
En la determinación y diferenciación del músculo intervienen varias proteínas

reguladoras pertenecientes a dos familias diferentes de factores de transcripción
denominadas FMR (Factores Musculares Reguladores o Proteínas Miogénicas), y
MEF-2 (Myocyte Enhancer Factor 2).
Factores Musculares Reguladores (FMR) (3,16,17,18,19)
En esta familia se incluyen cuatro proteínas denominadas MioD (primera des-

cubierta), Miogenina, Myf5 y Mrf4. Reciben el nombre colectivo de Proteínas
Miogénicas porque cuando su expresión es inducida experimentalmente en otras
células (fibroblastos) estas expresan las proteínas propias de las células muscula-
res.
Los miembros de esta familia se expresan únicamente en las células musculares
y se unen a secuencias específicas en el ADN denominadas cajas E.
La expresión de los FMR está sometida a regulación espacial y temporal a lo
largo del desarrollo muscular. Por ejemplo, se detecta expresión de Myf5 en la
región dorsomedial del somito en el día octavo del desarrollo, expresándose un día
y medio después en la región lateral. Con excepción de la Mrf4, que se expresa de
forma transitoria durante los días diez y once del periodo embrionario y nueva-
mente, a partir del día dieciséis, el resto de las proteínas miogénicas, una vez ini-
ciada su expresión, ésta permanece, aunque en intensidad variable, hasta el estado

adulto.
Diversos estudios de mutagénesis dirigida, parecen indicar, que cada una de las
proteínas miogénicas poseen diferentes funciones in vivo. Así, las proteínas MioD
y Myf5 parecen estar principalmente implicadas en la determinación de los somitos
y en su conversión en mioblastos (Fig. 6.3), mientras que Miogenina y Mrf4 inter-
vendrían más bien en el proceso de la diferenciación.
MEFs (Muscle Enhancer Binding Factors) (17,18,20)
Los MEFs, a diferencia de los FMR, son incapaces por sí mismos de inducir la
miogénesis, pero hacen posible que los FMR lo hagan. Los MEFs son expresados
por otros tipos celulares, además de por las células musculares, durante el desarro-
llo. Las regiones del ADN a las cuales se unen específicamente se denominan cajas
MEF.
Estructura de los FMR y MEFS. Control combinatorio

en la miogénesis (3,4,17)
Tanto los FMR como los MEFs contienen en su estructura molecular el motivo
HLH básico. Esto les permite formar homodímeros y heterodímeros y por tanto,
combinarse de formas diversas, con las correspondientes implicaciones en la expre-
sión génica. Y así, aunque cada uno de estos factores puede unirse a sus ADNs
diana, la afinidad de unión es mucho mayor, cuando cualquiera de ellos lo hace aso-
ciado con él mismo o con otro. Por ejemplo, los MRFs forman heterodímeros con
la proteína E2A (factor de transcripción expresado en varios tipos celulares, que
posee también el motivo HLH básico), y este heterodímero se une a la caja E del
ADN. Por su parte, la unión de los MEFs a su ADN diana (caja MEF), requiere la
dimerización de los mismos. Los dímeros MEF-MEF, pueden a su vez combinarse
con los heterodímeros MRF-E2A.
Teniendo en cuenta que los genes implicados en la diferenciación terminal del
músculo (Fig. 6.4) poseen cajas E, cajas MEFs o ambas, y que los heterodímeros
MRF-E2A interaccionan con los dímeros MEF-MEF, dependiendo del tipo de inte-
racción, con las mismas proteínas reguladoras pueden activarse hasta tres genes
diferentes.
En general, estas diferentes posibilidades de combinación, producen altos nive-
les de expresión en los genes responsables de la formación del músculo. En con-
clusión, la llave de la especificidad miogénica se encuentra en la asociación com-
binatoria de las diferentes proteínas a sus correspondientes sitios de control.
A E2A FMR
MEF MEF
Promotor
Caja MEF
B
MEF
MEF
Promotor
FMR E2A
Caja E
C Caja MEF
MEF
MEF
E2A Promotor
FMR
Caja E
Figura 6.4. Modelos de combinación de las proteínas implicadas en la miogénesis. Cada una
de las tres combinaciones de proteínas (A, B y C) podría activar un gen diferente implicado en la
miogénesis. FMR (Factores Musculares Reguladores). E2A (Factor de transcripción E2A). MEF
(Muscle Enhancer Binding Factor). Caja E (secuencia de ADN especifica para la unión del díme-
ro FMR-E2A). Caja MEF (secuencia de ADN específica para la unión del dímero MEF-MEF).
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7
Genes para la presentación
y el reconocimiento de antígenos
R. Millán González y J. R. Regueiro
Introducción
El sistema inmune surgió durante la evolución de los vertebrados para combatir
las infecciones causadas por virus, bacterias, protozoos, hongos y helmintos. Estos
patógenos pueden ser responsables de infecciones intracelulares o extracelulares,
para las cuales la respuesta inmune debe ser diferente. De hecho, el sistema inmu-
ne ha desarrollado una variedad de respuestas apropiadas para combatir cada tipo de
patógeno, al mismo tiempo que mantiene la tolerancia a los componentes del pro-
pio organismo. Para eliminar un patógeno que haya establecido una infección (atra-
vesando las barreras epiteliales del organismo) lo primero que debe de hacer el sis-
tema inmune es reconocerlo como tal y a continuación desarrollar una respuesta
adecuada para destruirlo. Para ello el sistema inmune ha desarrollado dos tipos de
mecanismos cuya diferencia principal reside en las estructuras de reconocimiento
de los patógenos, ya que los mecanismos efectores de destrucción son esencial-
mente similares. Estos dos mecanismos son la inmunidad innata y la inmunidad
adquirida.
La inmunidad y la autotolerancia innatas

Los mecanismos innatos, más primitivos evolutivamente hablando, de acción
inmediata, son mecanismos inespecíficos de reconocimiento del patógeno y caren-
tes de memoria inmunológica. Son los encargados de combatir la infección desde el
mismo momento de su inicio y durante sus primeras fases (aproximadamente de
0-5 días) con gran eficacia. Si éstos no consiguen eliminar la infección, al menos la
mantienen bajo control mientras se desarrolla el otro tipo de mecanismo, la inmu-
nidad adaptativa, que requiere más tiempo (aproximadamente una semana) para
desarrollarse. Las respuestas innatas generadas influyen en el tipo de respuesta

adaptativa que se desarrollará más tarde.
La inmunidad innata se basa en la activación del complemento por la vía alterna-
tiva y en los fagocitos (monocitos/macrófagos y neutrófilos) e inflamocitos (masto-
citos), células que tienen receptores innatos para múltiples patógenos (1):
1. Receptores que reconocen estructuras características de los patógenos.
— Lectinas de superficie que reconocen carbohidratos en la superficie de
bacterias, levaduras y células senescentes (como LPSR o CD14 y el
receptor de manosa, MR).
— Receptores de detritos (scavenger) que reconocen polímeros aniónicos
presentes en la superficie microbiana y de células muertas.
2. Receptores para el fragmento Fc (FcR) de las inmunoglobulinas. Se encuen-
tran en la superficie celular y están específicamente diseñados para recono-
cer y unirse al fragmento constante de las inmunoglobulinas y mediar su fun-
ción biológica.
3. Receptores para proteínas del complemento (CR).
Todos estos receptores son capaces de reconocer, de forma inespecífica, estruc-

turas propias del patógeno y opsoninas. Una vez que el patógeno ha sido reconoci-
do, se iniciará la fase efectora de la respuesta inmune innata. En el caso de un fago-
cito, tras el reconocimiento, se producirá la activación del fagocito, ingestión del
patógeno (formación del fagosoma) y, por último, la digestión (formación del fago-
lisosoma y destrucción del patógeno).
Existen otros mecanismos innatos que no actúan inmediatamente, sino que son
inducibles, como son la respuesta de fase aguda, los interferones (especialistas en
defendernos de los virus), las células citolíticas naturales (NK, natural killer), las
citocinas y otros mediadores que producen inflamación.
Como se indicó anteriormente, la función principal del sistema inmune es la
defensa frente a las infecciones, pero además, dicho sistema tiene que aprender a
tolerar las estructuras propias para no reaccionar contra ellas. En el caso de la inmu-
nidad innata, debido a que es una inmunidad que ya está desarrollada desde el naci-
miento (está determinada en la línea germinal) y no necesita el contacto previo con
la sustancia ofensiva, los mecanismos de tolerancia se realizan por la acción de la
selección natural. Los individuos en los que las células o moléculas que pertenecen
a la inmunidad innata no respeten los componentes propios del organismo serán
purgados por acción de la selección natural y no serán viables.
La inmunidad adaptativa
Los mecanismos adaptativos (más recientes evolutivamente hablando) tardan
una semana en desarrollarse (por eso constituyen la inmunidad adquirida), tienen
unos mecanismos de reconocimiento del patógeno extremadamente específicos (los
GENES PARA LA REPRESENTACIÓN Y EL RECONOCIMIENTO… 83
receptores para antígeno TCR y BCR) y presentan memoria. Los linfocitos T y B

son las únicas células capaces de reconocer específicamente los agentes patógenos,
cada linfocito está programado genéticamente para reconocer de forma exclusiva un
único antígeno. El sistema inmunitario en conjunto puede reconocer específica-
mente miles de antígenos, de tal forma que los linfocitos que reconozcan un antí-
geno determinado deben constituir una fracción minúscula del conjunto total de lin-
focitos (2). ¿Cómo es posible entonces generar una respuesta inmunitaria adecuada
frente a un agente infeccioso? La respuesta es que cuando un agente se une a las
escasas células capaces de reconocerlo, dichas células inician un proceso de proli-
feración masiva. Al cabo de pocos días, su número es suficiente para ejercer una
respuesta inmunitaria eficaz. Es decir, el antígeno selecciona los clones de células
que son capaces de unirse a él y promueve su proliferación (véase Fig. 7.1).
FASES
RECONOCIMIENTO
(SELECCIÓN CLONAL) LINFOCITOS
VÍRGENES B B B
B 1 2 3 n
SELECCIÓN CLONAL
B B
2 2
ACTIVACIÓN PROLIFERACIÓN
(EXPANSIÓN CLONAL) LINFOCITOS
ACTIVADOS
B 2 B 2 B 2 B 2
DIFERENCIACIÓN
LINFOCITOS
EFECTORES 2 2
2 2
2
CÉLULAS PLASMÁTICAS
CÉLULAS DE MEMORIA
FUNCIÓN
EFECTORA ANTICUERPOS
Figura 7.1. La selección clonal. Cada linfocito y su progenie (el clon) tienen una única especifi-
dad generada por azar (de la 1 a la n). Cada antígeno seleciona por estimulación al linfocito que
es capaz de reconocerlo, ignorando a los demás (el 2 en este ejemplo). Éste entonces prolifera y
madura amplificando la respuesta específica y generando memoria inmunológica. Las fases de
reconocimiento, activación y función efectora son aplicables.
Por tanto, el fenómeno primario y esencial de toda respuesta inmune es el reco-

nocimiento del antígeno por los linfocitos T y B, que se consigue gracias a la pre-
sencia en su membrana de receptores específicos para él. En el caso de los linfoci-
tos B, este receptor está constituido por inmunoglobulinas de membrana (mIg), que
se hallan asociadas de forma no covalente con el heterodímero CD79_-CD79`. En
el caso de los linfocitos T, lo constituye el TCR, que se halla asociado de forma no
covalente a las moléculas CD3. Un sistema especial de reordenamiento de estos
genes, sistema que sólo poseen los linfocitos T y B, garantiza que durante su desa-
rrollo en los órganos linfoides primarios, cada clon linfocitario (célula y todas las
células derivadas de ella por división celular) adquiera un receptor antigénico
(inmunoglobulina en el caso de los linfocitos B, TCR en el caso de los linfocitos T)
con un único sitio de unión al antígeno, es decir, con una sola especificidad, que es
diferente de la de los receptores de los otros clones linfocitarios. El repertorio de
especificidades distribuidas clonalmente entre los distintos linfocitos T y B madu-
ros es enorme, lo que permite que haya siempre linfocitos, aunque sea en muy bajo
número, con receptores específicos para epítopos de las múltiples (potencialmente
millones) sustancias extrañas (antígenos) que pueden penetrar en el organismo de
un individuo. Una vez maduros, los linfocitos pasan a la periferia, circulando y
recirculando por los órganos linfoides secundarios, donde desarrollarán las res-
puestas cuando encuentren el antígeno para el que son específicos. Estas respuestas
obedecen al principio de selección clonal, de forma que el antígeno «selecciona» (es
decir, se une de forma selectiva) clones de linfocitos T y/o B con receptores espe-
cíficos para él; esto determina la activación y proliferación de dichos clones y la
consiguiente amplificación clonal del número de linfocitos específicos para ese
antígeno. Esta ampliación del número de linfocitos específicos de antígeno garan-
tiza que la respuesta secundaria frente al mismo antígeno se comporte como una
respuesta con memoria, es decir, sea mucho más rápida, eficaz e intensa.
Linfocitos B y su receptor para el antígeno
Las células B son generadas por el organismo a lo largo de toda su vida, pro-
ducción que tiene lugar en la médula ósea. Las células precursoras residentes en
dicho órgano tienen que sufrir un proceso de diferenciación, en el que se requiere
la participación de las células del estroma a través de contactos directos célula-célu-
la y a través de la producción de factores solubles. En el proceso de maduración del
linfocito B se va a producir la formación del complejo BCR (receptor de la célula
B) maduro y funcional. El BCR está formado por dos tipos de cadenas, cadenas
variables (inmunoglobulina de membrana) y cadenas invariables (iguales en todos
los linfocitos, CD79). Cada complejo receptor está formado por la unión de la inmu-
noglobulina a dos heterodímeros CD79_/CD79`. ¿Cómo se genera la diversidad en
estos receptores? (3) Las moléculas de inmunoglobulina son codificadas por genes
que contienen múltiples versiones para cada región de la cadena. De este modo un
linfocito B elige entre todas esas opciones posibles y expresa al final en su mem-
brana una molécula de inmunoglobulina concreta. Las regiones constantes de las

cadenas ligeras y pesadas se encuentran codificadas por los denominados segmen-
tos C y las regiones variables por los segmentos V y J o V, D y J según se trate de
cadenas ligeras o pesadas respectivamente. Los segmentos codificantes (V, J y C, y
también D en el caso de las cadenas pesadas) se encuentran separados en el geno-
ma de todas las células del organismo, excepto en los linfocitos B, la aproximación
de estos segmentos génicos durante la maduración de la célula B es necesaria para
su expresión. Dicha aproximación tiene lugar por un proceso de recombinación
somática (véase Fig. 7.2). Sólo los segmentos que codifican para la región variable
de cada cadena recombinan y se aproximan. Los segmentos constantes permanecen
separados del resto y es a nivel del ARNm cuando se unen a la combinación VDJ o
VJ ya recombinada. Por tanto, el mecanismo básico para la generación de la diver-
Figura 7.2. Ejemplo de reordenamiento, transcripción y traducción de una cadena ligera g en un

precursor de linfocitos B. Una de las versiones V (•) se yuxtapone a una J (•) por recombinación
somática, eliminándose grandes segmentos de ADN (*). Ahora ya es posible la síntesis de un RNA
con los segmentos necesarios (V, J, C) que se alinearán por excisión intrónica (se eliminan gran-
des segmentos de ARN). La región variable de la cadena ligera está codificada por dos segmen-
tos génicos (V y J).
sidad de los anticuerpos es la recombinación somática al azar de las distintas ver-

siones de los genes que codifican cada región de sus cadenas, y la asociación al azar
de las propias cadenas pesadas y ligeras, pero no es el único. La imprecisión en la
unión de los segmentos génicos a la hora de la recombinación y la hipermutación
somática que tiene lugar durante el reordenamiento amplifican dicha diversidad.
Tenemos, por tanto, formado un amplio repertorio de linfocitos B capaces de reco-
nocer específicamente un amplio espectro de antígenos a pesar de que cada linfoci-
to B expresa y sintetiza una única inmunoglobulina.
Linfocito T y su receptor para antígeno
Los linfocitos B reconocen antígenos libres o solubles mediante su receptor

antigénico de superficie. En el caso de los linfocitos T, el antígeno es previamente
degradado y procesado en el interior de las células presentadoras de antígeno
(APC). Posteriormente, los fragmentos procesados son expuestos en la superficie de
la célula presentadora, en el seno de una molécula del complejo principal de histo-
compatibilidad (MHC de clase I o de clase II). El TCR no reconoce al antígeno libre
de forma directa como ocurre con los anticuerpos, sino que reconoce sólo frag-
mentos del antígeno en la membrana de esas células presentadoras, unidos o «pre-
sentados» por las regiones polimórficas de las moléculas MHC de clase I o clase II
propias. Esto implica que el MHC heredado por un individuo determinado condi-
ciona o restringe la especificidad del TCR de sus linfocitos T. En otras palabras, una
célula T no es específica de un antígeno, X, como ocurre con los linfocitos B, sino
de X + MHC propio. La restricción por el MHC de la especificidad de las células T
es una propiedad adquirida durante su desarrollo en el timo.
Además del TCR, las células T expresan en su membrana determinadas proteí-
nas de superficie, denominadas colectivamente moléculas accesorias, cuya función
principal es estabilizar la interacción inicial entre la célula T y la célula presentadora
(como CD4, CD8, CD2). Esta interacción inicial facilita el posterior reconocimien-
to del antígeno por el TCR. Además, asociado a las dos cadenas polimórficas que
constituyen el TCR se encuentra un grupo de proteínas monomórficas, denomina-
do en conjunto CD3, formando así el complejo TCR-CD3. Las cadenas CD3 son
imprescindibles para la transmisión de la señal de reconocimiento antigénico al
interior celular, estando probablemente implicadas en las interacciones del TCR con
las moléculas accesorias antes citadas. A lo largo de su desarrollo en el timo los lin-
focitos T adquieren el receptor del antígeno de las células T (TCR), y al igual que
ocurre con los linfocitos B, cada linfocito T adquiere un único TCR, cuya especifi-
cidad es distinta de la de los otros linfocitos T.
El TCR
Es un heterodímero con un peso total de 86 kD cuyas dos cadenas polipeptídi-

cas, denominadas _ y `, están unidas covalentemente por puentes disulfuro. Es la
porción específica del receptor, por lo tanto polimórfica, y en ella se da la variación

clonotípica que permite el reconocimiento de los diferentes antígenos. Existe un
isotipo del TCR que se encuentra en una pequeña subpoblación (inferior al 5 %) de
células T y está formado por cadenas a y b en lugar de _ y `. Este heterodímero
tiene una estructura similar al TCR_`, y su función biológica aún no está clara-
mente determinada. Los genes que codifican las cadenas del TCR están formados
por la unión de elementos génicos separados que codifican para las regiones V, D,
J y C. Las secuencias adyacentes a los segmentos V, D y J tienen, como los de las
inmunoglobulinas, determinadas secuencias (heptámero-espaciador-nonámero) que
están implicadas, como señal de reconocimiento, en el reordenamiento somático. El
mecanismo de reordenamiento sigue tres etapas: a) interacción de las secuencias
complementarias de uno de los genes D y J, al azar; b) el gen V sigue un mecanis-
mo análogo, constituyéndose segmentos V-D-J; los segmentos V podrían asociarse
con los J cuando no existe la región D, y c) por último, se produce un reordena-
miento de un gen de la región C, dando lugar al ADN reordenado y completo que
habría así creado una especificidad al azar. La amplia diversidad de TCR posibles
se genera por los siguientes mecanismos: multiplicidad de genes V; unión aleatoria
de los múltiples segmentos de los genes V, D, J y C; diversidad de unión que resul-
ta de una fusión imprecisa entre los últimos segmentos, responsable de deleciones
y adiciones de nucleótidos, lo que origina una diferencia en el número de aminoá-
cidos (este cierto grado de flexibilidad es una característica que sólo poseen los lin-
focitos T), y asociación al azar de las dos cadenas (_-` y a-b) que constituyen el
receptor. En contraste con las inmunoglobulinas, los genes de TCR no parecen
diversificarse mediante mutaciones somáticas de los genes reordenados, posible-
mente debido a la necesidad de reconocimiento de las moléculas MHC.
El sistema HLA
El sistema HLA constituye el sistema principal de histocompatibilidad (MHC)

humano. Está compuesto por una serie de proteínas de membrana que se hallan
codificadas por genes situados en una región, cercana al centrómero, en el brazo
corto del cromosoma 6. Su función en el sistema inmunitario consiste en combi-
narse con péptidos que han sido procesados por las células presentadoras de antí-
genos (APC), formando un complejo que puede ser reconocido por las células T.
Para este fin, las moléculas de histocompatibilidad cuentan con una región poli-
mórfica, que se encarga de unir péptidos e interaccionar con el TCR, y una región
monomórfica, que ancla la molécula a la membrana y se encarga de interaccionar
con los correceptores CD4 o CD8. Dos familias de moléculas de histocompatibili-
dad se han especializado en presentar péptidos a los linfocitos T CD4+ y CD8+: las
de clase II y las de clase I respectivamente. Cada familia de moléculas cuenta con
varias versiones o isotipos (HLA A, B, C de clase I y HLA-DR, DP, DQ de clase II),
cada uno de los cuales presenta un elevado polimorfismo en la población. Cada una
de la variantes o alotipos de cada uno de los isotipos de las moléculas de clase I y
de clase II presenta un grupo de péptidos ligeramente diferente, aunque la flexibili-

dad existente permite que siempre se produzca alguna presentación.
Fases de la inmunidad adaptativa
Si un patógeno logra sortear las tremendamente eficaces barreras inmunes inna-

tas y establecer una infección, se ponen en marcha los mecanismos de inmunidad
adaptativa. A menudo ésta se pone en marcha de todos modos, simplemente para
reforzar la inmunidad innata en futuras infecciones. Las respuestas adaptativas
comienzan con el reconocimiento del antígeno, a continuación se produce la acti-
vación de los linfocitos y su posterior proliferación para alcanzar un número de lin-
focitos mínimo tal que, al diferenciarse y adquirir su función efectora, sean capaces
de eliminar el antígeno (patógeno). A la vez que se generan linfocitos efectores tam-
bién se producen linfocitos de memoria. La respuesta inmune adaptativa consta de
las siguientes fases:
1. Reconocimiento: Consiste en la unión del antígeno a los receptores especí-

ficos para antígeno de los linfocitos maduros. Los linfocitos B reconocen determi-
nantes antigénicos conformacionales (proteínas, carbohidratos o lípidos) de los
patógenos extracelulares o sus productos (en forma soluble) por medio de su BCR.
Los linfocitos T reconocen el antígeno por medio de su TCR, pero a diferencia del
linfocito B no lo hacen en forma soluble, sino que reconocen pequeños péptidos (9-
24 aminoácidos) unidos a las moléculas de histocompatibilidad HLA (de clase I y
II) propias presentados por células presentadoras de antígeno.
Las moléculas MHC de clase II y de clase I muestran una diferente especiali-
zación para presentar el antígeno según la procedencia intracelular o extracelular de
éste. Las de clase II están especializadas en la presentación de antígenos extracelu-
lares (cualquier antígeno proteico exógeno) que entren en la célula presentadora por
endocitosis o fagocitosis, mientras que las de clase I están especializadas en la pre-
sentación de antígenos procedentes de proteínas citosólicas sintetizadas por la pro-
pia célula (como una proteína vírica en una célula infectada). Esto está condiciona-
do por las distintas vías biosintéticas seguidas por las moléculas MHC de clases II
y I. Las cadenas que forman las moléculas de clase I se sintetizan en el retículo endo-
plásmico, donde se ensamblan, formando un heterodímero físicamente inestable a
temperatura fisiológica. La presencia de péptidos antigénicos de 8-10 aminoácidos
es esencial para la formación de heterodímeros estables. Una vez formado el hetero-
dímero estable unido al péptido, se sigue el proceso de exocitosis común a las molé-
culas de membrana, es decir, del retículo endoplásmico son transportadas al apara-
to de Golgi y, desde éste, pasan a la membrana plasmática a través de un sistema
vesicular. Los péptidos que se unen a las moléculas MHC de clase I en el retículo
endoplásmico proceden generalmente de proteínas citosólicas o nucleares que se
han degradado en el citosol. Los péptidos producidos como consecuencia de esta
degradación son transportados a la luz del retículo endoplásmico mediante trans-
porte activo dependiente de ATP que es llevado a cabo por proteínas transportadoras
de péptidos (TAP, del inglés transporters associated with antigen presentation),
consistentes en dos subunidades (TAP-1 y TAP-2) ancladas a la membrana forman-
do un heterodímero. Se han descrito péptidos procedentes de las secuencias señales
que pueden unirse al MHC de forma independiente de TAP, probablemente tras
degradación proteica dentro del retículo endoplásmico. Por otro lado existen otros
genes, LMP2 y LMP7, que codifican subunidades de un complejo de proteasas cito-
sólico denominado proteasoma, que pueden estar involucrados en la producción de
los péptidos citosólicos que van a ser transportados al retículo endoplásmico. En
cuanto a las moléculas MHC de clase II, las cadenas _ y ` que forman el heterodí-
mero también se sintetizan en el retículo endoplásmico. Dentro de éste se asocian a
una tercera cadena polipeptídica, la cadena invariante (hi), formando un trímero _-
`-hi. Dicha asociación impide a la molécula de clase II unirse a un péptido dentro
del retículo endoplásmico. Además, la cadena invariante dirige el transporte de las
moléculas MHC de clase II a través del aparato de Golgi a un compartimiento de la
vía endolisosómica, aún no totalmente definido, donde se separa por proteólisis,
dejando dímeros _` libres para unir péptidos procedentes de la degradación prote-
olítica de antígenos que han entrado en la vía endocítica. Los péptidos antigénicos
que se unen a las moléculas MHC de clase II proceden, en su mayor parte, de pro-
teínas extracelulares que entran en la célula por endocitosis. La unión del péptido y
las moléculas MHC de clase II en los endolisosomas es independiente de TAP. En
células en reposo se ha demostrado que los ligandos naturales de las moléculas de
clase II proceden mayoritariamente de proteínas citosólicas que pueden entrar en la
vía endolisosomal.
2. Activación: Para la completa activación del linfocito se requieren simultá-

neamente sobre él dos tipos de señales: la primera se la da el antígeno y la segunda
procede de una célula coestimuladora o accesoria (una célula presentadora de antí-
geno profesional para los linfocitos T y un linfocito Th para los B). Si se produce
un reconocimiento del antígeno sin señal coestimuladora no sólo no se activa el lin-
focito, sino que se puede convertir en anérgico y ya no responder más a dicho antí-
geno (mecanismo que previene de la autoinmunidad). Una vez activado correcta-
mente el linfocito, comienzan los procesos de proliferación que conducen a la
expansión de los clones de linfocitos específicos de antígeno para generar un núme-
ro de linfocitos necesario para eliminar (una vez adquirida la función efectora en
una fase posterior) al patógeno (esta fase lleva una semana aproximadamente). Una
vez alcanzado un número de linfocitos suficiente se produce su diferenciación
(mediada por citocinas distintas a las que mediaban la proliferación) con lo que
adquieren su función efectora definitiva (una pequeña parte de los linfocitos proli-
ferantes permanecen como células de memoria). Por ejemplo, los linfocitos B se
diferencian a células plasmáticas productoras de anticuerpos, que se unen al antí-
geno en el medio extracelular y activan los mecanismos de eliminación del antíge-
no dependientes de anticuerpos. Los linfocitos T se diferencian a linfocitos T coo-
peradores que ayudan a los macrófagos a la lisis de patógenos fagocitados por éstos,
o ayudan a los linfocitos B en la producción de anticuerpos, o bien se diferencian a

linfocitos T citolíticos con capacidad de lisis de células infectadas intracelularmen-
te (por ejemplo, por virus). En esta fase, además de generarse un elevado número de
linfocitos efectores, también se producen cambios en otras proteínas de su superfi-
cie, las moléculas de adhesión, las cuales les permiten llegar rápidamente a los
lugares del organismo donde se está produciendo la infección.
3. Función efectora: Son todos los mecanismos que emplea el linfocito diferen-
ciado para eliminar el antígeno. Con la adquisición de la función efectora se pro-
duce la transición de unas pocas células con una única función de reconocimiento
específico de antígeno, a un elevado número de células con capacidad de mediar
(directa o indirectamente) la destrucción específica de dicho antígeno. Lo que dife-
rencia realmente a los linfocitos del resto de las células efectoras del sistema inmu-
ne (además de la memoria inmunológica) es su sutil capacidad para reconocer las
estructuras (por el BCR) o secuencias de aminoácidos (por el TCR) de los patóge-
nos que sean distintas a las propias (para las cuales es tolerante). Dichos antígenos
son imposibles de distinguir por los mecanismos de inmunidad innata. Por lo
demás, los mecanismos efectores destructivos son muy similares en las respuestas
innatas y en las respuestas adaptativas y la función biológica de los linfocitos es
hacer de adaptadores (de ahí la palabra adaptativa) para poner en contacto a los
esquivos patógenos con los diversos y universales mecanismos destructores, que
también funcionan en ausencia de linfocitos.
Tolerancia adaptativa
El sistema inmune es capaz de responder a una gran variedad de antígenos dife-
rentes, debido al amplio repertorio de especificidades, generadas somáticamente,
que poseen sus células B y T. Sin embargo, y como consecuencia de que la genera-
ción de dicho repertorio es aleatoria, es posible que muchos de los linfocitos T o B
producidos por el organismo reconozcan componentes propios. Estas células se
encuentran normalmente controladas por distintos mecanismos que aseguran la
tolerancia a lo propio. Pero, ocasionalmente, alguna célula B o T específica para un
antígeno propio puede escapar a estos mecanismos generadores de tolerancia y ata-
car a los tejidos propios donde se localice el antígeno para el que es específica,
dando lugar a una patología de tipo autoinmune: Los componentes de la inmunidad
innata son en general autotolerantes de manera igualmente innata, por lo que sólo
participan en las reacciones autoinmunes si son invocados por los linfocitos T o las
Igs. El establecimiento de tolerancia frente a los componentes propios (autoantíge-
nos) es un proceso fundamental para el normal funcionamiento del sistema. En el
caso de la inmunidad adaptativa, la tolerancia es específica del antígeno y es un
fenómeno adquirido. La deleción, la anergia y la ignorancia clonales son los prin-
cipales mecanismos de inducción y mantenimiento de la tolerancia. Cada uno de
ellos puede intervenir a nivel central (timo o médula ósea para las células T y B, res-
Figura 7.3. La selección de los timocitos _`. En el timo se rescatan (selección positiva de los
útiles), se eliminan (selección negativa de los dañinos) o se pierden (no selección de los útiles) los
timocitos según la afinidad de su TCR_` por las moléculas de MHC/péptidos propias. Apenas un
5 % de los timocitos sobreviven.
pectivamente) o periférico (órganos linfáticos secundarios y tejidos) (véase Fig.

7.3).
Deleción clonal
El mecanismo fundamental, aunque no el único, de tolerancia T a nivel central
es la deleción de los clones de timocitos autorreactivos en el timo. En el timo ocu-
rren dos procesos aparentemente contradictorios: la selección positiva de aquellos
linfocitos cuyo receptor es capaz de reconocer las moléculas HLA propias y la eli-
minación (selección negativa) de las células T autorreactivas. Las células del estro-
ma tímico son las encargadas de presentar péptidos propios a los linfocitos T para
realizar dicha selección (4). Existen dos umbrales de afinidad diferentes entre el TCR
y el complejo HLA-péptido propio: los linfocitos portadores de TCR con afinidades
bajas e intermedias por los complejos HLA-péptido propio serían seleccionados

positivamente (a efectos prácticos se habrían seleccionado todos los linfocitos capa-
ces de reconocer el HLA propio), mientras que aquellos cuyo TCR tuviera una afi-
nidad alta serían seleccionados negativamente. Por tanto, en el timo morirán timo-
citos por tres razones distintas: a) fallo en la producción de un TCR funcional a
través de los procesos de recombinación de los segmentos V, J y D de las cadenas
_ y ` del TCR; b) incapacidad de su TCR de reconocer algún complejo HLA-pép-
tido incluso con una afinidad relativamente baja; y c) reconocimiento con muy alta
afinidad del TCR de complejos HLA-péptido propio. El mecanismo de muerte de
los timocitos en todas estas circunstancias es la apoptosis.
El proceso de deleción de los clones autorreactivos en el timo no puede ser
exhaustivo so pena de reducir drásticamente el repertorio de linfocitos T disponible
para responder a los antígenos ajenos, por lo que se mantienen en circulación clo-
nes capaces de reconocer antígenos de los tejidos periféricos (por periféricos se
entienden todos los tejidos que no forman parte del sistema hematopoyético y el
timo) aunque normalmente, no responden a antígenos periféricos. Las razones de
esta ausencia de respuesta pueden ser de dos tipos: a) Ignorancia, indiferencia clo-
nal o silencio inmunológico. Estos tres términos, prácticamente equivalentes, des-
criben el siguiente mecanismo: la mayoría de las células parenquimatosas de los
tejidos periféricos —desde las células musculares hasta las neuronas— no expresan
moléculas de HLA de clase II, un requerimiento esencial para el reconocimiento de
los antígenos por parte de los linfocitos CD4+ de tipo colaborador. Normalmente,
estas células periféricas tampoco expresan moléculas de adhesión (por ejemplo
ICAM-1) que faciliten el contacto con ellos, y las células endoteliales de los capi-
lares que las rodean no expresan niveles suficientes de moléculas de adhesión o
receptores de «asentamiento» linfocitario. La circulación de linfocitos a través de
estos tejidos periféricos es, en situación normal, muy reducida y, por tanto, la pro-
babilidad de encuentro con su autoantígeno en forma inmunogénica, remota. El
resultado es que los linfocitos autorreactivos se mantendrán indiferentes frente a
células periféricas que, si bien contienen antígenos reconocibles por ellos, los man-
tienen inmunológicamente silentes. b) Anergia clonal. Se ha demostrado que algu-
nas células T circulantes autorreactivas no responden a la presentación del autoan-
tígeno en el contexto apropiado. Se cree que dichas células están en una situación
de anergia, este estado se produce probablemente por la presentación «incompleta»
de los antígenos periféricos. Este concepto parte de la hipótesis de que la activación
de todo linfocito requiere dos señales: una primera señal generada por el contacto
del TCR con el complejo HLA-péptido apropiado y una segunda señal normalmente
generada por el contacto con células presentadoras de antígeno «profesionales» (es
decir, macrófagos y células dendríticas) o por otras moléculas, como citocinas e
incluso ciertas moléculas de adhesión y los correceptores CD4 y CD8. Dado que en
la periferia las células parenquimatosas, incluso cuando expresan HLA de clase II,
no poseen —que se sepa— actividad coestimuladora, al interaccionar con los lin-
focitos autorreactivos los anergizarían.
Tolerancia B
Está bien establecido que una notable proporción de linfocitos B del repertorio
normal primario (células B recién formadas que no han tenido contacto con el antí-
geno) expresan inmunoglobulina de membrana (mIg) con actividad contra autoan-
tígenos. Hay que señalar, sin embargo, que no existen linfocitos B reactivos contra
autoantígenos ampliamente distribuidos e importancia biológica decisiva como los
antígenos de los grupos sanguíneos ABO o los antígenos de histocompatibilidad.
Además, afortunadamente, estos linfocitos B autorreactivos, en condiciones nor-
males, no desarrollan una respuesta, ya que para ser activados por un antígeno los
linfocitos B, requieren la colaboración de linfocitos T CD4+ específicos de otros epí-
topos del mismo antígeno, y el repertorio de linfocitos T CD4 es poco autorreacti-
vo. Esta limitación no es absoluta y, de hecho, falla cuando el sistema se enfrenta a
un autoantígeno que contenga (en la misma molécula o en moléculas físicamente
asociadas) epítopos reconocidos por linfocitos B autorreactivos junto a epítopos
exógenos reconocibles por el repertorio de linfocitos T CD4. Éste sería el caso de
una molécula microbiana con epítopos reconocidos por células B que tenga reacti-
vidad cruzada (mimetismo molecular) con un componente propio o bien un fárma-
co que se conjugue a una proteína propia; la célula B autorreactiva puede entonces
activarse y secretar autoanticuerpos ya que recibe la ayuda de las células T CD4+ que
reconocen los epítopos extraños. Hay que tener en cuenta, además, que durante su
respuesta frente a los antígenos exógenos, las células B diversifican su repertorio
de anticuerpos (repertorio secundario de células B) por los mecanismos de hiper-
mutación somática de los genes de las regiones VH y VL, con lo que se pueden
generar autoanticuerpos de alta afinidad. La alta frecuencia de células B autorreac-
tivas en el repertorio primario se explica porque éstas no sufren un proceso de
selección negativa durante su desarrollo en la médula ósea, tan radical y riguroso
como ocurre con los linfocitos T en el timo. Al igual que en el caso de las células
T, la deleción clonal es el principal mecanismo de tolerancia central (en la médula
ósea), mientras que la anergia clonal lo sería en la periferia. Estudios con ratones
que expresan transgenes codificadores de autoanticuerpos contra distintos tipos de
autoantígenos indican que las células B fuertemente autorreactivas contra autoan-
tígenos de membrana celular de amplia distribución, como las moléculas del com-
plejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I, son delecionadas a nivel
central y no se hallan en la periferia. En cambio, cuando se trata de autoantígenos
proteicos solubles, los linfocitos B autorreactivos no son delecionados sino que
aparecen en la periferia; sin embargo son anérgicos, es decir, incapaces de activar-
se frente al antígeno. El hecho de que un autoantígeno favorezca la deleción en
lugar de la anergia, depende de su mayor capacidad para inducir un fuerte liga-
miento cruzado de las mIg, lo que se da en el caso de los autoantígenos multiva-
lentes de membrana. Dicho «puenteo» de las mIg de los linfocitos B en desarrollo
generaría una fuerte señal activadora que, en ausencia de una segunda señal pro-
porcionada por las células T (probablemente vía CD40), conduciría a la apoptosis
de la célula B; si este «puenteo» es menor, como ocurre con los antígenos solubles,
se favorecería la anergia. Por otro lado, las células B autorreactivas generadas en el

repertorio secundario, es decir, por el mecanismo de hipermutación somática del
centro germinal de los folículos linfoides durante una respuesta frente a un antíge-
no exógeno, serían igualmente eliminadas por deleción clonal o silenciadas por
anergia clonal, incluso si el antígeno se hallara bien representado en el microam-
biente del centro germinal, al faltarles la ayuda (vía CD40) de células T CD4+
específicas del mismo autoantígeno.
Los mecanismos generadores de tolerancia que se han descrito, tienen una
eficiencia muy elevada. Por ello, se cree que la autoinmunidad podría reflejar la
activación desafortunada de algunas células potencialmente autorreactivas en esta-
do de anergia o ignorancia inmunológica. Sólo algunos autoantígenos inducen
autoinmunidad, y suelen ser aquellos para los que es difícil generar tolerancia cen-
tral o periférica por no ser ni muy abundantes ni extremadamente raros y para los
que existen linfocitos autorreactivos. La mayoría de las veces, estos linfocitos no se
encuentran activados, y sólo se activan en determinadas circunstancias, dando lugar
a la respuesta autoinmune. Debido a la depedencia de los linfocitos B y Tc respec-
to a los Th, se considera que la mayor parte de las respuestas autoinmunes comien-
zan por la activación de linfocitos Th autorreactivos, que precisa de dos señales, la
generada por un autoantígeno asociado a MHC, y la señal coestimuladora de la pro-
pia célula presentadora. Esta última es necesaria, no sólo para la activación del lin-
focito efector, sino para el mantenimiento de la función efectora: si el coestímulo
cesa, entonces el linfocito autorreactivo deja de actuar y muere.
Enfermedades autoinmunes
Las enfermedades autoinmunes son la consecuencia patológica de una respues-

ta inmune contra componentes del propio huésped. Aunque no se conoce todavía la
causa o causas concretas que desencadenan la autoinmunidad, parece necesaria la
existencia de células presentadoras con complejos MHC/autoantígeno en su super-
ficie, de células T o B efectoras autorreactivas y de señales coestimuladoras capa-
ces de activar a esos linfocitos. Se ha sugerido que las infecciones pueden ser un
factor desencadenante, y así parecen probarlo algunos datos experimentales. La
pérdida de tolerancia podría deberse a que el agente infeccioso induce la expresión
de moléculas MHC de clase II y/o señales coestimuladoras —antes ausentes— en
la célula presentadora o diana del ataque autoinmune o bien el patógeno obliga a
rescatar linfocitos anérgicos que finalmente consiguen eliminarlo, pero con el coste
autoinmune. También se ha apuntado la posibilidad de que anticuerpos o células T
generadas frente al agente infeccioso puedan dar reacciones cruzadas con antígenos
propios. En este caso, los anticuerpos o linfocitos T reconocen, además de los antí-
genos del agente infeccioso, otros propios del organismo de similar estructura
(mimetismo molecular). Otro modelo propone que las células B capaces de reco-
nocer el antígeno propio interaccionan con él cuando éste se encuentra asociado a
la bacteria —que actúa como «portadora»— y pueden recibir, entonces, ayuda de
las células Th. En el caso de tejidos inmunoprivilegiados, se ha sugerido que el trau-

ma o la infección podrían permitir el acceso de los linfocitos autorreactivos a los
autoantígenos antes secuestrados, disparando la autoinmunidad.
Por otro lado, parece claro que muchas, si no todas, las patologías autoinmunes
tienen un importante componente genético, además del ambiental. De hecho,
muchas enfermedades de este tipo parecen presentar una fuerte asociación con cier-
tas moléculas HLA, principalmente de clase II, aunque a veces con clase I. Esta idea
no es nada descabellada, puesto que la respuesta inmune (y autoinmune) implica la
participación de células T que reconocen, precisamente, péptidos presentados por
moléculas del MHC. Además de las moléculas HLA, otros factores genéticos, como
el sexo, son importantes en el desarrollo de enfermedades autoinmunes.
Las enfermedades autoinmunes pueden estar mediadas por anticuerpos como
tales o formando parte de complejos inmunes o por linfocitos T, tanto Th como Tc.
Los síntomas que se asocian a cada enfermedad autoinmune dependen esencial-
mente del origen (ubicuo o localizado) y la naturaleza del autoantígeno (soluble, o
bien asociado a membranas celulares, o a la matriz extracelular...).
Diabetes mellitus tipo I

Es un trastorno en el cual la destrucción de las células ` productoras de insuli-
na de los islotes pancreáticos de Langerhans, origina deficiencia de insulina. Está
mediado por células Tc (que a diferencia de las Th reconocen autoantígenos cito-
plásmicos, esto es, producidos por las propias células blanco). En esta enfermedad
las células ` del páncreas son destruidas selectivamente. Además, hay presencia de
anticuerpos contra diversos antígenos, algunos de ellos sin caracterización molecu-
lar hasta el momento; entre ellos, los más representativos son (5):
Anticuerpos contra células de los islotes (ICA). El antígeno, quizás un glucolí-
pido, aún no ha sido caracterizado.
Anticuerpos antiinsulina. Se han descrito en el suero del 50 % de los pacientes
en estadios preclínicos y clínicos de inicio reciente.
Antidescarboxilasa del ácido glutámico (GAD). El GAD existe en dos formas
derivadas de genes separados que codifican para las proteínas GAD-65 y GAD-67
que tienen un 65 % de identidad de aminoácidos. Ambas formas se encuentran en
altas concentraciones en neuronas y en células ` del páncreas. Aunque se han des-
crito anticuerpos contra ambas formas, los correspondientes a 65 kD se han detec-
tado con mayor frecuencia (80 % de las formas preclínicas).
Autoanticuerpos contra otros antígenos. Entre ellos se incluyen el anti-37 kD/40
kD, que es un fragmento tríptico de GAD-65, y el anti-38 kD una proteína parcial-
mente purificada de la membrana de los gránulos secretores de insulina (anticuer-
pos contra este antígeno se encuentran en el 30 % de los pacientes con enfermedad
de inicio reciente).
Otros aspectos inmunológicos de la diabetes tipo I son: a) infiltrado linfoide de
los islotes (insulitis), preferentemente a expensas de linfocitos T citotóxicos (ver
96
Figura 7.4. Mecanismos de autotolerancia y autoinmunidad. Nótese el papel central de los lifoncitos Th en la respuesta autoinmune. Los lifonci-
tos anérgicos pueden ser rescatados por patógenos en ciertas circunstancias, causando quizá autoinmunidad.
Fig. 7.4); b) rechazo rápido con insulitis de páncreas trasplantados, y c) asociación

con DR3, DR4, de modo que un alelo u otro se encuentra en el 90-95 % de los
pacientes diabéticos, mientras que la frecuencia en la población no diabética es del
40-45 %. El posible papel de este hecho en la instauración de la enfermedad aún no
se ha aclarado. El HLA-DR2 se considera un alelo protector.
Enfermedad de Graves
Es una enfermedad autoinmune que se presenta como tirotoxicosis con bocio

difuso. El diagnóstico inmunitario de la enfermedad se basa en la identificación de
anticuerpos antitiroideos con propiedad de alterar la función normal tiroidea. Hay
anticuerpos estimulantes del tiroides [antirreceptor de hormona tirostimulante
(TSH)] en el 90 % de los casos, y anticuerpos antitiroglobulina y antiperoxidasa
tiroidea en el 25 y el 50 %, respectivamente, de los pacientes. Se observa infiltración
linfocitaria difusa, a expensas de células T activadas, CD4+ y, en menor cantidad,
CD8+. Los anticuerpos antirreceptor de TSH con frecuencia pertenecen a un solo
tipo de cadena ligera, kappa o lambda, lo que sugiere que se desarrollan a partir de
una población de células B restringida. Los autoanticuerpos promueven in vitro el
crecimiento de las células tiroideas, por lo que al parecer desempeñan un papel en
el aumento del tamaño de la glándula. La responsabilidad de los anticuerpos anti-
rreceptor de TSH en la patogenia del hipertiroidismo se demuestra convincente-
mente por el cuadro de hipertiroidismo que presentan los hijos recién nacidos de
madres con enfermedad de Graves, cuadro clínico que desaparece cuando cataboli-
zan los anticuerpos transferidos de la madre. La oftalmopatía de la enfermedad de
Graves se asocia a la presencia de anticuerpos contra una proteína del músculo del
ojo de 64 kD (véase Fig. 7.4).
Resumen
Los principales aspectos que se han tratado en el presente artículo son:
Genes para la presentación y el reconocimiento de antigenos BCR, TCR
Polimorfismo MHC.
La autoinmunidad innata (determinada en línea germinal) se purga por la acción
de la selección natural.
La autoinmunidad adaptativa (determinada somáticamente) se purga por la
acción de la selección negativa central y por anergia por falta de colaboración con
linfocitos T colaboradores (a nivel periférico).
Los mecanismos de tolerancia a veces fallan: enfermedades autoinmunes.
Ejemplo de enfermadad autoinmune mediada por anticuerpos: Enfermedad de
Graves.
Ejemplo de enfermedad autoinmune mediada por linfocitos T citotóxicos:
IDDM.
¿Por qué existen estos fallos en la tolerancia? Papel central de los linfocitos Th.
Factores genéticos (asociación con MHC clase I y II) y factores ambientales (infec-
ciones).
Bibliografía
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5. Roitt I, Brostoff J, Male D. Inmunología. 5.a Edición Barcelona. Ediciones Harcourt,
S.A., 2000.
8
Oncogenes. Proteínas tumorales.
Mecanismos de activación de
proto-oncogenes. Genes supresores
de tumores. Genes mutadores
J. M. Ruíz Albusac, y E. Velázquez Sánchez
Introducción
Etapas del desarrollo del cáncer (2,3)
La investigación llevada a cabo sobre las bases moleculares del cáncer ha per-
mitido conocer las fases del desarrollo del mismo:
• Comienza cuando una célula de una población normal sufre una mutación
genética que le permite continuar proliferando cuando, en condiciones nor-
males, debería estar quiescente. Esta célula alterada —y su progenie— con-
serva su apariencia normal, pero se reproducen en exceso (hiperplasia).
• Años más tarde, alguna de estas células sufre otra mutación que altera, aún
más, el control del crecimiento celular, con lo que su progenie presentará un
aspecto anormal en su morfología y orientación (displasia).
• Después de cierto tiempo, una de estas células adquiere una mutación que
altera su comportamiento. Sus descendientes tienen otro aspecto y presentan
nuevas anomalías en su desarrollo. Si no ha traspasado ninguna barrera, se
forma un tumor benigno, o cáncer in situ, capaz de permanecer así indefini-
damente y alcanzar grandes proporciones.
• Algunas células pueden sufrir nuevas mutaciones. Si estos cambios genéticos
permiten la ruptura de la lámina basal, la invasión del tejido circundante y la
entrada de las células en el torrente circulatorio (o en la linfa), se forma un
tumor maligno.
• La acción inmediata de las células del sistema inmune acabará con la mayo-
ría de ellas. No obstante, si unas pocas células supervivientes se adhieren a la
pared vascular, de los capilares que bañan otro tejido u órgano, podría produ-
cirse extravasación.
• Las células invasoras pueden proliferar hasta dar lugar a nuevos tumores en
otra parte del cuerpo, formando un tumor secundario o metástasis, que puede
resultar letal si afecta a un órgano vital.
En resumen, una neoplasia se define como un proceso complejo, que se desa-

rrolla en múltiples etapas y que envuelve cambios secuenciales en los mecanismos
moleculares responsables del control del crecimiento celular; esto es:
a) Proliferación o división celular.
b) Diferenciación celular.
c) Muerte celular programada (apoptosis).
d) Reparación del ADN.
Sistemas de señalización celular (2,5,13)
¿Cuáles son los eventos moleculares involucrados en el control de la división

celular? ¿Qué mecanismos producen la pérdida de este control y la formación de
células cancerosas? Las células normales están, permanentemente, recibiendo seña-
les del exterior: por vía endocrina, paracrina, autocrina o yuxtacrina. Todos los
mensajes son transmitidos hasta el núcleo e integrados por el reloj del ciclo celular
que, en definitiva, será el encargado de decidir si las células deben o no proliferar:
• Las señales estimuladoras son iniciadas por los factores de crecimiento (EGF,
PDGF, etc.), cuyo objetivo es la producción de proteínas que ponen en mar-
cha la división celular.
• Las señales inhibitorias, iniciadas por citoquinas (TGF-`, interferón, TNF,
etcétera) producen, por el contrario, proteínas que inhiben la división celular.
Una alteración en las cascadas estimuladoras producirá una señal continuada
de proliferación celular. Una pérdida de la señal de parada producirá un error
en la inhibición de la división celular.
En ambos casos, la consecuencia es la misma: la célula pierde el control de su

propio crecimiento, permitiendo que avance en el ciclo.
Los factores de crecimiento hacen que las células en reposo (G0, quiescentes)
entren y progresen a través del ciclo celular. Durante la fase G1 temprana es nece-
saria la presencia sostenida (varias horas) de los denominados factores de compe-
tencia (EGF, PDGF, etc.). En el primer punto de control del ciclo (punto de
Restricción), para que la célula no detenga su crecimiento, se necesita la presencia
simultánea de los denominados factores de progresión. Durante la fase G1 tardía, y
el comienzo de la fase S, sólo es necesaria la presencia de factores de progresión
(IGF-I, etc.). En ciertas células, la ausencia de estimulación por factores de creci-
miento causa una rápida entrada en muerte celular programada. Algunas citoquinas
(TGF-`), pueden antagonizar los efectos proliferativos de los factores de creci-
miento, e incluso revertir su efecto, si se añaden al final de la fase G1.
ONCOGENES. PROTEÍNAS TUMORALES. MECANISMOS DE… 101
Otros puntos de control del ciclo se encuentran en la fase G2 y en la propia fase

M, impidiendo, mediante su destrucción, que la célula llegue realmente a dividirse.
Genes y cáncer (1,2,11,15,16,17,18,19,20,21,22)

El genoma es el portador de la información expresada en las proteínas que regu-
lan la división celular; por ello, sólo se puede considerar el cáncer como una enfer-
medad genética, cuando las alteraciones tienen lugar al nivel de los genes. ¿Cuáles
son estos genes? Se distinguen tres categorías:
Proto-oncogenes: Regulan los procesos de crecimiento celular.

Genes supresores de tumores: Responsables de inhibir la mitogénesis.
Genes mutadores: responsables de la reparación del ADN.
Oncogenes. Proteínas tumorales (7)
Los oncogenes son las versiones patológicamente alteradas de los proto-onco-

genes que, de forma dominante, están involucradas en la transformación neoplási-
ca de las células.
La mayoría de los acontecimientos genéticos que producen cáncer ocurren en
las células somáticas. Éstos se acumulan a lo largo de la vida del individuo, hasta
que se pierde un número crítico de elementos de control del crecimiento. De esta
forma se origina el clon que dará inicio a un tumor. La frecuencia con la que trans-
curren estos acontecimientos puede alterarse por la exposición a mutágenos
ambientales. Como estas alteraciones genéticas tienen lugar en las células somáti-
cas, no se transmiten a las generaciones futuras; es decir, no se heredan. Sin embar-
go, si el daño se produce en las células germinales, los descendientes recibirán una
forma alterada de estos genes, heredando la predisposición o la susceptibilidad de
padecer cáncer.
Retrovirus transformantes
Los oncogenes fueron inicialmente identificados como genes portados por un

tipo de virus cuyo material genético estaba constituido por ARN, y que eran capa-
ces de causar tumores en los organismos susceptibles a los pocos días de la infec-
ción. Por ello, recibieron el nombre de retrovirus de transformación aguda. Por el
contrario, los retrovirus de transformación crónica o débil (no defectivos) no por-
tan oncogenes. Estos virus causan tumores en tejidos específicos (tras un periodo
de latencia de muchos meses), pero por un mecanismo diferente al de los anterio-
res y, aunque pueden replicarse in vivo, no son capaces de transformar células en
cultivo. El virus del sarcoma de Rous es uno de los más representativos del grupo
de retrovirus transformantes agudos. Su genoma, además de los genes caracterís-

ticos (gag, pol y env), que porta la especie salvaje de referencia (virus de leucemia
murina), y que codifican las proteínas necesarias para la proliferación viral, con-
tiene el oncogén v-src. Este oncogén codifica una proteína tirosina quinasa res-
ponsable del sarcoma de los pollos. El oncogén v-src resulta ser la forma mutada
de un proto-oncogén homólogo, denominado c-src, presente en el genoma de la
célula huésped.
Se conocen más de 30 oncogenes responsables de causar tumores en animales
(incluido el hombre); algunos de ellos se mencionan en la Tabla 8.1. En general,
cada genoma viral porta un oncogén, aunque hay casos, como el del virus de la eri-
troblastosis aviar, que porta dos oncogenes: erb-A y erb-B.
Si los oncogenes proceden de la célula huesped, ¿cómo han sido incorporados
al genoma de los retrovirus? La información genética de los retrovirus está conte-
nida en una molécula de ARN monocatenario, por lo que la replicación del virus
pasa necesariamente por la síntesis, dentro de la célula huésped, de su ADN com-
plementario. La enzima responsable de esta síntesis se denomina transcriptasa
inversa y es una de las proteínas cuya información está contenida en el genoma
viral. Este ADN complementario viral se integra seguidamente dentro del genoma
del huésped, formando lo que se denomina un provirus.
Los retrovirus pueden transferir información genética tanto horizontalmente
como verticalmente. La transferencia horizontal se lleva a cabo durante el proceso
de infección viral y que consiste en el aumento del número de células infectadas en
un mismo huésped. La transferencia vertical tiene lugar cuando el provirus se ha
integrado en las células germinales de un organismo, pudiendo ser transmitido a la
generación siguiente como si se tratara de un locus de herencia mendeliana.
Tabla 8.1. Algunos retrovirus transformantes, tumor inducido y oncogén responsable.
Virus (nombre) Tumor inducido (especie) Oncogén
Sarcoma de Rous (RSV) sarcoma (pollo) src

Sarcomas murinos:
de Harvey (Ha-MuSV) sarcoma/eritroleucemia (rata) H-ras
de Kirsten (Ki-MuSV) sarcoma /eritroleucemia (rata) K-ras
de Moloney (Mo-MuSV) sarcoma (ratón) mos
Osteosarcoma murino
de FBJ (FBJ-MuSV) condriosarcoma (ratón) fos
Sarcoma de simio (SSV) sarcoma (mono) sis
Sarcomas felinos:
(PI-FeSV) sarcoma (gato) sis
(SM-FeSV) fibrosarcoma (gato) fms
(ST-FeSV) fibrosarcoma (gato) fes
Sarcoma de ave (ASV-17) fibrosarcoma (pollo) jun
Sarcoma de Fujinami (FuSV) sarcoma (pollo) fps
Mielocitomatosis de ave (MC29) carcinoma/sarcoma/mielocitoma (pollo) myc
Leucemia de Abelson (MuLV) linfoma de células pre-B (ratón) abl
Reticuloendoteliosis (REV-T) leucemia linfoblástica (pavo) rel
Eritroblastosis de ave (AEV) eritroleucemia/fibrosarcoma (pollo) erb-B, erb-A
Mieloblastosis de ave (AMV) leucemia mieloblástica (pollo) myb
A veces la integración del provirus se produce en un lugar cercano a un proto-

oncogén. Cuando se producen errores de transcripción, el genoma retroviral puede
llevar parte de la secuencia del proto-oncogén. En sucesivas transmisiones verticales
esta secuencia puede ir completándose, hasta que una partícula viral porte la secuen-
cia completa de exones codificados por el proto-oncogén. Si durante cualquiera de los
ciclos de reproducción del retrovirus, el proto-oncogén sufre una mutación, se for-
mará un oncogén. Este oncogén tiene la capacidad de transformar la célula huésped
dado que, expresa un producto proteico defectuoso: oncoproteína o proteína tumoral,
que interviene activamente en la regulación de la proliferación celular. ¿Para qué le
sirve al virus el oncogén? Una célula en continuo proceso de proliferación debe tener
a punto su maquinaria de replicación, transcripción y traducción. Obviamente, esta
maquinaria será utilizada por el virus. Parece claro que alguna ventaja evolutiva
obtendrá, máxime cuando la mayoría de los retrovirus transformantes han perdido
parte del gen pol —en esto el virus del sarcoma de Rous representa una excepción—,
que les impide replicarse por sí mismos. En este caso la infección va acompañada de
la cepa salvaje del virus, que actúa como ayudante de la replicación.
Los retrovirus portadores de oncogenes son capaces de transformar células en
cultivo, produciendo cambios fácilmente apreciables a tres niveles:
• Anomalías en la membrana plasmática: Incremento de las necesidades meta-
bólicas; aumento del paso de los distintos metabolitos con pérdida de especi-
ficidad de algunos transportadores; aparición de burbujas.
• Problemas de adherencia: Disminución de la adherencia al sustrato; cambio
del aspecto normal poligonal-aplastado a la forma redondeada; nueva reorga-
nización del citoesqueleto; incremento de la proteólisis extracelular.
• Anomalías en la proliferación celular: Las células crecen formando focos;
baja dependencia de los factores de crecimiento y de anclaje; proliferan inde-
finidamente y pueden causar tumores si se inyectan a animales susceptibles.
Funciones de los proto-oncogenes
En general, los proto-oncogenes codifican proteínas que están implicadas en el

control del crecimiento celular. Según sus propiedades bioquímicas y funcionales se
clasifican en los siguientes grupos:
I. Factores de crecimiento
Polipéptidos que funcionan como señales extracelulares. Estimulan la prolife-
ración de las células que disponen en su membrana plasmática de un receptor espe-
cífico para dicho factor.
II. Receptores de factores de crecimiento

Son las máquinas moleculares que transmiten información unidireccionalmen-
te a través de la membrana celular. En general, constan de tres dominios:
• Extracelular de unión al ligando.

• Transmembrana.
• Intracelular con actividad tirosina quinasa.
La fosforilación de proteínas citoplasmáticas específicas pone en marcha una
serie de eventos bioquímicos dirigidos hacia la división celular.
III. Transductores intracelulares de señal

Transmiten la señal desde la cara interna de la membrana plasmática hasta el
núcleo, mediante proteínas —generalmente fosforiladas— que interaccionan en
el citosol. Dos grupos principales:
• Proteína quinasas citosólicas (no receptores).
– Tirosina quinasas.
– Serina/Treonina quinasas.
• Proteínas de unión a GTP/con actividad GTPasa intrínsica.
– Monoméricas (ras).
– Heterotriméricas (proteínas G).
IV. Factores de transcripción

Son proteínas nucleares que regulan la expresión de los genes o familias de
genes diana. La regulación transcripcional es mediada por proteínas de unión a
secuencias de ADN específicas o motivos estructurales de ADN, usualmente loca-
lizados corriente arriba del gen diana. Los factores de transcripción son el eslabón
final en la vía de transducción de señal que convierten señales extracelulares en
cambios modulados en la expresión génica.
V. Reguladores de la muerte celular programada (proteínas

antiapoptóticas)
Los tejidos normales presentan un balance regulado entre la proliferación celu-
lar y la muerte celular programada, un componente importante en el proceso de
embriogénesis normal y desarrollo orgánico. En las células cancerosas falla también
la muerte celular programada, último recurso que dispone una célula, que presenta
una regulación descontrolada de su crecimiento, para evitar que se transforme al
fenotipo neoplásico.
VI. Proteínas que controlan el ciclo celular

Para que el ciclo celular avance, determinadas proteínas deberán ejercer sus
acciones específicas en ciertos momentos del mismo. Modificaciones en la activi-
dad de los complejos ciclina/quinasa dependiente de ciclina pueden dar lugar a un
exceso de señal de división.
Tabla 8.2. Clasificación funcional de oncogenes/proto-oncogenes.
A B C D E F G H I
c-sis c-erb-B N-ras c-src mos crk c-fos Bcl-2 PRAD1

KS/HST erb-B2,3 Ha-ras c-abl A-raf vav c-jun MDM2
wnt1 c-ms Ki-ras yes B-raf c-erbA cdk4
int2 c-kit gsp/gip fgr c-myb
ros fes c-myc
trk syn N-myc
ret c-fps L-myc
sea c-rel
met
mas
A. Factores de crecimiento; B. Receptores de Factores de crecimiento; C. Proteínas de unión a GTP; D. Tirosina

quinasas post-receptor; E. Serina/Treonina quinasas; F. Reguladores SH2/SH3; G. Factores de transcripción;
H. Reguladores de la apoptosis; I. Reguladores del ciclo celular.
Se conocen más de 100 proto-oncogenes, algunos de los cuales se presentan en

la Tabla 8.2. Mediante técnicas bioquímicas y de citogenética, la localización cro-
mosómica de muchos de ellos ya se conoce.
Activación de proto-oncogenes
Se denomina activación de proto-oncogenes al conjunto de circunstancias que

causan alteraciones en la estructura/función, o en la expresión, del producto protei-
co de un proto-oncogén. Se dice entonces que el proto-oncogén se ha convertido en
un oncogén, y por ello capaz de transformar células al fenotipo neoplásico. Puesto
que la neoplasia es un proceso en varias etapas, más de uno de estos mecanismos
deberán coincidir en una célula para que ésta contribuya en la génesis de un tumor.
Por otra parte, en la expresión completa del fenotipo neoplásico —incluyendo la
capacidad para formar metástasis—, normalmente estarán involucrados una com-
binación de proto-oncogenes activados y la pérdida o inactivación de genes supre-
sores de tumores.
Los mecanismos de activación de proto-oncogenes siguen dos modelos:
A) Modelo cualitativo. El producto proteico presenta cambios estructurales,
responsables de la alteración de su actividad biológica, sin que haya modificación
en la cantidad de proteína expresada. Tres tipos:
1. Deleción.
2. Mutación puntual.
3. Translocaciones que producen proteínas de fusión.
B) Modelo cuantitativo. El producto proteico presenta una actividad biológica

normal, pero se expresa una cantidad mucho más elevada de lo normal, o bien se
expresa en un tejido inadecuado. Tres tipos:
1. Inserción mutacional.
2. Amplificación génica.
3. Translocaciones que producen activación génica.
Estas alteraciones se producen en las células somáticas (excepcionalmente, alte-

raciones en los oncogenes RET, CDK4 y NET también pueden producirse en las
células germinales), y se transmiten a las células hijas en forma autosómica domi-
nante, mediante un mecanismo de ganancia de función.
Un ejemplo de deleción lo constituye el oncogen v-erb B, que codifica para un
receptor de EGF cuyo dominio de unión al ligando está ausente y el extremo car-
boxílico, que regula la actividad tirosina quinasa del receptor, truncado. En conse-
cuencia, el oncogén v-erb B está permanentemente activado, aun en ausencia del
factor de crecimiento.
El proto-oncogén src codifica una proteína tirosina quinasa unida a la membra-
na plasmática, cuya activación depende de la unión de un factor de crecimiento a su
receptor. La quinasa, en su forma inactiva, tiene en la posición 527 un resto de tiro-
sina fosforilada, unido a un dominio SH2 del extremo N-terminal, y otro residuo de
tirosina desfoforilado, en la posición 416, dentro del dominio catalítico. La unión
del ligando produce: la dimerización del receptor y la consiguiente autofosforila-
ción en residuos específicos de tirosina. Estas nuevas fosfotirosinas compiten por el
dominio SH2 de src, liberando la fosfotirosina 527, que inmediatamente es desfos-
forilada, a la vez que el resto de tirosina 416 es fosforilado. De este modo la quina-
sa se convierte en la forma activa.
El producto del oncogén v-src tiene sustituidos los 19 aminoácidos finales
(incluida la tyr-527) por otros 12 aminoácidos diferentes —como consecuencia de
una mutación puntual que origina un error en la lectura de los tripletes del ARN
durante la síntesis proteica, a la vez que anticipa el codón de terminación—, y la tyr-
416 está fosforilada. Esta alteración permite que la proteína src se encuentre activa
de forma constitutiva.
En la mayoría de los tumores en los que se ha aislado el oncogén ras, la altera-
ción consiste en una mutación puntual que da lugar a la sustitución de un solo ami-
noácido. La familia de proto-oncogenes ras codifican proteínas de 188-189 amino-
ácidos (en general, conocidas como p21ras). Las mutaciones normalmente se han
detectado en las posiciones 12, 13 y 61. Por ejemplo, la sustitución de la glicina-12
por cualquier otro aminoácido —excepto prolina—, o de la glutamina-61 por un
aminoácido distinto de la prolina o el ácido glutámico, da lugar a una proteína
mutante, que tiene alterada su actividad biológica.
Las proteínas ras ocupan un papel central en la transducción de señales genera-
das por factores de crecimiento, interviniendo en la cascada de activación de la
familia de proteína serina/treonina quinasas activadas por mitógenos (MAP quina-
sas) que inducen, a su vez, la fosforilación —activación— de determinados facto-
res de transcripción. Se trata de una proteína monomérica de unión a nucleótidos de
guanina con actividad GTPasa intrínsica. La proteína ras unida a GDP es inactiva,
mientras que la unida a GTP es activa. Pues bien, las proteínas ras mutantes, cuya
forma unida a GDP fuera activa o que la forma unida a GTP no pudiera desfosfori-
larse, estarían enviando al núcleo una señal continuada de proliferación y serían res-
ponsables de su acción oncogénica.
Las células tumorales suelen expresar resistencia a algunos agentes quimiotera-
peúticos mediante el mecanismo de amplificación génica. Consiste en la produc-
ción de centenares o millares de copias de un gen que codifica para una proteína que
interviene en el proceso degradativo del agente. Los cromosomas son notablemen-
te más largos, y mediante las técnicas de bandeo se aprecian segmentos cromosó-
micos que han perdido el patrón normal de alternancia de bandas claras y oscuras,
denominadas regiones homogéneamente teñidas (HSR), y cuya ruptura da lugar a
los llamados cromosomas diminutos. Uno de los genes más comúnmente afectados
por este mecanismo de amplificación es el de la dihidrofolato reductasa (DHFR). A
veces, cuando uno de estos genes se encuentra próximo a un proto-oncogén (por
ejemplo, c-myc), éste también se amplifica. En consecuencia, se produce una sobre-
expresión de la proteína Myc y un incremento en la señal de proliferación.
El mecanismo de inserción mutacional se produce cuando un retrovirus no defec-
tivo, de transformación lenta o crónica —que no porta un oncogén— integra su ADN
complementario en las proximidades de un proto-oncogén (por ejemplo, myc). Los
elementos reguladores del provirus (LTR), y no el promotor de myc, son los que diri-
gen la transcripción del mismo. De este modo, el proto-oncogén escapa a los meca-
nismos de control celular, produciéndose una sobreexpresión de la proteína Myc.
El gen myc consta de tres exones: el exón 1, no se traduce, y los exones 2 y 3
forman la proteína c-Myc. Se han descrito distintos sitios de inserción de retrovirus
en los dominios del proto-oncogén myc: 1) dentro del primer intrón; 2) dentro de
este primer intrón, pero orientado a la inversa; 3) pasado el tercer exón. En todos los
casos, la secuencia codificada por c-myc es correcta, por lo que la oncogenicidad es
atribuida a la pérdida de control normal y a la sobreexpresión del gen.
La baja probabilidad de las inserciones retrovirales en las proximidades de un
proto-oncogén, y los diferentes modos de inserción, justifican que los retrovirus no
defectivos tengan periodos de latencia muy largos, y que sus efectos transforman-
tes sean menos intensos que el de los retrovirus portadores de oncogenes.
En ocasiones, una recombinación anormal entre cromosomas puede situar a un
proto-oncogén bajo la influencia de las secuencias reguladoras de otros genes, que
tienen la propiedad de ser muy expresados en un tipo celular determinado. En estas
circunstancias se produce también una sobreexpresión del proto-oncogén, y como
consecuencia de ello, una elevación de los niveles de la proteína oncogénica que da
lugar a la aparición del fenotipo neoplásico. Este fenómeno recibe el nombre de
activación génica. Un ejemplo característico lo representa el linfoma de Burkitt, en
donde se produce una translocación entre el cromosoma que contiene al proto-
oncogén c-myc (cromosoma 8) y uno de los cromosomas que contienen los genes
que codifican para la cadena pesada y las cadenas kappa y lambda ligeras de las
inmunoglobulinas (cromosomas 14, 2 y 22); o bien otra translocación entre los cro-
mosomas 8 y 14, que sitúa al proto-oncogén c-myc próximo al gen del receptor _
de las células T (TCR_). En cualquiera de las circunstancias descritas se produce
una desregulación de la expresión del proto-oncogén c-myc, que puede dirigir hacia
la transformación neoplásica de la célula. La sobreexpresión de c-Myc impide a los
linfocitos inmaduros diferenciarse en células B y T, maduras.
Existe otro tipo de reordenamiento cromosómico en donde el punto de ruptura
se sitúa dentro del loci de dos genes. Se produce un nuevo gen, que contiene en su
extremo inicial parte de uno, y en su extremo final parte del otro. Los genes híbri-
dos de fusión codifican proteínas quiméricas de fusión con actividad transforman-
te, en la que los dos genes implicados en la fusión contribuyen al potencial trans-
formante de la oncoproteína quimérica. En consecuencia, la cantidad de proteína
expresada es normal, pero tiene la función biológica alterada. El ejemplo mejor
conocido se corresponde con la leucemia mieloide crónica (LMC), una enfermedad
que se caracteriza por la presencia en todos los pacientes del denominado cromo-
soma Filadelfia. Durante algún tiempo, se pensó que este pequeño cromosoma se
formaba como consecuencia de la transformación neoplásica de las células; hoy se
conoce bien que este cromosoma representa la causa misma de la enfermedad. La
leucemia mieloide crónica (y la leucemia linfoblástica aguda, LLA) se caracteriza
por una translocación entre los cromosomas 9 y 22, dentro de los loci del proto-
oncogén de Abelson (c-abl) y del gen bcr, respectivamente. El gen bcr codifica para
una proteína adaptadora que regula la actividad de proteína tirosina quinasas; el
proto-oncogén abl codifica para una proteína tirosina quinasa citosólica. La trans-
locación produce un gen híbrido que tiene secuencias del gen bcr, al principio, y la
secuencia que expresa el dominio catalítico del c-abl, en el extremo del gen. Este
gen híbrido se transcribe y el mensaje se traduce en una proteína de fusión (Bcr-
Abl), en la que los aminoácidos codificados por bcr activan a los aminoácidos de la
región codificada por el gen c-abl. Esta proteína híbrida tiene propiedades oncogé-
nicas, ya que pone en marcha la división celular al mantener constitutivamente acti-
va la vía de transducción de señales a través de Ras.
En general, las translocaciones cromosómicas asociadas a cánceres del ser
humano afectan mayoritariamente a las células sanguíneas. No obstante, también se
han descrito translocaciones responsables de algunos tumores sólidos.
Genes supresores de tumores (4,12,14)

Los genes cuya actividad esencial consistía en inhibir una proliferación celular
descontrolada fueron primeramente conocidos con el nombre de antioncogenes.
No obstante, esta denominación se consideró inapropiada, ya que su mecanismo de
acción molecular no consistía en oponerse a la de los oncogenes. Pronto se descu-
brió que la fusión de células malignas con células normales en cultivo producía la
supresión del fenotipo maligno en las células híbridas; por ello recibieron el nom-
bre de genes supresores de tumores. Las mutaciones en estos genes impiden que
ejerzan su función normal de control de la división celular. Por analogía con los
oncogenes, se dice entonces que han adquirido capacidad oncogénica, dada su
implicación en el desarrollo de tumores; por ello se les conoce también con el nom-
bre de oncogenes supresores. Estas mutaciones pueden producirse tanto en las célu-
las somáticas —cáncer espontáneo—, como en las células germinales —cáncer
hereditario—. También se les denomina oncogenes recesivos, dado que las muta-
ciones se transmiten en forma autosómica recesiva, mediante un mecanismo de
pérdida de función; esto es, desde el punto de vista celular, las mutaciones son
recesivas y las células heterocigóticas no desarrollan tumores. Sin embargo, estas
mutaciones son dominantes desde el punto de vista del individuo, dado que los hete-
rocigóticos suelen desarrollar la enfermedad —en realidad, lo que se hereda como
rasgo autosómico dominante es la gran predisposición a la formación de tumores—.
Esta aparente contradicción se resuelve teniendo en cuenta que sólo se necesita una
única célula tumoral, en una población de millones de células, para iniciar un tumor.
Se conocen algo más de una docena de genes supresores de tumores. Codifican
proteínas que intervienen en la transducción de señales, en la transcripción, en las
interacciones célula-célula y, sobre todo, en alguna de las etapas directamente
implicadas del ciclo celular (Tabla 8.3).
Tabla 8.3. Algunos ejemplos de genes supresores de tumores y su papel en el cáncer
Gen Función del producto génico Cáncer hereditario
RB1 Interrumpe el ciclo celular al Retinoblastoma/osteosarcoma

formar un complejo con E2F
APC Interacciona con la catenina ` Cáncer de colon familiar con
en la vía de señalización de Wnt poliposis adenomatosa
NF1 Inhibe la proteína ras Neurofibromatosis tipo 1
NF2 Enlace entre proteínas de Neurofibromatosis tipo 2
membrana y el citoesqueleto
p53 Induce parada del ciclo celular Síndrome de Li-Fraumeni
o apoptosis. Factor de transcripción
VHL Regula la elongación transcripcional Enfermedad de von-Hippel-Lindau
WT1 Factor de transcripción Tumor de Wilms
p16 Inhibidor de CDK Melanoma familiar
BRCA1 Interacciona con RAD 51 Cáncer de mama y ovario familiar
(proteína reparadora de ADN)
BRCA2 Interacciona con RAD 51 Cáncer de mama familiar
PTEN Fosfatasa Enfermedad de Cowden
AT Regula el ciclo celular en respuesta Ataxia telangiectasia
al daño en el ADN
ARF Antagoniza a mdm2 para activar p53 –
DPC4 Inhibe la división celular Cáncer de páncreas
Cd95 Responde al daño en el ADN Linfoma de timo
por rayos a
El gen Rb 9
Uno de los ejemplos más característicos que ilustran la diferencia entre genes del
cáncer hereditario y genes alterados somáticamente es el responsable del retinoblas-
toma (Rb) en humanos. Una persona que hereda una copia de un gen mutado del reti-
noblastoma ha de experimentar una segunda mutación somática, en uno o más reti-
noblastos, para desarrollar uno o más retinoblastomas. Igualmente, pueden
producirse dos mutaciones somáticas en un único retinoblasto de un feto no predis-
puesto, lo que dará lugar a un retinoblastoma esporádico. Por esta razón, todos los
pacientes con retinoblastoma hereditario presentan tumores bilaterales, mientras que
los retinoblastomas esporádicos aparecen normalmente en un solo ojo.
La eliminación de la copia normal del gen Rb, en una célula retiniana (hetero-
cigótica) que ha heredado una copia defectuosa, puede llevarse a cabo mediante
alguna de las siguientes vías: pérdida del cromosoma completo portador del gen
normal (monosomía) durante la mitosis; segregación cromosómica errónea y
duplicación del único cromosoma portador del gen anormal; recombinación mitó-
tica; conversión génica; deleción y mutación puntual del gen normal. Todas estas
situaciones llevan a la pérdida de heterocigosidad para el gen del retinoblastoma en
una célula determinada, la cual comenzará a proliferar de forma descontrolada y
constituirá el clón que posteriormente dará origen a un tumor. Además del retino-
blastoma, otros cánceres humanos también manifiestan la pérdida de heterocigo-
sidad.
El gen Rb, situado en el cromosoma 13 (13q14), codifica una proteína nuclear
(pRB, de 928 aminoácidos) que se encuentra en todos los tipos celulares, incluyen-
do tanto las células en reposo como las que se dividen muy activamente. Además,
se encuentra presente durante todas las etapas del ciclo celular, en donde funciona
sincrónicamente como un conmutador molecular, regulando el avance a través del
mismo. Si pRB está desfosforilada —activa—, durante la fase G1, forma un com-
plejo con el factor de transcripción E2F, que queda inactivo. De esta forma pRB
actúa como el freno principal del paso a la fase S, deteniendo la división celular. Por
el contrario, si pRB está fosforilada —inactiva—, el factor E2F queda libre y por
tanto activo, permitiendo la transcripción de los genes que codifican para proteínas
necesarias para que la célula avance en el ciclo celular. La fosforilación es cataliza-
da por proteínas quinasas dependientes de ciclinas (concretamente las CDK4 y
CDK6), que son activas cuando forman un complejo con las ciclinas D o E.
Si las dos copias del gen Rb desaparecen o sufren una mutación en una célula
retiniana, la proteína pRB estará ausente o defectuosa, no pudiendo, por tanto, regu-
lar la división celular. En este caso, la célula se divide continuamente, formando un
tumor. Si esta alteración se produce, por ejemplo, en hueso dará lugar a un osteo-
sarcoma.
Como pRB juega un papel esencial en la regulación del ciclo celular, cualquier
situación que la mantenga inactiva producirá los mismos efectos sobre la división
celular. Así, por ejemplo, la activación del proto-oncogén cdk4, producirá una onco-
proteína activa constitutivamente; es decir, que mantiene permanentemente fosfo-
rilada a la pRB, aun en ausencia de ciclinas, permitiendo que el ciclo celular avan-
ce. Igualmente, la inactivación de pRB por interacción con oncoproteínas virales
(antígeno T del SV 40, o la proteína E7 del virus del papiloma), permitirá que el fac-
tor de transcripción E2F esté siempre activo, enviando una señal continuada de
proliferación celular.
El gen APC
En ocasiones, la aparición de un cáncer puede deberse a la alteración de un solo

gen —caso del retinoblastoma—; sin embargo, en otras muchas, el cáncer surge
como consecuencia de múltiples eventos moleculares que producen la activación
de proto-oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores. Un buen
ejemplo lo representa el cáncer de colon familiar con poliposis adenomatosa, en
donde, al menos, tres oncogenes (K-ras, neu, myc) y cuatro genes supresores (APC,
DCC, p53, HNPCC) han sido caracterizados en algún momento del desarrollo del
tumor. Aunque para el desarrollo de tumores malignos, a partir de la mayoría de los
adenomas, sea decisiva la suma de los cambios acumulados, en este caso los fenó-
menos mutacionales suelen producirse en una determinada secuencia. Así, los ade-
nomas más precoces muestran un sólo cambio genético (APC), los intermedios lle-
van dos o tres y los más tardíos cuatro o cinco. Para la formación del carcinoma y
las posteriores metástasis, los demás cambios adicionales también tienen que pro-
ducirse.
Una alteración en el gen APC predispone significativamente al cáncer de colon,
y también está implicado en la mayoría de las manifestaciones esporádicas del
mismo. Este gen supresor de tumores, situado en el brazo largo del cromosoma 5,
funciona como principal regulador de la vía Wnt, un sistema de señalización bien
caracterizado desde el punto de vista bioquímico, que interviene en las fases del
desarrollo y embriogénesis. Codifica para una proteína que puede modular los nive-
les de `-catenina, una proteína implicada en la adhesión celular y en la formación
de complejos de transcripción. Existen cánceres de colon que presentan el gen APC
normal, pero tienen mutado el gen de la `-catenina.
El gen p53 (8)
Aproximadamente el 50 % de los cánceres humanos se caracteriza por tener for-

mas mutadas del gen supresor de tumores p53. Este gen codifica una fosfoproteína
nuclear de 390 aminoácidos, que presenta varios dominios:
• De activación de la transcripción (aminoácidos: 1-50).
• De señalización (60-90).
• De unión al ADN (100-290).
• De oligomerización (320-350).
• De unión al ADN dañado (370-390).
La forma activa de la proteína es tetramérica. Cuando se asocian determinadas

formas mutantes con la forma nativa de la proteína, el tetrámero adopta la confor-
mación mutante y es incapaz de funcionar. Por ello, aunque se considera a p53
como un gen supresor de tumores, estas mutaciones ejercen un efecto dominante
sobre la transformación celular: Mutantes dominantes negativos. Otras formas
mutantes de p53 tienen propensión a amplificar el ADN. No obstante, el 80-90 % de
las mutaciones del gen p53 son de sentido erróneo y se concentran en la región del
gen que codifica para el dominio de unión al ADN.
El gen p53 se activa en respuesta a señales de daño —por irradiación— en el
ADN. La proteína P53 actúa como un factor de transcripción que interacciona, al
menos, con otros seis genes. Si la célula se encuentra en la fase G1 del ciclo celu-
lar, P53 se une al promotor del gen p21, que codifica una proteína inhibidora de
CDK4 (p15, p16 y p27 también bloquean la activación de la proteína del retino-
blastoma —PRB—). Se detiene el ciclo celular antes de pasar a la fase S, propor-
cionando tiempo a la célula para la reparación del ADN dañado. Alternativamente,
si la célula se encuentra en la fase G2, p53 pone en marcha un programa de muerte
celular (apoptosis); esta respuesta se elige también cuando no es posible detener el
ciclo celular para reparar el ADN por estar afectada la vía del PRB. No obstante, los
mecanismos moleculares que pone en marcha p53 para optar por una vía u otra aún
no se conocen. Cuando existen mutaciones en p53, las células con el ADN dañado
no detienen el ciclo para su reparación y eluden los programas de autodestrucción,
por lo que la proliferación continuada de células con el ADN dañado puede dar
lugar a la aparición de tumores
El dominio central de unión al ADN capacita a P53 para unirse un palíndromo
de 10 pares de bases. Este dominio también es reconocido por determinadas onco-
proteínas virales. Los virus que contienen ADN se reproducen —infectan— en
células permisivas; por el contrario, cuando un virus entra en células no permisivas,
no se produce infección, sino la integración de parte o todo el ADN viral en regio-
nes al azar dentro del genoma del huésped. Por ejemplo, la transcripción y posterior
traducción de la región temprana del virus SV40, integrado en una célula huésped
da lugar a la aparición de los antígenos T/t. Estos antígenos pueden bloquear el
dominio de unión al ADN de la proteína P53, ocasionando la transformación de la
célula huésped.
Genes mutadores (6)

Se denominan genes mutadores a aquellos que codifican para un sistema de
enzimas «correctores de pruebas». Estos genes fueron primeramente estudiados en
E. coli y en levaduras, constituyendo los genes Mut HLS. También se les conoce
con el nombre de genes reparadores de los errores en el ADN. Detectan los defectos
en el apareamiento de bases causados por errores de la transcripción o por agentes
mutagénicos exógenos. Los individuos que heredan una mutación en estos genes son
constitutivamente heterocigotos, transmitiéndose mediante un mecanismo de pérdi-
da de función. La ausencia o un defecto en la actividad de los enzimas reparadores,

incrementa la tasa de mutación espontánea, lo que aumenta el riesgo de desarrollar
tumores. Los homólogos humanos de los genes mutadores fueron localizados en las
mismas regiones cromosómicas responsables del cáncer de colon hereditario sin
poliposis (HNPCC). Este síndrome de predisposición al cáncer se hereda como un
desorden autosómico dominante y constituye un ejemplo de cáncer producido por
inestabilidad genómica. La inestabilidad genómica se caracteriza por la presencia en
el genoma de microsatélites: Breves secuencias de los nucleótidos CA o CG, repeti-
das decenas o cientos de veces en un solo sitio, que se encuentran distribuidas por
millares de sitios diferentes del genoma. Se han identificado cuatro genes mutadores
implicados en este cáncer: hMSH2, hMLH1, hPMS1 y hPMS2.
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9
Apoptosis
E. Vara
Muerte celular
La muerte celular es un fenómeno fundamental de los organismos biológicos. Es
un proceso que ocurre de forma fisiológica durante la organogénesis y embriogé-
nesis y también en el «turnover» celular en el adulto, y como proceso patológico en
respuesta a distintos tipos de daño.
Hay dos tipos fundamentales de muerte celular que se conocen como necrosis y
apoptosis (1) (Fig. 9.1). El término necrosis se refiere a la muerte de la célula por un
daño severo y repentino como el debido a un trauma físico o químico y se suele
referir a un tipo de muerte accidental en el que la célula pierde rápidamente la capa-
cidad para mantener la homeostasis. En la necrosis, la membrana plasmática suele
ser el lugar principal que sufre el daño perdiendo su capacidad para regular la pre-
sión osmótica por lo que tanto la célula como los orgánulos subcelulares se rompen
esparciendo su contenido al espacio tisular adyacente, provocando así una respues-
ta inflamatoria. Los leucocitos intentan eliminar los restos de células necróticas para
tratar de reparar el daño, pero al mismo tiempo liberan mediadores proinflamatorios
que pueden lesionar el tejido normal vecino, amplificando así el daño (1).
La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso normal que contribu-
ye a la renovación tisular tanto en el desarrollo como en el estado adulto (1,2).
Durante el desarrollo, la apoptosis está implicada en diversos procesos tales
como la selección clonal negativa, remodelación de tejidos y diferenciación celular,
y se ha sugerido que este fenómeno podría jugar un papel complementario a la vez
que opuesto, a la mitosis en el mantenimiento de la homeostasis celular (3). La apop-
tosis está también implicada en procesos patológicos, tales como la muerte de célu-
las tumorales, enfermedad de injerto contra huésped, respuesta al estrés celular,
exposición a compuestos citotóxicos y puede funcionar también en la patogénesis
de algunas enfermedades degenerativas. Podríamos decir que la apoptosis es un
NECROSIS
APOPTOSIS
Fagocitosis
Figura 9.1. Muerte celular por necrosis y apoptosis.
proceso fisiológico y sutil mediante el cual la célula activa una serie de mecanismos
que desencadenan en última instancia su propia autodestrucción de una forma dis-
creta y programada. Así, la apoptosis es equivalente a un suicidio celular.
Cambios bioquímicos y estructurales

Los cambios mas característicos observados en una célula que sufre apopto-
sis (1-4) incluyen alteraciones de la membrana plasmática, condensación de la cro-
matina, reducción del tamaño celular, formación de poros en la membrana nuclear
y finalmente fragmentación de la célula en los llamados cuerpos apoptóticos, en los
que distintos componentes celulares están rodeados y sellados por una membrana
plasmática que no permite que salga nada al exterior por lo que no se provoca reac-
ción inflamatoria, a diferencia de lo que ocurría en la necrosis. Estos cuerpos apop-
tóticos son reconocidos por células fagocíticas adyacentes que se encargan de su eli-
minación (Fig. 9.1). Este proceso de eliminación por fagocitosis puede efectuarse
en etapas más tempranas del proceso apoptótico y muy frecuentemente no se llega
al último paso de fragmentación total de la célula.
También la membrana celular sufre alteraciones durante la apoptosis. Las célu-
las pierden el contacto con las células vecinas y comienzan a aparecer «ampollas»
hasta que la célula adquiere una forma característica «blebbing» previa a la forma-
ción de los cuerpos apoptóticos. Además en los primeros estadios de la apoptosis la
APOPTOSIS 117
célula pierde la asimetría de los fosfolípidos de membrana y los residuos de fosfa-

tidil serina (PS), que en una célula normal se encuentran en la cara interna de la
membrana, se reorientan hacia la superficie externa de la membrana celular.
En cuanto a la mitocondria, aunque su estructura permanece intacta, durante la
apoptosis hay una alteración del potencial de membrana debido a cambios en la dis-
tribución de H+ y otros iones a través de la membrana mitocondrial. Estos cambios
en el potencial de membrana ocurren muy tempranamente, antes de la fragmenta-
ción del ADN e incluso antes de la reorientación de los residuos de PS y parecen
estar mediados por canales transmembrana que regulan el potencial iónico de la
célula (4).
En cualquier caso, el hecho más característico de la apoptosis es la fragmenta-
ción del ADN por lo que cuando se examina por electroforesis se observa una esca-
lera de bandas múltiplos de 180-200 pares de bases. Cada cromosoma eucariótico
contiene una molécula de ADN que debido a su gran tamaño debe plegarse y com-
pactarse de forma ordenada dentro del núcleo de la célula formando complejos
compactos con proteínas, preferentemente histonas, constituyendo lo que se deno-
mina la cromatina. Las histonas son proteínas relativamente pequeñas, enriquecidas
con residuos de arginina y lisina cargados positivamente, que se agregan para for-
mar una especie de bolsas alrededor de las cuales el ADN se enrolla dando lugar a
los llamados nucleosomas que se conectan entre sí por fibras delgadas de ADN. La
longitud del ADN asociada con cada uno de los nucleosomas es de aproximada-
mente 180-200 pares de bases. Cuando se produce una respuesta apoptótica se acti-
va una endonucleasa endógena que degrada al azar al ADN que une nucleosomas
adyacentes en la fibra de cromatina ya que este ADN internucleosomal es más acce-
sible al ataque enzimático que la región nucleosomal protegida por las histonas. La
acción de la endonucleasa genera de esta forma varios fragmentos de ADN múlti-
plos de 180-200 pares de bases. La separación ulterior del ADN y la posterior elec-
troforesis en geles de agarosa del ADN aislado permite visualizar, tras tinción con
bromuro de etidio, la escalera típica de fragmentos de ADN característica de la
apoptosis (Fig. 9.2).
Genes implicados en la apoptosis

Para que el procero apoptótico se desencadene, es necesario que se activen en la
célula una serie de mecanismos que en muchos casos van a estar controlados a nivel
genético (4). Los mejores ejemplos de genes implicados en la apoptosis han sido
definidos en invertebrados, sobre todo en Caenorhabditis elegans, un nematodo en
el que se han realizado una gran parte de los estudios sobre este proceso y en el que
se identificaron genes implicados en el inicio de la apoptosis (eg-1, ces-1, ces-2), en
el proceso mismo de la apoptosis (ced-3, ced-4, ced-9), en la fagocitosis de las célu-
las apoptóticas (ced-1, ced-2, ced-5, ced-6, ced-7, ced-8, ced-10) y en la digestión
y degradación de la célula muerta (nuc-1); de todos ellos han resultado ser espe-
cialmente interesantes el ced-9 que es un supresor de la apoptosis y el ced-3 que es
Nucleosoma
Cromatina
–
180-200 bp
Dirección de migración
Digestión por
endonucleasa
Electroforesis
180-200 bp
Figura 9.2. Fragmentación del ADN en fragmentos múltiplos de 180-200 bp.
necesario para que se produzca la apoptosis. Estos genes se habían identificado en

invertebrados, pero la apoptosis es un proceso conservado a lo largo de la evolu-
ción. Esta sugerencia de conservación evolutiva fue sugerida por la confluencia de
estudios genéticos realizados en nematodos y en células tumorales.
Tres tipos de proteínas (Tabla 9.1) parecen ser críticos en esta vía tan conser-
vada:
a) Proteínas reguladoras. Pueden promover o reprimir la apoptosis.
b) Adaptadores. Interaccionan tanto con los reguladores como con los efecto-
res. En ausencia de factores tróficos promueven la activación de los factores.
Tabla 9.1. Tipos de proteínas implicadas en la apoptosis
Reguladores Adaptadores Efectores
C. Elegans Ced-9 Ced-4 Ced-3 A Muerte celular

Vertebrados Bcl-2 Apaf-1 Casp9 A Casp3 A Muerte celular
APOPTOSIS 119
Tabla 9.2. Inductores de apoptosis
Activadores Inductores Agentes asociados Toxinas

fisiológicos de daño a terapias
Proteínas de la familia Células T citotóxicas Quimioterapia Etanol

del TNF (TNF, Fas L) p53 Radiación Y
Ausencia de factores Radicales libres Radiación UV
de crecimiento de oxígeno
Glucocorticoides
c) Efectores. Son una familia de cistein proteasas cuya activación conduce a la

degradación de varios sustratos celulares y finalmente a la muerte celular.
El control de la apoptosis implica diferentes mecanismos y/o factores que indu-
cen o reprimen la apoptosis. El balance entre inductores (Tabla 9.2) e inhibidores
(Tabla 9.3) va a determinar si la célula vive o muere.
En muchos casos la apoptosis es iniciada por la unión de un ligando a un recep-
tor específico y han sido descrita una familia de receptores que puede disparar espe-
cíficamente la apoptosis. Estos receptores, «death receptors» (4,5), se caracterizan por
poseer dominios extracelulares ricos en cisteína, y un dominio intracelular que aco-
pla los receptores a la maquinaria inductora de apoptosis. Miembros de esta fami-
lia incluyen el CD95 (Apo 1 o Fas), TNF-R1, FADD (Fas activating death domain),
TRADD (TNF-R1 asociated death domain) y RIP (receptor interacting protein). De
todos ellos el mejor caracterizado es el Fas. Todos ellos poseen una región homó-
loga de 70 aminoácidos (death domain) necesaria para la transmisión de la señal de
muerte y que está muy conservada filogenéticamente. Los ligandos que se unen a
estos receptores (oncogene related products) también presentan estructuras homó-
logas, lo que se refleja en mecanismos similares de reconocimiento del receptor e
iniciación de la respuesta. Estos ligandos (excepto el Lt_) son sintetizados como
proteínas transmembrana, a partir de las cuales se puede generar una forma soluble
por acción de metaloproteasas. El papel de estas formas solubles no está claro y
aunque en algunos casos se ha reportado actividad para estas formas solubles, otros
autores piensan que solo es capaz de inducir apoptosis la forma unida a membrana.
In vivo, la activación de los «death receptor» es controlada en muchos casos por la
expresión «de novo» de sus respectivos ligandos.
Tabla 9.3. Inhibidores de apoptosis
Inhibidores fisiológicos Agentes virales Otros
Factores de crecimiento Adenovirus Ciertos agentes farmacológicos

Proteínas reguladoras
Andrógenos
Estrógenos
bcl-2
Acoplamiento entre estímulo y apoptosis

Aunque en el acoplamiento entre estímulo y el proceso final de apoptosis van a
estar implicadas diferentes señales, en la mayor parte de los sistemas apoptóticos
está implicada una actividad proteolítica. Se puede considerar la proteólisis como
un fenómeno común en todos los procesos apoptóticos, con diferentes proteasas
implicadas y distintas proteínas como diana de esta actividad proteolítica.
Los candidatos mas importantes como mediadores finales de la apoptosis son las
caspasas (4,6). Las caspasas son una familia de cistein proteasas de las que se cono-
cen al menos 14 homólogos aunque no todos han sido asociados a la apoptosis.
Los genes codificantes de caspasas codifican proenzimas que requieren una rup-
tura proteolítica para su activación. Las caspasas pueden propagar la señal apoptó-
tica rompiendo/activando otras caspasas o pueden intervenir en el proceso final
rompiendo sustratos (6). Por ejemplo, la caspasa 8 activa a la caspasa 3, mientras que
ésta actúa sobre proteínas diana específicas como poly-ADP polimerasa, laminina,
actina, quinasa dependiente de ADN, etc.
En mamíferos (7), la vía más importante de iniciación de la apoptosis es vía Fas
(Fig. 9.3), que es un receptor de superficie relacionado con el receptor de TNF (su
ligando el Fas L está relacionado con el TNF).
La unión de un ligando al receptor inicia la activación de una proteasa lo que
conduce a la liberación de citocromo c de la mitocondria lo que a su vez activa a
otras proteasas, siendo el resultado final la destrucción de las estructuras celulares.
El TNF-R está unido a una proteína llamada TRADD (TNF-R asociated death
domain) que a su vez se encuentra unido a FADD (Fas activating death domain)
mientras que el receptor Fas se encuentra unido a FADD. En ambos casos FADD se
une a la caspasa 8 (FLICE), la cual tiene un dominio de muerte, «death domain» y
una actividad catalítica proteasa que inicia un camino común. La caspasa 8 hidroli-
za a la proteína Bid liberando el extremo C-terminal que se transloca a la membra-
na mitocondrial e induce la liberación del citocromo c. El citocromo c induce la
interacción de una proteína, Apaf 1, con la procaspasa 9; esto causa una autohidró-
lisis que activa a la caspasa 9 que a su vez hidroliza a la procaspasa 3 para dar lugar
a la caspasa 3 activa (7) (Fig. 9.4).
La caspasa 3 puede ser considerada el efector de la vía y es la que va a actuar
sobre los sustratos diana, lo que implica hidrólisis de proteínas y ADN. La frag-
mentación del ADN implica la hidrólisis por parte de la caspasa 3 de una subunidad
del dímero DFF (ADN fragmentation factor). La otra subunidad activa a una nu-
cleasa que degrada ADN (6).
El camino descrito es la vía que podríamos llamar prototípica, pero el Fas tam-
bién puede activar la apoptosis por un camino que implica una quinasa, la JNK qui-
nasa, cuyo sustrato predominante es el factor de transcripción c-jun. Esto conduce,
por mecanismos no bien conocidos, a la activación de proteasas (Fig. 9.4). En este
camino juega un papel importante como mediador la proteína Daxx que reconoce en
FADD un sitio diferente a Fas por lo que ambos caminos pueden funcionar inde-
pendientemente. Es probable que la activación de Fas active ambas vías de apopto-
APOPTOSIS 121
TNF-R1
Fas/TNF-R1
FADD
Caspasa-8
Bid
Anti-apoptosis
Bcl-2
Mitocondria
Caspasa-9
Apaf-1
Caspasa-3
DFF
Degradación de Daño de
proteínas membranas
Ruptura del ADN
Figura 9.3. Camino clásico de iniciación de la apoptosis mediada por Fas.
sis y la importancia relativa de ambos caminos puede variar dependiendo del tipo
de célula y/o la señal que reciba.
La liberación de citocromo c es un punto importante de control de la apopto-
sis (7,8). A este nivel parecen jugar un papel regulador importante una serie de pro-
teínas de la familia bcl 2, entre las que se incluyen bcl 2, que tiene un papel regu-
lador antiapoptótico y bid que ya hemos visto que favorecía la apoptosis. Otros
miembros de la familia bcl 2 pueden jugar un papel importante en la regulación
de la apoptosis favoreciéndola (bclxs, bax) o inhibiéndola (bclxL). Estas proteínas
de la familia bcl 2 pueden estar en forma de homodímeros o heterodímeros y pare-
ce necesaria la formación del homodímero bcl2/bcl2 para que pueda ejercer su
papel protector, mientras que los heterodímeros bcl2/bax o bcl2/bclxs no protegen.
Se puede concluir que las diferentes asociaciones entre miembros de la familia
pueden producir dímeros con diferentes efectos en la apoptosis y que la expresión
relativa entre los diferentes miembros de la familia puede ser importante. La sus-
Fas/TNF-R1
Daxx
JNK
C-Jun
C-Jun
Caspasas
APOPTOSIS
Figura 9.4. Apoptosis, vía Fas, mediada por JNK quinasa.
ceptibilidad de una célula a la apoptosis parece ser proporcional a la relación entre

ellos.
Un hecho importante es que todas las proteínas de esta familia parecen actuar a
nivel de la membrana mitocondrial, así por ejemplo, Bid favorece la liberación de
citocromo c y bcl2 la inhibe; bax probablemente está implicado en los cambios de
potencial de membrana.
Se ha sugerido (8) que el papel inhibidor de los factores de crecimiento sobre la
apoptosis se deba a la inhibición de estos reguladores proapoptóticos. En presencia
de factores tróficos (por ejemplo NGF que protege a las neuronas de la muerte celu-
lar) se estimula la PI3 quinasa que a su vez activa la AKT-quinasa que fosforila a
Bad. Bad cuando está fosforilado forma un complejo con la proteína 14-3-3 y per-
manece en el citosol formando un complejo antiapoptótico que puede inhibir a Bax
previniendo la liberación de citocromo c y la activación de la cascada de caspasas.
En ausencia de factores tróficos, no se activan las quinasas, Bad no se fosforila
y se une a las proteínas antiapoptóticas impidiendo que inhiban a Bax. Bax forma
APOPTOSIS 123
canales que permite el flujo de iones lo que implica la liberación de citocromo c y

activación de las caspasas.
Otro posible camino (9) apoptótico es el disparado por los linfocitos T citotóxi-
cos, los cuales matan a las células diana por un proceso que implica la liberación de
gránulos conteniendo serin proteasas y otros componentes líticos como perforina y
granzimas. La granzima B puede iniciar algunos de los hechos característicos de la
apoptosis incluyendo la activación de caspasas y fragmentación del ADN.
Papel del p53 en la apoptosis

El p53 (10) es una proteína que se une al ADN y que normalmente se encuentra
en forma de tetrámero. Puede actuar como activador transcripcional de una serie de
genes diana, pero también puede tener un papel como represor transcripcional, pro-
bablemente por interacción con factores de la transcripción. Además puede interac-
cionar con otras proteínas celulares y él mismo es molécula diana para ciertas pro-
teínas virales.
Su papel esencial es la prevención de la proliferación de células portadoras de
mutaciones. En una célula normal los niveles de p53 son bajos; en respuesta al
estrés genotóxico el p53 se activa (y esto implica también un aumento de sus nive-
les) y dos tipos de acontecimientos son iniciados como consecuencia de esta acti-
vación: Parada del crecimiento celular y apoptosis.
El p53 bloquea el ciclo celular tempranamente (fase G1) lo que permite la repa-
ración del ADN dañado antes de entrar en la fase S; en este aspecto, parece que el
p53 podría intervenir directamente en la reparación del ADN y/o probablemente
activar enzimas reparadoras. Si una célula está en fase de división, entonces el p53
inicia un programa de muerte celular.
En resumen, cuando una célula normal sufre una lesión en su ADN tiene la posi-
bilidad de dos respuestas, detener el ciclo celular o bien seguir la apoptosis. La deci-
sión de seguir una respuesta u otra dependerá en primer lugar del ciclo en el que se
encuentre la célula, pero también depende del tipo de célula y de factores extrínse-
cos medioambientales (2,11-13).
Los desencadenantes de la apoptosis dependiente de p53 incluyen, además de
las lesiones del ADN, la activación inapropiada de oncogenes, citoquinas, hipoxia
o el shock térmico.
Los mecanismos moleculares por los que actúa el p53 no son totalmente cono-
cidos, pero parece que es necesaria la transcripción de Bax, que cuando supera los
niveles de bcl2 induce la apoptosis (10).
La apoptosis dependiente de p53, inducida por lesiones en el ADN, es crítica en
el embrión para evitar la teratogénesis radio-inducida y en la supresión de carcino-
génesis en especial en los tejidos hematopoyético y linfático. La apoptosis depen-
diente de p53 que se produce en respuesta a una proliferación inadecuada inhibe la
carcinogénesis en un estadio precoz al destruir células potencialmente neoplási-
cas (10).
Papel de la apoptosis en los procesos fisiopatológicos

El hecho de encontrar que el p53 y otros protooncogenes están implicados en la
regulación de la apoptosis de las células neoplásicas ha sido un hallazgo importan-
te en el campo de la oncología, ya que el proceso apoptótico parece estar relacio-
nado con la progresión tumoral y con la respuesta de las células tumorales a los
diferentes tratamientos. Se puede destacar el caso de los adenocarcinomas gástricos
y sobre todo colorectales en los que la progresión tumoral está directamente rela-
cionada con la apoptosis, cuya determinación en el laboratorio podría incluso ser-
vir para la clasificación y seguimiento post-quirúrgico de estos tumores (14).
Pero además del cáncer cada vez es más evidente que la apoptosis puede jugar
un papel importante en la patogénesis de un gran número de enfermedades. En este
aspecto hay que considerar dos tipos de alteraciones, las asociadas al incremento de
apoptosis (14,15) o sea, con un aumento de muerte celular, y aquellas asociadas a una
disminución de la apoptosis (15-18), lo que resulta en una supervivencia prolongada.
Entre las enfermedades asociadas a la inhibición de la apoptosis se encuentran
varios tipos de neoplasia, como los tumores dependientes de hormonas, cáncer de
próstata, de ovario o de mama; carcinomas que expresan mutaciones en el p53, lin-
fomas foliculares, algunas enfermedades autoinmunes y algunas enfermedades vira-
les.
Otras enfermedades o situaciones se asocian con un incremento de la apoptosis,
entre ellas el SIDA, algunas enfermedades degenerativas (Alzheimer, Parkinson),
síndromes mielodisplásicos (anemia aplásica), lesiones isquémicas (infarto de mio-
cardio o síndrome de isquemia-reperfusión), enfermedades hepatotóxicas (alcoho-
lismo) y enfermedades autoinmunes (diabetes).
Modulación de la apoptosis por óxido nítrico

Se acepta generalmente que el óxido nítrico (NO), y sus productos de reacción,
pueden tanto prevenir como inducir apoptosis. El NO podría ser uno de los factores
responsables del daño celular en respuesta a diferentes situaciones patológica y
recientemente, ha sido sugerido para el NO un papel como modulador de la apop-
tosis (19), aunque sin embargo su papel no ha sido completamente aclarado y se han
descrito tanto efectos proapoptóticos como antiapoptóticos para esta molécula.
El NO es una molécula de vida media corta sintetizada a partir de L-arginina por
acción de las NO sintasas. Estos enzimas son expresados en microorganismos, plan-
tas y mamíferos y participan en diferentes funciones fisiológicas incluyendo la neu-
rotransmisión, regulación del tono vascular, comunicación celular, inflamación y
respuesta inmune. En mamíferos se expresan tres isoformas distintas de nitrato sin-
tasa, la nNOS (neuronal tipo 1) y eNOS (endotelial tipo 3) que son constitutivas y
se regulan predominantemente a nivel postranscripcional, y una isoforma inducible
iNOS (tipo 2) que puede ser inducida en respuesta a varios estímulos. Las formas
constitutivas son importantes en los procesos fisiológicos, mientras que el NO gene-
APOPTOSIS 125
rado por la iNOS funciona tanto como regulador como efector en los procesos de
infección e inflamación. Dentro de las funciones efectoras se incluiría la citotoxici-
dad frente a células tumorales, microorganismos y células huésped. La capacidad
citotóxica del NO resulta de la capacidad de interacción del NO con el ión superó-
xido para formar peroxinitrito que es un potente antioxidante.
Efectos proapoptóticos del NO

La capacidad del NO para inducir apoptosis fue descrita por Albina et al. en
1993 (20), que observó que el NO inducia apoptosis en macrófagos; posteriormente
se describieron efectos proapoptóticos para el NO en otros tipos celulares. La sen-
sibilidad al NO depende del tipo de célula. Entre las células que muestran mayor
sensibilidad se incluyen, además de los macrófagos (20), las células ` de los islotes
pancreáticos (21), timocitos (22) y ciertas neuronas (23).
Los efectos proapoptóticos del NO parecen ser independientes de la acumula-
ción de cGMP, aunque también han sido descritos efectos apoptóticos para el NO
vía activación de la guanilato ciclasa soluble (24), probablemente mediados por una
protein quinasa dependiente de cGMP.
Aunque los factores que determinan la sensibilidad de los distintos tipos celula-
res al NO no están totalmente dilucidados, la inducción de apoptosis por NO puede
ser el resultado del daño al DNA lo que resultaría en un aumento de los niveles
de p53 que, ya se ha dicho, es un indicador primario y esencial de la inducción de
apoptosis (25). En cualquier caso, la inducción de apoptosis por NO requiere la expo-
sición a niveles altos de NO. Tales niveles tóxicos de NO podrían ser poco impor-
tantes en condiciones fisiológicas, pero se pueden encontrar en ciertas alteraciones
patológicas como la sépsis. Es posible además que esta acción del NO rompiendo
el DNA pueda estar mediada por la formación del radical peroxinitrito (25).
Efectos antiapoptóticos del NO

Han sido descritas también la inhibición de la apoptosis por NO en otros tipos
celulares. El NO puede suprimir la apoptosis por dos mecanismos diferentes. A tra-
vés de la activación de la guanilato ciclasa soluble con el consiguiente aumento de
los niveles de cGMP que interrumpe las señales apoptóticas en algunos tipos celu-
lares, incluyendo hepatocitos (26) y esplecnocitos (27). El aumento de los niveles
intracelulares de cGMP disminuye la concentración de Ca2+ que es una de las lla-
ves señalizadoras de la apoptosis. En este caso, el mecanismo propuesto también
(como en las acciones proapoptóticas) implica la activación de una proteína qui-
nasa dependiente de cGMP. Esta proteína quinasa podría participar en la inhibición
de las caspasas lo que a su vez podría limitar la degradación de bcl2. El NO tam-
bién puede inhibir las caspasas directamente. A través de estos mecanismos, el NO
puede prevenir la degradación de bcl2 y la liberación de citocromo c de la mito-

condrias (27).
La decisión de que una célula sufra o no apoptosis depende del balance entre las
fuerzas proapoptóticas y antiapoptóticas. El NO parece contribuir de forma impor-
tante a este balance suprimiendo el camino apoptótico a diferentes niveles; la inhi-
bición de las caspasas por nitrosilación es el mejor conocido. Sin embargo, niveles
muy altos de NO podrían inclinar la balanza en el sentido de la apoptosis. Además,
la presencia del ión superóxido podría dirigir el papel del NO en el sentido apoptó-
tico debido a la formación de peroxinitrito.
Resumen
La apoptosis es una forma fisiológica de muerte celular. Sus causas y mecanis-
mos de ejecución todavía no son totalmente conocidos y diferentes mediadores,
entre ellos NO, estrés oxidativo, Ca2+, proteasas, nucleasas y alteraciones en la
mitocondria, han sido implicados. Por otra parte, dado que la apoptosis es un pro-
ceso altamente regulado e implica la actividad de enzimas hidrolíticos, condensa-
ción de la cromatina y formación de vesículas apoptóticas, es probable que sea un
proceso altamente dependiente de energía (28). Alteraciones en los niveles energéti-
cos de la célula (ATP) podrían ser un factor determinante en la decisión de muerte
celular por apoptosis o necrosis.
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10
Terapia génica en células somáticas
J. P. García-Ruíz
Introducción
La terapia génica tiene como objetivo corregir enfermedades mediante la inser-
ción de un gen funcional en células somáticas. En teoría todas las enfermedades
hereditarias como la inmunodeficiencia severa combinada (SCID), la fibrosis quís-
tica, la enfermedad de Huntington, la anemia falciforme o enfermedades adquiridas
durante la vida de un individuo, como el cáncer o el SIDA, podrían ser tratadas
mediante terapia génica. Este sueño, que nació hace 25 años, no es una ilusión sino
algo muy complejo que requiere la cooperación y los avances científicos de las dis-
tintas áreas de las Ciencias de la Salud, tales como Biología Molecular, Genética,
Virología, Endocrinología Molecular, Inmunología, etc. La terapia génica ha resul-
tado ser mucho más compleja de lo que se podía prever por ignorar aspectos bási-
cos y tan importantes como la toxicidad que representa la expresión de un transgén
en un sitio inadecuado, o la respuesta inmunológica de algunos de los vectores usa-
dos para insertar el transgén. En este sentido, Alain Fisher comenta en un artículo
reciente sobre lo «naïve que resultan hoy los primeros intentos de terapia génica sin
tener presente el bagaje de los conocimientos actuales» (1).
El análisis genético y el uso de técnicas de ADN recombinante han permitido el
aislamiento y caracterización de gran número de genes, así como la caracterización
de aquellos cuyo defecto es causa de enfermedades hereditarias en humanos. Tanto
las enfermedades causadas por una alteración en un único gen, o monogénicas,
como las debidas a fallos en varios genes, o multigénicas, tienen interés en terapia
génica. Sin embargo, las enfermedades monogénicas son los objetivos prioritarios
y en ellas es donde se han obtenido los primeros logros terapéuticos.
La terapia génica requiere de la inserción de un gen correcto en una célula somá-
tica específica y que éste se exprese adecuadamente durante toda la vida del indivi-
duo. Con objeto de entender la complejidad del abordaje de este tipo de terapia y los
logros conseguidos, resulta necesario recordar algunos conceptos, como qué es un

gen y cómo se transcribe, los vectores virales que ofrecen más ventajas en la trans-
ferencia génica y cómo se obtienen y cultivan las células somáticas objetivo de la
transferencia génica.
Elementos de los genes eucarióticos

Un gen puede ser definido como la secuencia de nucleótidos necesaria para la
síntesis de una proteína funcional y está compuesto por la secuencia de nucleótidos
que codifica para la proteína (secuencia codificante) y por secuencias de nucleóti-
dos no codificantes de proteína pero absolutamente necesarias para la correcta
transcripción del gen. Los genes humanos son monocistrónicos y contienen la
secuencia nucleotídica que los codifica distribuida en un número variable de exo-
nes. Las secuencias no codificantes de proteína se encuentran localizadas entre los
exones, intrones, y en ambos extremos del gen. En el extremo 5´ del inicio de la
transcripción de los genes, se encuentran las regiones reguladoras de la transcrip-
ción, conocidas como enhancers o potenciadores distribuidas a una distancia varia-
ble que puede llegar a ser de 50 Kb o mayor. Las otras secuencias no codificantes
de proteínas, que igualmente son críticas en la transcripción correcta de un gen, son
las señales de corte y poliadenilación localizadas en el extremo 3´ del gen y las
secuencias que intervienen en el splicing o ayuste de los transcritos primarios.
La complejidad de los genes es variable. Los hay que producen un solo tipo de
transcrito que codifica para una proteína (unidades de transcripción simple), y otros
cuya transcripción es compleja. Estos últimos son genes que tienen varios sitios de
iniciación de la transcripción regulados por distintos elementos y/o que cuyos trans-
critos primarios pueden ser procesados mediante diferentes pasos. A modo de ejem-
plo sirve la transcripción del gen del receptor de la hormona prolactina. La trans-
cripción del único gen del receptor puede ser regulada desde tres regiones diferentes
localizadas en el extremo 5´ del gen y, además, presenta una transcripción alterna-
tiva de exones que da lugar a varias moléculas de ARNm, cuya composición es par-
cialmente distinta, y que son traducidas en las conocidas isoformas del receptor de
prolactina (2). Cualquier mutación en la secuencia nucleotídica de los exones, intro-
nes o regiones reguladoras de un gen puede ocasionar alteraciones en la expresión
de una proteína. Con este concepto de gen es fácil darse cuenta de la cantidad de tra-
bajo pendiente de realizar para conocer todos los genes humanos.
Inicio de la transcripción de un gen codificante

para una proteína
Los factores que determinan que los genes codificantes de proteínas en los orga-
nismos pluricelulares tengan una velocidad de transcripción específica de tejido son
muchos, incluyendo las decisiones tomadas por las células durante el desarrollo
TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTICAS 131
Estado celular Ligandos

y desarrollo neuroendocrinos/receptores
Conformación y
accesibilidad
del DNA
Segundos mensajeros
ARN polimerasa II
Factores de transcripción
Activadores e inhibidores
5’ TATA 3’
Promotor distal Promotor proximal Iniciación Elongación Terminación
Figura 10.1. Esquema de los factores implicados en la transcripción de un gen.
(Fig. 10.1). La enzima que cataliza esta reacción es la ARN polimerasa II (3). Esta
proteína reconoce una secuencia o «caja» TATA presente en el extremo 5´ no codi-
ficante del gen y hace que la ARN polimerasa II se asocie a la secuencia existente
entre –35 y –10 del codón de iniciación. La región, que ocupa aproximadamente
200 pb anteriores al sitio de iniciación de la transcripción, constituye la región pro-
motora donde existen secuencias consenso para la unión de distintos factores de
transcripción. Hay genes que tienen otra región promotora más alejada del inicio de
la transcripción llamada promotor distal. La transcripción de un gen, así como la
activación como la represión, es consecuencia de la unión de los factores de trans-
cripción a sus sitios consenso, la adecuada activación de éstos y de la cooperación
de interacciones entre los factores de transcripción y el complejo de iniciación de la
transcripción (4). Este proceso es más complejo en algunos genes ya que pueden uti-
lizar promotores alternativos. Los factores neuro-endocrinos y citoquinas regulan la
expresión génica mediante la unión a sus respectivos receptores y la activación de
las cascadas de reacciones celulares que modulan la expresión de los factores de
transcripción y/o el estado de activación de éstos.
Los genes que codifican proteínas suponen únicamente el 5 % del genoma
humano. La accesibilidad de un gen dentro de la estructura de la cromatina a los fac-
tores proteicos implicados en la regulación del inicio de la transcripción es crítica
en la expresión de éste. La estructura de la cromatina es muy compacta. La doble
cadena de ADN se dispone alrededor de un octámero de proteínas, denominadas
histonas, constituyendo la unidad estructural de la cromatina: el nucleosoma. Una
secuencia de seis nucleosomas espaciados por regiones que asocian a la Histona
tipo 1, His1, forma un selenoide donde las His1 quedan en el interior de una estruc-
tura muy compacta. El grado de condensación de la cromatina se regula por la ace-
tilación de la región amino-terminal de la His1. Cuando la cromatina está conden-
sada, los factores de transcripción no pueden acceder a las regiones reguladoras de

muchos genes (5). Este hecho, entre otros factores, supone que la expresión de algu-
nos genes sea específica de tejido.
Transferencia de un gen a una célula somática

La transferencia de un gen a una célula es un proceso que tiene lugar normal-
mente ex vivo, es decir, en células explantadas de un paciente, las cuales, una vez
modificadas genéticamente, seleccionadas y expandidas in vitro son reimplantadas
en el mismo paciente (6,7). Existen muchos métodos para la introducción de material
genético en células en cultivo, cuya eficacia es variable en función del tipo de célu-
la. La manera más eficaz de transferir un gen a células somáticas es con la ayuda de
vectores derivados de virus. Existen vectores virales derivados de los Retrovirus,
Adenovirus, Herpesvirus y Parvovirus, tales como el virus asociado a Adenovirus
(AAV) entre otros. Todos los vectores conservan la capacidad de infectar células y
son manipulados genéticamente para que transporten el gen objeto de la terapia. De
todos los posibles vectores virales, los más idóneos son aquellos cuyo ciclo bioló-
gico comprende una fase de integración en el ADN genómico teniendo menor inte-
rés aquellos que se mantienen como elementos episomales o aquellos que activan
una respuesta inmunológica del huésped.
Vectores derivados de oncorretrovirus

Los vectores más utilizados en terapia génica son los derivados de los
Oncorretrovirus, concretamente los derivados del virus de la leucemia murina
(MoMLV) (8). Las partículas del MoMLV están formadas por dos moléculas idénti-
cas de ARN, y las enzimas que requiere el virus para su replicación rodeadas por la
nucleocápsida y por la envoltura viral. Esta última se compone de una glicoproteí-
na viral y fracción de membrana perteneciente a la célula huésped donde se replicó
el virus. La molécula del ARN viral presenta en la mitad dos fases abiertas de lec-
tura (ORF) (Fig. 10.2). La primera ORF corresponde a dos genes en tándem: gag-
pol, que codifican para una poliproteína precursora de la proteína de la nucleocáp-
sida (GAG), la transcriptasa inversa (RT) y de la integrasa (IN). La segunda ORF
constituye el gen env que codifica las proteínas de la envuelta viral (ENV) y es res-
ponsable del reconocimiento de los receptores de la célula en el proceso de infec-
ción, denominado tropismo viral. En el extremo 5´ contiene varias regiones no
codificantes: R, que se repite en sentido directo en el extremo 3´; U5, que contiene
la señal de poliadenilación del ARN; PBS, lugar donde hibrida un ARNt cebador
usado en la actividad RT; SD, secuencia donadora de splicing, y s, necesaria para
la encapsidación del ARN en las partículas virales. En el extremo 3´ tiene secuen-
cias no codificantes, como PPT (Poly Purina Track) necesarias para la síntesis de la
segunda cadena de ADN viral, y la U3, que corresponde al promotor viral.
A
gag-pol
R U5 PBS ^ PPT U3 R
env
SD SA
gag pol
LTR LTR
env
Figura 10.2. Esquema de la molécula ARN del virus de la leucemia murina (A). Esquema del
ADN viral correspondiente al virus citado (B).
El ciclo de replicación de un retrovirus se muestra en el esquema de la Figu-

ra 10.3. La infección viral empieza cuando la glicoproteína de la envoltura viral
interacciona con los receptores presentes en las células suceptibles de la infección,
fusionándose los componentes de membrana de la envoltura viral y de la célula. El
ARN es transcrito por las moléculas de RT dando lugar sucesivamente a una cade-
na de ADNc y al ADN viral de doble cadena. El ADN es transportado al núcleo en
forma de un complejo con las proteínas, ING, GAG y otras, llamado complejo de
pre-integración (PIC). El PIC es de gran tamaño molecular por lo que la entrada al
núcleo se logra cuando la célula está en mitosis. El provirus es integrado en el ADN
cromosómico en sitios no predeterminados de éste y es catalizado por la actividad
integrasa viral que elimina dos nucleótidos de ambas LTR (Long Terminal Repeat)
y corta el ADN cromosómico.
Los vectores derivados de MoMLV, y en general de los retrovirus, son virus
que han sido modificados para que pierdan su capacidad de propagación (8).
Mediante ingeniería genética se retiran los genes virales gag-pol y env y se intro-
duce el gen de interés terapéutico (Fig. 10.4). La propagación de los vectores en
células se puede conseguir suministrando los productos de los genes gag-pol y env
de diversas maneras: mediante el uso de virus auxiliares; cotransfectando con vec-
tores de expresión que codifican para los genes gag-pol y env; o usando células
empaquetadoras. Las células empaquetadoras son células modificadas para expre-
sar constitutivamente los genes correspondientes a las proteínas virales antes men-
cionadas y así obtener las denominadas partículas transferentes de los genes tera-
péuticos (Fig. 10.5). Se dispone de muchos tipos de células empaquetadoras, ya
que el gen env, responsable del tropismo, puede ser modificado. Por ejemplo, sus-
Virus infectivo
Transcripción
reversa Producción de
proteínas virales
ADN viral
Integración
ARN viral
Encapsidación
del ARN viral
ADN Provirus ADN
celular celular
núcleo
citoplasma
Liberación de
partículas virales
Figura 10.3. Esquema mostrando el ciclo de replicación de un retrovirus.
tituyendo parte del gen env por el gen de la hormona eritropoyetina, se obtienen
partículas transferentes que reconocen las células que expresan el receptor de esta
hormona.
Vectores derivados de los lentivirus

Otros vectores retrovirales con gran futuro son los generados a partir de los len-
tivirus. Éstos tienen, tanto el genoma, como el ciclo de replicación, más complejo
Sitio de
Sitio de integración
integración
PPT
PBS SD ^
LTR TRANSGÉN LTR
Inicio de la Término de la
transcripción transcripción
Figura 10.4. Esquema de una partícula transferente de un transgén derivada de un retrovirus.

Vector con el
transgén
Producción de
proteínas virales
Encapsidación
del vector
transgén
gag-pol env
núcleo
citoplasma
Liberación de
partículas transferentes
del transgén
Figura 10.5. Esquema mostrando la producción de partículas transferentes en una célula empa-
quetadora.
que los oncorretrovirus. Sin embargo, los lentivirus, en término de aplicabilidad

clínica, además de incorporarse al genoma, infectan células que no están en divi-
sión (9,10). Los vectores más estudiados son los derivados del virus de la inmunode-
ficiencia humana HIV-1 (Fig. 10.6). En el genoma del HIV-1 hay genes accesorios
que juegan un papel importante en el ciclo de replicación, como tat, rev y vpr. La
proteína TAT activa el promotor HIVLTR, y la REV junto a la VPR intervienen en
el transporte del ADN viral al núcleo. El complejo de preintegración (PIC) de los
lentivirus tiene asociadas varias proteínas, entre ellas la proteína VPR capaz de
unirse al poro nuclear, mientras que la integrasa y la proteína de la matriz (GAG)
tienen dominios que actúan de chaperonas del complejo facilitando su transporte al
tat
rev
pol rev
LTR LTR
gag vif
nev
vpr vpr
Figura 10.6. Esquema del genoma de de HIV-1.

núcleo. Recientemente se ha demostrado que la secuencia PPT juega un papel

importante en el transporte del PIC al núcleo (11). Esta secuencia interviene en la
generación de una triple hélice de ADN importante en la estructura del complejo
PIC. La generación de la triple hélice se produce mediante el siguiente proceso
(Fig. 10.7). La transcripción inversa que sufren las dos copias del ARN presentes en
la partícula viral, empieza con la síntesis de la hebra (-). La síntesis de la hebra (+)
es discontinua y los segmentos a la derecha e izquierda se sintetizan indepen-
dientemente. Desde el PPT se inicia uno de estos segmentos (+) que cuando se une
al segmento generado en dirección contraria, da lugar a un segmento solapante de
99 nucleótidos conocido como flap. La triple cadena así generada es importante en
la estructura del complejo PIC para que sea transportado al núcleo, como ha sido
demostrado con mutantes de la región PPT.
Transcriptasa inversa
ADNc viral
PPT
Hebra –
Hebras +
Complejo de pre-integración
Poro nuclear
Figura 10.7. Esquema que muestra la formación del complejo de preintegración de un lentivi-
rus y su entrada por el poro nuclear de la célula infectada.
La mayoría de los vectores lentivirales derivan del HIV-1 (9,10). También hay vec-
tores derivados del HIV-2 (12), del virus de la inmunodeficiencia de simios, SIV (13) y
equinos (14). Las estrategias seguidas han sido realizadas para cambiar el tropismo
natural del virus por el receptor CD4 de macrófagos y linfocitos T, manipulando el
gen env y la generación de células empaquetadoras. Mediante estos vectores se ha
conseguido introducir genes en hígado, retina, músculo y neuronas.
Células diana de la terapia génica

Los tejidos de los animales adultos tienen un número variable de células embrio-
narias que sirven para los procesos de regeneración. Estas células pueden ser aisla-
das, expandidas in vitro e implantadas en un mismo individuo sin disparar la res-
puesta del sistema inmmune. La médula ósea del hombre adulto es una fuente
asequible y excelente de células pluripotenciales del sistema inmuno-hematopoyé-
tico y mesenquimales. Las correspondientes al sistema inmuno-hematopoyético se
aíslan del resto porque expresan el antígeno de superficie CD34 y, por esto, están
siendo ampliamente utilizadas en todos los proyectos de terapia génica del sistema
inmune con gran éxito, como veremos en el siguiente apartado.
Las células pluripotenciales mesenquimales (MSCs) aisladas de la médula ósea
tienen la potencialidad de diferenciarse en cartílago, hueso, tejido adiposo, ten-
dón, etc. (Fig. 10.8) (15). Las células implantadas adquieren el fenotipo del lugar de
la implantación como hueso, cartílago, tejido adiposo, músculo, etc. (16,17), y se están
empezando a establecer las condiciones y factores necesarios para la diferenciación
in vitro (18). Resultan muy interesantes los estudios que muestran la diferenciación de
la MSCs en neuronas.
El potencial terapéutico de las MSCs es grande. Éstas se aíslan del resto de célu-
las de la médula ósea por su capacidad de adherencia. El número de MSCs presen-
tes en la médula ósea varía en relación inversa a la edad de los individuos. Sin
embargo, la potencialidad de diferenciación de las MSCs obtenidas de adultos se
mantiene inalterada. Estas células pluripotentes amplificadas in vitro son unas dia-
nas excelentes para ser modificadas genéticamente mediante el uso de los vectores
antes mencionados, ya que al ser implantadas adquieren el fenotipo adecuado para
la expresión del transgén. En estas células descansa el futuro de la terapia génica sin
alterar la células germinales de los individuos.
Logro de la terapia génica en la inmunodeficiencia severa

combinada (SCID)-X1
La enfermedad hereditaria SCID-X1 se caracteriza por un bloqueo temprano en
el proceso de diferenciación de los linfocitos. La causa de esta enfermedad es un
defecto en el receptor de citoquinas ac (19). Dos niños franceses con edades de 11
Proceso Mesengénico
138
Célula Mesenquimal Progenitora
Proliferación
Tendogénesis/ Estroma
Destino Osteogénesis Condrogénesis Ligamentogénesis Miogénesis Celular Otros
Osteoblasto Condrocito Fibroblasto Célula Estromal

Expansión Transitorio Transitorio Transitorio Mioblasto
Transitoria
clonal
Osteoblasto Condrocito
Diferenciación Fusión Mioblástica
Adipocito
Célula
Célula Dermal
Condrocito Fibroblasto Estromal
Otros
Osteocito Hipertrófico Miotúbulo
Maduración
Cartílago Tendón/ Tejido

Hueso ligamento Músculo Médula conjuntivo
Figura 10.8. Esquema de la diferenciación de las células pluripotenciales mesenquimales aisladas de la médula ósea.
y 8 meses que padecían dicha enfermedad han sido pioneros en experimentar con
éxito la terapia génica (20). A ambos pacientes se les extrajo médula ósea y se aisla-
ron las células progenitoras del sistema inmunitario mediante bolitas magnéticas
tapizadas con el anticuerpo anti-CD34. Las células progenitoras CD34+ se ampli-
ficaron en placas tapizadas con fibronectina y en medio de cultivo definido. El
medio contenía IL-3, factor de diferenciación de megacarioticitos y el tiempo de
incubación empleado fue de 24 horas. El gen humano completo codificante para el
receptor ac fue introducido en un vector oncorretroviral llamado MFG-ac y empa-
quetado en una línea de células disponibles en el mercado. El sobrenadante de las
células conteniendo 500.000 partículas transferentes por ml fue utilizado para infec-
tar durante tres días las células progenitoras CD34+ aisladas de ambos pacientes.
Transcurrido este tiempo, las células se lavaron y fueron retornadas a la médula de
los respectivos pacientes. Los resultados del seguimiento efectuado durante 10
meses a los dos pacientes, muestran que la expresión del transgén comienza a las
dos semanas de la infusión de las células en la médula y consecuentemente se llega
a alcanzar unos niveles de linfocitos T, B y NK, similares a los controles sin enfer-
medad. Además los pacientes muestran una funcionalidad del sistema inmunitario
totalmente normal cuando fueron vacunados de la polio, el tétano y la difteria.
Gracias a la terapia génica, estos niños destinados a vivir en una burbuja o recibir
un transplante alogénico llevan casi dos años haciendo vida normal con la única
molestia de dos inyecciones en la médula.
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11
Introducción a la Biotecnología
y generalidades sobre cultivos
celulares
Definición
En líneas generales podemos definir la Biotecnología como la utilización indus-
trial de seres vivos para la obtención de sustancias de interés. Como vemos se trata
de una definición muy amplia por lo que no debe sorprendernos el hecho de que la
Biotecnología sea casi tan antigua como la civilización. Los procesos biotecnoló-
gicos más antiguos de los que se tiene conocimiento son las fermentaciones para
obtener bebidas alcohólicas o la aplicación de pan mohoso a las heridas que los
antiguos egipcios practicaban como profilaxis de las infecciones. En la actualidad
existe una larga lista de productos obtenidos por la Biotecnología que afecta a
todos los órdenes de la vida: tejidos, alimentación, caucho, farmacia, medio
ambiente. Así pues, atendiendo a la amplitud del campo en el que nos movemos,
centraremos nuestra atención en la aplicación de la Biotecnología a las Ciencias de
la Salud.
La palabra «Biotecnología» deriva de vocablos griegos cuyo significado es «uti-
lización industrial de formas vivas» o «el uso integrado de la ingeniería, la bioquí-
mica y la microbiología para conseguir la aplicación tecnológica de las capacidades
de microorganismos, células de tejido cultivado y sus partes». En el campo de la
salud, existe una multitud de productos de origen natural debido en general a que su
elevada complejidad estructural hace muy difícil su síntesis. Incluso algunos pro-
ductos como las vacunas, son organismos vivos o partes de ellos. Hace 20 o 30 años
habríamos podido decir que la Biotecnología farmacéutica era la obtención de fár-
macos a partir de substratos naturales. El conocimiento actual de la Biología es lo
que nos ha permitido alcanzar el nivel molecular de la vida, abriendo con ello nue-
vos horizontes de posibilidades en la obtención de sustancias curativas. De hecho y
como más adelante volveremos a mencionar, el desarrollo de la tecnología del ADN
recombinate y su aplicación industrial ha abierto las puertas de un mundo de posi-
bilidades tanto en la fabricación de drogas como en la directa terapia sobre enfer-

mos de dolencias hasta la fecha consideradas incurables. No debemos olvidar que
el término «droga» que se utiliza habitualmente referido a personas es sin embargo
utilizable en la salud animal y que la farmacia veterinaria tiene también un peso
económico importante.
Muchas sustancias terapéuticas han sido descubiertas accidentalmente en ani-
males y plantas. Sólo en épocas muy recientes la ciencia ha explorado en el nivel
básico y ha sido capaz de convertir en drogas el producto de esa investigación. Éste
hecho es lo que comúnmente veníamos denominando «Biotecnología Far-
macéutica». Sin embargo, el término «Biotecnología Farmacéutica» se ha desvir-
tuado y se ha transformado en un cajón de sastre en el que se incluye una amplia
variedad de avances científicos dirigidos al cuidado de la salud. Dentro de ellos pue-
den destacarse siete campos:
1. Reconocimiento y caracterización de factores endógenos que median los
efectos producidos por las drogas tradicionales.
2. Utilización de la tecnología del ADN recombinante.
3. Producción industrial de anticuerpos monoclonales para terapia, diagnóstico
y purificación de otras sustancias.
4. Diseño de fármacos por ordenador.
5. Sistemas de administración de drogas (DDS)
6. Organismos transgénicos.
7. Aplicaciones del cultivo de tejidos.
Inevitablemente se genera una nueva industria sobre estas tecnologías con un
elevado desarrollo potencial y real. Existen miles de empresas en EE UU y Europa
relacionadas con estos campos. Actualmente hay diversos fármacos en el mercado
producidos mediante tecnología del ADN recombinante y muchos más en fase de
ensayos clínicos o esperando su aprobación por las autoridades sanitarias (r-hGH,
r-FSH, Insulina, Factor VIII, Factor IX...). Estas producciones dan lugar al desa-
rrollo de una gran industria auxiliar dedicada a la fabricación de plásticos, reactivos,
etcétera, formando todo ello un tejido industrial que mueve actualmente miles de
millones de dólares. La evidencia de que la Biotecnología es una industria y que
como tal tiene un peso económico (creciente) nos conduce a definiciones si bien un
tanto prosaicas del término, no por ello desacertadas. De este modo se dice que la
Biotecnología es hacer dinero con la Biología o en una concepción menos econó-
mica pero también llena de pragmatismo la Biotecnología se define como la apli-
cación industrial de la Biología.
La «Biotecnología Farmacéutica» persigue la obtención de cantidades «indus-
triales» de productos que existen en la naturaleza en cantidades muy pequeñas con
objeto de tratar enfermedades. Uno de los más antiguos productos obtenidos por la
Biotecnología Farmacéutica es la insulina, que en los años veinte comenzó a puri-
ficarse en grandes cantidades a partir de los páncreas porcinos y bovinos.
La extracción de sustancias a partir de tejidos animales, no digamos ya huma-
nos, lleva aparejados problemas relacionados con la presencia de agentes adventi-
INTRODUCCIÓN A LA BIOTECNOLOGÍA Y GENERALIDADES… 143
cios difícilmente detectables. Ejemplos muy sobresalientes de este hecho es el

lamentable contagio de SIDA de personas tratadas con factor VIII o la aparición
prematura de demencia senil como manifestación de la enfermedad de Creutfeldt-
Jakobs en personas tratadas con hormona de crecimiento extraída de tejidos huma-
nos. Por otra parte, determinadas sustancias que son muy escasas en la naturaleza
pueden obtenerse en cantidades relativamente abundantes mediante la manipula-
ción genética de organismos. Estos hechos favorecen que la tecnología del ADN
recombinante irrumpa con fuerza en la Biotecnología Farmacéutica y que sea en la
actualidad la más sobresaliente aplicación de tecnología con una realidad terapéu-
tica y comercial. Hoy en día disponemos de moléculas humanas en grandes canti-
dades que, sin embargo, jamás han estado relacionadas con seres humanos. Tal es
el caso de la hGH , insulina o factores de coagulación.
También en el campo de la inmunología tiene una gran importancia la tecnolo-
gía del ADN recombinante puesto que diversas vacunas incluyen únicamente par-
tes del patógeno incapaces de desarrollar enfermedad alguna, sino tan sólo la res-
puesta inmune.
Las fronteras actuales de la Biotecnología Farmacéutica se encuentran en la
búsqueda de nuevos productos capaces de acabar con enfermedades como el cáncer
y en el tratamiento a nivel genético de las enfermedades para poder corregirlos en
origen. Es la terapia génica que comienza a mostrar sus primeros éxitos.
Con todo lo dicho podemos redefinir el término Biotecnología Farmacéutica
como el uso de sistemas biológicos para producir drogas o sustancias o también
como la utilización de tecnologías modernas para producir sustancias terapéuticas
a partir de sistemas biológicos.
Reseña histórica
Ya se ha indicado que la Biotecnología tiene una edad no inferior a los 5.000
años pero entre las primeras fermentaciones en la antigua Mesopotamia y las
modernas terapias génicas se producen una serie de hechos destacados que van
marcando la pauta de desarrollo y crecimiento de esta tecnología. A continuación
trataremos de sintetizar la historia de la aplicación industrial de organismos vivos en
varias etapas.
1. Anterior a Pasteur. Se limita a la producción de alimentos y bebidas fer-

mentadas, destilación, utilización de levaduras y fabricación de yoghurt y
vinagre, todos ellos procesos tradicionales cuyas causas son, evidentemente
desconocidas para quienes las realizan.
2. Era Pasteur. Los trabajos de Louis Pasteur demostraron la participación de
los microorganismos como agentes activos en la producción de cerveza y
vino y en la descomposición de alimentos. Los hitos principales de este
periodo son fundamentalmente dos:
• Producción microbiológica de butanol, glicerol y ácido cítrico.

• Producción de acetona y butanol con Clostridium acetobutylicum
(Weizmann 1913-1915, Manchester).
3. Era de los antibióticos. Fleming descubrió en 1928 la penicilina pero hasta

1940 no se inició su producción en masa gracias a la aplicación de la tec-
nología de la industria alimentaria, que permitió la fermentación a gran
escala del Penicillium notatum, que hasta entonces se había crecido en
botellas.
Al desarrollo de la penicilina, le siguieron otros muchos antibióticos,
como la eritromicina y la estreptomicina.
4. Era Post-antibióticos. El desarrollo de la bioquímica y la microbiología
impulsó la utilización de microorganismos en la producción de diversas sus-
tancias; es el caso de las vitaminas B2 y B12, de aminoácidos (licina y glu-
cosa) o la transformación masiva de glucosa en fructosa.
Otros productos de interés industrial generados por Biotecnología son el
gasohol, etanol obtenido por fermentación y utilizado como combustible y la
goma de xantano, que reemplaza el caucho.
Un uso muy llamativo aunque fallido de los microorganismos fue la
producción de SCP (Single Cell Proteins) que durante un tiempo persiguió
la obtención de proteínas útiles para el consumo animal e incluso humano
a partir de la transformación de residuos agrícolas y petroleros, partiendo
de la premisa de que el mundo tendría en el futuro escasez de proteínas.
Tras varios años de inversión y esfuerzo investigador, el cultivo de la soja
terminó con esta iniciativa.
También corresponde a este periodo la utilización de microorganismos
para la limpieza de efluentes y como auxiliares de lixiviación.
5. Incorporación de la Biología Molecular. La combinación de las técnicas de
la Biología Molecular con el cultivo masivo de microorganismos ha supues-
to una revolución en el campo de Biotecnología. La tecnología del ADN
recombinante en combinación con las técnicas de cultivo masivo de bacterias
y, desde 1962, también de células eucariotas se convierte en la vía para pro-
ducir cantidades importantes de proteínas de interés terapéutico, como anti-
cuerpos monoclonales de gran especificidad, hormonas, mediadores biológi-
cos, etcétera.
La frontera actual de la biotecnología se encuentra en la creación de seres trans-

génicos capaces de expresar genes ajenos e incorporar el producto o efecto de los
mismos como parte de su propia naturaleza, en la clonación de organismos supe-
riores y en las terapias génicas que permiten la corrección de defectos genéticos en
organismos ya desarrollados.
Fuera del campo de la salud, los sensores biológicos y las enzimas inmoviliza-
das ocupan la vanguardia de la Biotecnología.
Producción de fármacos por Biotecnología

Una vez detectado el interés terapéutico de una sustancia, hay que seguir una
secuencia de pasos hasta llegar el producto final. Con matices, todos los fármacos
obtenidos por un proceso biotecnológico siguen una secuencia similar. Nos centra-
remos pues en la producción de proteínas recombinantes.
Una vez detectada, aislada y caracterizada la sustancia de interés terapéutico se
procede a la localización del ADN que la codifica en el organismo de origen, habi-
tualmente el hombre. Existen diversos métodos para aislar la secuencia de ADN,
como la creación de sondas y genotecas, que en otro capítulo se describirán en de-
talle.
Cuando se posee el ADN de interés, se transfiere al organismo elegido para la
producción industrial. En este paso temprano se aplican por primera vez criterios
económicos al proceso. Así, si bioquímicamente, es viable la producción de la
proteína, en diversos organismos, será necesario pensar en las posibilidades de
sacar adelante el cultivo, productividad, costes de purificación del producto, pro-
blemas de impurezas y caracterización final. Como ejemplo, siempre que una
proteína requiera modificaciones estructurales post-traduccionales para ser fun-
cional, las bacterias quedarán automáticamente descartadas como organismo pro-
ductor.
Una vez realizada la construcción génica y seleccionado y creado el organismo
hospedador, se ha de proceder a la elaboración del banco de células. Éste no es sino
un reservorio de células productoras, todas iguales entre sí, que se mantienen en
condiciones de conservación durante años. La homogeneidad y buena conserva-
ción de las células resulta esencial para garantizar el desarrollo del proceso pro-
ductivo.
Una vez creado el banco de células, comienza el diseño del proceso de produc-
ción. La naturaleza del hospedador seleccionado, bacteria o eucariota es muy deter-
minante en este desarrollo. Las bacterias admiten condiciones de crecimiento
mucho menos depuradas que las células. Las áreas de trabajo en la optimización del
proceso son también diferentes dependiendo de que se trabaje en células o bacterias
y de si aquellas viven en suspensión o son dependientes de anclaje. Parámetros
como la concentración de gases en solución, la distribución de temperaturas en el
tiempo o el control de pH, por ejemplo, son algunos de los factores a tratar a la hora
de poner en marcha un proceso. En estos desarrollos son habituales los ensayos
multifactoriales para determinar los parámetros realmente importantes y la manera
en que inciden sobre el mismo.
Un aspecto de capital importancia a la hora de seleccionar el organismo pro-
ductor es el método de purificación del producto final. Un ejemplo muy ilustrativo
lo encontramos en la fabricación del tPA. Esta proteína fue clonada en Escherichia
coli y en células CHO (Chinese Hamster Ovary). En ambos casos y pese a tratarse
de una proteína con estructura terciaria, el producto resultaba funcional tanto in
vitro como in vivo. Además, el producto generado por E. Coli (ECOtPA) resultaba
más estable una vez inyectado que el procedente de células CHO con lo que reque-
ría dosis menores para actuar. Sin embargo, la ECOtPA se producía en forma de grá-
nulos insolubles intracelulares lo que requería un complejo proceso de recuperación
y purificación en el que se consumían grandes cantidades de urea y guanidina y
hacía necesario el trabajo con grandes volúmenes. Además, el rendimiento final del
proceso era de un 2,8 %. Consecuentemente se adoptó la CHO como organismo
productor de tPA a pesar de que la productividad en el crudo era de tan sólo 33,5
mg/L frente a los 460 mg/L generados por las bacterias.
Junto con la elección de las condiciones de cultivo y de los pasos a dar para la
purificación del producto, se definen los controles en proceso necesarios. El control
en proceso es fundamental para la elaboración de un producto de estas caracterís-
ticas puesto que un conocimiento preciso de la evolución de la producción resulta
imprescindible para detectar y atajar los posibles problemas que vayan surgiendo y
garantizar la ausencia de «sorpresas» desagradables en el producto final.
El diseño general del proceso de fabricación junto con las características del
organismo hospedador, dará la pauta a seguir en el diseño de las instalaciones y la
elección de los métodos de trabajo.
La forma final del procedimiento de fabricación se obtiene con el rodaje de la
producción, ya que sólo la práctica diaria pone de manifiesto los problemas exis-
tentes.
El tiempo requerido por un fármaco para llegar al mercado se divide en tres
periodos:
• Preclínico: Es toda la etapa de desarrollo del producto que ya hemos comen-
tado. La fase en que se produce la detección de la sustancia, su implantación
en un organismo hospedador y el desarrollo del modelo de producción.
• Clínico: Es el momento en que comienzan los ensayos clínicos. Las observa-
ciones realizadas en esta fase pueden modificar partes o incluso la totalidad
del proceso de producción.
• De revisión: Terminadas las dos fases anteriores, la propuesta de productos es
enviada a las autoridades sanitarias para su estudio y aprobación. Las pregun-
tas y demostraciones solicitadas por dichas autoridades pueden también afec-
tar al proceso de fabricación.
El tiempo medio de salida al mercado de productos obtenidos por biotecno-
logía viene siendo de siete años desde su concepción hasta su venta al público.
Este tiempo es comparable al requerido para la salida al mercado de drogas para
el tratamiento del SIDA y sensiblemente menor que el requerido a los fármacos
tradicionales o los extractivos, estos últimos permanentemente bajo sospecha y
frecuentemente inspeccionados.
Un punto que ayuda a la rapidez en la salida al mercado de productos biotecno-
lógicos es el hecho de que algunos de ellos, como la insulina y la hGH, son sustan-
cias que ya existían como fármacos y en los que únicamente cambia el sistema de
fabricación. No obstante, y en el caso de los NBE (New Biological Entities), los pro-
ductos biotecnológicos también vienen requiriendo menores tiempos de revisión
por parte de las autoridades.
Cultivo in-vitro de células

Una población bacteriana depositada en el seno de un medio nutritivo y no reno-
vado, produce un perfil de crecimiento de tipo sigmoide. En la curva de crecimien-
to se identifican tres fases fundamentales que son de importancia a la hora de desa-
rrollar una producción biotecnológica. Dichas fases son:
• De latencia o lag. Durante este periodo las bacterias se adaptan al medio.
• De crecimiento exponencial o log. Es el periodo de crecimiento neto, carac-
terizado por una intensa duplicación del cultivo. Las bacterias se multiplican
en una progresión geométrica de razón 2 durante esta fase, es decir, siendo N
el número inicial de individuos, la población crecerá de la siguiente manera:
N A 2N A 4N A 8N A 16N…
Entre cada multiplicación transcurre un tiempo específico, constante y caracte-

rístico de cada especie que es conocido como tiempo de duplicación. Es posible
determinar este tiempo, el número de duplicaciones producidas o prever la cantidad
de bacterias al cabo de cierto tiempo mediante ecuaciones sencillas.
Xt = X0 · 2n
Donde Xt : microorganismos en tiempo t

X0: microorganismos en t0
n: número de duplicaciones
Puesto que n = t / td, siendo td el tiempo de duplicación, entonces:

Xt = X0 · 2n = X0 · 2t/td c X/X0 = 2t/td c n(X-X0) = ln 2t/td
Por tanto:
(logX – logX0) 0,693
2,303 ––––––––––––– = –––––
t td
Es decir, que una gráfica de crecimiento frente al tiempo produce una recta cuya
pendiente es 0,693/td.
Estos cálculos sólo son aplicables a la fase de crecimiento exponencial, lógica-
mente.
Medida de crecimiento bacteriano
Existen diversos métodos para medir el crecimiento. Podemos clasificarlos en

directos e indirectos.
— Directos: Son los diversos sistemas de recuento, ya sean la cámara cuenta-

glóbulos o los contadores de células.
— Indirectos: Evalúan diversos parámetros que dan una idea aproximada del
número de células presente.
• Peso seco: Recuperación mediante filtración o centrifugación de las célu-
las contenidas en un volumen conocido de cultivo, desecación en estufa de
las células retiradas y pesada de las mismas.
• Peso húmedo: Se recuperan las células mediante la filtración de un volu-
men conocido de cultivo y se pesa la biomasa recogida.
• Disolución seriada de una muestra del cultivo y siembra en medio sólido.
Se considera que cada una de las colonias formadas sobre la placa corres-
ponde a una sola bacteria en suspensión. Multiplicando el número de colo-
nias obtenidas por el factor de dilución se puede estimar la concentración
bacteriana en el cultivo original.
• Absorción de luz visible. Las suspensiones de bacterias absorben luz visi-
ble. La absorción es tanto mayor cuanto más elevada es la concentración de
bacterias. La combinación de esta medición con la realización de diluciones
seriadas de los cultivos permite establecer una relación entre la concentra-
ción de microorganismos y la absorbancia de un cultivo bacteriano.
Cultivo de células eucariotas

Gran parte de los principios aplicados al cultivo de bacterias son extrapolables
a los cultivos de células. De hecho, bastantes técnicas de trabajo con bacterias han
sido aplicadas al cultivo de eucariotas. Sin embargo, es frecuente que las células
eucariotas pierdan parte de sus propiedades cuando son extraídas de los órganos que
se encuentran y que su proliferación requiera la utilización de condiciones especia-
les, incluyendo los cultivos histotípicos.
En esencia, la célula inmortalizada en cultivo sigue un ciclo similar al que
hemos visto en bacterias. Tras una fase inicial de latencia se produce un creci-
miento exponencial con una fuerte predominancia de células en división que con-
duce a una fase estacionaria cuando los elementos críticos para el desarrollo
comienzan a escasear, culminada por una fase de muerte si los nutrientes llegan a
desaparecer por completo.
La cinética de este crecimiento puede expresarse en forma de ecuaciones mate-
máticas idénticas a las que hemos visto para el caso del crecimiento bacteriano.
Entre los diversos parámetros que definen la dinámica de una población celular des-
tacaremos por su utilización frecuente la estimación del número de duplicaciones n.
X
n = 3,32 log –––
X0
Donde X es el número de células a tiempo t y X0 el número inicial de células.

Células inmortalizadas
A diferencia de las bacterias, la célula eucariota carece de sistemas de protección

frente al entorno quedando esta función supeditada a la organización tisular y orgá-
nica. Así pues, una célula eucariota extraída de su entorno muere con facilidad, aun
manteniéndola en un ambiente muy controlado.
En ocasiones se realiza cultivo de órganos que, tras una necrosis traumática ini-
cial, adquieren un estado estacionario en el que pueden vivir durante días e incluso
semanas en condiciones de laboratorio. Esta modalidad de cultivo, utilizada tan sólo
con fines científicos, tiene la ventaja de mantener las condiciones fisiológicas y bio-
químicas propias del tejido original. Sin embargo plantea problemas de reproduci-
bilidad de los experimentos.
Como alternativa al cultivo de órganos se encuentra el cultivo de células que
consiste, como ya indica su nombre, en el mantenimiento de las condiciones vita-
les de células que se han independizado de la estructura tisular.
El paso del órgano a las células independientes tiene lugar por simple y espon-
tánea migración de las células o bien mediante la disgregación mecánica o enzimá-
tica del órgano y tejido originales.
Las células diferenciadas son incapaces de dividirse en la mayoría de los casos.
Por otra parte, un cultivo de células específicas puede presentar diversos estadios,
así por ejemplo, el cultivo de queratinocitos puede contener células madre que se
multiplican, células precursoras y escamas queratinizadas. En otros casos, las célu-
las pueden mantener un aspecto homogéneo y dar lugar a cultivos cuya prolife-
ración depende de la densidad, como es el caso de los fibroblastos, capaces de divi-
dirse a baja densidad (104 cell/cm2) pero incapaces de multiplicarse a altas
densidades (106 cell/cm2).
Finalmente, una población celular puede tener un aspecto homogéneo y mante-
ner sin embargo diferencias genéticas distribuidas en distintos clones.
La multiplicación de las células en cultivo requiere la utilización de densidades
de crecimiento adecuadas, bajas concentraciones de Ca++ (entre 100 y 600 mM) y
la utilización de factores de crecimiento tales como el EGF, IGF, PDGF, retinoides,
etcétera, todos ellos presentes en el suero sanguíneo.
Con todo, las células normales en cultivo se dividen un número limitado de
veces y después mueren. Sin embargo las células de origen tumoral son capaces
de dividirse ilimitadamente con tal de que se mantengan las condiciones adecua-
das para ello. Algunas, como las células B16 procedentes de un melanoma de
ratón son capaces de sufrir una diferenciación parcial y seguir no obstante divi-
diéndose.
Las células de tipo no neoplásico pueden generar líneas inmortales. La aparición
de estas células inmortales se registra al cabo de una serie de divisiones, cuando la
mayoría de las células en cultivo empiezan a morir. La inmortalización de las célu-
las se considera producto de mutaciones relacionadas con delecciones en algunos
genes pero no se puede descartar la pre-existencia de clones inmortales en un teji-
do normal.
Las células inmortalizadas presentan diferencias morfológicas con respecto a

aquellas células de las que proceden. En general suelen ser de menor tamaño, menos
adherentes, más redondeadas y presentan una relación núcleo/citoplasma mayor.
Son también frecuentes alteraciones de tipo cromosómico siendo muy habituales las
aneuploidías y la heterocariosis.
Las células inmortalizadas en cultivo son las más utilizadas en la biotecnología
farmacéutica actual para producir proteínas de interés terapéutico.
Las células en cultivo pueden vivir en suspensión, como es el caso de los hibri-
domas, células procedentes de la fusión entre linfocitos y células procedentes de un
tumor ascítico.
La otra forma de crecimiento de células en cultivo son las células dependien-
tes de anclaje (ADC), que deben mantenerse unidas a una superficie para su desa-
rrollo.
La selección del tipo de células más adecuado durante el proceso de desarrollo
de un fármaco biotecnológico debe tener en cuenta las posibilidades de realizar con
éxito un cultivo a gran escala y tratar de compatibilizarlo con las posibilidades de
transformación de la célula.
Las células capaces de crecer en suspensión ofrecen algunas ventajas sobre las
dependientes de anclaje.
• Fácil escalado.
• Menor manipulación.
• Fácil inducción del estado estacionario.
El cultivo de células es una técnica de gran complejidad y precisión con un fuer-

te predominio de las respuestas empíricas. Los métodos, materiales y medios de cul-
tivo deben ser previamente ensayados en el laboratorio para realizar la elección de
los mismos. Con todo, hay algunos valores de referencia que pueden darse como
norma general:
• pH. El valor óptimo suele encontrarse en torno a 7,2 y 7,4. Valores inferiores
a 6,8 suelen resultar inhibitorios del crecimiento. El mantenimiento del pH se
consigue tamponando los medios de cultivo habitualmente con CO3H– que se
mantiene en equilibrio con el CO2 atmosférico.
• Temperatura. Frecuentemente se considera que la temperatura óptima de cre-
cimiento es de 37° C pero esto no ha de ser necesariamente así. Determinadas
líneas celulares murinas muestran su crecimiento óptimo a 35 °C y hay líneas
celulares de aves que encuentran su temperatura óptima a 40 °C.
• Aporte de oxígeno. La solubilidad del oxígeno es de 7,6 μg/ 106 cell/mL. El
ritmo de consumo de O2 alcanza los 6 μg/ 106 cell/mL lo que significa que un
cultivo estándar con 2·106 células /mL acaba con todo el oxígeno en solución
en menos de una hora. Existen diversos sistemas de aporte de O2 que van
desde variaciones en la superficie de aireación hasta sofisticados sistemas de
burbujeo y perfusión y cuya elección depende del tipo de cultivo.
• El medio de cultivo. No existe un medio de cultivo universal. Cada célula,

cada proceso, y cada producción debe llevar su medio de cultivo específico.
Los medios de cultivo contienen una fuente de carbono, habitualmente glu-
cosa y/o glutamina, diversas sales minerales y un amplio abanico de nutrien-
tes fundamentalmente aminoácidos esenciales y vitaminas.
• Suero. Es frecuente que el medio de cultivo se complemente con suero animal.
Existen varias fuentes de suero comúnmente utilizadas y comercializadas:
humano, equino, etc., pero la más habitual es el suero fetal bovino. El aporte
del suero es fundamental para el desarrollo de los cultivos puesto que propor-
cionan a las células una multitud de factores de crecimiento y elementos mito-
génicos además de un ambiente muy estable y adecuado para el crecimiento.
Es habitual la utilización de concentración de suero entre el 2 % y el 20 %. El
suero presenta, no obstante, importantes inconvenientes tales como la posible
aparición de agentes adventicios, la no garantía de abastecimiento y la falta de
homogeneidad del producto. De ahí que se esté desarrollando un intenso tra-
bajo en la obtención de medios de cultivo libres de suero en los cuales éste se
sustituye por una variedad de componentes estimulantes de crecimiento cono-
cidos y en cantidades controladas.
Contaminación y prevención
No podemos terminar este apartado de generalidades sobre el cultivo celular sin

mencionar la principal amenaza que sobre ellos pesa: La contaminación. Por su cre-
cimiento lento y la riqueza en nutrientes y condiciones altamente fisiológicas que se
requieren, los cultivos celulares son un blanco ideal para la contaminación por bac-
terias, levaduras y hongos. Es por ello frecuente la adición de antibióticos a la for-
mulación del medio, pero esto no siempre puede ser así: la producción de proteínas
para consumo humano debe hacerse necesariamente sin antibióticos que de otro
modo podrían generar resistencias o reacciones alérgicas en los pacientes.
Aparte de estos contaminantes comunes, merecen especial atención los mico-
plasmas, diversos virus animales y, últimamente, los priones, como es el caso de la
BSE. Existen diversos métodos para detectar la presencia de agentes adventicios
que, en muchos casos, pueden no presentar efectos citopáticos visibles. La mejor
manera de evitar la aparición de estos elementos indeseables en los cultivos es el
análisis de las materias primas, el trabajo aséptico y la utilización de salas y equi-
pos controlados y diseñados para prevenir la contaminación.
Tipos de cultivos
Trabajemos con procariotas o eucariotas, los cultivos se dividen en dos catego-
rías: batch o discontinuo y continuo.
Cultivo discontinuo
Consiste en la inoculación de una cantidad conocida de células en un cierto

volumen de medio, bajo las condiciones adecuadas para el crecimiento. Las células
se multiplican y van cambiando su ambiente debido al consumo de nutrientes y a la
acumulación de metabolitos tóxicos. Esta variación en el entorno se traduce en alte-
raciones de carácter fisiológico en las células que finalmente terminarán por morir
o mantener una población residual.
Existen diversas variaciones del cultivo discontinuo destinadas a prolongar la
duración del mismo. Éstas son:
• Batch alimentado (fed batch). Consiste en la adición periódica de cantidades
de medio de cultivo sin retirada del consumido, con el consecuente incre-
mento de volumen.
• Batch semi-continuo. Consiste en la periódica retirada de cantidades fijas de
medio de cultivo y su sustitución por medio nuevo. Estos sistemas retienen
siempre en mayor o menor medida una cierta cantidad de desechos y mantie-
nen por ello un ambiente fluctuante.
• Sistemas de perfusión. Consisten en la continua entrada de medio con salida
de cantidad igual, manteniendo las células retenidas en el reactor. Es el típico
sistema de los cultivos histotípcios como el biorreactor de fibra hueca. La
renovación del medio se puede realizar con medio fresco o bien procediendo
a la regeneración del medio consumido.
Cultivo continuo
Es en el que se consiguen auténticas condiciones homeostáticas evitando fluc-

tuaciones en el ambiente. Consiste en la salida continua de medio de cultivo con
células que es reemplazado por medio fresco.
El fundamento del quimiostato reside en el hecho de que el crecimiento celular
está determinado por la concentración de nutrientes específicos limitantes del cre-
cimiento. En un cultivo, las células crecen hasta alcanzar un equilibrio que está rela-
cionado con la dilución de un factor limitante. Entonces las células entran en lo que
se denomina «estado estacionario».
En el estado estacionario, el ratio de crecimiento, μ, es igual al ratio de dilución,
D que a su vez es la relación entre el flujo de medio entrante (f) por unidad de tiem-
po y volumen de cultivo V es decir:
μ = D = f/V · días –1
Puesto que el ratio de crecimiento es dependiente del ratio de flujo entrante, el

tiempo medio de generación puede expresarse como:
td = ln(2/D)
Un sistema automatizado para conseguir un cultivo continuo es el turbidostato,

que valora la densidad celular por turbidimetría.
El interés del cultivo continuo reside en el mantenimiento de las condiciones
fisiológicas óptimas, requisito en muchos casos para mantener una buena produc-
ción.
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12
La ingeniería genética I.
Herramientas y Metodología
Introducción
En el inicio de la década de los sesenta los genetistas tenían una clara visión de
la genética clásica. Sin embargo, carecían por completo de metodología para estu-
diar y obtener los genes excepto a través de laboriosos experimentos de aparea-
mientos y análisis de los mutantes resultantes. No existían procedimientos para
examinar los genes a nivel molecular. No fue hasta 1974 cuando las operaciones de
ingeniería genética, también llamadas técnicas de ADN recombinante se hicieron
realidad.
La ingeniería genética es un término que, por un lado, hace referencia a aspec-
tos técnicos: ingeniería, herramientas y a ensamblaje, mientras que el otro término,
genética, remite a los genes, el soporte material de la herencia, a la transmisión a los
descendientes de la información inscrita en el patrimonio hereditario de un orga-
nismo.
La ingeniería genética no es una ciencia sino un compendio de técnicas capaces
de intervenir sobre el patrimonio genético de los organismos; de esta forma, las téc-
nicas de ingeniería genética permiten modificar selectivamente (reprogramar) los
genes de un organismo mediante la incorporación de nueva información genética,
de forma que ésta se exprese y se perpetúe en la progenie.
Desde su aparición hacia 1974, la ingeniería genética ha evolucionado muy
deprisa hacia un grado muy alto de perfección técnica, en la actualidad es posible
aislar fragmentos discretos de ADN procedentes de un gran genoma, mantenerlos y
expresarlos en sistemas sencillos que faciliten su estudio a nivel molecular. Es posi-
ble también, secuenciar y mutar el gen clonado, ponerlo bajo óptimas condiciones
de expresión, en distintos hospedadores, observar su comportamiento, determinar la
estructura tridimensional y determinar interacciones con otras macromoléculas.
Todos estos estudios han supuesto un avance espectacular en el campo de la
Biología Molecular, ejemplo de ello son los descubrimientos de la organización de

los genes eucarióticos en intrones (o regiones no codificantes) y exones (o regiones
codificantes), la caracterización de innumerables nuevos genes y sus elementos de
control.
Además del avance en conocimientos e investigación básica, las técnicas de
ingeniería genética han llevado al campo biomédico a cambios revolucionarios
como son la producción masiva de proteínas con alto valor terapéutico, (escasas o
difíciles de extraer del organismo humano u otras fuentes naturales) o sentar las
bases para la terapia génica.
A pesar de todo lo anterior, la puesta en práctica de la ingeniería genética se ha
enfrentado y enfrenta a dificultades. Es muy frecuente que estas dificultades sean
tanto técnicas como económicas; las técnicas de ingeniería genética conllevan ele-
vados gastos económicos y la mayoría de los trabajos sobre expresión génica se lle-
van a cabo en los laboratorios de empresas de ingeniería genética que se encuentran
en una carrera vital de supervivencia para comercializar producciones lucrativas. La
información esencial y útil no deriva a la comunidad científica y se conserva como
secreto industrial. A veces, es posible técnica y económicamente la obtención de un
determinado producto mediante ingeniería genética y son otros factores, no cientí-
ficos (presiones políticas o ecológicas) los que evitan que la producción se lleve a
cabo.
Técnicas de ADN recombinante

Las técnicas de Ingeniería Genética han permitido romper las barreras naturales
entre especies y se ha cambiado el concepto clásico de herencia: genes eucarióti-
cos se expresan en sistemas procarióticos con gran eficiencia; genes procarióticos
se insertan en genomas de mamíferos y también se expresan, los genes humanos se
pueden aislar, mutar y sustituir; la manipulación genética de plantas permite obte-
ner plantas resistentes a plagas o herbicidas. En conjunto, estas técnicas han abierto
un inmenso abanico de posibilidades y aplicaciones prácticas en campos tan dis-
pares como la biomedicina, agricultura, ganadería o industria.
Todos estos avances han sido y son en la actualidad posibles en base a los dos
pilares de la ingeniería genética:
1. El empleo de proteínas (enzimas) con capacidad de intervenir sobre los áci-

dos nucleicos (AN) macromoléculas de la herencia. Estas proteínas constitu-
yen las herramientas de la ingeniería genética.
2. La universalidad del código genético que nos permite cruzar las barreras
naturales entre especies, introduciendo y expresando genes de cualquier
organismo en un organismo hospedador no relacionado, en el que pueden
perpetuarse indefinidamente.
LA INGENIERÍA GENÉTICA I 157
Herramientas de la ingeniería genética

Nucleasas de ácidos nucleicos
Las nucleasas son enzimas que degradan los AN. En función de si actúan degra-
dando desde los extremos o desde el interior de la cadena se denominan exonucle-
asas o endonucleasas respectivamente. Las más empleadas se describen a conti-
nuación:
ADNasa I
Características: Endonucleasa inespecífica de ADN de cadena sencilla (ADNcs)
o doble (ADNdc). En presencia de Mg++ produce cortes al azar en ambas cadenas ori-
ginando mellas o nicks, si se utiliza Mn++ los cortes se producen enfrentados en
ambas cadenas provocando una degradación del ADN tratado. El corte se realiza en
3’ del esqueleto azúcar-fosfato dejando extremos 3’-OH y 5’-fosfato (5’-P).
Uso en ingeniería genética: Esta enzima se emplea para realizar digestiones
totales o parciales de ADN para generar genotecas de genomas completos. También
es muy utilizada para marcaje de fragmentos de ADN junto con la ADN polimera-
sa en la técnica de desplazamiento del corte (nick translation).
Exonucleasa III
Características: Exonucleasa inespecífica de ADNdc que corta en dirección
3’ A 5’ hasta dinucleótido dejando extremos 5’P protuberantes. Requiere que el
extremo 3’ esté sin fosforilar.
Uso en ingeniería genética: Se utiliza para el marcaje de los extremos 3’ de
fragmentos de ADN en combinación con la ADN polimerasa I que rellena los extre-
mos protuberantes generados por la Exonucleasa III. También se emplea para gene-
rar delecciones unidireccionales progresivas de fragmentos de ADNdc.
h Exonucleasa
Características: Aislada de E. coli infectada por el fago h. Es una exonucleasa
inespecífica de ADNdc que corta en dirección 5’ A 3’ hasta dinucleótido a partir
de extremos 5’P generando extremos 3’ protuberantes.
Uso en ingeniería genética: Se utiliza para el marcaje de los extremos 3’ de frag-
mentos de ADN en combinación con la Transferasa terminal que alarga los extre-
mos protuberantes 3’ generados por la h Exonucleasa.
Nucleasa S1
Características: Es una exonucleasa y Endonucleasa de ADN y ARN de cade-

na simple en dirección 5’ A 3’ cortando en 3’ dejando extremos 3’-OH y 5’P.
Uso en ingeniería genética: Se utiliza para eliminar los extremos 5’ protube-

rantes generados por las enzimas de restricción o fragmentos de ADN o ARN de
cadena simple libres que no estén hibridados a un molde.
Nucleasa Bal31
Características: Es una exonucleasa sobre ADNdc y endonucleasa sobre

ADNcs. Posee las actividades de la Exo III (3’ A 5’) y la h Exonucleasa (5’ A 3’)
pero degrada de forma progresiva.
Uso en ingeniería genética: Se utiliza para eliminar los extremos 3’ o 5’ protu-
berantes generados por las enzimas de restricción. Puesto que la degradación del
ADN es estrictamente dependiente de Ca++ es posible controlar la reacción a dife-
rentes tiempos mediante la adición de agentes quelantes de Ca++ como EGTA lo cual
hizo de esta enzima la de elección cuando se necesitaban generar delecciones pro-
gresivas de fragmentos para su posterior secuenciación, previo relleno de los extre-
mos con el fragmento Klenow de la ADNpol I.
Ribonucleasa A (ARNasa A)
Características: Es una endonucleasa sobre ARN de cadena sencilla con especi-

ficidad de corte en pirimidinas (U y C).
Uso en ingeniería genética: Se utiliza para eliminar ARN en purificaciones de
ADN y/o proteínas, eliminación de ribosondas no hibridadas y dada su especifici-
dad de corte en U+C, se emplea en la secuenciación de ARN.
Ribonucleasa H (ARNasa H)
Características: Es una endonucleasa sobre ARN siempre que se encuentre en

forma de cadena mixta (heterodúplex) ADN/ARN. Presenta especificidad de corte
en restos de riboadenina (A).
Uso en ingeniería genética: El hecho de no degradar ARN de cadenas dobles
o sencillas hace que su empleo fundamental sea la eliminación del ARN del híbri-
do ADN/ARN tras la transcripción reversa previa a la síntesis de la segunda cade-
na de ADNcopia (ADNc) en la construcción de genotecas.
Enzimas de restricción
El ADN de las células se presenta en forma de moléculas inmensas que hay que
fragmentar de manera precisa y reproducible para aislar los pequeños fragmentos
que contienen los genes. Fue a partir del año 1974, momento en el que se descu-
brieron las endonucleasas de restricción, cuando se pudo dividir el ADN de los
organismos en fragmentos discretos relativamente fáciles de manejar.
Las enzimas de restricción son proteínas, que se encuentran de forma natural en

las bacterias. Suponen un sistema inmunitario rudimentario frente a la infección de
las bacterias por fagos (virus bacterianos). El término restricción refiere a que las
enzimas de restricción degradan el ADN «intruso» a la vez que protegen el suyo
modificándolo.
Las enzimas de restricción son endonucleasas capaces de cortar en el interior de
la doble cadena de la molécula de ADN cuando reconocen una secuencia diana de
nucleótidos específica siempre y cuando la diana no tenga modificados por metila-
ción algunos de los nucleótidos que la componen. El corte se puede producir sobre
la diana de reconocimiento o a una cierta distancia de ella.
Hay varios tipos de enzimas de restricción, denominados Sistemas I, II y III
por sus diferentes características. Los sistemas I y III no se emplean en inge-
niería genética, se caracterizan porque la secuencia de reconocimiento y la
secuencia de corte están separadas una distancia variable (entre 24-26 pb en el
caso del sistema III o 1.000 pb en el sistema II) y las secuencias de corte aun-
que no son al azar no son totalmente específicas. En cualquier caso las enzimas
de restricción de tipo II son las verdaderas tijeras moleculares de la ingeniería
genética.
Enzimas de restricción Tipo II
Las enzimas de restricción de tipo II se caracterizan porque cortan la molécu-

la de ADN en la misma secuencia diana de reconocimiento. Las secuencias de
reconocimiento son específicas para cada enzima de restricción y constan de una
corta secuencia de 4 a 10 nucleótidos que sirven de referencia para realizar el
corte. Las secuencias reconocidas por estas enzimas son capicúas o palindrómi-
cas, es decir, la lectura un sentido (5’ A 3’) de los nucleótidos de la diana en una
cadena idéntica a la de la cadena complementaria del ADN leída en ese mismo
sentido (5’ A 3’).
El corte dentro del ADN se realiza en el extremo 3’ del esqueleto azúcar-fosfa-
to, liberando fragmentos 5’-fosfato y 3’-OH. Este dato es muy importante, pues se
trata de extremos que luego podrán ser reparados con ligasas de ADN. En general
la secuencia de reconocimiento es específica, pero cambiando las condiciones de sal
y sustituyendo Mg++ por Mn++, es posible modificar la actividad de algunas enzi-
mas, obteniéndose una especificidad de corte relajada que se denomina actividad
estrella.
Existen enzimas que producen cortes enfrentados en ambas cadenas dentro de la
secuencia de reconocimiento y generan fragmentos con los extremos lisos o romos;
otras sin embargo, realizan cortes quebrados en la secuencia de reconocimiento y
generan extremos protuberantes. Los extremos protuberantes son también denomi-
nados como cohesivos o adhesivos dado que la complementariedad de bases per-
mite que sean más fácilmente soldados por acción de ligasas ya que los puentes de
hidrógeno que se forman entre ambos extremos estabilizan el ADN y las ligasas
actúan más eficientemente.
La nomenclatura de las enzimas de restricción hace referencia al género y la

especie bacteriana de la que se aislaron inicialmente; así la primera letra indica el
género y las siguientes la especie y cepa. Si existen más enzimas de restricción en
la especie se numeran con números romanos:
PstI: Providentia stuartii I. Sau3AI: Staphilococus aureus cepa 3AI
Cuando dos enzimas de restricción diferentes reconocen, total o parcialmente, la

misma secuencia y cortan en la misma posición se denominan isosquizómeros.
En principio es posible calcular la frecuencia de corte de una enzima de restric-
ción en función del número de nucleótidos que constituyen la diana de corte. Para
enzimas que reconocen un tetranucleótido la frecuencia de corte sería 44, una vez
cada 256 nucleótidos, para un hexanucleótido 46, una vez cada 4.096 nucleótidos.
Sin embargo estos datos no son reales debido a que el contenido real de GC en rela-
ción a AT no es del 50 % en los ADN y por tanto, la distribución de las dianas no es
homogénea en los genomas.
Actualmente se han identificado unas 150 enzimas de restricción, la mayoría de
ellas disponibles comercialmente como herramienta de biología molecular. La gran
importancia de estas enzimas radica, como se indicó inicialmente, en la capacidad
de cortar de forma precisa, específica y reproducible moléculas de ADN para su
posterior manipulación.
Polimerasas de ácidos nucleicos
Las polimerasas son enzimas que catalizan la formación de las moléculas de AN

a partir de sus unidades correspondientes y un molde para copiar. Hay muchos
pasos en los experimentos de ingeniería genética que requieren de la participación
de las polimerasas de los AN: polimerasas de ADN (ADNpol) y de ARN (ARNpol).
El empleo de estas enzimas es vital para la síntesis de ADN o ARN in vitro o crear
sondas con las que localizar luego genes o secuencias de interés.
Todas las polimerasas requieren:
• Presencia de Mg++ y nucleótidos trifosfato (deoxi- o ribo-) en el medio para su

actividad.
• Un molde de ácido nucleico (con la única excepción de la enzima denomina-
da transferasa terminal) para copiar.
• Un cebador, corta secuencia de oligonucleótidos hibridado al molde que pro-
porciona el punto de partida de la polimerización.
• Todas la polimerasas presentan polaridad de síntesis, siempre en la dirección
5’ A 3’ del ADN a partir de un extremo 3’-OH libre.
Las polimerasas más empleadas en ingeniería genética se describen brevemen-

te a continuación:
ADN polimerasa I (ADNpol I)
Características: La enzima funciona con actividad polimerasa y exonucleasa en

dirección 5’ A 3’ y tiene una actividad exonucleasa correctora de errores 3’ A 5’.
Uso en ingeniería genética: La principal utilidad de esta enzima es el marcaje
radiactivo o fluorescente de moléculas de ADN por el procedimiento de traslado de
corte (nick translation). El procedimiento se basa en el tratamiento de ADN con una
pequeña cantidad de una endonucleasa (ADNasa I) para que se generen pequeños
cortes al azar en la molécula de ADN, estos pequeños cortes proporcionan el extre-
mo de inicio a la ADNpol I. En presencia de Mg++ y deoxinucleótidos trifosfatos la
ADNpol I va digiriendo los nucleótidos de la cadena por delante del corte en direc-
ción 5’ A 3’ a la vez que los sustituye por los deoxinucleótidos trifosfato del medio.
Uno o varios de estos deoxinucleótidos puede ser radiactivo o llevar algún agente
fluorescente, de forma que la molécula de ADN estaría marcada para emplearla
como sonda.
Fragmento Klenow de la ADNpol I
Características: Es una modificación de la ADNpol I que ha perdido la activi-

dad exonucleasa 5’ A 3’ y por tanto no puede alargar los cortes en una molécula de
ADN.
Uso en ingeniería genética: Se utiliza principalmente para el relleno de huecos
internos en moléculas de ADN o el relleno extremos cohesivos generados por enzi-
mas de restricción para hacerlos romos. Es muy utilizada para la síntesis de la
segunda cadena de ADN a partir de un molde de cadena sencilla. Inicialmente se
empleó en las reacciones de secuenciación por el método de los di-deoxinucleó-
tidos, en la actualidad se emplea frecuentemente para el marcaje isotópico de frag-
mentos de ADN con alta actividad específica empleando cebadores de secuencia
aleatoria de 4-6 nucleótidos que hibridan aleatoriamente con ambas cadenas del
ADN a marcar (ramdom priming).
ADN polimerasa de T7 (ADNpol T7) y Secuenasa®
Características: La ADNpol T7 es una polimerasa que se aisla de E. coli infecta-

da por el fago T7. Es la polimerasa de ADN más eficiente que se conoce y la que sin-
tetiza cadenas más largas. Posee las actividades exonucleasa y polimerasa 5’ A 3’ y
la exonucleasa 3’ A 5’. Sin embargo esta actividad correctora de errores es tan
potente que a veces destruye los fragmentos cebadores si no están fuertemente apa-
reados con el molde.
Uso en ingeniería genética: La enzima modificada sin la actividad exonucleasa
3’ A 5’ se denomina Secuenasa ®, su elevada procesividad (numero de nucleótidos
incorporados cada vez que una molécula de enzima se une al ADN molde) la hacen
la enzima de elección en la secuenciación del ADN.
Polimerasas termorresistentes
Características: Son un conjunto de polimerasas de AN caracterizadas por ser

termoestables y presentar temperaturas óptimas de actividad entre 75-80 ºC. La
más conocida es la Taq polimerasa, aislada originalmente de Thermus aquaticus
y en la actualidad obtenida por ingeniería genética. Otras polimerasas termoesta-
bles son la Pfu polimerasa o la Vent polimerasa que polimerizan ADN con meno-
res errores de copia que la Taq. Otra enzima termoestable importante es la Tth
polimerasa que además de su actividad ADN polimerasa, posee capacidad de
transcripción reversa: utilizando un molde de ARN y un cebador, es capaz de sin-
tetizar ADN.
Uso en ingeniería genética: Estas enzimas se emplean en reacciones de secuen-
ciación y de amplificación de ADN mediante PCR (-Polymerase Chain Reaction-
reacción en cadena de la polimerasa).
Transcriptasas reversas
Características: Las transcriptasas reversas son enzimas de retrovirus que

sintetizan ADN utilizando ARN como molde siempre y cuando exista un corto
cebador hibridado que proporcione un 3’-OH como punto de inicio de polimeri-
zación.
Las transcriptasas reversas carecen de la actividad exonucleasa 3’ A 5’ y por lo
tanto cometen bastantes errores de copia (1 nucleótido erróneo cada 500 incorpora-
dos) y poseen una actividad enzimática ARNasa H que degrada híbridos ADN-
ARN. Las transcriptasas más empleadas son la AMV polimerasa (del Virus de la
mieloblastosis aviar) y la MMLV polimerasa (del virus de la leucemia murina) en
las versiones comerciales modificadas por ingeniería genética que han perdido la
actividad ARNasa H.
Uso en ingeniería genética: Se emplean en la obtención de ADN copia (ADNc),
a partir de ARN molde. Estas enzimas son fundamentales para la generación de
genotecas de ADNc.
Transferasa terminal
Características: Es una polimerasa que cataliza la adición de deoxinucleótidos

a extremos 3’-OH libres de moléculas de ADN. Prefiere extremos protuberantes
3’-OH de cadenas simples o dobles de ADN, pero también es capaz de actuar con
extremos romos.
Uso en ingeniería genética: La enzima se emplea comúnmente para añadir colas
de homopolímeros a moléculas de vector e inserto que se quieren unir posterior-
mente usando ADN ligasa.
ARNpolimerasas
Características: Son enzimas que reconocen secuencias específicas en el ADN

llamadas promotores y en presencia de ribonucleótidos trifosfatos y Mg++ catalizan
la síntesis de ARN complementario a una de las hebras del ADN molde. Requieren
de ADN de doble cadena (ADNdc) como molde y no necesitan ningún cebador,
siendo el ribonucleótido 5’ de inicio un ribonucleótido trifosfato. Las ARN polime-
rasas más empleadas son las ARN polimerasas de los fagos SP6 y T7 debido a que
sus secuencias promotoras son muy potentes y la transcripción a ARN desde estos
promotores es muy eficiente.
Usos en ingeniería genética: Estas enzimas se emplean junto con vectores que
poseen sus secuencias promotoras para realizar transcripción in vitro (obtención de
ARN a partir de un ADN incluido en un vector de expresión. La transcripción in
vitro se puede emplear para marcaje homogéneo, isotópico o no isotópico, de un
fragmento de ARN (ribosonda) o para realizar una traducción in vitro a proteínas de
los ARN sintetizados u obtener cortos ribonucleóticos que sirvan como ARN anti-
sentido para bloquear transcripción de un fragmento de ADN.
Poli-A polimerasas
Características: Son enzimas que añaden colas de AMP a los extremos 3’-OH
de los ARNs a partir de ATP y en presencia de Mg++ y Mn++. No necesitan molde ni
cebador.
Usos en ingeniería genética: Tanto las eucarióticas como las procarióticas se
emplean para añadir colas de poli-A a los extremos 3’ de ARN para obtener ARN
poliA+ y retrotranscribirlos a ADNc. Se pueden obtener de esta forma genotecas de
ADNc a partir de ARN total. El empleo de ATP marcado isotópicamente o con fluo-
rocromos permite obtener ribosondas marcadas en el extremo 3’.
Enzimas de modificación de ácidos nucleicos
Ligasas de ADN
Características: Las ligasas de ADN catalizan, la formación de un enlace fos-

fodiéster entre el extremo 3’-OH y el extremo 5’-P de moléculas de ADN median-
te la hidrólisis de rATP a rAMP y pirosfofato. La más empleada comercialmente es
la ligasa del fago T4 (T4 ligasa) que también puede ligar ARN. La reacción de liga-
ción es más eficiente en la unión de moléculas de ADN con extremos cohesivos
pero también es factible entre moléculas de extremos romos.
Usos en ingeniería genética: La ligasa se emplea en la reparación de cortes o
mellas en la moléculas de ADN de doble cadena, ya sean lineales o circulares. Sin
embargo el principal uso de las ligasas ha sido su empleo como pegamentos mole-
culares en la unión de fragmentos de ADN generados por las enzimas de restricción

para experimentos de clonaje.
Quinasas de ácidos nucleicos
Características: Las quinasas catalizan la transferencia del grupo fosfato en a

del rATP a extremos 5’-OH libre de múltiples sustratos, ADN y ARN de cadenas
simples y dobles o oligonucleótidos sintéticos. La enzima comercialmente usada es
la quinasa del fago T4 (T4 quinasa). Esta enzima es capaz también de provocar el
recambio del grupo fosfato de un extremo 5’-P.
Usos en ingeniería genética: La quinasa posee múltiples usos, se emplea en el
marcaje isotópico de extremos 5’-P de ADN o ARN empleando [a-32P] rATP estos
fragmentos marcados en 5’ se emplean como sondas o para secuenciación de ADN
o ARN o simplemente como marcadores radiactivos de peso molecular para elec-
troforesis. Otro importante uso es la fosforilación de extremos 5’-OH de fragmen-
tos de ADN (normalmente generados por las enzimas de restricción) para poder ser
unidos por las ligasas.
Fosfatasas de ácidos nucleicos
Características: Las fosfatasas catalizan la eliminación del grupo fosfato ter-

minal de los extremos 5’-P de múltiples sustratos, ADN y ARN de cadenas simples
y dobles o oligonucleótidos sintéticos. La enzima comercialmente usada es la fos-
fatasa alcalina.
Usos en ingeniería genética: Las fosfatasas se emplean en la preparación de
fragmentos de ADN que se desea que no sean sustratos de las ligasas o en el mar-
caje isotópico de extremos 5’-P de ADN o ARN empleando [a-32P] rATP, primero
se tratan con fosfatasas para eliminar el fosfato terminal frío y luego se marcan em-
pleando la quinasa.
Procedimientos de ingeniería genética

A continuación se describen una serie de procedimientos y técnicas básicas que
se emplean habitualmente en los laboratorios de biología molecular para la obten-
ción, caracterización y modificación de los AN.
Métodos de obtención purificación de AN
El primer paso para la caracterización y aislamiento de un gen de interés lleva

asociado el aislamiento y purificación física del ADN o el ARN que codifica por él.
No existe un método general y perfecto para el aislamiento y purificación de los
AN, sino que los métodos se emplean en función de diversos factores condicionan-
tes:
• Fuente de obtención, (organismos procarióticos y/o eucarióticos).
• Tipo de ácido nucleico: ARN o ADN.
• Propósitos preparativos o analíticos del ácido nucleico purificado.
En cualquier caso, en el aislamiento y purificación de los AN se siguen una serie
de pasos secuenciales:
1. Ruptura celular. En función de la fuente biológica de los AN podemos
seguir distintos procedimientos:
• Cultivos bacterianos: El paso inicial suele ser la concentración del cultivo
bacteriano, normalmente por centrifugación. Una vez obtenidas las células
bacterianas los métodos de ruptura empleados pueden ser mecánicos
(mediante homogeneización con abrasivos como alúmina o procesos suce-
sivos congelación/descongelación) químicos (mediante el empleo de deter-
gentes iónicos como el SDS o neutros como el Tritón X-100 o Nonidet P-40)
o enzimáticos (mediante el empleo de una solución isotónica de lisozima
que degrada las paredes bacterianas).
• Virus en suspensión: Tras un paso inicial de concentración por centrifuga-
ción el método más empleado es el de la degradación de las envueltas de
los virus con detergentes y tratamiento con proteasas de baja especificidad
como la proteinasa K.
• Cultivos celulares y tejidos: En el caso de tejidos el paso previo es la dis-
gregación celular mediante tratamiento enzimático (con colagenasa) o
mecánico (ruptura en mortero con nitrógeno líquido) seguido de una
homogeneización en un homogenizador. El tratamiento de elección depen-
de de la consistencia del tejido de partida (tejido animal o vegetal) y la can-
tidad de partida. En el caso de cultivos celulares, el paso previo es la obten-
ción de la suspensión celular, bien mediante raspado directo de las células
sobre las placas de cultivo, bien por tratamiento enzimático con tripsina.
Una vez obtenidas las suspensiones celulares la rotura de las células se rea-
liza por tratamiento con detergentes iónicos o no iónicos o directamente
por la adición de solventes orgánicos.
2. Fraccionamiento celular. Una vez obtenido el homogeneizado se procede a

la separación y eliminación de los lípidos, azúcares y proteínas de los AN. El
fraccionamiento utilizado de forma habitual implica una digestión previa
con proteinasa K seguida de extracciones empleando solventes orgánicos en
los cuales no son solubles ni proteínas ni AN La extracción en fenol de los
homogeneizados seguida de centrifugaciones ha sido el método tradicional
de obtención de los AN, fundamentalmente ADN.
La elección del procedimiento de fraccionamiento dependerá del propósi-
to final al cual se destine el ácido nucleico y el tipo del mismo; por lo gene-
ral si es ADN de alto peso molecular se suelen emplear tratamiento suaves

(sin agitar o pipetear) que evitan la rotura de las moléculas de ADN, este
ADN es susceptible de ser empleado en la construcción de genotecas a par-
tir de ADN genómico. En el caso de ARN se han empleado soluciones que
llevan agentes caotrópicos como el isotiocianato de Guanidina o cloruro de
guanidina que desnaturalizan y destruyen las ARNasas que pudieran dañar al
ARN a purificar.
Al final de esta etapa de fraccionamiento se suele obtener una fracción
acuosa con los AN y algunas proteínas contaminantes. Es posible ya el ais-
lamiento directo de ambos AN mediante precipitación llevando la fase acuo-
sa a una determinada concentración de sal y añadiendo un alcohol (etanol o
isopropanol). La concentración de sal, los volúmenes de alcohol y la tem-
peratura determinan una precipitación selectiva de uno o ambos AN, que se
recogen posteriormente por sedimentación tras una etapa de centrifugación.
Normalmente el ADN precipita en forma de hebras mientras que el ARN lo
hace como copos.
A la etapa de sedimentación le sucede una etapa de secado y resuspensión
en una solución adecuada, a ser posible estéril y libre de nucleasas. El ADN
así obtenido es susceptible de ser digerido por enzimas de restricción o modi-
ficado por otras enzimas de ácidos nucleicos.
3. Purificación. Si el propósito del ADN es analítico (secuenciación) o si se va
a utilizar para introducirlo en células (tranfección) o se van a aislar distintos
tipos de moléculas (mARN de ARN totales) se suelen llevar a cabo procesos
de purificación adicionales. Estos procesos de purificación se basan en dos
tipos de técnicas:
Centrifugación: Se emplea la sedimentación en gradientes de sedimenta-
ción alcalinos de sacarosa (que informan acerca de la conformación de las
moléculas de ADN) o en gradientes de densidad de cloruro de cesio (CsCl).
Este último método es un método de purificación basado en la gran diferen-
cia de densidad de las proteínas y el ADN en un gradiente de CsCl. El ADN
obtenido por este método es de gran pureza, además, si el gradiente de den-
sidad generado con el CsCl se realiza en presencia de bromuro de etidio, es
posible separar moléculas de ADN circulares intactas de moléculas de ADN
circulares con cortes en alguna de las cadenas. Esta tediosa técnica se ha
empleado muy frecuentemente en el pasado para la obtención de plásmidos
(vectores transmisión de información genética)
Cromatografía: Actualmente se emplean microcolumnas de cromatogra-
fía, disponibles comercialmente, preempaquetadas con distintas matrices
capaces de retener y eluir selectivamente los distintos AN de banda simple o
doble. En otros casos el tratamiento de las soluciones de AN con pequeñas
bolitas modificadas químicamente permite la purificación de subpoblaciones
de moléculas de ADN o ARN.
Hoy en día en los laboratorios de biología molecular se dispone de un catálogo

muy amplio de productos específicamente diseñados para el objetivo perseguido
por el investigador y en función de sus necesidades. La mayoría de estos productos
no emplean los disolventes orgánicos anteriormente tratados y se basan en el
empleo de columnas desechables que suelen ahorrar tiempo de procesamiento y rin-
den el producto específico buscado: ARN poliadenilado, ADN circular o lineal, de
doble cadena o cadena sencilla.
Métodos de detección de ácidos nucleicos:
Métodos de detección-cuantificación directos
Una vez obtenidos los AN el siguiente paso lógico es la cuantificación de los

mismos; para ello se han empleado tres tipos básicos de valoración de los AN:
Métodos biológicos: Son métodos que implican que los AN obtenidos sean bio-
lógicamente activos para poder someterlos a reacciones enzimáticas. Estos métodos
no suelen ser muy utilizados para cuantificación, por citar algún ejemplo: la valo-
ración de la eficiencia de transformación (en un determinado rango de concentra-
ción de ADN existe una relación lineal entre colonias de transformantes que toman
el ADN y la concentración del ADN empleado). En el caso de ARN mensajero, la
eficiencia de síntesis in vitro de una proteína es, en determinadas condiciones, una
relación directa de la cantidad de ARN mensajero del ensayo.
Métodos físicos: Los métodos físicos se basan fundamentalmente en la medida
espectrofotométrica de la cantidad de radiación ultravioleta (UV) absorbida por las
bases nitrogenadas de los AN. Este método es el más empleado si la muestra es rela-
tivamente pura (sin cantidades significativas de contaminantes tales como proteí-
nas, fenol o agarosa). Las determinaciones se realizan midiendo la absorción de la
muestra a dos longitudes de onda UV a 260 y 280 nm. La relación entre la absor-
ción a ambas longitudes de onda indica (DO260/DO280) determina la pureza de la
muestra: Muestras puras de ADN o ARN presentan valores de DO260/DO280 de 1,8
y 2,0 respectivamente, valores inferiores indican una contaminación de la muestra
con proteína o fenol. La lectura de absorción a 260 nm indica la concentración de
AN en la muestra, un valor de DO260 = 1 corresponde a 50 μg/mL de ADNdc, 40
μg/mL de ADNcs o ARN y 20 μg/mL de oligonucleótidos de cadena simple.
El principal inconveniente de esta técnica radica el bajo grado de sensibilidad y
que no es posible cuantificar por separado ADN, ARN y oligonucleótidos.
Métodos químicos: Se basan en reacciones de los AN con reactivos adecuados
que originan complejos coloreados o fluorescentes. Tradicionalmente se emplearon
métodos específicos de baja sensibilidad como el del orcinol para el ARN (el orci-
nol en presencia de FeCl2 reacciona con la ribosa del ARN y origina un complejo de
color verdoso) o la difenilamina para el ADN (la difenilamina reacciona con las 2’-
deoxipentosas del ADN y genera, en medio ácido, un color azulado); sin embargo
los métodos más empleados actualmente emplean agentes que permiten cuantificar
cantidades del orden de pg (10-12 g) y ng (10-9 g). Los agentes más empleados son
el bromuro de etidio, Sybr Green®, azul de metileno y naranja de acridina:
Bromuro de etidio: La determinación se basa en valorar la fluorescencia emitida
por el bromuro de etidio intercalado entre las bases nitrogenadas del ADN o ARN al
irradiar la muestra con luz UV de 300 nm de longitud de onda. Puesto que la canti-
dad de fluorescencia emitida es proporcional a la masa total del ADN, la cantidad de
ADN en una muestra puede ser estimada comparando el rendimiento de fluorescen-
cia de la muestra con una serie de estándares de ADN de concentración conocida.
Mediante este método es posible detectar visualmente concentraciones entre 1-5 ng
totales de ADNdc. Dado que la afinidad del bromuro de etidio por AN de cadena sen-
cilla, es relativamente baja comparada con la afinidad por AN de cadena doble, la
sensibilidad para la cuantificación de ADNcs y ARN es también menor.
Sybr Green®: El mecanismo de actuación del fluorocromo Sybr Green® es simi-
lar al del bromuro de etidio pero es menos carcinogénico que él y el nivel de sensi-
bilidad es mucho mayor (25-100 veces más sensible). El fluorocromo es capaz de
unirse a ADNdc, ADNcs y ARN y sólo manifiesta fluorescencia cuando está unido
al AN y se irradia la muestra con luz UV. La sensibilidad de este método alcanza
entre 20 y 60 pg de ADNdc y 1-2 ng para ARN, ADNcs y oligonucleótidos.
Azul de metileno y naranja de acridina: Los niveles de sensibilidad de estos dos
reactivos están muy lejos de los dos anteriores (40-200 ng de ADNdc para el azul
de metileno 50-100 ng de ADNdc y ADNcs respectivamente, para el naranja de
acridina), sin embargo, el hecho de tratarlos se debe a que el azul de metileno no es
tóxico y el naranja de acridina permite distinguir entre moléculas de cadena senci-
lla (presentan fluorescencia en color rojo) y cadena doble (que presentan fluores-
cencia en color verde.).
La mayoría de estos colorantes químicos no solo se emplean para cuantificar los
AN en solución, sino que son ampliamente utilizados para visualizar las moléculas
de los mismos cuando se separaran por electroforesis en gel como veremos más
adelante.
Métodos de detección por hibridación: Southern y Northern
Las principales técnicas de detección/identificación de AN se basan en la com-

plementariedad de bases, propiedad química que hace que dos cadenas simples de
ácidos nucleicos se unan o apareen entre sí al establecerse puentes de hidrógeno
entre las bases nitrogenadas complementarias de cada cadena. Esta propiedad hace
que dos cadenas complementarias de un AN (ADNdc o ARNdc o híbrido
ADN/ARN) puedan ser separadas individualmente (desnaturalizadas) mediante
distintos tratamientos y luego vuelvan a unirse de forma espontánea al cesar el pro-
ceso de desnaturalización.
Las técnicas que aprovechan esta propiedad se denominan técnicas de hibrida-
ción, las principales son el Southern y el Northern. La idea es obtener un fragmen-
to de ADN (denominado sonda) o ARN (ribosonda) de cadena sencilla marcado de

alguna forma (isotópica, fluorescente o enzimáticamente), que, en presencia de una
población de moléculas de ADN o ARN, sea capaz hibridar o aparearse con secuen-
cias complementarias presentes en esa población de AN. La marca de la sonda
hibridada nos identificará la molécula de interés de la población total.
Las técnicas de hibridación normalmente requieren de un paso de separación e
inmovilización de las poblaciones o fragmentos de ácidos nucleicos previo a la
identificación con sondas. Normalmente el paso suele ser la electroforesis.
Electroforesis de AN. Los ácidos nucleicos sometidos a electroforesis van a
migrar en el campo eléctrico generado hacia el cátodo (b+) debido a su carga neta
negativa. Su velocidad vendrá determinada por su tamaño molecular y el tamaño de
poro determinado por la composición de la matriz. La electroforesis a través de
geles de agarosa o poliacrilamida es un método estándar de separación, identifica-
ción y purificación de fragmentos de AN principalmente ADN. La localización de
fragmentos de ADN o poblaciones de ARN dentro del gel puede ser determinada
por tinción del gel con un agente intercalante de los AN como son el bromuro de eti-
dio o Sybr Green®; así, bandas discretas de ADN o ARN pueden ser identificadas
mediante visualización del gel teñido expuesto a la luz ultravioleta. Si fuera nece-
sario, es posible aislar las moléculas de AN que componen una banda discreta y
recuperarlas del gel para su empleo en variedad de aplicaciones.
Los geles de agarosa y poliacrilamida se pueden emplear en multitud de tama-
ños, grosores y porosidades y desarrollar la electroforesis en diferentes configura-
ciones. La elección depende principalmente del tamaño de los fragmentos a sepa-
rar:
• Los geles de poliacrilamida en vertical son el método de elección más efecti-
vo en la separación de pequeños fragmentos de ADN (5 A 500 pb —pares de
bases—). El poder de resolución es tan alto, que es posible separar fragmen-
tos de ADN que difieren en tamaño en 1 pb, como ocurre en el caso de la
secuenciación de ADN. Los principales inconvenientes de los geles de polia-
crilamida son: la neurotoxicidad de la acrilamida y la dificultad de prepara-
ción y manejo.
• Los geles de agarosa poseen un poder de resolución mucho menor pero pre-
sentan a su favor una amplio rango de separación para fragmentos de alto peso
molecular (100 pb A 50 Kpb). Normalmente los geles de agarosa se desa-
rrollan en horizontal y sumergidos en el tampón de electroforesis.
Existen una serie de factores que afectan la migración de los AN sometidos a

electroforesis, entre todos ellos destacaremos:
— Tamaño o peso molecular: Moléculas lineales de AN de cadena doble migran
a través de la matriz del gel a velocidades inversamente proporcionales al
logaritmo decimal de su peso molecular en pb. La moléculas de alto peso
molecular migran más lentamente que las de bajo peso molecular debido al
efecto de filtrado ejercido por el tamaño de poro de la matriz del gel.
— Porosidad de la matriz del gel: Un fragmento lineal de AN migra a diferen-

te velocidad en función del tamaño de poro del gel. Usando geles de dife-
rentes concentraciones de agarosa o poliacrilamida es posible resolver dis-
tintos rangos de tamaños de AN.
— Conformación del AN: La conformación de las moléculas también influye
sobre la velocidad de migración, en presencia de bromuro de etidio las molé-
culas lineales son las más lentas, a continuación las moléculas circulares con
cortes y las más rápidas son las moléculas circulares cerradas.
Técnicas de Southern y Northern. En realidad se trata de una única técnica de
hibridación con sondas con dos variaciones: El Southern trata de identificar unas
moléculas de ADN concretas en una población general de moléculas de ADN sepa-
radas por electroforesis e inmovilizadas en un filtro mediante el empleo de una
sonda específica (ya sea sonda o ribosonda). La técnica del Northern trata de reali-
zar el mismo objetivo pero sobre una población de moléculas de ARN.
En resumen, la técnica de Southern identifica por hibridación moléculas espe-
cíficas de ADN mientras que la técnica de Northern identifica por hibridación molé-
culas específicas de ARN.
Ambas técnicas se basan en la capacidad de adsorción selectiva que tienen
las membranas de nitrocelulosa para retener específicamente ADN o ARN de
cadena sencilla. Si bien en un principio fue la nitrocelulosa el soporte emple-
ado, en la actualidad existe una amplia oferta comercial de membranas adap-
tadas a la fijación específica de AN de cadena sencilla o doble, diseñadas para
ADN y/o ARN que, mediante la unión covalente de las moléculas inicial-
mente adsorbidas, permiten su empleo sucesivas veces. Las más utilizadas en
la actualidad son las membranas de nailon cargadas positivamente. Aunque
cada fabricante refiere las condiciones para una retención óptima del AN con
su membrana, el procedimiento general se describe a continuación:
1. En un primer paso la población de moléculas se separa por electroforesis,
esta población puede variar desde un ADN genómico de alto peso molecular
digerido con enzimas de restricción hasta el ARN total de un tejido o cultivo
celular. En el caso de electroforesis de ARN, ésta se realiza en condiciones
desnaturalizantes (en presencia de formaldehído o glioxal) de forma que el
ARN migre en el gel como moléculas lineales en función sólo de su peso
molecular.
2. Tras la electroforesis, el gel, conteniendo las distintas poblaciones de AN
separadas por peso molecular, se somete a un tratamiento desnaturalizante de
forma que todas las moléculas sean de cadena sencilla. Este tratamiento se
suele realizar con una solución de alta sal y con hidróxido sódico, después
se neutraliza el gel en condiciones de alta sal para evitar que las cadenas des-
naturalizadas por acción del hidróxido sódico vuelvan a hibridar entre sí. En
el caso del ARN no es necesario este tratamiento desnaturalizante.
3. El siguiente paso es la transferencia de las moléculas de AN desnaturalizadas
desde el gel de electroforesis hasta la membrana de nitrocelulosa o nailon.
Existen tres métodos de transferencia básicos, a elección en función de las

características de las membranas a emplear, tipo de gel y AN a transferir:
— Capilaridad: Fue el método empleado originalmente. En este método los
fragmentos de AN son transportados desde el gel hasta el filtro mediante
un flujo de líquido que es mantenido por la acción capilar ejercida por un
bloque de papel absorbente. Obviamente, la velocidad de transferencia es
función del tamaño de poro del gel y del tamaño molecular de los AN: a
menor tamaño molecular mayor movilidad. Normalmente las transferen-
cias por capilaridad se realizan durante una noche (12-15 horas).
— Electrotransferencia: Es un método más rápido que la capilaridad que se
basa en transferir las moléculas de AN desde el gel hasta la membrana a
través de un campo eléctrico empleando un tampón de transferencia. Este
sistema requiere habitualmente de un sistema de enfriamiento del tampón
ya que se genera bastante calor en la transferencia. Este método es el de
elección para transferencias desde geles de poliacrilamida y se lleva a
cabo normalmente entre 2-3 horas.
— Vacío: La transferencia por vacío es extremadamente más rápida y efi-
ciente que la capilaridad. En este método, el gel es puesto en contacto
directo con el filtro y ambos depositados sobre una base porosa conecta-
da a una cámara de vacío. Un contenedor con tampón de transferencia que
es situado encima del gel, proporciona la solución que arrastra los AN
desde el gel hasta el filtro al ser absorbido por el vacío de la cámara infe-
rior. La transferencia se realiza entre 30 minutos y una hora.
4. Una vez obtenido el filtro o membrana con la población de moléculas de AN
separadas y adheridas, el siguiente paso consiste en identificar aquellas molé-
culas que tienen algún interés, para ello es necesario diseñar una sonda que
sirva como anzuelo molecular para «pescar», mediante hibridación, esa
población de moléculas. La dificultad técnica reside en cómo diseñar la
sonda y prepararla para nuestros propósitos. Existen diferentes abordajes:
— Si lo que se persigue es identificar un gen de secuencia no conocida aún,
es posible emplear como sonda un fragmento del gen homólogo de una
especie relacionada.
— Si se conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína que codifica es
posible deducir mediante la equivalencia entre codón (triplete de nucleó-
tidos que codifica por un aminoácido) y aminoácido, la secuencia de
nucleótidos que posee el gen en su parte codificante y poder diseñar y sin-
tetizar sondas ARN que tengan la secuencia complementaria para captu-
rar el fragmento que contenga el gen.
— En el caso de disponer de información de la secuencia de nucleótidos del
gen el procedimiento es igual al anterior: diseño y síntesis de fragmentos
de cadena simple de ADN o ARN que tengan la secuencia complementa-
ria del gen para emplearlos como sonda.
En lo referente a la preparación de la sonda, la elección de la naturaleza

(sonda de ADN o ARN), la longitud de la misma y el tipo de marcaje (isotó-
pico, fluorescente o enzimático, etc.) depende de cada caso, pero en general
la preparación de la sonda se realiza por marcaje in vitro utilizando las enzi-
mas anteriormente descritas y los procedimientos de relleno de extremos,
nick translation, marcajes terminales, etc.
5. Para finalizar, una vez se dispone de la sonda marcada y las poblaciones de AN
inmovilizadas en el filtro, los pasos finales se destinan a lograr que las molé-
culas de sonda busquen e hibriden con las moléculas de AN que poseen la
secuencia complementaria. La hibridación se lleva a cabo en recipientes her-
méticos, (bolsas selladas o tubos cerrados), a elevada temperatura que ponen en
contacto el filtro con el AN y una solución de hibridación que contiene las
moléculas de sonda y una serie de aditivos que optimizan y favorecen la hibri-
dación. La temperatura a la cual se realiza el proceso de hibridación es un pará-
metro crítico ya que va a determinar la formación del híbrido específico entre
la sonda y las moléculas de AN diana. Una temperatura demasiado baja pro-
ducirá hibridaciones inespecíficas por apareamientos parciales de la sonda con
fragmentos que sólo sean complementarios con alguna región de la sonda.
Una temperatura demasiado alta evitará la hibridación entre la sonda y el AN.
6. Pasado el tiempo de hibridación se procede a la identificación del AN que ha
hibridado con las moléculas de sonda, para ello se lava el filtro para eliminar
las moléculas de sonda que no estén completamente hibridadas a su AN com-
plementario y se procede a revelar la señal portada por la sonda:
— Si el marcaje de la sonda es isotópico o fluorescente, la energía de la
radiación o fluorescencia se utiliza para impresionar películas autorradio-
gráficas, de forma que una vez expuesto el filtro con la película y revela-
da ésta es posible identificar las bandas hibridadas al aparecer éstas como
bandas de color gris o negro sobre un fondo claro.
— Si el marcaje de la sonda es enzimático, el revelado puede ser directo
sobre el mismo filtro, utilizando algún sustrato colorante que reacciona
con la enzima de la sonda y permite la visualización o emite quimiolumi-
niscencia que es detectada, de forma indirecta, mediante una película
autorradiográfica.
Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos

La variabilidad de las moléculas de los AN no radica en su estructura ni en la
diversidad de sus componentes, sino en el orden secuencial de los cuatro nucleóti-
dos constituyentes de sus moléculas (A, G, C y T para el ADN y A, G, C y U para
el ARN). Dado que diferencias de un solo nucleótido en una secuencia pueden
representar un enorme cambio en la proteína codificada, el último paso en el cono-
cimiento de los AN reside en la determinación de su secuencia constituyente.
Secuenciación del ADN
Existen dos técnicas básicas rápidas para obtener la secuencia correcta de un

ADN: secuenciación por el método de degradación química y secuenciación por el
método enzimático. Aunque diferentes en el abordaje ambos métodos comparten
algunos puntos:
• Es necesario el marcaje (isotópico o fluorescente) de las moléculas a
secuenciar.
• Es necesario generar una población de moléculas de ADNcs marcadas en un
extremo cuyo tamaño molecular difiera únicamente en un solo nucleótido.
Esta población de moléculas puede ser separada en sus elementos constitu-
yentes, que difieren en una sola base, mediante electroforesis en geles des-
naturalizantes de poliacrilamida. El orden de los nucleótidos en el ADN
puede ser leído directamente de la imagen del gel obtenida por autorradio-
grafía o por un sistema automático de lectura asistida por computador.
Método de secuenciación por degradación química: Fue descrito inicialmente
por Maxam y Gilber en 1977 y modificado en 1980. El método implica un marca-
je de la molécula a secuenciar en uno de sus extremos. Este marcaje terminal se
lleva a cabo en los extremos 5’ P mediante la acción de la enzima T4 polinucleótido
quinasa que incorpora un grupo radiactivo 5’[a32P o a35S]. Como el marcaje termi-
nal se verifica en ambas cadenas del ADNdc es necesario separarlas para la secuen-
ciación de cada una individualmente (mediante el corte con una enzima de restric-
ción por ejemplo). El marcaje terminal genera de esta forma una población de
moléculas idénticas marcadas en su extremo 5’. El siguiente paso es separar la
población en cuatro muestras que se someterán, por separado, a una degradación
química específica para una base o tipo de base (púricas: A+G o pirimidínicas
T+C). Las condiciones de reacción con los reactivos específicos son tales que sólo
se permita una modificación de una(s) base(s) por molécula. De esta forma distin-
tas moléculas, para un mismo tratamiento, serán modificadas en diferentes puntos
susceptibles de degradación. Se emplean cuatro tipos de reactivos específicos, el
primero modifica los residuos de guanina (G), el segundo modifica las purinas: ade-
nina (A) y guanina (G) (A+G), el tercer reactivo modifica los residuos de timina (T)
y el último ataca las citosinas (C). El tratamiento final de estas moléculas con otro
reactivo (piperidina) rompe la cadena por la base modificada. Cada tratamiento
individual ha generado una población de moléculas que poseen un extremo 5’ ter-
minal común marcado y se alargan hasta el punto en donde la base específica fue
modificada. Las moléculas obtenidas por los cuatro tratamientos se separan median-
te electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida cargando cada reac-
ción en pocillos contiguos. La exposición del gel seco a una película de autorradio-
grafía hace que se obtenga una escalera decreciente de fragmentos radiactivos que
permiten la lectura secuencial de los nucleótidos modificados desde el extremo
inferior del gel (representado por el nucleótido más próximo al extremo 5’ marca-
do) hasta la parte superior del gel (que representa los extremos más alejado del mar-
caje terminal). Este método de secuenciación cuando está optimizado permite la

lectura directa de fragmentos de unos 250 nucleótidos como máximo, pero presen-
ta una gran ventaja: la secuenciación es directa sobre moléculas de ADN originales,
a diferencia del método enzimático que la secuencia se determina a partir una copia
generada del fragmento molde a secuenciar.
Método de secuenciación enzimática: Fue descrito inicialmente por Sanger en
1977. Es conocido como método de terminación de cadena por dideoxinucleótidos
trifosfatos (ddNTPs). El método se basa en obtener una población de moléculas
marcadas sintetizadas a partir del ADN molde del cual queremos obtener la secuen-
cia, para ello se necesita un cebador que proporcione el extremo 3’-OH libre para
la síntesis del ADN por la acción de una polimerasa. Este oligonucleótido cebador
suele ser específico y complementario de una secuencia de localización concreta en
el fragmento del ADN molde a secuenciar o próxima a él en el vector de secuen-
ciación. Las enzimas empleadas para la síntesis del ADN que vamos a marcar
radiactivamente (normalmente usando _ 35S dATP) son el fragmento Klenow de la
ADNpol I o más frecuentemente la Secuenasa®. Al igual que con el método de
secuenciación química, el ADN a secuenciar se divide en cuatro muestras y en cada
una individualmente se llevarán a cabo reacciones específicas para cada base (A, T,
G, C). Las reacciones de secuenciación individuales se llevan a cabo en dos pasos:
En el primer paso el cebador se hibrida con el ADN molde y se inicia la síntesis

del ADN complementario hasta una distancia determinada del punto de hibridación,
esta síntesis se lleva a cabo en presencia de los cuatro, dNTPs incluyendo el _ 35S
dATP marcado isotópicamente.
En el segundo paso se incorpora a cada reacción una pequeña cantidad de un
dideoxirribonucleótido análogo de la base específica que queremos identificar, así
en la muestra de identificación de la adenina (A) se añade dideoxirriboadenosina tri-
fosfato (ddATP), a la muestra de la citosina se le añade dideoxirribocitosina trifos-
fato (ddCTP) y lo mismo en las muestras restantes, ddTTP y ddGTP. La adición de
los ddNTPs provoca la terminación de las cadenas que estaban siendo elongadas
cuando incorporan el ddNMP. Los dideoxirribonucleótidos, al carecer de grupos
-OH tanto en el carbono 2’ como en el 3’ de la ribosa, imposibilitan el crecimiento
de la cadena en la que se han incorporado y se paraliza su síntesis.
El resultado final en cada muestra es una población de fragmentos, de tantos
tamaños como unidades de la base en concreto existan en la secuencia. Los frag-
mentos generados se cargan y separan por electroforesis, como en el caso anterior,
y la secuencia se lee directamente por autorradiografia del gel de igual forma. Este
método permite leer por encima de 300 nucleótidos.
Métodos de secuenciación automática del ADN
La incorporación de la informática y la microelectrónica al campo de la secuen-

ciación y la carrera por la obtención de la secuencia completa del genoma humano
han llevado al desarrollo de sistemas automatizados para obtener y analizar la

secuencia de bases de cualquier ADN. Existen dos sistemas básicos de secuen-
ciación automática:
Secuenciación por hibridación: Microchips de ADN. Es un método, actual-
mente en desarrollo, basado en utilizar oligonucleótidos sintéticos de secuencia
conocida inmovilizados en un soporte de vidrio modificado o polipropileno que per-
miten la hibridación y detección de fragmentos de ADN marcados (con fluorocro-
mos o isotópicamente) de secuencia desconocida. Un ordenador, con el software
apropiado se encarga de la lectura del microchip de ADN y determina la secuencia
del ADN.
Secuenciación automática con fluorocromos: Es una adaptación del método de
secuenciación enzimática que permite eliminar el marcaje radiactivo y automatizar
las fases de manipulación del gel y lectura de la secuencia. Las reacciones de
secuenciación se realizan mediante la técnica de PCR. El marcaje de la población
de moléculas generada por elongación del ADN molde se realiza de dos formas:
1) Marcaje terminal de las cadenas terminadas, cada uno de los cuatro dideoxi-
rribonucleótidos de terminación de cadena lleva conjugado un fluorocromo dife-
rente. Esta estrategia ha sido utilizada por la empresa Celera en la secuenciación del
genoma humano.
2) Marcaje de cebadores. Las moléculas de cebadores de cada reacción se mar-
can con un único fluorocromo o bien con diferentes tipos de fluorocromo. En la pri-
mera opción, cuando las cadenas han sido terminadas por los dideoxirribonucleóti-
dos cada reacción se lee mediante un rayo láser en pocillos separados de un gel de
electroforesis. El rayo láser manda la información del tamaño del fragmento detec-
tado en cada pocillo a un ordenador, que se encarga de ordenar los fragmentos y
proporcionar la secuencia. En la segunda opción, como los cebadores están marca-
dos de forma diferencial con diferentes fluorocromos, las cuatro reacciones se car-
gan en un único pocillo y son leídas directamente por el rayo láser. Como los espec-
tros de emisión de cada fluorocromo son distintos el láser envía directamente al
ordenador información de la secuencia a medida que los fragmentos, con diferentes
pesos moleculares, pasan por el detector. Con estos métodos de secuenciación rápi-
da es posible determinar un total de unas 600 bases con fiabilidad.
Es posible utilizar también el método de marcaje con fluorocromos para reali-
zar de una forma automatizada la secuenciación por degradación química. La única
diferencia es que son las moléculas originales de ADN las que resultan marcadas
con el/los fluorocromo/s.
Secuenciación del ARN
Al igual que en la secuenciación del ADN existen las mismas técnicas rápidas
para obtener la secuencia correcta de un ARN: secuenciación por el método de
degradación química y secuenciación por el método enzimático. Las consideracio-
nes establecidas para la secuenciación del ADN son también válidas aquí: el mar-
caje (isotópico o fluorescente) de las moléculas a secuenciar y la generación una

población de moléculas de ARN marcadas en un extremo cuyo tamaño molecular
difiera únicamente en un solo nucleótido que se resuelve posteriormente en sus ele-
mentos constituyentes mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de polia-
crilamida. El orden de los nucleótidos en el ARN es establecido de la lectura direc-
ta de una autorradiografía del gel.
Método de secuenciación por degradación química: Se procede al marcaje 5’
terminal de la moléculas de ARN mediante la acción de la enzima T4 polinucleótido
quinasa que incorpora un grupo radiactivo 5’[a32P o a35S]. El siguiente paso es sepa-
rar la población en cuatro muestras que se someterán, por separado a una degrada-
ción química específica para una base o tipo de base (puricas: A+G o pirimidinicas
U+C). Las condiciones de reacción y los reactivos empleados son diferentes a los
empleados en la secuenciación del ADN pero los pasos de separación de las molé-
culas por electroforesis y lectura de la secuencia son equivalentes.
Método de secuenciación por degradación enzimática: Este método no es equi-
valente al método enzimático de secuenciación del ADN, en realidad es una varia-
ción del método anterior de degradación química pero utilizando la especificidad de
corte de ribonucleasas para degradar específicamente una base o grupo de bases.
Así la ribonucleasa T1, ARNasa T1 corta en guaninas (G), la ARNasa P corta en piri-
midinas (C+U), la ARNasa U2 corta en adeninas (A) y la ARNasa I corta en adeni-
nas, guaninas y uracilos (-C).
Una estrategia alternativa es secuenciar el ARN a través de su copia a ADNc y
secuenciar el ADNc de cadena sencilla mediante los métodos de secuenciación del
ADN. Si el ARN a secuenciar es un ARN mensajero eucariótico, la cola de poli-A
del extremo 3’ puede servir de molde para un corto cebador poliT. La hibridación
del cebador e incubación de ambos con una transcriptasa reversa en presencia de
dNTPs provoca la síntesis de la cadena de ADNc sobre el molde de ARN. La eli-
minación posterior del ARN molde mediante la adición de ARNasa H, libera las
moléculas de ADNc de cadena simple que puede ser secuenciado directamente por
cualquier método de secuenciación de ADN. En el caso de que los ARN a secuen-
ciar carezcan de cola de poli-A, la estrategia es la misma pero utilizando la activi-
dad de la enzimas poli-A polimerasa para añadir una cola de poli-A que sirva de
secuencia de enganche al cebador poli-T para la síntesis de la cadena complemen-
taria de ADNc.
Aplicaciones de la secuenciación de ácidos nucleicos
Los métodos de secuenciación automatizada han supuesto una revolución bio-

tecnológica, si en principio se procedió a la determinación de la secuencia de bases
de genes codificantes de proteínas conocidas como la insulina, citocromo c, hemo-
globina, interferones, etc., y se procedió al estudio de las mutaciones que generaban
diferentes enfermedades genéticas como la hemofilia A y talasemias, en la actuali-
dad se está abordando el proceso inverso, el denominado clonaje posicional, la idea
es proceder a secuenciar grandes regiones del genoma y localizar posteriormente

enfermedades cuyos marcadores citogenéticos estén relacionados con los genes
descubiertos en dichas regiones y de los cuales se desconoce la función de la pro-
teína o proteínas que provocan la enfermedad.
Los intereses científicos y económicos implicados han desencadenado una ver-
dadera carrera para obtener la secuencia completa del genoma humano (3 × 10 9
pares de bases). La secuencia completa identificará unos 35.000 nuevos genes que
constituirán un verdadero diccionario del ser humano y cuya información será
empleada (bajo patente) para generar nuevos agentes terapéuticos en cuatro áreas
principales:
• Terapia Génica: Cada nuevo gen descubierto posee el potencial de uso en
terapia génica humana. La terapia génica se empleará para el tratamiento del
cáncer, enfermedades genéticas y enfermedades inducidas por virus (SIDA
hepatitis, etc.).
• Terapia Proteica: Cada nuevo gen puede emplearse para generar su corres-
pondiente proteína recombinante que pueda usarse como agente terapéutico
en distintas enfermedades. Ejemplos actuales son la eritropoyetina, interfero-
nes, hormona de crecimiento o la insulina.
• Estudios farmacogenómicos: Puesto que el genoma humano contiene nume-
rosas variaciones denominadas polimorfismos no existen dos individuos igua-
les. Cuando estas variaciones afectan a regiones codificantes de genes, las
proteínas de distintos individuos pueden manifestar diferentes comporta-
mientos en términos de eficacia o efectos secundarios, frente a una droga
determinada. La correlación entre cambios en el genoma y el estudio de los
efectos farmacológicos de una droga se conoce como farmacogenómica. Un
ejemplo de un gen con diferentes variantes polimorficas que afectan al meta-
bolismo de drogas terapéuticas es el gen del citocromo P450.
• Diseño Químico: Cada nuevo producto génico es una nueva diana para desa-
rrollar, mediante ingeniería química, nuevas moléculas capaces de interaccionar
con él aumentando o bloqueando su actividad. (Generación de moléculas blo-
queantes de receptores celulares, bloqueo de moléculas de anticuerpos, etc.).
• Otras aplicaciones de la secuenciación de los AN se encuentran en el campo
de la medicina forense o en estudios epidemiológicos.
Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR puede definirse como un méto-
do enzimático in vitro que permite la amplificación selectiva de una secuencia de
ADN dada. Este mecanismo de amplificación selectivo in vitro mimetiza el proce-
so de replicación del ADN in vivo.
Para entender la reacción de PCR es necesario recordar varios puntos principales:
• Las dos cadenas de ADN forman una doble hélice.
• La secuencia de bases en ambas cadenas de la molécula de ADN es comple-

mentaria.
• La orientación de ambas cadenas es opuesta:
La cadena sentido posee orientación. 5’ A 3’
La cadena antisentido posee orientación 3’ A 5’.
• Todas las polimerasas conocidas sintetizan ADN en el sentido 5’ A 3’.
La PCR consiste en la amplificación de copias de ADN por medio de la repeti-
ción de unas reacciones cíclicas, que constan de tres pasos que se realizan a dife-
rentes temperaturas: 1) desnaturalización 2) hibridación y 3) extensión.
En el primer paso, desnaturalización, las moléculas de ADN de doble cadena se
desnaturalizan por calor; la temperatura, entre 92-95 °C, rompe los puentes de hidró-
geno que mantienen unidas las dos cadenas complementarias y se separan entre sí
como cadenas sencillas de ADN que servirán de moldes para la amplificación.
En el segundo paso, hibridación, dos tipos de moléculas cebadoras (primers)
cuyas secuencias son complementarias a los extremos de la secuencia a amplificar
en el ADN, hibridan específicamente con las secuencias presentes en las moléculas
de ADN molde desnaturalizadas anteriormente. La temperatura de hibridación varía
entre 60-40 °C en función de la longitud y secuencia de los cebadores. Una vez
hibridadas las moléculas de los cebadores al ADN molde se generan cortos frag-
mentos de ADN de doble banda que sirven como puntos de partida para la posterior
polimerización.
En el tercer paso, extensión, una ADN polimerasa termorresistente sintetiza una
cadena complementaria a cada una de las cadenas molde, adicionando nucleótidos
al extremo 3’ del cebador hibridado. La reacción de elongación se realiza a una tem-
peratura próxima a los 72 °C y se realiza en ambas cadenas en dirección de la
secuencia que se quiere amplificar. Al final del proceso de extensión se generan dos
nuevas moléculas de ADN de cadena doble idénticas a la original en la secuencia
amplificada.
Las nuevas cadenas sintetizadas sirven a su vez, además del ADN original,
como moldes en el siguiente ciclo de reacción. Los ciclos se repiten un número
variable de veces entre 20-45, resultando una acumulación exponencial del frag-
mento de ADN amplificado delimitado por cebadores: en teoría, después de 20
ciclos de amplificación se obtendría un millón de copias de la secuencia amplifica-
da, después de 30 ciclos 1.000 millones de copias. A medida que aumenta el núme-
ro de ciclos se incrementa la cantidad de moléculas en las cuales sólo se amplifica
la región de interés comprendida entre ambos cebadores. Esta cantidad de ADN
amplificado es más que suficiente para ser visualizado y cuantificado por los méto-
dos espectofotométricos o directamente en geles de electroforesis con colorantes
como el BrEt o Sybr-green®.
El ARN puede también servir de molde para la PCR (RT-PCR), pero se necesi-
ta un paso previo de síntesis a ADNc catalizada por una transcriptasa reversa.
Actualmente se encuentran disponibles comercialmente ADN polimerasas termo-
rresistentes con actividad transcriptasa reversa que permiten la realización de que

ambas reacciones de forma secuencial con una sola enzima y en el mismo tubo de
reacción.
Las reacciones de PCR se encuentran totalmente automatizadas por el uso de
aparatos llamados termocicladores que realizan de forma autónoma los ciclos de
subidas y bajadas de temperatura. Cada ciclo de reacción (desnaturalización-hibri-
dación-extensión) se repite una y otra vez en menos de 3-4 minutos, por lo que en
menos de dos horas se pueden generar más de 1.000 millones de copias de la
secuencia deseada.
Desde la publicación en 1985 del método de la amplificación específica de frag-
mentos de ADN por Mullis, Saki y colaboradores, la reacción en cadena de la
Polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) ha producido un cambio revolu-
cionario en las tecnologías aplicadas al diagnóstico y la investigación. La PCR se ha
convertido en un procedimiento rutinario, imprescindible en cualquier laboratorio
de biología molecular debido a su capacidad para amplificar fragmentos de ADN (o
ARN) de forma específica. La posibilidad de automatización de esta técnica abre un
potencial ilimitado de aplicaciones, entre las cuales podemos destacar:
• Diagnóstico genético pre y postnatal de enfermedades genéticas.
• Estudio y análisis de mutaciones en enfermedades genéticas.
• Diagnostico general (sanidad, agricultura y ganadería) de enfermedades infec-
ciosas causadas por diferentes organismos (virus, bacterias o parásitos unice-
lulares).
• Aislamiento de genes a partir de genotecas.
• Estudios epidemiológicos.
• Estudios de evolución molecular entre especies.
• Obtención de huellas genéticas aplicables a medicina forense (estudios de
paternidad y análisis de muestras de ADN en casos forenses de crímenes o
violaciones).
La extraordinaria y rápida contribución de esta metodología en proyectos médi-
cos, industriales y de investigación fue reconocida por la concesión del Premio
Nobel de Medicina a su autor, K. Mullis, sólo ocho años después de su descubri-
miento.
13
La ingeniería genética II.
Proteínas recombinantes
Introducción
Como se indicó en la introducción con la tecnología del ADN recombinante,
además del avance en conocimientos e investigación básica, uno de los principales
objetivos de la ingeniería genética persigue la producción masiva de proteínas con
alto valor terapéutico en diferentes organismos. Este objetivo implica la reprogra-
mación genética de los organismos para adquirir los genes que les capacitan para la
síntesis de las proteínas de interés. La estrategia a seguir para lograr esta reprogra-
mación conlleva una serie de pasos sucesivos: 1) aislamiento del gen que codifica
para la proteína de interés; 2) inserción del gen en un vector adecuado; 3) transfe-
rencia del vector recombinante al organismo hospedador; 4) selección de los orga-
nismos modificados genéticamente que expresan el gen de interés; 5) caracteriza-
ción del producto clonado; y 6) crecimiento a gran escala de los organismos
genéticamente modificados para la producción industrial de la proteína de interés.
Con la excepción del punto 6) que será objeto de otro capítulo, pasaremos a ana-
lizar los elementos clave implicados en este proceso.
Aislamiento del gen. (Clonaje y subclonaje)

En el caso de proteínas constituidas por un pequeño número de aminoácidos de
los cuales se conoce su secuencia (entre 15-20 aminoácidos), es posible un aborda-
je directo y sintetizar artificialmente el gen teniendo en cuenta el código genético:
tres bases sucesivas en el ADN (codón) codifican por un aminoácido. Conociendo
los codones que codifican de los aminoácidos identificados se procede a la síntesis
química de un oligonucleótido que sería la cadena sencilla codificante de la proteí-
na (cadena con sentido). Una vez sintetizada la cadena con sentido se sintetiza la
cadena complementaria para disponer del fragmento de ADNdc que se incluiría en

el vector adecuado.
Este abordaje tan sencillo, no es posible llevarlo a cabo con proteínas de alto
peso molecular. Puesto que el gen a aislar se encuentra dentro del genoma comple-
to del individuo, el aislamiento del gen del resto de las secuencias implica necesa-
riamente un primer paso de fragmentación del ADN completo del organismo en
fragmentos de un tamaño adecuado de manera que en alguno/s de los fragmentos
generados se encuentre nuestro gen.
El mayor problema de la ruptura del genoma completo es la obtención de frag-
mentos de ADNdc de tamaños adecuados y a la vez que homogéneos. Las técnicas
de ruptura del ADN genómico para la obtención de fragmentos (insertos) son de dos
tipos:
• Roturas inespecíficas: El ADN se rompe por mecanismos físicos como agita-

ción o ultrasonicación. La fragmentación se produce al azar y los fragmentos
generados oscilan entra 300 pb y 40 Kpbs según el método empleado. En
general, las condiciones se eligen para generar fragmentos de tamaño medio
entre 20 y 40 Kpbs, suficientemente grandes para incluir la mayoría de los
genes típicos.
• Roturas específicas: El ADN genómico se digiere mediante enzimas de res-
tricción de tipo II que reconocen y cortan en secuencias específicas. Se suelen
elegir enzimas con dianas de corte de cuatro nucleótidos y las condiciones de
digestión son parciales de forma que no se corten todas las dianas para la enzi-
ma en todas las moléculas de ADN genómico. La enzima de restricción más
empleada es Sau3A.
Con cualquiera de los dos métodos se obtienen poblaciones de insertos de ADN

genómicos en los que se encuentra representada la totalidad del genoma del orga-
nismo que sintetiza la proteína de interés. Estos fragmentos, incluidos en vectores
adecuados, constituirán las llamadas genotecas o librerías genómicas (también lla-
madas bancos de genes).
Un abordaje más adecuado y sencillo siempre que se trate del clonaje de genes
eucarióticos es conseguir fragmentos de ADN que incluyan sólo las secuencias que
codifican para proteínas y buscar el fragmento que codifica nuestra proteína. Para
obtener este tipo de fragmentos se parte del ARN mensajero (ARNm) maduro del
tipo celular donde se expresa la proteína de interés o del organismo completo. Todas
las moléculas de ARNm se copian en ADN complementario o copia (ADNc)
mediante la acción de la enzima transcriptasa reversa. Se obtiene así una población
de fragmentos de ADNc que son representativas de los genes que se expresan en un
momento dado en una población celular. La inserción de estos fragmentos en vec-
tores adecuados da lugar a las genotecas de ADNc o librerías de expresión.
Por lo general, el aislamiento y clonaje de un gen de secuencia conocida no
implicará necesariamente la construcción de una genoteca, en la actualidad se dis-
pone comercialmente de un amplio catálogo de genotecas, tanto genómicas de múl-
LA INGENIERÍA GENÉTICA II 183
tiples organismos, como genotecas de expresión de distintos organismos, tejidos o

fases de desarrollo, para proceder a la búsqueda del gen de interés mediante la téc-
nica de PCR. La secuencia del gen será amplificada del ADN de la genoteca e
incluida en el vector adecuado a través las dianas de restricción presentes en las
moléculas de los primers cebadores. Por si ello no fuera suficiente, existen empre-
sas comerciales capaces de generar genotecas a medida a partir del ADN genómico
proporcionado el investigador o, incluso, proceder al aislamiento directo del clon
que contenga el gen de interés para el investigador.
Inserción del gen en un vector adecuado: Vectores de ADN

Una vez obtenidos los insertos representativos de todo el genoma o sólo de
aquellos genes que se expresan en proteína, se insertan en moléculas genéticas por-
tadoras (vectores).
Los vectores son moléculas especiales de ADN que sirven como vehículos para
la transferencia de ADN a distintos organismos hospedadores. A grandes rasgos es
posible distinguir dos tipos principales de vectores:
• Vectores de clonaje: Son aquellos utilizados para servir únicamente como

vehículos replicativos del ADN que llevan insertado.
• Vectores de expresión: Son aquellos que llevan todos los elementos para la
expresión del gen que va incluido en el inserto una vez introducido en el hos-
pedador adecuado.
Si bien esta diferenciación es válida a nivel conceptual, la gama actual de vec-

tores disponibles hace que las barreras de definición de uno y otro tipo queden a
menudo eliminadas y es posible obtener vectores con ambas características.
Por lo general, se tiende a emplear los vectores de clonaje para la inserción de
grandes fragmentos de ADN (construcción de genotecas de ADN genómico) en los
cuales proceder, posteriormente, a la identificación del fragmento que posee el gen
de interés. Una vez identificado el inserto, se procede a su manipulación (subclo-
naje) para eliminar las secuencias adyacentes hasta obtener un fragmento que sólo
incluya el gen de interés.
Los vectores de expresión se emplean, bien cuando el gen de interés está ya
caracterizado (subclonado), bien para insertar fragmentos de ADNc cuya expresión
es directa (genotecas de ADNc).
La elección del tándem vector-hospedador es crítica a la hora de lograr el fin
experimental de obtener la expresión de una proteína de interés. La elección exige
sólidos conocimientos sobre los mecanismos de replicación/expresión del vector y
sobre los mecanismos de expresión del gen en la célula hospedadora en donde se va
a introducir. Los vectores actuales, tanto para células hospedadoras procarióticas
como para células eucarióticas, son construcciones artificiales muy complejas, ela-
boradas mediante técnicas de ingeniería genética en base a una serie de cualidades:
• Estabilidad, una vez incluido el fragmento de ADN exógeno no debe perder-

lo ni modificarlo.
• Genéticamente heredables a la progenie.
• Fenotipo seleccionable, el vector debe conferir unas características que nos
permitan identificarlo en la población de células hospedadoras (resistencia a
antibióticos, actividad enzimática marcadora, expresión de una proteína fluo-
rescente).
• Número de copias constante y alto para que se incremente el número de
copias del gen mantenidas dentro del hospedador o ser susceptibles de ser tra-
ducidas a proteína.
• Capacidad de replicación en varios tipos de hospedadores (vectores lanzade-
ras).
• Existencia de regiones de control de replicación, expresión compatibles con
la biología molecular de las células hospedadoras. La presencia de estas
regiones de control en el entorno del hospedador adecuado servirán para
lograr tanto una adecuada replicación del gen incluido en el vector como una
potente expresión del gen. De particular importancia son las señales de excre-
ción que permiten la excreción de la proteína al exterior celular para facilitar
la purificación de la misma.
Los vectores más utilizados en ingeniería genética son de cuatro tipos princi-
pales: 1) Plásmidos; 2) Cósmidos; 3) Bacteriófagos; y 4) vectores virales eucarió-
ticos.
1) Plásmidos: Son moléculas de ADNdc circulares de pequeño tamaño (53-4
Kpbs) con replicación autónoma aislados inicialmente en bacterias a la cua-
les confieren resistencia a antibióticos. Los plásmidos actuales son todos
artificiales y tienen su tamaño reducido al mínimo para así aumentar su capa-
cidad de aceptar insertos. El tamaño máximo de inserto aceptado suele ser de
10-13 Kpbs, ya que plásmidos recombinantes (plásmido+inserto) de más de
15 Kpbs son muy inestables.
Todos los plásmidos artificiales poseen:
Adaptadores de policlonaje, secuencias únicas para 10 o más enzimas de res-
tricción, estos adaptadores de policlonaje se emplean para incluir el inserto
dentro del vector.
Marcadores fenotípicos de selección. Normalmente son de dos tipos, genes
de resistencia a antibióticos (ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol o neomi-
cina) y genes de marcadores enzimaticos (`-galactosidasa) o fluorescentes
(luciferasa o GFP). En el caso de plásmidos bacterianos normalmente el
adaptador de policlonaje se encuentra incluido en medio del gen de la `-
galactosidasa. La secuencia de policlonaje no afecta a la expresión de la
enzima de manera que las células hospedadoras bacterianas que reciben el
vector sin inserto poseen `-galactosidasa, estas colonias en presencia de un
colorante llamado X-gal presentan un color azulado en placas de agar. Si el
vector lleva un inserto, la interrupción de la secuencia del gen de `-galacto-

sidasa por el inserto, inactiva la expresión del gen de la `-galactosidasa y las
colonias de bacterias presentan un color blanco al no poder degradar el colo-
rante X-gal.
Regiones de control de replicación y expresión compatibles con las células
hospedadoras.
2) Cósmidos: Los cósmidos son plásmidos modificados con la región Cos del
fago h para aceptar insertos de gran tamaño. Estos vectores se introducen
(empaquetan) en fagos (virus de bacterias) como ADNdc lineales, estos
fagos al infectar las bacterias inyectan el ADN del cósmido que se vuelve cir-
cular cerrado y se comporta como un plásmido dentro de las bacterias. Las
bacterias infectadas se seleccionan por resistencia a antibióticos. Los cósmi-
dos son los vectores de clonaje de elección para las inserción de fragmentos
de ADN genómicos grandes, entre 40 y 50 Kpbs.
3) Bacteriófagos: Los vectores derivados de bacteriófagos más empleados deri-
van del fago M13 y del fago h.
Los vectores derivados del fago M13 son moléculas de ADN circulares de
cadena sencilla cuando están empaquetados dentro de la partícula viral o de
cadena doble cuando el ADN ha sido inyectado en bacterias. Estos vectores,
que poseen selección por color (`-galactosidasa) y resistencia a antibióticos,
se emplean como vectores de clonaje para secuenciación del ADN insertado
por el método enzimático y para realizar mutagénesis dirigida de los insertos,
aprovechando la característica de ser moléculas de cadena sencilla.
Los vectores derivados del fago h son de dos tipos, vectores de sustitución en
los cuales un fragmento de ADN no esencial para la viabilidad del fago h es
reemplazado por el inserto y vectores de inserción en los que el inserto se
integra dentro del genoma del fago por una diana de restricción determinada.
Los vectores de sustitución, son vectores de mixtos clonaje-expresión idea-
les para incluir fragmentos de ADN genómicos o de ADNc grandes, hasta 24
Kpbs. Los vectores de inserción son vectores de expresión ideales para
ADNc pequeños (hasta 8 Kpbs), su principal ventaja reside en que producen
proteínas de fusión con el extremo amino del gen de la `-galactosidasa, lo
cual permite utilizar métodos inmunológicos (anticuerpos) para la detección
de la expresión del inserto.
4) Vectores virales para células eucarióticas. No profundizaremos demasiado
en su descripción, en general son de dos tipos:
Plásmidos modificados artificialmente con secuencias reguladoras de control

de replicación expresión y excreción derivadas de genes eucarióticos o virus
de células eucarióticas.
Virus eucarióticos modificados con regiones de control virales o de genes
eucarióticos, equivalentes a los vectores de reemplazamiento e inserción deri-
vados del fago h. Los principales vectores de origen viral derivan de baculo-
virus, retrovirus, SV40, virus de la vacuna, herpesvirus y virus del papiloma.
Una vez obtenidos los fragmentos de ADN y las moléculas de vector, el paso
final es la incorporación de las moléculas de inserto en las moléculas de vector. Para
realizar este paso de unión se incuban ambas poblaciones de moléculas en presen-
cia de la enzima ADN ligasa. Existen distintas estrategias para asegurar que los
fragmentos de ADN se inserten en los vectores con orientaciones determinadas o
para evitar que las moléculas de inserto o de vector se unan así mismas.
Transferencia del vector de recombinante al hospedador

Métodos de Transferencia del ADN a células hospedadoras
Una vez obtenidos los vectores recombinantes, el siguiente paso a seguir es la

introducción de los mismos en una célula hospedadora adecuada, los métodos de
transferencia de ADN son múltiples y dependientes tanto de la célula hospedadora
receptora como del tipo de vector en el cual se encuentre nuestro ADN. La transfe-
rencia de ADN exógeno a bacterias y levaduras se denomina transformación, la
transferencia de ADN exógeno a células en cultivo se denomina: transfección si el
vector es un plásmido o derivado plasmídico o transducción si es un vector viral,
incluido en una partícula de virus, el que transfiere el ADN.
Los métodos más empleados se explican a continuación:
• Transformación con CaCl2. La transferencia se realiza empleando bacterias

competentes, es decir, capaces de aceptar ADN extracelular. Las bacterias se
vuelven competentes en una determinada fase de su crecimiento al tratarlas con
una solución de CaCl2 en frío (4 °C). En condiciones óptimas es posible obte-
ner eficiencias de transformación mayores de 108 colonias por μg de ADN de
plásmido. En la actualidad existen cepas bacterianas competentes, disponibles
comercialmente capaces de generar rendimientos * 5 ×109 colonias/μg de ADN.
• Transformación con bacteriófagos: Cuando los vectores son cósmidos o bac-
teriófagos la transformación es normalmente directa. Los vectores recombi-
nantes son partículas virales infecciosas capaces de infectar bacterias sensi-
bles y transferirles el ADN incluido en el vector.
• Transfección con fosfato cálcico: Se desconoce el mecanismo por el cual las
células de mamífero son capaces de ingerir el ADN por endocitosis al ser
tratadas con fosfato de calcio. El procedimiento es conseguir la formación
de microprecipitados de ADN con el fosfato de calcio mediante la mezcla de
ADN con cloruro de calcio y un tampón fosfato. Es el método más común
para la transferencia de plásmidos a células de mamífero.
• Electroporación: Este método se encuentra desarrollado tanto para transferir
ADN a células eucarióticas como a procarióticas. Las eficiencias de transfor-
mación son las más elevadas, del orden de 109-1010 colonias/μg de ADN para
bacterias y 20-30 transformantes por cada 105 células eucarióticas. El proce-
dimiento es relativamente sencillo, se realiza en pequeñas cámaras en las cua-
les se encuentra un microelectrodo, se mezclan el ADN y las bacterias o célu-

las eucarióticas en una solución conductora. La cámara se coloca en frío y se
da un pulso eléctrico de alto voltaje (entre 2 y 4 Kv). Los poros inducidos
momentáneamente en las células permiten la entrada del ADN.
• Liposomas: La transfección se realiza empleando de soluciones de lípidos,
disponibles comercialmente, que envuelven (liposomas catiónicos) o introdu-
cen en su interior (liposomas aniónicos) las moléculas de ADN para ayudar-
las a atravesar la membrana plasmática de las células de mamífero.
• Transducción: Cuando se trata de vectores virales de células de mamífero, los
vectores se encuentran incluidos en partículas virales infectivas, de forma que
los mecanismos de infección viral se encargan de introducir el vector recom-
binante en las células en cultivo.
Existen, en otros contextos, otros métodos para la transferencia de ADN a célu-
las de mamífero como son la microinyección directa y el bombardeo genético. La
microinyección nos permite la introducción de ADN (o cualquier otro compuesto)
de forma directa e individual en el interior del núcleo de una célula. Este proceso se
realiza ayudado por un micromanipulador y visualizando la operación en un micros-
copio o una pantalla de vídeo. El bombardeo genético se utiliza para la transferen-
cia de ADN a células vegetales o células con paredes celulares consistentes. El
método usa una pistola especial que proyecta una nube de partículas de un metal
pesado, como oro o tungsteno, recubiertas de ADN sobre las células.
Elección de las células hospedadoras
Bacterias, levaduras, células de insectos y mamíferos son los organismos hos-

pedadores comúnmente empleados a la hora de expresar proteínas de interés. La
elección particular del hospedador, incluso del tipo celular o cepa bacteriana
dependerá de múltiples factores tanto biológicos (biología del hospedador, el tipo de
vector elegido, el tamaño de la proteína, facilidad de purificación, inmunogenici-
dad, etc.) como de otros factores políticos o económicos (impacto ambiental, costo
de producción, mercado potencial de aplicación, etc.).
Los principales factores a considerar a la hora de elegir la célula hospedadora
incluyen: 1) velocidad de crecimiento (rápido o lento); 2) coste económico de la
producción y purificación (necesidad de medios especiales o suplementos nutriti-
vos, necesidad de manipulaciones especiales y el diseño de las áreas de producción,
(upstream) y purificación, (downstream); 3) nivel de expresión y excreción de la
proteína en la célula hospedadora; 4) capacidad del hospedador para rendir un pro-
ducto biológicamente activo, no inmunogénico, mediante una adecuada síntesis y
modificación post-traduccional de la proteína; y 5) la posibilidad de obtener vecto-
res de expresión adecuados para el hospedador elegido.
En base a la variedad de estos factores, la mayoría de las veces la elección del
hospedador viene determinada por un compromiso entre los mismos. Analizaremos
a continuación cada uno de los candidatos a célula hospedadora:
Hospedadores procarióticos
Las bacterias han sido los primeros hospedadores para el clonaje y expresión de
genes, tanto eucarióticos como procarióticos y en la actualidad aún juegan un deci-
sivo papel en la expresión de productos de interés biotecnológico.
Tradicionalmente se han empleado cepas de Escherichia coli, debido principal-
mente a su bien conocida genética y biología. Otras bacterias utilizadas han sido
Bacillus subtilis y algunas cepas de Salmonella.
Las bacterias se han empleado como hospedadores cuando se trataba de obtener
proteínas de pequeño peso molecular que no requieren de modificaciones posterio-
res a la traducción para su actividad biológica. Estos microorganismos presentan
numerosas ventajas para la producción en masa:
— Cultivo celular fácil y barato.
— Facilidad de escalado desde la fase piloto a la etapa industrial.
— Rápida velocidad de crecimiento (divisiones cada 20-90 minutos).
— Con el vector apropiado, generan altos rendimientos de producción.
— Son bastante resistentes a cambios bruscos del medio.
Sin embargo, también presentan graves inconvenientes:
— Incapacidad de procesar los ARN transcritos directamente de genes eucarió-
ticos que contienen secuencias no codificantes (intrones). Este problema es
evitable clonando en los vectores solamente los ADNc obtenidos a partir de
los ARNm maduros.
— Incapacidad de segregar al medio de cultivo las proteínas recombinantes de
alto peso molecular. Este hecho determina una posterior lisis de las células
para obtener la proteína de interés. Esta lisis provoca la contaminación del
producto recombinante con proteínas bacterianas que pueden arrastrarse
hasta el producto final y provocar reacciones inmunogénicas en los indivi-
duos que han sido tratados con proteínas recombinantes. En algunos casos, es
posible introducir una señal de secreción en el vector (secuencia líder) junto
con el gen que permita la exportación al espacio periplásmico. En cualquier
caso, es necesaria una lisis controlada de la pared celular para liberar la pro-
teína al medio. Este proceso conlleva de nuevo, el riesgo de contaminación
con los restos de la pared bacteriana.
— Tendencia a concentrar las proteínas expresadas en forma de gránulos inso-
lubles en los que la proteína, en muchos casos, pierde su actividad biológica
de forma irreversible o incluso puede resultar tóxica para el propio hospeda-
dor. Esta toxicidad puede llevar a la lisis de la bacteria.
— Carencia de un sistema postraduccional de maduración de proteínas, que in-
capacita a estos organismos para la síntesis de proteínas eucarióticas las cua-
les requieren de estas modificaciones post-traduccionales. Si estas modifica-
ciones son requeridas para la funcionalidad biológica de la proteína puede
darse la paradoja de obtener grandes cantidades de una proteína correcta-
mente expresada sin ninguna actividad biológica.
Hospedadores eucarióticos
Normalmente las proteínas eucarióticas después de su síntesis requieren de una

serie de modificaciones postraduccionales que permiten que la proteína adquiera
una conformación espacial adecuada, responsable de su completa actividad bioló-
gica. Las modificaciones más comunes son: establecimiento de puentes disulfuro,
modificaciones de algunos aminoácidos (hidroxilación, metilación, acetilación y
fosforilación) y la incorporación de moléculas de azúcares (glicosilación) y de áci-
dos grasos (acilación).
Estas modificaciones son muy importantes no sólo por conferir la actividad bio-
lógica a la proteína, sino porque además determinan las propiedades antigénicas y
de estabilidad de la misma.
Se entiende ahora el por qué de la necesidad de hospedadores eucarióticos que
puedan proporcionar estos mecanismos para la expresión de proteínas eucarióticas
funcionales, estables y totalmente inocuas cuya actividad biológica sea estricta-
mente idéntica a la natural. Otra ventaja adicional de los hospedadores eucarióticos,
respecto a los procariotas, es la secreción directa de las proteínas sintetizadas al
medio de cultivo, con la consiguiente facilidad de purificación.
Tradicionalmente se han empleado las levaduras y las células de mamífero
como sistemas huésped, sin embargo las células eucarióticas de insecto comienzan
a dar resultados prometedores.
Levaduras. Las levaduras comparten muchas ventajas con las bacterias (rápida
velocidad de crecimiento, bajo costo de producción entre otras) pero la expresión de
genes en células de levadura plantea también graves inconvenientes:
— El nivel de expresión es considerablemente inferior al obtenido en bacterias.
— Un uso un poco especial del código genético.
— Una tendencia a la inestabilidad de los vectores de expresión.
— Cierta especificidad por los genes propios (preferencia en la expresión).
— Aunque el sistema de eliminación de los intrones de los ARN transcritos fun-
ciona correctamente, el sistema de modificación post-traduccional, funda-
mentalmente la glicosilación, es diferente (inducen hiperglicosilación) al de
células eucarióticas de mamífero.
A pesar de estas limitaciones, se ha logrado producir y excretar un número acep-
table de proteínas heterólogas con eficiencias variables (entre 1-10 mg/L) como la
lisozima humana o el antígeno vacunal del virus de la hepatitis B.
Células de insecto: La expresión de proteínas recombinantes en células euca-
rióticas de insectos puede ser comparable o superior al sistema de las levaduras, con
producción de 1 a 100 mg por litro de cultivo. Cultivos de células de insecto han
logrado producciones a gran escala de productos de alto valor económico como el
interferón _ humano, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) o polimerasas de
ácidos nucleicos para uso comercial.
Las vectores de expresión son virus de invertebrados en los cuales un gen
estructural del virus (gen de la poliedrina) es sustituido por el gen de interés.
La principal desventaja de estos hospedadores radica en la incapacidad de gene-

rar un patrón correcto de glicosilación muy parecido al de células de mamífero.
Otros inconvenientes adicionales son de carácter básicamente económico y comu-
nes a los de la células de mamíferos.
Células de mamífero. Sólo las células de mamífero en cultivo son satisfactorias
para la producción de proteínas humanas normales, correctamente plegadas y pro-
vistas de todas las modificaciones que puedan generar la totalidad de la funcionali-
dad biológica, estabilidad e inocuidad.
El uso de células de mamífero plantea fundamentalmente inconvenientes de
índole económica (altos costos) como de índole sanitario (capacidad de contamina-
ción con agentes infecciosos).
El cultivo de células de mamífero no es siempre sencillo:
— Poseen unos complejos requerimientos nutricionales que hace que los
medios de cultivo y sus suplementos provoquen altos costos de producción.
— Las células poseen un crecimiento lento (duplicaciones cada 16-24 horas).
— Los rendimientos de producción no son muy elevados (100 mg/L de cultivo).
— El empleo de células de mamífero conlleva la necesidad de evaluar los posi-
bles contaminantes, normalmente virus o ADN viral de los vectores, que,
procedentes de la células o de los suplementos de origen animal, puedan
contaminar el producto.
Así, la producción industrial en células de mamífero resulta relativamente cara y
está solamente reservada a proteínas complejas de alto valor biológico y económico.
Selección de los organismos que expresan el gen de interés

Una vez transferidas las moléculas de ADN recombinante la célula hospedado-
ra elegida, el paso final es el de seleccionar aquellas células hospedadoras que han
tomado el gen codificante para la proteína de interés para su aislamiento y posterior
escalado. Normalmente este proceso de selección se lleva a cabo en dos etapas: 1)
una etapa inicial de cribado (screening) de toda la población de células hospedado-
ras resultantes de la transferencia para seleccionar sólo aquellas que han tomado los
vectores con los insertos ADN recombinante (clones recombinantes); y 2) una etapa
final de selección de los clones recombinantes para identificar cuál o cuáles poseen
y/o expresan el gen de interés. Estos abordajes son tanto válidos para células pro-
carióticas como eucarióticas.
Los métodos de screening o cribado se basan, normalmente en las características
fenotípicas aportadas por las moléculas del vector (resistencia a antibióticos, la
expresión de actividades enzimáticas o expresión de proteínas fluorescentes). Es
relativamente sencillo de detectar la presencia de los clones recombinantes sin más
que seleccionar aquellos que presentan estos fenotipos en la población; más com-
plicado es el proceso de selección del clon o clones de interés. Existen tres enfoques
principales:
1. Detección de la actividad biológica de la proteína de interés. En este méto-

do se ensayan los clones recombinantes a la búsqueda del que presenta la
actividad biológica buscada. Este abordaje es perfecto siempre y cuando se
disponga de un método lo suficientemente sensible de detección de la activi-
dad biológica y que las células hospedadoras no posean una actividad bioló-
gica similar. La selección del hospedador en este caso es crítica.
2. Métodos de detección inmunológicos. Si se poseen anticuerpos específicos
para la proteína existen numerosos protocolos para determinar qué clones
recombinantes de la población están secretando la proteína reconocida por el
anticuerpo.
3. Métodos de hibridación de los AN. Estos métodos se apoyan en ensayos de
hibridación similares a los explicados en la técnica de Southern. Los méto-
dos de hibridación se basan en encontrar o diseñar sondas específicas (los
métodos de diseño de las sondas ya fueron explicados en la técnica de
Southern) del gen de interés. Estas sondas marcadas (isotópica, enzimática-
mente, o con fluorocromos) sirven de anzuelos moleculares para buscar,
sobre el ADN de los clones recombinantes transferido a membranas de hibri-
dación, aquellos clones que poseen el gen de interés que lleva la secuencia
complementaria a la de la sonda. En el caso de cultivos de células de mamí-
feros, es posible aplicar una variación de esta técnica de hibridación con son-
das específicas sin necesidad de transferir el ADN de los clones a membra-
nas de hibridación simplemente realizando la hibridación sobre los clones
directamente mediante la técnica de hibridación in situ.
Caracterización del producto y células productoras
Caracterización del producto clonado
La caracterización del producto recombinante obtenido puede ser tan importan-

te como el proceso de clonaje y obtención del mismo, sobre todo en aquellos casos
en los que la fidelidad entre la proteína original y la producida por ingeniería gené-
tica haya de ser máxima. En el entorno farmacéutico las proteínas recombinantes
están sometidas a rigurosos controles periódicos por agencias gubernamentales. En
estos controles además del verificar la estabilidad del proceso de producción bajo
normativa GMP (Good Manufacture Procedures), se analiza exhaustivamente la
similitud entre el producto obtenido in vitro y el natural.
La caracterización primaria (o de identidad) incluye la determinación del peso
molecular, carga eléctrica, punto isoeléctrico, secuencia y composición de amino-
ácidos e hidrofobicidad. Adicionalmente se analiza la conformación estructural y la
actividad biológica o enzimática. Especial atención se dedica a los extremos amino
y carboxilo para detectar la posible degradación por proteasas, así como al correc-
to patrón de glicosilaciones, puentes disulfuro, fosforilaciones y cualquier otra
modificación postraduccional que requiera la proteína para su actividad biológica y

estabilidad.
La caracterización secundaria (pureza y estabilidad) es otro factor crítico para
descartar la posible contaminación del producto con péptidos inmunogénicos. Es
necesario asegurar, mediante diferentes métodos físico-químicos e inmunológicos,
que la proteína está libre de virus o ácidos nucleicos que, procedentes del medio o
de las células hospedadoras pudieran suponer un factor de riesgo para el hombre.
Caracterización de las células productoras (bancos celulares)
El otro punto de control para asegurar una correcta obtención de las proteínas
recombinantes se encuentra en la caracterización de la célula hospedadora. De
acuerdo a la producción bajo normas GMP, la estabilidad genética de las células
productores es un factor crítico. Es necesario establecer y caracterizar un determi-
nado clon celular de producción a partir del cual generar un banco celular maestro
origen de la producción (Master cell bank). Este banco celular se expande en culti-
vo para obtener bancos celulares de trabajo (Working cell bank) con los cuales lle-
var a cabo los lotes individuales de producción. Ambos tipos de bancos, almacena-
dos en N2 líquido a –196 °C, deben ser amplia y cuidadosamente caracterizados para
asegurar:
1) La estabilidad genética e identidad de las células productoras. (Caracte-
rización morfológica, análisis de isoenzimas y análisis citogenéticos.)
2) La estabilidad de la construcción genética que origina la proteína recombi-
nante. (Secuenciación de la contrucción génica, patrón de restricción, esti-
mación del número de copias del gen.)
3) La ausencia de agentes adventicios como virus y micoplasmas. (Análisis de
carga viral y análisis de actividad transcriptasa reversa; test de detección de
micoplasmas.)
4) La consistencia de crecimiento y productividad de las células. (Deter-
minación de la productividad y número de duplicaciones de la población en
los diferentes lotes de producción.)
Estos procedimientos de control aseguran la consistencia y reproducibilidad de
cada lote de producción.
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Walker JM. and Gingold EB. Biología molecular y biotecnología. Zaragoza, Editorial
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Thilly WG. Mammaliam Cell Technology. London, Butterworths Publishers. 1988.
Nota del Autor: Ambos capítulos (12 y 13) de Ingenieria Genética fueron desarrollados
sobre la base de una presentación de Microsoft® Power Point®. Las figuras complementarias
al texto de ambos capítulos estan disponibles, con fines educativos, solicitándolas a la
siguiente dirección electrónica. jose.casatorres@serono.com
14
Producción industrial de fármacos
recombinantes
Introducción
Toda persona con experiencia en un laboratorio de investigación está familiari-
zada con cierto equipo de cultivo: placas, matraces, frascos T, placas multipocillo,
estufas de cultivo, incubadores orbitales y con unas determinadas condiciones de
trabajo relativas a las salas, aislamiento, material de protección. Muchos de estos
sistemas son también utilizados a nivel industrial, unas veces tal cual los conocemos
en el laboratorio y otras modificados y adaptados al manejo de grandes volúmenes.
Los equipos utilizados en la producción de grandes cantidades de células son muy
diversos ya que en muchos casos han sido desarrollados pensando en satisfacer las
necesidades creadas por un organismo concreto. Haremos una primera mención al
cultivo a gran escala de bacterias y hongos para entrar con alguna extensión en los
sistemas de producción masiva desarrollados para el cultivo de células, siempre más
complejos y sofisticados. También haremos referencia a las necesidades de cons-
trucción y diseño que plantea un proceso de producción en la industria biotecnoló-
gica sin dejar de lado las condiciones ambientales y de bioseguridad que debe cum-
plir una industria con tantos problemas potenciales. A continuación repasaremos
algunas nociones de purificación de proteínas, para terminar con una mirada a las
condiciones de calidad requeridas en la industria.
Cultivos procariotas
Tanto bacterias como hongos presentan muchas ventajas y facilidades en su cul-
tivo a gran escala si se comparan con las células eucariotas. Estas ventajas residen
fundamentalmente en dos cualidades de este tipo de células, su activo metabolismo
que les facilita el uso de una amplia gama de nutrientes y el rápido incremento de
biomasa, y su natural resistencia mecánica y química que facilita enormemente el

control de las condiciones de cultivo en términos de aparataje. Los cultivos masi-
vos de bacterias se llevan a cabo en fermentadores. Los fermentadores son equipos
que consisten en un vaso que puede ocupar volúmenes muy diversos, desde unos
pocos litros hasta decenas de miles, en el que se carga el medio de cultivo y se ino-
cula el organismo adecuado, acompañado por sistemas de control de las condicio-
nes de cultivo. Veamos a continuación los principales elementos del cultivo de pro-
cariotas.
El medio de cultivo
Los medios de cultivo definidos, es decir, aquellos en que se conoce la natura-

leza y cantidad de todos y cada uno de sus componentes, tan utilizados en el labo-
ratorio, resultan inviables en la producción a gran escala debido a su coste y/o baja
capacidad para generar biomasa y producción. Es frecuente pues, que se utilicen
medios de cultivo total o parcialmente indefinidos en los que se incluyen compo-
nentes de naturaleza compleja que aportan cierta variabilidad al proceso. En algu-
nas fermentaciones se intenta utilizar como elemento nutritivo determinados dese-
chos agrícolas.
En general, el medio de cultivo para bacterias debe incluir una fuente de carbo-
no, y una fuente de aminoácidos y/o proteínas siendo también deseable el aporte de
ácidos grasos esenciales en algunos casos. Para evitar el desarrollo de revertientes
es frecuente la adición de algún antibiótico cuyo gen de resistencia va incorporado
a la construcción que contiene el DNA de la proteína recombinante.
Parámetros de cultivo
Control de temperatura
Los requisitos de temperatura para garantizar la supervivencia de las bacterias

no son demasiado estrictos aunque saliendo de determinados márgenes se pueden
ocasionar caídas de productividad o mutaciones indeseables. Salvo que el microor-
ganismo presente un requerimiento específico de temperatura, se trabaja dentro de
rangos fisiológicos, entre 35 y 37 ºC. Algunos equipos permiten diseñar un perfil de
temperatura cambiante a lo largo del proceso. Este sistema resulta muy útil cuando
las temperaturas óptimas de crecimiento y producción no coinciden o cuando es
necesario un pulso de temperatura para estimular la producción de la proteína de
interés.
La cuba del fermentador está equipada con una camisa de refrigeración por la
que circulan a conveniencia vapor, agua caliente y líquido refrigerante. El refrige-
rante habitual es el agua aunque es posible la utilización de otras mezclas refrige-
rantes como agua glicolada.
PRODUCCIÓN INDUSTRIAL DE FÁRMACOS RECOMBINANTES 197
Las fases iniciales del cultivo, cuando la biomasa es escasa, requieren la cale-
facción del mismo. A medida que el cultivo se desarrolla y la actividad metabólica
se intensifica se genera calor y el cultivo puede llegar a requerir refrigeración lo que
se consigue haciendo circular líquido refrigerante por la camisa.
Control del pH
La cuba del fermentador está dotada con sondas de pH a partir de cuya señal se
adicionan pulsos de soluciones concentradas de ácido o base directamente sobre el
cultivo.
Aporte de oxígeno
La solubilidad del oxígeno en medio acuoso es muy baja. De ahí que los culti-
vos líquidos a pequeña escala requieran grandes cámaras de aire para evitar la apa-
rición de procesos anaerobios. Estas cámaras de aire no son posibles en los cultivos
masivos, con lo que es necesario recurrir al burbujeo bien sea de aire o de mezclas
conocidas y controladas de gases.
Agitación
Dentro del fermentador son deseables unas condiciones lo más homogéneas

posibles. Para conseguir un óptimo de productividad y minimizar el riesgo de muta-
ciones es deseable eliminar los microambientes. Además, una adecuada corrección
del pH y la temperatura y una aireación apropiada exigen la continua mezcla de los
elementos del cultivo. Esto se consigue con la introducción de un sistema de agita-
ción, consistente en un eje con unas palas impulsado por un motor eléctrico, gober-
nado por un variador de velocidad. Es habitual que el variador esté conectado al sis-
tema de control de aireación y qué parámetros como la presión parcial de oxígeno
sean los que regulen el incremento o disminución de la velocidad de agitación.
Volumen de los cultivos
La agitación en combinación con la presencia de concentraciones elevadas de

proteínas y otras sustancias tensoactivas, provocan la formación de grandes canti-
dades de espuma que es preciso evitar. Los fermentadores están dotados de sondas
de nivel que regulan la adición de productos antiespumantes.
Cultivo de células eucariotas

La extremada sensibilidad tanto frente a agentes químicos como físicos que pre-
sentan las células eucariotas y la posibilidad de que sea necesario su anclaje a super-
ficies para posibilitar su crecimiento, hacen que el cultivo de este tipo de organis-
mos, partiendo de unos elementos comunes con respecto al crecimiento bacteriano
se sofistique enormemente tanto en los métodos empleados como en las medidas de
calidad necesarias.
Como se ha mencionado anteriormente, el medio de cultivo adecuado para las
células eucariotas no responde a una fórmula universal. Cada tipo de célula, cada
producción específica, requiere su propia formulación. Los medios de cultivo utili-
zados a gran escala son los mismos empleados en el laboratorio y habitualmente
contienen concentraciones de suero entre el 2 y el 10 %. Además de los componen-
tes nutricionales del medio es frecuente que la formulación incluya agentes anties-
pumantes y viscosizantes como el poliglicol o la carboximetilcelulosa, con objeto
de minimizar el efecto de cizalladura y prevenir la formación de espuma.
Biorreactores
Este término se aplica a los sistemas de cultivo a gran escala para células euca-
riotas. Sus fundamentos proceden de los fermentadores pero los equipos de control
utilizados y la forma de trabajar son diferentes de la de aquéllos, especialmente
cuando se trata de sistemas perfundidos. Como norma general, los biorreactores
deben cumplir con lo siguiente:
• Estar construidos en materiales de calidad farmacéutica (acero 316 L o haste-

lloid, plástico clase VI USP).
• Tener sistemas de impulsión que no provoquen turbulencias ni cizalladuras,
siendo el caso extremo los fermentadores de tipo airlift.
• No presentar en su interior piezas de gran tamaño que dificulten la circu-
lación del líquido.
• Tener una geometría interior suave, con fondos cóncavos y el mínimo posible
de ángulos y esquinas para facilitar la homogeneización del cultivo y facilitar
la limpieza y esterilización del equipo.
• Interiores electropulidos o pulidos «a espejo».
El medio de cultivo que entra en un cultivo de células debe incorporarse en per-

fectas condiciones de pH, temperatura y gases en solución, con lo que los recipien-
tes de cultivo van frecuentemente acompañados de recipientes de «acondiciona-
miento» en los que se rectifican los parámetros mencionados.
Control de pH y aireación
El tampón más frecuentemente utilizado en los cultivos de células es el CO2-

CO3H–, que basa su capacidad tamponante en la relación entre el CO2 atmosférico
y el CO2 en disolución. De este modo, la generación metabólica de CO2, la difusión
de gases en el medio y la eliminación de gases de desecho se mantienen en íntima

relación.
El aporte de gases al medio se realiza por difusión a través de membranas semi-
permeables o por simple burbujeo de aire comprimido o mezclas controladas de
gases. En este último caso, es posible la regulación del pH variando la concentra-
ción relativa de los gases de la mezcla.
La difusión de gases mediante el sistema de agitación que tenía lugar en los fer-
mentadores está sin embargo limitada en el cultivo de eucariotas que rara vez admi-
ten velocidades de agitación superiores a las 350 RPM.
Biorreactores airlift
Este tipo de biorreactores hace referencia a equipos que no utilizan sistemas de

agitación y que para homogeneizar el cultivo mantienen un burbujeo desde la base
con la mezcla de gases adecuada. Las burbujas de gas arrastran las células hacia la
parte superior del reactor al mismo tiempo que oxigenan el medio de cultivo.
Además, el medio oxigenado es ligeramente menos denso con lo que, junto a la
aireación, se generan corrientes de convección que arrastran a las células a lo largo
de todo el vaso.
Los reactores airlift son muy adecuados para células especialmente frágiles o
que no admiten sustancias viscosizantes pero tienen el inconveniente de requerir
una relación diámetro-altura muy baja, es decir, son altos y estrechos, lo cual plan-
tea serios problemas en el escalado.
Células en suspensión y células dependientes de anclaje
Estos términos hacen referencia al hecho de que una célula pueda vivir en una
fase líquida, tal y como ocurre con las células sanguíneas o con muchas células
tumorales y transformadas o si por el contrario requieren una superficie a la que
mantenerse adheridas, como es el caso de los fibroblastos, por ejemplo. Las células
dependientes de anclaje incluyen un nuevo factor limitante a tener en cuenta a la
hora de diseñar el cultivo: la superficie disponible. Las células que deben crecer
asociadas a un sustrato lo hacen hasta alcanzar un cierta densidad más allá de la cual
no les es posible la división. Es el estado conocido como confluencia. Cuando el
cultivo llega a la máxima confluencia entra en fase estacionaria. Si en un cultivo de
estas características se desea obtener un mayor número de células que el alcanzado
es necesario separar las células del sustrato, diluirlas y resembrarlas sobre nuevas
superficies en el proceso que se conoce como subcultivo.
La necesidad de una superficie para el crecimiento de las células introduce nue-
vos factores de incertidumbre en el cultivo, relacionados con la influencia que el
material de soporte puede ejercer sobre el crecimiento celular y aún sobre la expre-
sión de los genes insertados. Existen diversos materiales susceptibles de soportar el
crecimiento celular entre los que el vidrio y el plástico ocupan lugares destacados.
Se dispone además de diversos tratamientos para modificar plástico y vidrio aumen-
tando su afinidad hacia las células.
El cultivo a gran escala de células dependientes de anclaje se puede asociar a
varios sistemas en los que se juega con la relación superficie/volumen.
Un primer paso en el cultivo a gran escala de células dependientes de anclaje
son las botellas rodantes. Estas botellas son recipientes cilíndricos en cuya pared se
adhieren y multiplican las células. El medio de cultivo no llena completamente la
botella, antes al contrario, deja una gran cámara de aire para facilitar el intercambio
de gases. Las botellas se emplazan en dispositivos que las mantienen rodando sobre
sí mismas a velocidad constante para permitir el intercambio de gases y nutrientes.
Las botellas rodantes pueden ser de superficie lisa o presentar diversas morfologías
que aumenten su superficie.
Diversos fabricantes han presentado múltiples opciones para incrementar la
relación superficie-volumen. De este modo se pueden encontrar productos como el
Spiracel ®‚ de Sterilin, consistente en una botella rodante que incluye una lámina
espiral de plástico en su interior o el sistema de tubos de vidrio de Belco.
Más allá de las botellas rodantes existe toda una gama de métodos para crecer
células dependientes de anclaje que buscan reproducir unas condiciones lo más
fisiológicas posibles. Se trata por lo general de sistemas perfundidos (con continua
renovación de medio). Algunos de ellos son:
• Multitray. Consiste en una colección de superficies paralelas para permitir el

anclaje de las células, encerradas en un contenedor. El ejemplo más sofistica-
do es el Cell-Cube ® de Corning, que permite realizar cultivos entre 8.500 y
340.000 cm2 de forma perfundida.
• Biorreactores de fibra hueca. Ofrecen una matriz fibrosa y repleta de canales
en los que introducen y multiplican las células y por el que perfunde medio de
cultivo. Este sistema permite muy elevadas densidades de células.
Cultivo en microcarriers
Los microcarriers o microportadores son partículas destinadas a servir como

soporte a las ADC (células dependientes de anclaje). Tales microcarriers (MC)
están constituidos por materiales en principio inertes, que resultan adecuados para
la unión de las células. Las células se anclan a la superficie del MC y proliferan
sobre ella hasta alcanzar el grado máximo de confluencia. La utilización de MC
para el cultivo de ADC presenta una ventaja crucial sobre todos los otros métodos
de cultivo en masa existentes para este tipo de células: los MC se introducen en un
biorreactor convencional y permiten tratar a las ADC como células en suspensión.
Consecuencias derivadas de ello son una mayor homogeneidad de las condiciones
de cultivo, la posibilidad de sacar muestras e incluso de observar las células al
microscopio, la posibilidad de recuperar fácilmente las células, y fundamentalmen-
te de poder disponer de un sistema de cultivo sencillo y fácil de controlar, que gene-

ra unas densidades de células y unas productividades superiores a otros métodos de
cultivo existentes para ADC.
El uso de MC fue inicialmente publicado en los años sesenta por van Wezel, que
utilizó partículas de una resina de intercambio iónico, la dietil-aminoetil-sephadex
(DEAE) de Pharmacia ®. Posteriormente se utilizaron otras resinas de intercambio
iónico; la constatación de cierta toxicidad en estos materiales así como la aparición
de nuevos sustratos y tratamientos físico-químicos para los mismos han dado lugar
a la aparición de una amplísima gama de MC disponibles en el mercado. No existe
un MC universal que garantice el crecimiento y la producción de cualquier tipo de
célula o material. Como de costumbre, cuando se habla de cultivos celulares, es
necesario probar hasta encontrar el sustrato más adecuado para nuestra línea celu-
lar e incluso para nuestra producción.
Biorreactores de lecho fluido
Son sistemas de cultivo en los que no existe agitación. Las células se crecen en
el interior de MC especiales, porosos y de gran tamaño, generalmente fabricados en
colágeno, que reposan en la base del reactor y reciben una corriente de medio de
cultivo fresco y acondicionado. Las células disfrutan de un ambiente muy estable y
alcanzan altas densidades de crecimiento al desarrollarse en el seno de una matriz
porosa.
Monitorización de procesos
La biotecnología farmacéutica se ha incorporado en la industria como el nuevo
método de producción de principios activos. Es un procedimiento muy diferente de
los tradicionales de la industria, como la síntesis química o la extracción, debido a
que utiliza un elemento completamente nuevo: organismos vivos. El uso industrial
de organismos vivos tiene una característica que es a la vez un inconveniente, sólo
son relativamente predecibles, lo que es especialmente notorio en el caso de las célu-
las eucariotas. Las células pueden ser extremadamente sensibles a factores ambien-
tales, en ocasiones a elementos que no pueden ser controlados por los propios méto-
dos analíticos. Así pues, para garantizar la máxima reproducibilidad posible en los
métodos de producción, es necesaria una exhaustiva monitorización de los cultivos.
¿Qué controlar?
En un cultivo de células hay que asegurar que el ambiente que rodea a las mis-
mas es el óptimo y que la variación es la menor posible. Para ello hay que vigilar
muchos puntos:
El medio de cultivo
Normalmente se utilizan formulaciones específicas realizadas por fabricantes

industriales. Es normal que al fabricante se le exijan certificados de composición del
medio, de origen de los componentes, especialmente de aquellos de origen animal
y garantías sobre la ausencia de determinados agentes adventicios. No es inusual
que en una producción industrial se especifique por parte del cliente el tamaño de
lote que se requiere para evitar la variabilidad debida a esta causa.
Mención especial requiere el suero. Los sueros utilizados en la producción far-
macéutica deben ser de origen conocido y garantizar su trazabilidad hasta los mata-
deros en que se recolecta la sangre. Naturalmente deben estar acompañados de aná-
lisis que certifiquen la ausencia de micoplasmas. No es inusual que los propios
consumidores testen la capacidad del suero para facilitar el crecimiento de sus lí-
neas celulares.
Una vez fabricado el medio de cultivo y antes de su utilización es imprescindi-
ble comprobar temperatura, pH y osmolalidad.
El agua
El agua utilizada en cultivos celulares debe ser bidestilada, apta para la admi-
nistración de inyectables conforme a normas USP.
Los materiales
Para evitar sorpresas desagradables, hay que asegurarse de que todos los mate-
riales utilizados en el cultivo de células son inertes. Dentro de que se manejen cali-
dades farmacéuticas, siempre respetando las normas USP y equivalentes, es impor-
tante la realización de ensayos de toxicidad sobre cuantos materiales nuevos entren
en la producción.
Tampoco hay que olvidar todos los sistemas de lavado, secado, acondiciona-
miento y esterilización de materiales directa o indirectamente relacionados con los
cultivos.
Las células
Las células utilizadas deben pertenecer a bancos controlados y analizados. Su

historia ha de ser trazable desde origen.
El cultivo
A lo largo del desarrollo del cultivo es necesario chequear el número de células

ya que la densidad de las mismas es un parámetro de vital importancia. Cuando se
producen proteínas recombinantes es preciso monitorizar el nivel de excreción.

Además es frecuente la monitorización de parámetros metabólicos, como el consu-
mo de glucosa o la generación de lactato y el control de la presión parcial de diver-
sos gases.
El estudio de estos parámetros nos da una visión general de lo que ocurre en el
cultivo que nos puede permitir actuar sobre algunos elementos para garantizar las
condiciones óptimas de producción.
Equipos de control
Los aparatos de control se basan en la utilización de transductores. Los trans-

ductores son aparatos capaces de transformar un tipo de energía en otro, habi-
tualmente una señal eléctrica. Así nos encontramos con transductores de presión,
de temperatura (termómetros), químicos (electrodos). Todos o la mayoría de
ellos tienen cabida en un sistema de cultivo de células. La preparación de medios
y soluciones requiere el empleo de pH-metros, termómetros, etc. Fermentadores
y biorreactores, así como sistemas perfundidos incorporan electrodos que moni-
torizan diversos parámetros a controlar en la producción: pH, pCO 2, temperatu-
ra, densidad celular. Es habitual que estos equipos envíen su señal a aparatos de
integración y registro que representan la evolución de los valores a lo largo del
tiempo.
Además de indicar el valor que están midiendo, los sistemas de control son sus-
ceptibles de ser programados con valores de referencia que generen acciones
correctoras sobre el sistema y que tiendan a mantener la condición estable. Los
mecanismos de control pueden ser de dos tipos:
— Regulación de todo o nada. El controlador acciona el mecanismo efector

correspondiente hasta alcanzar el valor de consigna prefijado. Una vez alcan-
zado dicho valor, el efector se desactiva, volviéndose a activar si se pierde
dicho valor.
— Regulación PID. El controlador recoge la lectura del valor y estima la segun-
da derivada de la función resultante en ese punto. En base a este dato y com-
parándolo con los valores óptimo y de histéresis consignados, estima la opor-
tunidad o no de activar o desactivar el efector. Este tipo de control es mucho
más sofisticado que el sistema de todo o nada y permite un control mucho
más ajustado.
Utilities y Layout
Identificamos como Utilities los servicios necesarios para llevar a cabo un pro-
ceso de producción mediante Biotecnología, y como Layout a las edificaciones des-
tinadas a albergar el proceso.
A la hora de diseñar una planta de producción hay que tener en cuenta tres ele-
mentos principales: las autoridades reguladoras, el tipo de proceso y las considera-
ciones ambientales.
Autoridades reguladoras
La venta en el mercado de un producto está condicionada por la necesidad ine-

ludible de contar con el permiso de las autoridades sanitarias locales. Habitualmente
se viene tomando como referencia la Food and Drug Adminstration (FDA), autori-
dad reguladora de los Estados Unidos. Normalmente las autoridades reguladoras
exigirán distintos niveles de realización y de seguridad en la construcción y los ser-
vicios dependiendo de que nuestro producto esté destinado a consumo humano, ani-
mal o agrícola. Tampoco el nivel de exigencia es el mismo si nos disponemos a
fabricar materia prima o producto terminado ni si éste tiene como forma final un
encapsulado o un inyectable.
Frecuentemente facilita las cosas la existencia de plantas que produzcan un pro-
ducto de características similares cuya venta esté autorizada y que su proceso haya
sido auditado.
Tipo de proceso
El sistema de fabricación de la proteína resulta esencial a la hora de establecer

la forma final de las instalaciones. Existen como hemos visto diversos sistemas de
cultivo de células a gran escala y todos ellos tienen sus ventajas y desventajas que
también alcanzan el terreno del diseño de salas y la elección de equipos. Así por
ejemplo, un proceso de producción en botellas rodantes requiere la construcción de
cámaras calientes de grandes dimensiones y la presencia de autoclaves y zonas de
flujo laminar habitualmente en mayor cantidad que un proceso realizado en fer-
mentadores. Estos, por su parte, suelen requerir una gran variedad de servicios dis-
ponibles en el propio punto de fabricación.
En el caso en que se utilicen biorreactores, no es lo mismo si se trata de un
proceso discontinuo que si se pretende realizar un proceso perfundido.
Normalmente, los cultivos de tipo batch se realizan en reactores de grandes
dimensiones que requieren salas amplias y techos altos. Los sistemas perfundidos
utilizan biorreactores de menor tamaño que se ubican en salas de dimensiones
más reducidas.
Es habitual que los biorreactores, especialmente si son grandes, lleven incorpo-
rados sistemas de limpieza y esterilización in situ. También es frecuente que el
máximo posible de conexiones a servicios sea permanente.
En el siguiente cuadro se muestra la influencia que el método empleado para el
cultivo ejerce sobre la construcción:
Cultivo discontinuo Cultivo perfundido
Tamaño de salas Gran tamaño. Techos elevados Pequeño tamaño. Techos bajos
Instalación Difícil Sencilla
Integración del reactor Muy integrados Baja o moderada

y la sala
Preparación de medios No son necesarias instalaciones Instalaciones especiales para

adicionales este fin
Purificación/concentración – Poco frecuente – Frecuente

– Grandes volúmenes – Volúmenes pequeños
– Dirigida por el cultivo – No dirigidas por el cultivo
de células de células
Consideraciones ambientales
Cada proceso tiene sus requerimientos ambientales. Estos vienen dados gene-
ralmente por el riesgo de contaminación de los cultivos y del producto. Así pues, las
medidas para prevenir la contaminación no son las mismas en una zona en que se
realiza un cultivo de células que en una sala en la que se concentra un eluído de una
cromatografía. Dentro de los cultivos, el riesgo de contaminación es menor si se
trata de un cultivo tipo batch que si se trata de un cultivo perfundido que se debe
mantener varios meses. Por otra parte, el riesgo de contaminación es mucho más
alto en los cultivos de células que en los bacterianos.
Principales agentes causantes de contaminaciones
Trataremos de enumerar los agentes que pueden causar la contaminación de un

cultivo de células y la forma de detectarlos. Más adelante nos referiremos a medi-
das preventivas y correctivas.
• Bacterias, hongos y levaduras. Son los más habituales. En general resultan
sencillos de detectar puesto que suelen producir turbidez e incluso colonias
apreciables a simple vista o cuando menos al microscopio.
• Micoplasmas. Los micoplasmas son bacterias de pequeño tamaño y despro-
vistas de pared bacteriana, lo que les permite atravesar los filtros que retienen
bacterias, de 0,2 μm, considerados habitualmente como esterilizantes. La pre-
sencia de micoplasmas es frecuentemente difícil de detectar debido a sus
requisitos para cultivo in vitro. Los sistemas habituales de detección de mico-
plasmas son el cultivo en condiciones especiales, la tinción diferencial
(Hoescht), métodos inmunológicos y últimamente la detección de su ADN
mediante técnicas de PCR. Algunas veces los micoplasmas pueden tener efec-
tos citopáticos y producir alteraciones visibles en los cultivos, tales como lisis
celular y turbidez y disminución de la productividad en proteínas recombi-

nantes, pero es frecuente que los micoplasmas convivan con las células sin
manifestar ningún efecto.
• Virus y retrovirus. Al igual que los micoplasmas, es frecuente que las infec-
ciones por este tipo de agentes no provoquen cambios apreciables. Es pues
necesaria su identificación mediante métodos inmunológicos o bioquímicos.
Prevención de la contaminación
El riesgo de contaminación y los efectos económicos de la misma sobre el pro-

ceso, marcan el nivel de inversión a realizar a la hora de prevenir las contamina-
ciones. Entre los elementos disponibles, algunos de los más destacados son:
• Tratamiento de aire. Consiste en la filtración de aire por filtros de profundi-

dad de distintas categorías. El aire filtrado se clasifica en función del número
de partículas por m3 y hora de muestreo. La clase 100 es considerada como
ambiente estéril. Por encima de ella tenemos las clases 1.000, 10.000 y 100.000.
• Cascadas de presión atmosférica. Es posible regular el número de renovacio-
nes de aire en una sala mediante la velocidad de impulsión y de salida del aire
de la misma. Merced a este sistema, se puede regular la presión atmosférica en
una zona de trabajo. Las presiones de las distintas salas de una instalación de
producción se pueden regular para establecer el sentido de circulación del
aire.
• Esclusas de acceso. Un método de aislamiento de una sala consiste en la cre-
ación de un espacio intermedio en el que es posible regular la presión del aire
para evitar la mezcla de ambientes de dos salas contiguas.
• Zonas de descontaminación. Áreas en las que se realiza la desinfección de
materiales o personas que entran o salen de las zonas de producción.
• Áreas de cambio. Frecuentemente se requiere la utilización de vestuario espe-
cial para acceder a las zonas de producción. Es importante construir depen-
dencias en las que se realice el cambio de equipamiento de forma ordenada y
racionalizada.
En todo caso, no se debe olvidar que el principal vehículo de acceso de las con-
taminaciones son los propios operadores y que ninguna prevención en el diseño de
instalaciones puede sustituir las normas de correcta fabricación y la adecuada for-
mación del personal.
Impacto ambiental y bioseguridad

Todas las actividades fabriles suponen un riesgo para los trabajadores y para el
entorno. La industria farmacéutica y más concretamente la Biotecnología, junto
con la investigación científica en el campo de la Biología no son una excepción. Es

frecuente el uso de reactivos de gran peligrosidad (ácidos, bases, neurotóxicos) y se
trabaja sobre organismos vivos frecuentemente modificados genéticamente cuando
no patógenos para el hombre o los animales domésticos. La más incipiente actua-
lidad en este terreno se centra sobre el esparcimiento en la naturaleza de seres que
han sufrido modificaciones genéticas en el laboratorio, es decir, de cultivos trans-
génicos
La peligrosidad generada por la industria biotecnológica y la investigación cien-
tífica en este campo se encuentra regulada por diversas directivas de la CEE, así
como la Ley de Prevención de Riesgos Laborales y los diversos Reales Decretos
que la complementan. El marco jurídico que regula los riesgos de la Biotecnología
es el siguiente:
• Directiva 90/219/CEE. Referente a la utilización de organismos modificados

genéticamente para usos comerciales o de investigación.
• Directiva 90/220/CEE. Sobre la liberación internacional en el Medio
Ambiente de organismos modificados.
• Directiva 98/81/CEE Por la que se modifica la directiva 90/219/CEE relativa
a la utilización confinada de organismos modificados.
• Ley 15/1994 de 3 de junio. Por la que se establece el régimen jurídico de la
utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos
modificados genéticamente a fin de prevenir los riesgos para la salud humana
y el medio ambiente.
• Real Decreto 915/1997 de 20 de junio. Por el que se aprueba el reglamento
general para el desarrollo y ejecución de la Ley 15/1994 de 3 de junio.
• Ley de Prevención de Riesgos Laborales (1995).
• Real Decreto 664/1997 de 12 de mayo. Sobre la protección de los trabajado-
res contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos.
• Directiva 98/24/CEE de 7 de abril. Relativa a la protección de la salud y la
seguridad de los trabajadores contra los riesgos relacionados con los agentes
químicos durante el trabajo.
• Real Decreto 833/1998 de 20 de julio. Por el que se aprueba el reglamento
para la ejecución de la Ley 20/1988 básica de residuos tóxicos y peligrosos.
• Real Decreto 1078/1993 de 2 de julio. Por el que se aprueba el reglamento
sobre clasificación, envasado y etiquetado de preparados peligrosos.
Al amparo de este conjunto de directivas, leyes y decretos, las agencias estata-

les o comunitarias correspondientes crean su propia documentación en forma de
reglamentos, ordenanzas sugerencias o los conocidos guidelines que regulan a nivel
práctico las actuaciones y medidas pertinentes para proteger al medio ambiente y a
los trabajadores de los peligros que acarrea su actividad.
Clasificación y prevención de riesgos en las industrias biotecnológicas
Los riesgos generados por la industria biotecnológica son de tres tipos, biológi-
cos, químicos y radiactivos.
Riesgos biológicos
Se deben al tipo de organismo utilizado. Existe una completa clasificación de

microorganismos en función del riesgo que entraña su manipulación y su cultivo a
gran escala en el que se valora su capacidad de supervivencia en condiciones natu-
rales, su capacidad infectiva y el tipo de dolencias que genera. La lucha contra el
riesgo biológico se lleva a cabo mediante los sistemas de biocontención.
Existen diversos mecanismos y sistemas para proteger a operadores y entorno de
los potenciales riesgos biológicos. Estos mecanismos se agrupan en equipos de
seguridad o barreras primarias, instalaciones o barreras secundarias y las prácticas
de trabajo.
Entre las barreras primarias nos encontramos con las cabinas de trabajo, siste-
mas que aíslan al operador del material biológico, vestuario específico y quipos de
respiración.
Las barreras secundarias, o de construcción, hacen referencia a sistemas de este-
rilización, como los autoclaves, los pasillos especiales de acceso, duchas químicas,
etcétera.
Por último, la buena práctica dentro del laboratorio se convierte en el elemento
esencial de todo sistema de seguridad. Una correcta metodología de acceso a las
zonas y el respeto y escrupuloso cumplimiento de la normativa son la garantía para
alcanzar el nivel de bioseguridad requerido de una manera efectiva.
Riesgos químicos
La Biotecnología utiliza frecuentemente productos intermedios con caracterís-

ticas químicas especiales que impiden su eliminación por los cauces habituales.
Valores extremos de pH, componentes orgánicos o presencia de sustancias alta-
mente tóxicas exigen protocolos especiales para su destrucción. Los trabajadores
más afectados por estas sustancias son sobre todo analistas e investigadores que
deben utilizar las medidas de protección adecuadas para cada caso.
Al igual que con el riesgo biológico, el factor fundamental de la seguridad es el
adecuado entrenamiento de los operadores y la existencia y cumplimiento de una
serie de normas de seguridad en las que se debe indicar el tipo de vestimenta a uti-
lizar, la necesidad de guantes y máscaras protectoras, las condiciones de almacena-
miento (humedad y temperatura), etc.
Como norma general, el almacenamiento de productos químicos debe realizar-
se en lugares de acceso restringido, no expuestos a la luz directa ni a humedad exce-
siva o temperaturas extremas salvo para productos que lo requieran específicamen-
te. Los productos volátiles, tales como los solventes orgánicos, deben guardarse en
lugares ventilados para evitar la acumulación de gases.
Exposición a la radiación
A escala industrial este riesgo se suele restringir a los analistas. Por lo general
es recomendable evitar la realización de pruebas radiactivas en las industrias. Si no
hay posibilidades alternativas, existen una serie de barreras físicas basadas en la uti-
lización de materiales como el plomo y el wolframio que son opacos a las radia-
ciones. En la construcción de instalaciones, dado el elevado coste de estos materia-
les, se utiliza el hormigón. El personal que trabaja con radiactividad debe estar
sometido a un estricto control médico y respetar escrupulosamente todas las normas
de seguridad relativas al manejo de fuentes radiactivas.
Gestión de residuos
Tras la protección de las personas, procede hacerse cargo de la protección del

ambiente, es decir, de la gestión de los residuos generados por el trabajo con pro-
ductos biológicos, químicos o radiactivos.
Residuos biológicos
En el nivel de bioseguridad 1, se considera que los residuos biológicos genera-

dos no son peligrosos y pueden por lo tanto ser eliminados por las vías normales sin
ningún tipo de tratamiento adicional. En niveles de bioseguridad superiores se pre-
vén diversas vías de eliminación de sólidos, líquidos y gases, todas ellas relaciona-
das con líneas de desagüe especiales, sistemas de esterilización y filtros. Los labo-
ratorios de mayor seguridad filtran el aire que vierten al exterior.
Residuos químicos
Las administraciones locales especifican la forma en que se deben eliminar los

diversos vertidos. En el caso de la Comunidad de Madrid, las vías de eliminación
son las siguientes:
Medicamentos caducados y vertidos de alta toxicidad. Se debe contratar a una
empresa autorizada por la Comunidad que se encargue de la destrucción específica
para cada sustancia. Existe normativa muy precisa sobre las condiciones de emba-
laje y almacenamiento de estos residuos.
Vertidos de baja toxicidad. Se eliminan a la red de alcantarillado después de un
tratamiento que garantice que los valores de pH, conductividad, DBO y DQO se
encuentran dentro de ciertos límites. Para que los vertidos alcancen esta situación,
es necesaria la construcción de fosas de neutralización, depósitos en los que el ver-

tido es tratado antes de su eliminación.
Residuos radiactivos
La peligrosidad de los residuos radiactivos y por lo tanto su eliminación varía

con la actividad, tipo de emisión y vida media de la fuente emisora. En general, las
instalaciones radiactivas deben proceder a una clasificación de los residuos que
generan basándose en los parámetros mencionados. Las administraciones públicas
se hacen cargo de estos residuos que deben cumplir condiciones muy precisas de
embalaje.
Las condiciones habituales de almacenamiento para residuos de alta actividad
dependen de su vida media. Se considera que por encima de 300 años de vida media,
las administraciones no pueden garantizar el almacenamiento seguro de residuos
radiactivos en superficie por lo que las prácticas habituales consisten en el enterra-
miento a gran profundidad o adecuadamente embaladas en los fondos marinos.
Purificación de proteínas recombinantes

Una vez generada la proteína de interés, la encontramos en situación de
«crudo», es decir, en un medio de cultivo modificado por el microorganismo o la
célula productora. A veces incluso, la proteína puede encontrarse en el interior de
la célula que es incapaz de excretarla al entorno, siendo necesario un proceso de lisis
que libere el producto del interior de las células sin dañarlo.
El proceso de purificación debe asegurar la recuperación del producto libre de
contaminantes. Dichos contaminantes son, además de otras proteínas, el DNA y los
pirógenos. En cada etapa de una purificación se pierde parte del producto a purifi-
car, lo que da a esta fase de la producción un gran peso económico dentro del pro-
ceso global.
El primer paso en la purificación de la proteína será necesariamente la clarifi-
cación del crudo que consiste en la filtración del mismo a través de filtros inertes de
las dimensiones adecuadas. Una vez realizada la clarificación se suceden procesos
de cromatografía y concentración.
Cromatografia
Es el proceso más universalmente utilizado para purificar proteínas. Se basa en

las interrelaciones de éstas con matrices poliméricas que exhiben diversas propie-
dades físico-químicas. Según sean dichas propiedades se establecen las interaccio-
nes con las proteínas y los distintos tipos de cromatografías. Los tipos de cromato-
grafía posibles son los siguientes:
Filtración molecular (Size Exclusion)
Separan las proteínas en función de su tamaño. Los geles utilizados en este tipo
de cromatografía son porosos y permiten el paso a su través de proteínas hasta un
cierto tamaño. El tiempo que tardan las proteínas en recorrer la columna es tanto
más largo cuanto mayores son.
La relación longitud-diámetro requerido en esta cromatografía debe ser entre
20:1 y 100:1, lo que hace difícil su utilización a escala industrial, al menos en fases
tempranas en que el producto suele suponer grandes volúmenes.
Cromatografía de adsorción
En este modelo se establecen uniones transitorias entre la proteína a purificar y

el gel de cromatografía. Este tipo de unión puede ser producida por cargas eléctri-
cas (cromatografía de intercambio iónico), por hidrofobicidad (cromatografía de
interacción hidrofóbica), por afinidad funcional tipo enzima-sustrato (cromatogra-
fía de afinidad) o por relaciones inmunológicas (cromatografía de inmunoafinidad).
Garantía de calidad
A lo largo de este capítulo hemos mencionado varias veces la importancia de los
métodos y las buenas prácticas a la hora de garantizar la seguridad del producto, las
personas y el entorno. Existe un área de las industrias farmacéuticas, presente tam-
bién en las biotecnológicas como no podía ser de otra manera, que se ocupa de que
los productos fabricados sean aceptables y cumplan plenamente su función; estamos
refiriéndonos a los departamentos de Garantía de Calidad. La Garantía de Calidad
se ocupa de que todos los procesos se hagan de manera controlada, conforme a
métodos descritos, plenamente documentados y respetando las GMP.
GMP
Es la abreviatura que designa los Good Manufacturing Practices (normas de

buena manufactura). Las GMP son un conjunto de normas que regulan el correcto
proceder a la hora de llevar a cabo un proceso industrial. Las GMP cubren un amplí-
simo espectro de temas, desde el tipo de materiales y acabados a utilizar hasta la
secuencia de documentos necesaria para la correcta realización de un proceso.
Las GMP no aparecen como tales en un solo documento ni constituyen una
doctrina estática e inamovible. Antes bien, existen normas escritas, líneas de actua-
ción y «recomendaciones» de las autoridades sanitarias. Existe una continua reno-
vación de las GMP que procede de los registros de nuevos fármacos, de las inspec-
ciones de las autoridades y del desarrollo de nuevas tecnologías.
Documentación de procesos
Cuando se desea fabricar una sustancia para su venta como producto terapéuti-
co es preciso contar con la correspondiente autorización para su venta. Dicha auto-
rización debe estar avalada, además de por una serie de ensayos clínicos, por una
descripción detallada del producto, de sus características químicas y biológicas y
del proceso seguido en su fabricación. Es el «registro» del medicamento.
En el registro de un producto fabricado por biotecnología figuran una descrip-
ción del método, de los equipos y de los controles analíticos que se realizan así
como de los criterios que debe cumplir la sustancia en cada paso de la fabricación
para acceder al siguiente. Este registro se entrega a las autoridades sanitarias y
constituye la documentación de referencia a la que debe supeditarse toda docu-
mentación de procesos.
En el punto de fabricación debe contarse con una descripción detallada y apli-
cable de todas y cada una de las operaciones que el personal debe realizar. Son los
llamados SOP (Standard Operating Procedures) o PNT (Procedimiento Norma-
lizado de Trabajo). Los SOP hacen referencia a todo tipo de normas, desde la forma
de inocular un reactor hasta el orden en que debe vestirse una persona para acceder
al área de trabajo o cómo debe procederse en la limpieza de un equipo.
A lo largo de la realización de un proceso se generan una serie de datos corres-
pondientes a medidas, cantidades administradas, confirmación de operaciones rea-
lizadas. Todos estos datos primarios se deben ir recogiendo en el momento y lugar
en que se producen. Los datos recogidos deben estar autentificados y comprobados.
El documento oficial que recoge los datos primarios del proceso es la guía de fabri-
cación o batch record.
Por último, es esencial garantizar que las personas que trabajan en el proceso
conozcan el mismo perfectamente. Deben existir planes de formación que cubran
este objetivo. La formación de cada persona debe estar adecuadamente registrada.
A lo largo de la vida de un proceso de fabricación es normal que éste vaya cam-
biando para incorporar nuevos materiales y avances tecnológicos. Cuando la incor-
poración de tales avances es contraria o se sale de lo indicado en el registro, es pre-
ciso comunicarlo a las autoridades sanitarias. Éstas valoran la importancia del
cambio propuesto por el fabricante y requieren la documentación y las pruebas que
consideren procedentes para dar por válido el método de fabricación modificado.
Bibliografía
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15
Presente y futuro de la Biotecnología
en las ciencias de la salud: productos
obtenidos mediante biotecnología
A. Campos de Olmo
Introducción
Los rápidos y constantes cambios que se han vivido en las ciencias en general
nos han llevado a cambiar el modo de entender la investigación, la medicina y la
técnica.
Al hablar de biotecnología, a la mayoría de nosotros se nos agolpan en la mente
películas tremendistas con un mucho de ficción científica y un algo de base cientí-
fica o noticias no siempre bien tratadas sobre clonaciones, monstruos y eugenesia.
En la actualidad las características de las nuevas biotecnologías tienen tal poten-
cial que han pasado de ser la cenicienta de los laboratorios a una disciplina con un
peso específico tan grande que está modificando y obligando a revisar conceptos y
fronteras entre los diferentes campos implicados. Así pues, hablamos de una disci-
plina multidisciplinar y multicultural en la que colaboran especialistas de campos
que tradicionalmente no tenían nada en común.
Productos obtenidos mediante biotecnología

en ciencias de la salud
La biotecnología que debemos desarrollar en el presente siglo se fundamenta en
el proyecto Genoma Humano, farmacoquímica-macrocíclica, diseño de fármacos,
diagnóstico génico ingeniería proteica y biomimética, terapia génica xenotrasplan-
tes, etc.
La aplicación práctica de todas estas especialidades ha llevado a obtener pro-
ductos de difícil catalogación en las rígidas estructuras de clasificación tradiciona-
les, así nos encontramos con vacunas que son anticuerpos y que a la vez son recom-
binantes y que se han diseñado por ingeniería molecular y lo producen organismos

transgénicos.
Pero lo realmente importante de todo esto es que ya se tienen vacunas mucho
más efectivas y sobre todo seguras y que proporcionan una inmunidad bastan-
te larga. Por técnicas de ADNr se han desarrollado cepas vivas atenuadas de V.
Cholerae que se usan como vacunas orales, también se ha dado un importante desa-
rrollo en la generación de vacunas de subunidades, sobre todo con el virus de la
hepatitis, las denominadas vacunas peptídicas y anticuerpos anti-idiotipos.
Otro punto a mencionar es el desarrollo de anticuerpos monoclonales partiendo
de los cultivos de hibridomas (células tetraploides resultantes de la fusión somá-
tica de linfocitos B con células de mieloma). Su campo de aplicación es muy amplio
y se pueden utilizar para eliminar selectivamente células que expresan un determi-
nado antígeno (como ciertos antígenos asociados a células tumorales), se han desa-
rrollado anticuerpos específicos de marcadores de diferenciación celular para selec-
cionar poblaciones celulares (como en trasplantes de médula ósea) o frente a
mediadores solubles. También son capaces de modificar el efecto de ciertas molé-
culas antigénicas o funcionar como reactivos para estudiar distribuciones tisulares
de proteínas.
A continuación haremos un breve repaso sobre el proceso de producción indus-
trial de hormonas recombinantes.
Producción industrial de hormona de crecimiento

recombinante (r-hGH)
En la actualidad se comercializa hormona de crecimiento humana por parte de
varios laboratorios farmacéuticos. Durante los últimos treinta años del siglo pasado
la obtención de hormona de crecimiento se conseguía por sistemas extractivos de
hipófisis de cadáveres y a principio de la década de los ochenta se aplican técnicas
microbiológicas junto con la técnica del ADN recombinante para obtener bacterias
productoras de somatropina.
No es hasta los primeros noventa con la aplicación de la ingeniería genética
junto con las técnicas de cultivos celulares de eucariotas cuando se comienza a
obtener una hormona de crecimiento recombinante totalmente humana y en las can-
tidades y calidades necesarias para abastecer el mercado mundial.
Una primera fase fue la obtención de una línea celular apropiada. En nuestro
caso se trata de células de cáncer de mama de ratón, células C127 que son depen-
dientes de anclaje e inhiben su crecimiento por contacto. Se les introduce el gen de
la hGH humana y se obtiene un producto de altísima calidad al realizar estas célu-
las una modificaciones postranscripcionales (splicing de ARNm) y postransduccio-
nales idénticas que en humanos (sobre todo la última glicosilación, que en bacterias
no era completa e incorporaba distintos residuos con un ligero potencial antigénico.
En estas células todas las modificaciones de maduración de Prot, se realizan por
parte del retículo endoplasmático y Golgi).
PRESENTE Y FUTURO DE LA BIOTECNOLOGÍA… 217
Una vez conseguido este importante logro científico en laboratorios de investi-

gación comienza la fase de escalado para conseguir un proceso industrial. Siendo
éste un paso complicado es factible y alcanzable.
El ciclo de producción tipo se compone de dos fases diferenciadas (Fig. 15.1).
1. Upstream
a) Subcultivos.
b) Producción.
2. Downstream
a) Cromatografía de interacción hidrofóbica.
b) Cromatografía de intercambio iónico.
c) Cromatografía de filtración molecular.
CICLO DE PRODUCCIÓN DE r-hGH

Día de
trabajo
0 26 54 70 84
S1 S2 S3 S4 H1H2H3 H14
Descongelar Comienzo Fin de la Final de Control de

ampollas producción producción purificación calidad
Cultivo celular Producción 90% Análisis
(14 Cosechas) Purif.
Figura 15.1. Ciclo completo de un lote de producción de r-hGH.
Upstream
Primeramente se genera un banco de células patrón (master cell bank = M CB) a

partir del cual se crean los bancos de células de trabajo (working cell bank = WCB).
Se mantienen las células congeladas en N2 líquido y almacenadas en viales o ampo-
llas. Los envíos de viales entre el MCB y el WCB se realizan en equipos especiales
que aseguran el mantenimiento de las condiciones óptimas durante todo el trayecto,
estando constantemente monitorizados por registradores de temperatura. La produc-
ción de r-hGH comienza con la descongelación de los viales del WCB. El número a
descongelar está directamente relacionado con el tamaño final del lote de producción.
Una vez descongelados los viales ser realiza un pool celular sobre DMEM
suplementado con suero fetal bovino (SFB) sembrándose todo sobre botellas rodan-
tes (roller bottles = Rb) de 850 cm2 de superficie.
A estas botellas, por lo general entre 6 y 11, se les realizan varios cambios de
medio para producir el crecimiento del cultivo y fomentar la división celular.
Cuando el cultivo ha alcanzado la fase de confluencia se realiza el primer subculti-
vo. El objetivo de éstos es ir aumentado el número de células productoras en el lote

lo que se acompaña, por tanto, de un incremento en el número de botellas rodantes.
La fase de escalado se completa con un cuarto subcultivo que fija el tamaño de lote
en unas 3.000 botellas rodantes de 2.125 cm2 o 1.700 cm2 de superficie (la elección de
una u otra superficie viene condicionada por las necesidades de hormona. Actualmen-
te tenemos capacidad para trabajar con un máximo de 3.600 Rb´s de 2.125 cm2).
A partir del subcultivo 4 se comienza un paulatino proceso de aclarado y elimi-
nación de SFB del DMEM para dirigir el metabolismo celular a la producción de la
hormona y no a la duplicación celular.
La fase de producción propiamente dicha se compone de 14 cosechas o harvest
durante los cuales se recoge entre 900 y 1.125 litros de medio de cultivo por día y
que contiene entre un 30-40 % de hormona en el total de proteína. Las botellas, lógi-
camente, se rellenan con DMEM fresco.
Todos los procesos enumerados anteriormente se realizan de forma automatiza-
da por robots ubicados dentro de cabinas de flujo laminar. El sistema está gestiona-
do por un complejo sistema informático que transmite órdenes precisas para que el
brazo robótico realice las típicas fases en técnicas de cultivos celulares (aclarado,
harvest, cambio de medio, tripsinizaciones, etc.). Destacar lo complicado de todas
estas operaciones, pues las instrucciones deben asegurar que el robot se mueva en
las tres direcciones del espacio, con movimientos suaves para que no afecten al cul-
tivo y todo ello en tiempos compatibles con un proceso industrial (preferiblemente
dentro de una jornada laboral) (Fig. 15.2).
Figura 15.2. Robot trabajando con cultivos celulares. El brazo articulado se encuentra en el inte-
rior de un flujo laminar y es capaz de realizar todas las tareas propias de un laboratorio de culti-
vos celulares.
Todas estas manipulaciones se llevan a cabo en un laboratorio de cultivos celu-

lares con técnicos muy cualificados que deben trabajar en condiciones de sala blan-
ca. Todo el laboratorio cuenta con un ambiente controlado en temperatura, hume-
dad, calidad y renovación del aire durante todos los días del año.
La totalidad de las Rb del cultivo se mantienen constantemente en movimiento
rotatorio en unos armarios denominados comercialmente como roller cell y que
cuentan con una capacidad de 100 botellas cada uno. De esta forma nos aseguramos
que la monocapa celular se encuentre siempre bañada por el medio que le aporta los
nutrientes necesarios. Los roller cell se introducen en cámaras calientes que man-
tienen temperaturas de 36.5 °C y sólo se permiten variaciones de + 0,2 °C.
UPSTREAM
Día 0 Día 28 Día 54

Crecimiento Cosecha
Descongelación
Lote 1
Lote 2
Lote 3
18 Lotes al año
Subcultivos
(8) X
Botellas rodantes
Ampollas 850 cm2
WCB
Botellas rodantes
1.700 cm2
(3.000)
⫻ 30
Figura 15.3. Esquema de la fase de producción de la hormona de crecimiento.

Una parte importante de todo el proceso es la logística de materiales y solucio-

nes. El ingente volumen de DMEM y tampones necesario por operación requiere de
sofisticados sistemas de esterilización. Los materiales de vidrio, plástico o acero
resistentes al autoclave se lavan previamente en máquinas especiales que utilizan
agua purificada para minimizar los contaminantes químicos en los materiales que
vayan a estar en contacto con las células. Los equipos que no caben en los autocla-
ves pasan por sistemas de esterilización CIP-SIP. Todos los líquidos que se prepa-
ran para su uso en los cultivo de células o determinados pasos del proceso de puri-
ficación se esterilizan por filtración en carcasas de 20 pulgadas.
Los ciclos de los autoclaves y las máquinas lavadoras son específicos para
cada tipo de material y volumen de carga. Están validados en las condiciones de
uso conforme a los requisitos que marcan las reglamentaciones vigentes y toda la
documentación generada durante la fabricación de un lote de producción se alma-
cena en registro escrito durante 10 años después de la caducidad del producto en
el mercado (en realidad estamos hablado de periodos de tiempo cercanos a los 30
años.)
El abastecimiento de agua para inyección (WFI) es crucial para la preparación
del medio de cultivo y las distintas soluciones de la fase de purificación. En la plan-
ta contamos con un lazo de agua WFI que la mantiene constantemente a 80 °C y en
circulación para evitar el crecimiento de microorganismos. El sistema se completa
con unas células de luz UV que esteriliza el agua por radiación. Todo el complejo
productor de agua se controla exhaustivamente incluyéndose caracterización orgá-
nica e inorgánica (conductividad y TOC) y monitorización continua, lo que asegu-
ra una calidad constante y, lo que es muy importante, estable (Fig. 15.3).
Downstream
El proceso de purificación de hormona aprovecha tres características de la hor-

mona de crecimiento:
1. Interacción hidrofóbica: en esta primera etapa se utiliza una columna de
phenyl-shepharosa que se carga con el harvest salado. Se recoge un pico
característico del cromatograma (Abs a 280 nm).
2. Cromatografía de intercambio iónico: Se aprovechan las regiones polares
de la hormona para retenerla en el gel. En esta etapa se usa una columna de
DEAE sepharosa que se carga con los eluidos obtenidos en la fase PS. El
pico del cromatograma se recoge en seis fracciones que incluyen los co-
leos de la curva del cromatograma. En este paso la pureza de la hormona es
ya de un 85 %.
3. Cromatografía de filtración molecular: En este paso los «contaminantes»
son en realidad agregados (tetrámeros) y dímeros de la hormona. El pool
DEAE se ultracentrifuga y se carga una columna de ultragel ACA54. Esta
columna está compuesta de varios discos interconectados entre sí, pues de
lo contrario tendría una altura cercana a los 6 metros. El cromatograma nos

separa tres picos que se corresponden con los diferentes agregados y se
recoge el monómero. Todo el eluido se dosifica y se obtiene una hormona
purificada al 90 %. En un sencillo último paso se obtiene r-hGH al 99 %.
Algunas de estas columnas tienen diámetros de lecho de 60 cm e incluso de ¡1
metro! El lector acostumbrado a trabajar en condiciones de laboratorio sabrá valo-
rar el dato en toda su magnitud (Fig. 15.4).
Las especificaciones durante el control en proceso (IPC) se basan en la identifi-
cación y pureza del producto final (SDS-PAGE, RP-HPLC y SE-HPLC), valoración
(SE-HPLC y OD a 276 nm) y microbiología (carga bacteriana, endotoxina, mico-
plasma y transcriptasa inversa).
Todo el proceso de producción se encuentra estrechamente vigilado por un
estricto control de calidad que se basa en especificaciones generados a partir de
leyes y organismos reguladores nacionales e internacionales (NDA, FDA, y distin-
tas farmacopeas como USP, PhEUR).
COSECHA
PURIFICACIÓN r-hGH (1 cada 2 Días)
(14 por lote)
PS Cromatografía de interacción hidrofóbica
–40 °C (+/–5)
FROZEN
r-hGH PS1 PS2 PS13 PS14
r-hGH
LOTE
DEAE Cromatografía de interacción iónica
AC Filtración molecular
54
Filtración y dosificación
r hG
LOTE
90%
Figura 15.4. Proceso de purificación de r-hGH. (Esquema cortesía Dpt. Purificación SERONO.
Tres Cantos.)
Producción industrial de r-hFSH

Utilizando los últimos avances en cultivos celulares, la producción industrial de
r-hFSH se basa en la tecnología de microportadores en biorreactores de células
eucariotas. En este caso la célula vector es de ovario de hámster chino (célula
CHO). La ventaja de estas células es que presentan patrones de glicosilación pos-
trancripcional idénticos a humanos, incorporando correctamente los restos de ácido
siálico, galactosa, manosa y fucosa con lo que la hormona obtenida es totalmente
humana. De estas células se conoce perfectamente su biología celular, son fácil-
mente cultivables en laboratorio y secretan el producto al exterior.
Igual que en el caso anterior el proceso industrial se divide en dos fases.
1. Upstream:
a) Proceso de cultivo celular o escalado (36 días).
1. Descongelación de viales de WCB.
2. Expansión celular en frascos T o botellas rodantes.
3. Tripsinización y mezcla con el lecho de microportadores y transferen-
cia al biorreactor.
b) Producción de r-hFSH (34 días).
1. Fomentar el anclaje y el crecimiento celular.
2. Dirigir el metabolismo celular para la producción de hormona.
3. Recolección (16 harvest).
2. Downstream:
a) Ultrafiltración.
b) Cromatografía.
c) Inmunoextracción de r-hFSH.
d) Cromatografía y RP-HPLC.
e) Ultrafiltración.
f) r-hFSH purificada al 99 %.
La aplicación de biorreactores a la producción de hormona es una técnica muy

novedosa a escala industrial. En nuestro caso utilizamos equipos de flujo continuo
de más de 50 litros lo que permite una recogida de tres harvest cada 24 horas.
Modificación genética en animales. Transgénicos.

Introducción
A finales del siglo XX los biólogos moleculares y celulares, en sus laboratorios,

han sido capaces de identificar, aislar y modificar genes en multitud de especies
incluida la humana.
El segundo paso fue desarrollar técnicas que permitiesen introducir esos genes
en células y organismos vivos para poder estudiar sus funciones y efectos.
En 1982 los doctores. Brinster y Palmiter fueron los primeros en fabricar «rato-
nes gigantes» obtenidos por la modificación del gen de la hormona del crecimien-
to. Demostraron así la posibilidad de alterar de modo permanente características en
animales y durante todo su ciclo vital.
Desde entonces han producido varios miles de líneas de animales transgénicos
y no sólo ratones. Algunas de estas modificaciones buscan obtener modelos válidos
de enfermedades humanas en animales para diseñar y ensayar nuevas terapias.
El concepto de transgén
Estructuralmente, un transgén es idéntico a un gen que se expresa in vivo, por
tanto debe contar con secuencias reguladoras y el gen estructural:
1. Gen estructural: secuencia de bases que codifica la información genética
necesaria para la síntesis del producto de interés. Actualmente se dispone de
varios miles de genes clonados y ya se ha anunciado la secuenciación com-
pleta del genoma humano.
2. Elementos reguladores: secuencias responsables de la expresión y regulación
del gen determinan los tipos celulares y tejidos en los que el transgén será
funcional.
Técnicas de generación de animales transgénicos
Microinyección pronuclear
Es el primer método desarrollado, se inició en el ratón y es el más ampliamente

utilizado. Permite la adición del gen exógeno a todas las células del animal incluso
las de línea germinal con lo que pueden transmitir el transgén a su progenie.
Las hembras donantes de embriones son tratadas previamente con hormonas
para inducir una superovulación. A continuación se cruzan con machos fértiles y
posteriormente a la monta (por aparición de tapón vaginal) se sacrifican para reco-
ger los embriones producidos. Los embriones se recogen en estadio de dos pronú-
cleos y son necesarios varios cientos por experimento. Los embriones se mantienen
en placas de cultivo y en un microscopio dotado de un sistema de micomanipula-
dores, se sujeta mediante una pipeta de sujeción. Con una finísima aguja de vidrio
(diámetro inferior a 1 mm) se le inyecta en uno de sus pronúcleos (normalmente el
paterno) una solución inocua cargada con entre 20 y 200 copias del transgén. Los
embriones así tratados son implantados en grupos a varias madres adoptivas en
las que completarán su desarrollo. Una vez terminada la gestación y mediante téc-
nicas de análisis del ADN como PCR o Southern blot se identifican los animales
transgénicos (si hay alguno, pues la eficacia de la técnica no supera el 5-15% para
construcciones génicas no muy grandes y con técnicos muy experimentados) y a
través de un sistema adecuado de cruzamiento se obtienen las líneas transgénicas
de interés.
Transgénicos Knock Out
Permite la mutagénesis de genes en ratones. Su desarrollo se basa en el estable-

cimiento de líneas de células madre embrionarias (ES) derivadas de la masa celular
interna del embrión que una vez transferidas a blástulas pueden dar lugar a cual-
quier línea celular del ratón (totipotencia).
El gen exógeno se integra gracias al mecanismo conocido como recombinación
homologa. Este sistema se suele utilizar para estudiar la función de un gen pues la
forma salvaje se sustituye específicamente por el transgen de interés. Otra aproxi-
mación consiste en la inactivación de un gen, en cuyo caso la modificación afecta
a la totalidad del organismo.
Con este sistema se obtuvieron los primeros ratones transgénicos en los años
ochenta y es una técnica que se encuentra actualmente en auge en investigación
básica aplicada a la clínica.
Mutagénesis condicional. Sistema Cre/lox P
El sistema Cre/lox se basa en la capacidad que tiene la enzima recombinasa Cre

(bacteriófago P1) de reconocer una secuencia de ADN llamada lox P. Si encuentra
dos copias de la secuencia lox P con igual orientación, se produce una recombina-
ción en la que se ve interesado el fragmento de ADN qué está entre ellas. Es decir,
la acción de Cre elimina o sustituye (según en que condiciones) ese fragmento. El
desarrollo del sistema «recombinasa Cre-secuencia de reconocimiento lox P» ha
permitido trabajar en modificaciones casi puntuales y específicamente dirigidas
sobre el genoma del ratón. La cualidad más sobresaliente de este novedoso sistema
es la capacidad de inactivar la función de un gen tan solo en aquellas células del
organismo que expresen la recombinasa Cre.
Para producir transgénicos por este sistema se necesitan dos líneas diferentes de
ratón (la primera creada por mutagénesis dirigida y la segunda por microinyección
pronuclear):
1. Un ratón portador del gen «floxeado» («flanqueado por las secuencias lox
P»).
2. Un ratón que exprese Cre en un tejido diana.
Del cruce de ambos (a ser posible de distinto sexo) obtendremos un individuo
que ha perdido el gen «floxeado» en los tejidos diana que expresan Cre.
Un esquema con dos de los sistemas se presenta en la Fig. 15.5:
A B
X
Obtención de Gen endógeno

embriones
Recombinación homóloga en células ES
lox P lox P
Gen flanqueado por secuencias lox P
Microinyección e integración del transgén
Ratón portador gen Ratón expresando Cre en

«loxeado» partes de sus tejidos
lox P lox P
Promotor Cre
Transferencia a madre
adoptiva
El gen «loxeado» se pierde en los

tejidos que expresan Cre
Identificación de
transgénicos
Figura 15.5. Esquema transgénicos. (A): Esquema de transgénesis por microinyección pro-
nuclear. (Foto cortesía de Dept. de Biología Molecular y Celular CIEMAT). (B): Esquema de trans-
génesis en sistemas inducibles crelox.
Los transgénicos en la industria
Hasta el momento solo se ha hablado de ratones transgénicos con aplicaciones

en experimentación básica y/o clínica. Pero una técnica con tantas posibilidades no
queda fuera de los «procesos industriales» por mucho tiempo.
En 1985 se publican los primeros éxitos en la producción de conejos, ovejas y
cerdos transgénicos. Sin embargo la técnica tiene limitaciones, como ya se ha indi-
cado anteriormente se necesitan muchos embriones y muchas madres de alquiler
para obtener un animal transgénico. En el caso de roedores (como el ratón o el cone-
jo) el elevado numero de crías por camada, su relativa facilidad de cría y su rápido
desarrollo permiten obtener buenos resultados a medio plazo con lo que el estable-
cimiento de líneas animales productoras es complicado pero abordable.
En el caso de animales como ovejas, cerdos, vacas o cabras las eficiencias de la
técnica bajan espectacularmente (entre el 1 y el 2 % de los embriones manipulados
dan lugar a animales transgénicos. A nadie se le escapa que conseguir 50 embriones
de vaca, manipularlos, implantarlos en otras tantas vacas nodrizas y esperar el naci-
miento de terneros trasnsgénicos es un proyecto muy largo y costoso (el proceso de
gestación en las vacas es de nueve meses, pero luego hay que esperar a tener indi-
viduos adultos y del sexo requerido) y sin una seguridad de éxito a medio plazo,
pues en ocasiones no se pueden regular todos los factores de los sistemas biológi-
cos lo que provoca en ocasiones que el transgén no tenga ningún efecto o su efecto
sea negativo.
De todas formas existen pequeños rebaños de ovejas, cabras y vacas transgéni-
cas que producen en la leche diferentes proteínas de interés comercial.
Los conocimientos de la glándula mamaria y su capacidad de generación láctea
de manera más o menos continua y estable y la relativa facilidad de separación de
productos en la misma, han ayudado a ello:
1. Producción de fármacos en leche. En la producción de proteínas con carácter
terapéutico en este tipo de animales se pueden conseguir concentraciones de
incluso 1 a 10 g/l. La caracterización de los elementos reguladores de la
expresión de distintos genes codificantes de proteínas lácteas ha permitido su
empleo para dirigir la síntesis de proteínas de interés en la leche de hembras
transgénicas, con eficiencias del orden de 1 a 40 gramos de proteína por litro
de leche producida (calcitonina, _-1-antitripsina, antitrombina III, factores de
coagulación. Como ejemplo de los problemas que pueden surgir en la aplica-
ción industrial de estas técnicas mencionaremos el caso del factor activador
del plasminógeno humano. Cabras transgénicas que generaban de 1 a 7 g/l de
esta proteína en leche, tenían períodos de lactación muy cortos y presentaban
signos similares a la mastitis debido a la insolubilidad del plasminógeno a esas
altas concentraciones. El mayor problema que se plantea en estos casos es el
conseguir lotes de producción estables y consistentes que puedan abastecer un
mercado muy exigente. Normalmente las producciones de referencia en artí-
culos suelen contabilizar un número muy reducido de animales y además
estos animales se ven afectadas por las diferentes estaciones, el clima, la ali-
mentación y las enfermedades que suelen contraer de manera natural.
2. Leche humanizada. Los intentos principales se dirigen a producir leches
humanizadas enriquecidas (ricas en lactoferrina) para minimizar intoleran-
cias alimentarias.
De todas maneras en 1998 se pusieron en marcha protocolos de ensayo clínico para
proteínas recombinantes que se extraían de diferentes animales transgenicos como la
alfa-glucosidasa de conejo (actualmente en fase II) y la antitrombina III de cabras
transgénicas (fase III). Aún no está resueltos ciertos problemas de bioseguridad y regu-
lación y no se conocen los efectos de una posible interferencia de secuencias retrovira-
les.
Producción de órganos para xenotrasplantes
Actualmente la técnica de trasplante de órganos (tanto en cirugía como en con-

trol del rechazo) es de uso común y es la falta de donantes lo que limita el uso de la
misma (se estima en un 50 % los trasplantes que no se realizan por falta de donan-
tes). La posibilidad del xenotrasplante (trasplante entre distintas especies) como
alternativa, pasa por evitar el rechazo hiperagudo. Este rechazo viene provocado por
la unión de anticuerpos del organismo receptor a moléculas xenorreactivas del teji-

do trasplantado y que desencadena la activación del sistema del complemento, que
se traduce en alteraciones de los vasos del órgano injertado.
Se han generado cerdos con proteínas humanas reguladoras del complemento
así como cerdos con bajos niveles de xenorreactivos, en un intento de evitar el
rechazo hiperagudo del trasplante.
El uso de órganos de estos cerdos transgénicos, unido a los moderadores de
rechazo utilizados en trasplantes humanos, permitió notables resultados en xeno-
trasplantes cerdo-mono. El uso de este tipo de órganos está actualmente condicio-
nado a la posibilidad de transmisión de enfermedades vinculadas al xenotrasplante.
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16
Biología molecular y endocrinología:
El ejemplo de los animales
transgénicos
J. Reventos, D. Martínez-Selva, O. Martínez-Tirado,
T. Pino, F. Munell
Introducción
En septiembre de 1980, Gordon et al. consiguieron el primer éxito en la pro-
ducción de un animal transgénico (1). Ello consistió en incorporar de forma perma-
nente un gen clonado previamente en el genoma del embrión de un mamífero, en
este caso, de un ratón. Estos autores acuñaron el término transgénico para referirse
a estos ratones (2). Este término es el usado actualmente para referirse tanto a ani-
males como a plantas a los cuales se les ha transferido artificialmente material
genético que en principio no poseen naturalmente.
¿Cuáles son las razones por las que esta tecnología —la creación de animales
transgénicos— ha revolucionado de forma tan notable la investigación en biología
y medicina y ha permitido este sustancioso avance en la comprensión de la regula-
ción genética y del desarrollo embrionario? (3).
La repuesta a esta pregunta podría resumirse de la siguiente manera: los genes
inyectados se expresan correctamente en los ratones. Sabiendo que la distribución
tisular de la expresión de un gen, así como su regulación durante el desarrollo, están
controlados por secuencias de ADN situadas muy cerca del gen mismo, se podrá
dirigir la expresión de éstos a voluntad del investigador siempre y cuando dichas
secuencias reguladoras (promotores y enhancers) se sitúen por delante del gen que
se quiere expresar. Este descubrimiento fue realizado por Brinster et al (4) al diri-
gir el gen de la timidin quinasa del herpes hacia el hígado de ratones transgénicos,
poniendo además este gen bajo el control del promotor del gen de la metalotionina
de ratón, que normalmente se expresa en el hígado.
Métodos utilizados para generar animales transgénicos

Métodos clásicos
Los primeros ratones transgénicos fueron realizados por el método de microin-

yección (2) en el pronúcleo, aunque actualmente existen otros tres métodos que son
también de gran utilidad para la producción de estos animales. Éstos son la infec-
ción de embriones por retrovirus portadores del gen que se quiere transferir (5), la uti-
lización de células pluripotenciales embrionarias previamente transfectadas con
ADN (6) y la trasferencia genética mediada por espermatozoides (los detalles de los
cuatro métodos para producir animales transgénicos pueden verse en detalle en las
Figuras 16.1, 16.2, 16.3 y 16.4). Estos métodos tienen ventajas e inconvenientes
cuando se comparan entre sí. Los puntos principales de esta controversia se hallan
resumidos en la Tabla 16.1.
Transferencia mediada por espermatozoides
A mediados de los ochenta, en Roma, en el laboratorio de Corrado Spadafora,

se desarrolló un método nuevo para crear animales transgénicos que se denominó
«transferencia génica mediada por espermatozoides» (7). El método en cuestión con-
sistía en incubar el ADN que se quería introducir en el ratón transgénico con esper-
matozoides de ratón. Después de dicha incubación se procedía a fertilizar in vitro
óvulos de un ratón hembra donante con dichos espermatozoides. El resultado era la
incorporación del ADN externo en algunas de las crías resultantes (Fig. 16.4). La
aparición de este método fue ampliamente discutida por la comunidad científica que
no consiguió repetirlo en otros laboratorios. Sin embargo, en un pasado más recien-
te, han seguido apareciendo publicaciones de distintos laboratorios confirmándose
su validez.
Recombinación homóloga
Los genetistas de las levaduras fueron los primeros en observar que un ADN
externo transferido a una célula de levadura se integraba en el mismo locus que el
gen endógeno. Ese mecanismo se denominó recombinación homóloga, a diferencia
del anteriormente descrito que era al azar o recombinación no-homóloga. Poco
tiempo después se conoció que este tipo de recombinación tenía también lugar en
las celulas de mamíferos pero en una frecuencia bajísima de aproximadamente
1:1.000. El descubrimiento importante llegó de las manos del laboratorio de Mario
Capecchi, en la Universidad de Utah, con la propuesta del método de selección lla-
mado «positivo-negativo» (8) que permitía identificar esta recombinación homóloga
entre otras 999 no-homólogas (ver detalles en la Figura 16.5, en su leyenda y en la
referencia (9)).
BIOLOGÍA MOLECULAR Y ENDOCRINOLOGÍA: EL EJEMPLO DE LOS… 231
Embrión unicelular
en estadio
pronuclear
ADN ajeno
Microinyección en el pronúcleo
Implantación
oviductal
Pseudogestante
Identificación de animales con el gen
Reacción
Southern-blot en cadena
de polimerasa
Figura 16.1. El gen que se quiere transferir se inyecta normalmente en el pronúcleo masculino
de un embrión unicelular, con la ayuda de un microscopio y de un micromanipulador. Estos
embriones se obtienen a partir del oviducto de hembras normales inmaduras superovuladas con
FSH y LH que han sido cruzadas el día anterior con machos fértiles normales. Después de inyec-
tarlos, los embriones manipulados serán transferidos al oviducto de una hembra pseudogestan-
te, es decir que ha sido cruzada el día anterior con un macho estéril. Esta madre portadora dará
a luz a crías que habrán incorporado o no el gen inyectado (esto se detectará a través de un
«Southern blot» o estudio del ADN de las crías por PCR). Las crías que posean el gen (muestra
número 3 en la Figura ), se irán cruzando progresivamente entre sí hasta obtener la línea de ani-
males transgénicos.
Vector retroviral Embriones de ratón

infeccioso
Inserción del
ADN retroviral Ratón con ADN retroviral
Células productoras
en el genoma
de retrovirus
Figura 16.2. Transferencia de genes mediada por retrovirus. El grupo de Rudolph Jaenisch fue
el pionero en la utilización de los retrovirus como vectores para transferir genes en embriones de
ratón. Estos son desprovistos de la zona pelúcida y puestos en contacto con células productoras
de virus (Moloney Murine Leukemia Virus, en la figura). Una vez inyectados, los embriones serán
implantados en una hembra portadora pseudogestante.
ADN ajeno Inyección de células pluripotenciales

transfectadas en blastocitos
normales de ratón
Células pluripotenciales
(stem cells)
Ratón normal Ratón

quimérico
Híbrico F1
El 50% es portador del nuevo gen
Figura 16.3. Utilización de células pluripotenciales (stem cells) para crear animales transgéni-
cos. Las células pluripotenciales existen en líneas establecidas a partir de embriones de ratón.
Estas células pueden ser mantenidas indefinidamente en cultivo y se les puede transfectar el ADN
que convenga. Las células así manipuladas serán a continuación inyectadas en los blastocitos de
ratones normales y posteriormente implantadas en las madres portadoras. Los ratones resultan-
tes, que serán quimeras, serán cruzados con ratones normales hasta obtener la línea de ratones
transgénicos.
Esperma
de ratón
ADN ajeno
El ADN ajeno
se incorpora a
los genes del ratón
Óvulo
de
ratón
Figura 16.4. Transferencia génica mediada por espermatozoides. Este método se basa en el
hecho de que el esperma maduro tiene la capacidad de incorporar ADN exógeno al ponerlo en
contacto con él. Los espermatozoides de ratón obtenidos a partir del epidídimo son incubados con
el ADN de interés que se desea transferir. Dichos espermatozoides incorporarán el ADN y serán
posteriormente utilizados en un proceso de fertilización in vitro. Los embriones así fertilizados
serán reintroducidos en el oviducto de hembras pseudogestantes y las crías transgénicas identi-
ficadas como se describe en la leyenda de la Figura 16.1.
Tabla 16.1. Comparación de las ventajas e inconvenientes de los tres métodos más
comúnmente utilizados para producir animales transgénicos
Método Ventajas Inconvenientes
Microinyección Técnicamente fácil, alto Existencia de cambios importantes en

nivel de expresión. los cromosomas (concatámeros).
Infección por retrovirus Técnicamente fácil, Bajo nivel de expresión. Limitación
integración de una sola de tamaño de ADN que se puede
copia de ADN, lo que facilita inyectar.
la posterior clonación.
Utilización de células Se puede seleccionar antes Técnicamente muy difícil.
pluripontenciales de producir el animal. La transmisión a las líneas celulares
germinal no siempre ocurre (quimeras).
Eliminación de una alelo en un animal:

el ejemplo de los ratones knock-out
La estrategia de la recombinación homóloga, ampliamente utilizada en la actua-

lidad, permite, no solo expresar el gen de interés bajo control de los promotores
endógenos existentes en el genoma del receptor, sino la misma sustitución del gen
endógeno, evitando pues su expresión, por un nuevo gen externo o construcción
génica que se desee insertar (10). Esta metodología permitió, además de la transgé-
nesis convencional, en este caso dirigida, la eliminación de un gen de forma selec-
tiva. Los animales resultante de dicha manipulación se han denominado «alelos
nulos» o «knock-outs». Conceptualmente, estos modelos representarían los opues-
tos a los transgénicos clásicos en los que se sobreexpresaba un gen externo de inte-
rés. Estos modelos están contribuyendo de forma extraordianaria al establecimien-
to de la función de los genes y de sus correlaciones entre genotipos y fenotipos.
Veremos en el curso de esta revisión algunos de los modelos de «knock-out» más
relevantes en la endocrinología.
Animales transgénicos de expresión inducible
Sin embargo, cuando un gen, ya sea sobreexpresado o anulado por transmisión

germinal en un animal transgénico, está presente en dicho animal desde el inicio del
desarrollo embrionario, éste puede en muchas ocasiones hacer inviable el desarro-
llo del animal y por tanto la no obtención del modelo deseado. Esta estrategia, útil
en muchos ejemplos, puede no serlo en otros. Para ello, varios grupos han diseña-
do un modelo de animal transgénico inducible externamente o condicional. Este
método de expresión inducible y tejido-específica, basado también en la recombi-
nación homóloga, se fundamenta en el sistema de recombinación Cre-loxP (11,12)
(véase Fig. 16.6).
Gen clonado X
interrumpido por la
inserción del gen aph
Gen tk
Recombinación Recombinación
no-homóloga homóloga
aph tk aph
Célula resistente al G 418 Gen X interrumpido, célula
y sensible al ganciclovir resistente al G 418 y al ganciclovir
Figura 16.5. Selección positiva-negativa para identificar los eventos de recombinación homólo-
ga. El gen clonado X ha sido interrumpido por la inserción de un gen aph (que codifica para la
resistencia al análogo de la neomicina G418). En dirección 3’ se ha clonado un marcador tk. La
incorporación de un marcador positivo se utilizará para seleccionar las células que hayan incor-
porado el vector de ADN después de la transfección. La pérdida del marcador negativo se utiliza
para distinguir las células que han incorporado la construcción al azar de las que lo han incorpo-
rado por recombinación homóloga. El marcador negativo está clonado en un extremo de la cons-
truccción, donde hay una región de no homología entre el vector de inyección y el ADN cromosó-
mico. Cuando la recombinación homóloga tiene lugar, esta zona es eliminada por la maquinaria
que gobierna la recombinación homóloga, y las células adquieren la capacidad de sobrevivir en
un medio selectivo que contenga el análogo de la timidina ganciclovir. En las células que han
incorporado el ADN al azar, la presencia de un tk activo permitirá la selección con ganciclovir.
Ejemplos de utilización de los animales transgénicos

en biomedicina
Los animales transgénicos se han utilizado para resolver una gran variedad de
problemas que la biología tiene planteados, principalmente relacionados con la
regulación génica. En la segunda parte de esta revisión, presentamos brevemente
algunos de los trabajos de más relevancia en campos tan distintos como la oncolo-
gía, la inmunología, la terapia por genes, la endocrinología (véanse revisiones en (13)

y (14), etc.
Oncología
La posibilidad de introducir en animales genes potencialmente oncogénicos clo-

nados a partir de virus o de células tumorales, ha permitido estudiar detalladamen-
te la función que tales genes pueden desempeñar en el desarrollo y en la evolución
del cáncer (3).
La introducción en ratones del oncogén c-H-ras unido al promotor de la elasta-
sa pancreática del tipo I causó la aparición de tumores de páncreas exocrino; sin
embargo, cuando es el proto-oncogén ras el que se introduce, los tumores pancreá-
ticos no aparecen.
Gen diana
Recombinación
Gen diana
homóloga
HSV-tk neo Construcción diana
loxP loxP loxP
Recombinación
homóloga de
HSV-tk neo
la línea
Recombinación mediada por germinal
Cre-loxP + tratamiento con
ganciclovir
gen diana flanqueado por loxP Delección del gen diana
Knockout inducible Knockout no inducible

Figura 16.6. Estrategia para generar deleciones de genes inducibles en células embrionarias
por recombinación homóloga. En un primer tiempo, una construcción génica direccional que
albergue tres sitios loxP flanqueando al gen diana y un cassette con un marcador de selección
que contenga el gen para la resistencia a la neomicina (neo r) y un HSV-TK son recombinados con
el ADN de la línea germinal. En un segundo tiempo, la enzima Cre se expresa en las células
embrionarias que contienen el ADN recombinado homólogamente. La expresión de Cre podrá
resultar ya sea en la deleción del gen diana producido por las células embrionarias portadoras de
la deleción en la línea germinal, o en una deleción del cassette con el marcador de selección pro-
ductor del gen flanqueante en el locus diana, permitiendo la inactivación inducible en las células
embrionarias resultantes.
La introducción de genes virales en ratones transgénicos ha permitido crear mode-

los para estudiar la malignidad y el potencial oncogénico de los virus. La inyección
en ratones del virus SV40 o de su antígeno T, origina la aparición de papilomas del
plexo coroideo. Cuando este gen se une al promotor de la insulina, los tumores apa-
recen en el páncreas endocrino. Este tipo de experimentos ilustra claramente el poder
de esta tecnología al dirigir la expresión de oncogenes hacia tejidos específicos, per-
mitiendo con ello seguir de forma precisa el proceso de transformación celular.
Creación de animales con enfermedades genéticas
De la misma manera que la transferencia de un gen puede corregir una enfer-

medad genética, aquella puede también originarla. El mejor ejemplo de este tipo de
experimentos fue el crear un modelo portador de la mutación letal responsable de
la osteogénesis imperfecta, que es una enfermedad en la que existe una alteración
de la formación del colágeno. Para producir dicho modelo animal, Stacey et al.
mutaron in vitro el gen clonado de la cadena alfa 1 del colágeno, insertando una cis-
teína o una arginina en la posición 849 de la proteína. Cuando el gen mutado artifi-
cialmente se transfirió a los ratones, éstos desarrollaron la enfermedad letal pareci-
da a la osteogénesis imperfecta (13).
Ratones transgénicos como modelos para terapia por genes
Los ratones que tienen una mutación específica responsable de una enfermedad
son modelos ideales para ser tratados restituyendo el gen anómalo o ausente (tera-
pia por genes). Los ratones portadores de una deleción del gen de la beta globina,
al ser cruzados hasta obtener homocigocidad, desarrollan la enfermedad conocida
como beta talasemia, que es una hemoglobinopatía corriente en humanos.
Costantini et al. consiguieron corregir la beta talasemia en estos ratones inyectán-
doles el gen de la beta globina humana (3).
Endocrinología
La determinación del sexo, en los animales superiores, requiere la expresión de

un gen del cromosoma Y, el SRY, que es capaz de inducir el desarrollo de la gona-
da indiferenciada hacia testículo en lugar de ovario. La evidencia directa de que el
gen SRY era el gen determinante de la aparición de testículos se obtuvo gracias al
análisis del genoma de hembras XY con disgenesia gonadal. La prueba definitiva
para demostrar la función del gen SRY se obtuvo, sin embargo, al introducir dicho
gen en embriones XX y observar si éstos desarrollaban un fenotipo masculino (15).
Este experimento, cuyos resultados fueron positivos, permitió identificar la secuen-
cia concreta del gen SRY responsable de la diferenciación testicular y del desarro-
llo masculino.
Todas las proteínas de la familia de las inhibinas y de las activinas han sido uti-
lizadas en animales transgénicos ya sea sobreexpresándolas o anulando su expre-
sión. En este sentido, y lejos de querer hacer cualquier tipo de revisión exhaustiva
en el presente manuscrito, quisiéramos mencionar únicamente algunos de los
modelos de «knock-out» obtenidos por recombinación homóloga que han contri-
buido enormemente a la comprensión de la función de estas proteínas en la repro-
ducción. Estos modelos, la mayoría provenientes del laboratorio de Martin Matzuk
del Baylor College of Medicine de Houston, incluyen prácticamente la totalidad de
los genes de la familia (16,17). El gen de la subunidad alfa de la inhibina fue delecio-
nado por recombinación homóloga en ratones. Los animales con el alelo nulo,
aunque fueron viables en su desarrollo, presentaron, posteriormente y en ambos
sexos, tumores de los cordones sexuales. Este hallazgo confirmó la función de la
inhibina como gen supresor de tumores. Su función en la reproducción, sin embar-
go, se afectaba de forma distinta en cada sexo. Mientras las hembras deficientes en
inhibina eran estériles, los machos, inicialmente, eran fértiles, con presencia de
esperma en sus epididimos y con la capacidad de entrecruzarse. Sin embargo, la
presencia de los tumores mencionados anteriormente acababa alterando la fertili-
dad normal.
El nanismo hipofisario y el hipogonadismo hipogonadotropo constituyen dos
ejemplos de enfermedades endocrinas congénitas que también han sido curadas en
ratones al inyectarles el gen deficitario. En el primer ejemplo, Palmiter et al. (18) con-
siguieron normalizar el crecimiento (e incluso sobrepasar la normalidad) de los
ratones enanos (lit/lit) mediante la inserción de gen de la hormona de crecimiento
de rata. Mason et al. (19) hicieron lo propio con los ratones mutantes portadores de
una deleción en el gen del factor liberador de las gonadotrofinas. Al inyectar el gen
de dicha hormona, estos autores consiguieron restituir los valores normales de LH
y de FSH, así como de fertilidad.
Otro modelo creado en ratones transgénicos ha sido el de la diabetes mellitus
insulino-dependiente. Una teoría de base autoinmune explicaría esta enfermedad
como consecuencia de una inflamación pancreática de origen infeccioso que a su
vez induciría la producción de interferón, causando ésta la aparición de moléculas
del antígeno mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II en las células de los
islotes pancreáticos. La asociación de estos determinantes antigénicos MHC con
antígenos específicos del páncreas es la causa de que las células T no reconozcan
como propias a las células de los islotes. Ello comportará el consecuente rechazo
autoinmune. Sarvetnick y colaboradores inyectaron en embriones de ratón el gen de
interferón o el del MHC unidos al promotor de la insulina produciendo en ambos
casos la destrucción de las células de los islotes pancreáticos (3).
Conclusiones
Estamos viviendo unos años de intensa revolución en la investigación en biolo-
gía y medicina. El descubrimiento de los animales transgénicos a finales de 1980 ha
contribuido notablemente al avance y mejora de la utilización de las técnicas de bio-

logía molecular (1-3,13,14,19).
La medicina y la biología se basaron en una época en los estudios en pacientes
y animales de laboratorio. Esto fue seguido por el aislamiento de órganos y tejidos
y el consecuente estudio histológico y anatomopatológico individualizado. Los
importantes avances de la bioquímica permitieron posteriormente identificar de
forma muy precisa las sustancias producidas por los tejidos aislados. A todo ello le
siguió la explosión de la biología celular y el desarrollo de los cultivos de células in
vitro. A partir de este momento fue posible determinar las funciones de las células,
estableciendo una relación causa-efecto casi perfecta. Los cultivos celulares, sin
embargo, prescinden de la inervación, de la vascularización así como de otros sis-
temas de comunicación paracrina que el tejido poseía in vivo, por lo que muchos de
los resultados obtenidos con esta metodología deben ser analizados con cierta pru-
dencia. La biología molecular cambió por completo las técnicas de investigación
hasta entonces utilizadas, ya que permitió identificar genes, así como conocer sus
secuencias, establecer comparaciones filogenéticas, etc. Hasta la llegada de las pri-
meras técnicas de transfección de genes en células en cultivo no se pudo profundi-
zar en la compresión de los efectos de dichos genes en sistemas biológicos. En este
sentido, los animales transgénicos representan, en cierto sentido, la culminación de
una tecnología muy sofisticada de investigación, ya que permiten estudiar los efec-
tos de un gen o parte de un gen (promotores, enhancers, etc.) en el contexto del ani-
mal vivo.
La tecnología de los ratones transgénicos y su extensión a animales mayores ha
demostrado ser de grandísima utilidad en aspectos muy diversos de la biología y de
la medicina. Esta técnica tiene aplicaciones en todos los aspectos del desarrollo de
los mamíferos en los que la endocrinología ocupa un lugar prioritario (13,14,19,20-23). El
hecho de poder dirigir la expresión de un gen a un órgano o tejido específico ha per-
mitido la producción de hormonas de forma no fisiológica, para con ello alterar los
sistemas de feed-back normales y poner en evidencia mecanismos de regulación
endocrina hasta ahora desconocidos.
Aunque creemos que los aspectos mencionados, así como otros muchos pre-
sentes en la literatura científica, permiten augurar un rápido incremento de la apli-
cación de la tecnología de los animales transgénicos en la mayoría de las áreas de
las ciencias biológicas y médicas, es oportuno señalar también que siguen existien-
do dudas y problemas todavía no resueltos que estos modelos plantean y que debe-
ran ser objeto de futuras investigaciones.
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17
Bases moleculares de la deficiencia
y resistencia a la acción
de la hormona de crecimiento:
Entidades sindrómicas
J. A. Chowen y J. Argente
Introducción
El crecimiento humano, entendido como un proceso biológico determinado
genéticamente y modulado por factores ambientales, puede alterarse por defecto
(hipocrecimiento) o por exceso (hipercrecimiento). El desarrollo espectacular de los
conocimientos moleculares en los últimos años ha permitido un diagnóstico cada
vez más preciso de las anomalías moleculares del crecimiento humano, distin-
guiendo eficientemente aquellas alteraciones debidas a lesiones genéticas, de las
causas nutricionales, orgánicas, tumorales, psicológicas o traumáticas. Esta revisión
se centrará, exclusivamente, en el análisis de las bases moleculares conocidas en el
momento actual, capaces de generar deficiencia de hormona de crecimiento (GH),
aislada o combinada o resistencia a la acción de la misma.
Las bases moleculares de la talla baja debida a deficiencia o resistencia a la
acción de la hormona de crecimiento, se han desarrollado gracias a la localización
y caracterización en el ser humano de los genes que codifican proteínas implicadas
en la regulación hormonal del crecimiento. Todo ello ha contribuido al descubri-
miento de nuevas enfermedades, como es el caso de la deficiencia combinada de
hormonas hipofisarias. Asimismo, ha mejorado el conocimiento de las deficiencias
de GH originadas por mutaciones del gen GH1 y del gen del rGHRH, demostrán-
dose al menos en un caso mutaciones en el gen de IGF-I. Finalmente, se ha conso-
lidado la comprensión de la heterogeneidad molecular de los síndromes de resis-
tencia periférica a la GH por anomalías del gen del rGH, tanto en la forma clásica
como en la forma parcial, ya por la existencia de mutaciones en el dominio extra-
celular, transmembrana o intracelular.
Las bases moleculares de la talla baja debida a anomalías en determinados genes
localizados en los gonosomas, tanto cromosoma X como Y, ha despertado un enor-
me interés y se encuentra en fase de profunda investigación. En la porción terminal
del brazo corto, en la región pseudoautosómica, de los cromosomas X e Y se ha car-

tografiado un gen relacionado con la talla baja (SHOX), cuya presencia o ausencia,
tiene un efecto significativo sobre la estatura. Además, algunas mutaciones en el
gen BTK (Xq21.3-q22) están implicadas como única causa de inmunodeficiencia y
déficit aislado de GH (tipo III). Junto a ello, ciertos casos de talla baja y deleción del
brazo largo del cromosoma Y (46, XYq-), apoyan la hipótesis de la presencia de uno
o más genes relacionados con el crecimiento en el brazo largo del cromosoma Y. De
hecho, se ha cartografiado en su porción proximal, cercano al centrómero, un gen
específico de crecimiento (GCY -«growth control in the Y»).
Bases moleculares del hipocrecimiento armónico

La deficiencia en factores de crecimiento semejantes a la insulina, en particular
del número I (IGF-I), ya por deficiencia o insuficiencia de hormona de crecimien-
to (GH), ya por resistencia, completa o parcial, a la acción de la misma, ya por
deficiencia primaria de IGF-I, de naturaleza congénita, se caracteriza por la ausen-
cia, absoluta o relativa, de IGF-I detectable en suero o plasma. La resistencia a la
acción de IGF-I originaría, en teoría, un fenotipo similar con niveles normales o ele-
vados de IGF-I.
La deficiente acción de IGF-I conduce, sea cual fuere su etiología, a un fenoti-
po caracterizado por un hipocrecimiento armónico, facies de muñeca con frente
abombada y puente nasal escasamente desarrollado. La longitud al nacimiento es
normal o está ligeramente disminuida en la mayoría de los niños con deficiencia de
IGF-I; sin embargo, el crecimiento postnatal es completamente anómalo, debido al
enlentecimiento progresivo de la velocidad de crecimiento, en especial a partir de
los seis meses de edad.
I. Hipocrecimiento por deficiencia genética de hormona

de crecimiento
En la actualidad puede procederse al diagnóstico de mutaciones en los genes de

GH1, Pit1, Prop1, Lhx3, Hesx1, rGHRH y SHOX. La posible implicación de otros
factores de transcripción [RPX, PITX1 (5q31), PITX2 (4q25-q26), IsI1 (5q)] en la
producción de deficiencia de GH en humanos, está en estudio.
Se conocen al menos cuatro tipos mendelianos de déficit aislado de la GH
(DAGH) (1). La deficiencia combinada de hormonas hipofisarias, denominada con
anterioridad panhipopituitarismo, es una alteración caracterizada por el déficit de al
menos una hormona hipofisaria, además de la deficiencia en GH, que puede pre-
sentar patrones variables de herencia: autosómica recesiva o ligada al cromosoma X.
El déficit de hormona de crecimiento puede asociarse también a alteraciones del
desarrollo embriológico secundarias a anomalías monogénicas o cromosomopatías.
En general, las anomalías en el desarrollo de la línea media cerebral pueden cursar
BASES MOLECULARES DE LA DEFICIENCIA Y RESISTENCIA… 245
con afectación hipofisaria o hipotalámica y, por consiguiente, con deficiencia de

GH. Entre estos cuadros clínicos se incluyen la ausencia aislada de hipófisis, la
anencefalia, la holoprosencefalia, algunos casos de displasia septo-óptica o síndro-
me de de Morsier, el síndrome ectrodactilia-displasia ectodérmica-labio leporino
(síndrome EEC), la anemia de Fanconi, el síndrome de Bloom, la deleción del brazo
corto del cromosoma 18 (18p-) y el cromosoma 18 en anillo.
Los genes conocidos relacionados con la expresión de la GH humana, son los
que siguen:
Cluster de la GH: El cluster del gen de la GH humana se localiza en el bra-
zo largo del cromosoma 17 (17q22-24) y ocupa una distancia de 66,5 kilobases
(kb) (2). Se compone de cinco genes alineados en la misma orientación transcripcio-
nal 5’ a 3’: gen de la GH hipofisaria (GH1), pseudogén 1 de la hormona somato-
mamotropina coriónica (CSHP1), gen 1 de la hormona somatomamotropina corió-
nica (CSH1), gen de la GH placentaria (GH2) y el gen 2 de la hormona
somatomamotropina coriónica (CSH2). Cada uno de los cinco genes consta de
cinco exones con cuatro intrones intercalados y todos ellos muestran entre sí un alto
grado de homología (92-98 %) en toda su secuencia. El análisis de esta importante
homología ha sugerido la hipótesis de que todos estos genes surgieron de un gen
ancestral común a través de una serie de recombinaciones homólogas, pero desi-
guales, que dieron lugar a duplicaciones génicas (3).
El gen GH1 se expresa en las células somatotropas de la hipófisis anterior,
mayoritariamente como una proteína de 191 aminoácidos (GH de 22kDa).
Gen de la hormona hipotalámica liberadora de la GH (GHRH): El gen que
codifica la GHRH en el hombre es único y ha sido localizado en el brazo largo del
cromosoma 20 (20q11.2) (4). Su longitud es de aproximadamente 10 Kb y contiene
5 exones. La transcripción del gen da lugar a un ARNm de aproximadamente 750
bases, cuya traducción origina un péptido de 107-108 aminoácidos que contiene: un
péptido señal, los 44 aminoácidos de la GHRH y un péptido carboxi-terminal, cuya
función, si es que la tiene, se desconoce (5).
Todavía no se han descrito mutaciones del gen de GHRH en humanos ni en otras
especies. De hecho, se ha excluido su existencia en la totalidad de casos familiares
de déficit aislado de GH en que se ha estudiado (6).
Gen de la hormona hipotalámica inhibidora de la GH (Somatostatina): El gen
que codifica la SS en el hombre es único y se encuentra localizado en el cromoso-
ma 3 (7). Su expresión da lugar a una molécula de 116 aminoácidos, la pre-proso-
matostatina (pre-proSS), que tras ruptura del péptido señal da lugar a la prosoma-
tostatina (proSS). Ésta es una prohormona de 92 aminoácidos con un peso
molecular de 10,3 kD de la que, en todos los mamíferos estudiados, se originan
tanto la SS-14, como la SS-28 (8). Del procesamiento de la proSS derivan otros pép-
tidos que no contienen la estructura de la SS-14 y por tanto no poseen actividad
somatostatinérgica y cuyas funciones son desconocidas; éstos son: SS-28(1-12),
proSS(1-76), proSS (1-63) y antrina.
Las posibles implicaciones de este gen en trastornos del crecimiento humano,

aún están por dilucidar.
Gen del receptor de GHRH: El gen que codifica el receptor de la hormona
liberadora de la GH (rGHRH) ha sido recientemente clonado y caracterizado (9), y
asignado al cromosoma 7p14. (10).
Una mutación homocigota en el receptor de GHRH ha sido definida como la
base molecular del defecto del ratón Little («Little mouse»), un modelo animal de
deficiencia aislada de GH autosómico recesivo (11), sugiriendo que el gen homólogo
humano podría ser un buen candidato para explicar al menos algunos casos de défi-
cit familiar aislado de GH. Posteriormente, se han descrito anomalías en el gen del
rGHRH causantes de talla baja en el ser humano y que proporcionan las bases
moleculares en algunos casos del déficit familiar de GH tipo IB (12).
Gen del factor de transcripción hipofisario número 1 (Pit1): La activación espe-
cífica de los genes de GH, prolactina y `TSH, requieren la presencia del factor de
transcripción Pit1 (13,14). Pit1 o GHF-1 es una proteína de 33 kD que contiene dos
dominios («POU-specific domain» y «POU-homeodomain»). El gen del Pit1 huma-
no se localiza en el cromosoma 3p11 (15); consta de seis exones y cinco intrones. El
interés en dicho gen radica en el hecho de que ya ha sido demostrada la existencia
de anomalías en el mismo causantes de patología en el crecimiento humano, como
se describirá más adelante.
Gen del factor de transcripción hipofisario Prop1: El «profeta» del Pit1, deno-
minado Prop1 y localizado en el brazo largo del cromosoma 5, ha sido reciente-
mente implicado en patología humana (16).
A. Deficiencia aislada de GH familiar
Las cuatro formas descritas varían en cuanto a la intensidad del déficit, el modo
de herencia y la respuesta al tratamiento sustitutivo con hormona de crecimiento.
DAGH IA
Es el más intenso. Los pacientes afectos de DAGH IA son, habitualmente, de

longitud normal o algo pequeños en el momento del nacimiento, pudiendo presen-
tar hipoglucemias en el período neonatal; sin embargo, todos ellos muestran un
hipocrecimiento muy marcado a los seis meses de edad.
Los niveles circulantes de GH son indetectables tanto en condiciones basales
como tras respuesta a cualquier estímulo provocativo.
La base molecular de esta enfermedad autosómica recesiva, en la mayoría de los
casos, consiste en una deleción de ambos alelos en homocigosis del gen que codi-
fica para la GH hipofisaria (GH1). La forma más frecuente (aproximadamente en el
70 % de los casos) es de 6,7 kilobases (kb). El resto de las deleciones descritas, son:
7,6 kb, 7 kb, 45 kb, y una doble deleción en el cluster del gen de GH (17).
Además de las deleciones, se han descrito otras mutaciones en el gen GH1

(T20X, IVS4+1GfiT, 300 del AG) en asociación con un fenotipo severo de DAGH
IA y niveles plasmáticos indetectables de GH (18). Todas estas mutaciones originan
alelos nulos del gen GH1, dando lugar a la producción de una proteína truncada que,
probablemente, es degradada intracelularmente.
DAGH IB
Enfermedad con patrón de herencia autosómico recesivo, asocia niveles plas-

máticos de GH bajos pero detectables tras estímulos farmacológicos estándar, con
el resto de las funciones endocrinológicas normales, y un fenotipo menos severo
que el tipo IA.
El gen de GHRH ha quedado excluido (6) y se han demostrado, recientemente,
mutaciones en el gen del rGHRH (12) que podrían establecer las bases moleculares
de esta anomalía en algunos casos.
DAGH II
Presentan las mismas características clínicas y similares criterios diagnósti-

cos que los pacientes con DAGH IB (1). El modo de herencia es autosómico domi-
nante. Los estudios de ligamiento genético son compatibles con cosegregación
de DAGH II con el gen GH1 en la mayoría de las familias, mientras que el gen de
GHRH ha sido excluido mediante análisis de ligamiento en todas las familias
estudiadas (6).
La alteración molecular causante del déficit aislado de GH tipo II ha sido des-
crita en varias familias no relacionadas. Curiosamente, en todos los casos se trata de
mutaciones en un alelo en el intrón III del gen GH1 (18). Tres de ellas son sustitucio-
nes de un nucleótido en la secuencia 5’ donante para el empalme del ARNm (IVS3
+ 1G c A, + 2T c C y + 6 T c C) (19), mientras que otras dos, una sustitución sim-
ple (IVS3 + 34 G c A) y una deleción de 18 pares de bases (IVS3 + 27 del 18) den-
tro de la secuencia intrónica (20,21), afectan secuencias necesarias para el procesa-
miento normal del ARNm («splicing enhancers») (22) o la estructura secundaria del
ARN heteronuclear. Todas estas mutaciones intrónicas producen el mismo efecto en
el procesamiento postranscripcional del ARN originando un escape o pérdida com-
pleta del exón 3 de GH1 en el ARNm maduro.
La proteína mutante que resulta de la traducción del ARNm mutado sería la GH
descrita de 17,5 kD que carece de los aminoácidos 32 a 71, incluyendo un residuo
de cisteína. Aunque el efecto negativo dominante de estas mutaciones no se encuen-
tra claramente definido, podría suponer la existencia de dimerización de la proteí-
na mutante con la GH normal gracias a la formación de puentes disulfuro intermo-
leculares entre los residuos libres de cisteína.
DAGH III
Se han descrito escasas familias con deficiencia aislada de GH mostrando un

patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma X, en las que todos los varones
afectos presentaban también hipogammaglobulinemia (23,24). El tratamiento de estos
pacientes con GH se ha asociado con un incremento de los linfocitos B y unos nive-
les plasmáticos más elevados de inmunoglobulinas (25). El análisis genético en varias
de estas familias sugirió que la combinación de agammaglobulinemia ligada al X
(XLA) y deficiencia aislada de GH podría ser debida a una alteración genómica que
afectase al gen de XLA (BTK) en el cromosoma Xq21.3-q22 y/o un locus contiguo
probable necesario para la expresión de GH. Sin embargo, se ha comprobado la
existencia de mutaciones puntuales en BTK como única causa de la inmunde-
ficiencia y del déficit de GH en al menos dos familias (26,27).
Es probable la existencia de otras formas de DAGH ligadas al X. Estas altera-
ciones explicarían el exceso de varones afectos en relación a mujeres en los casos
de DAGH. En la actualidad, existen evidencias que sugieren la presencia de varios
loci en el cromosoma X capaces de intervenir en la regulación de la hormona de cre-
cimiento. Así, se han descrito algunos pacientes con DAGH asociado a anomalías
en distintas regiones del cromosoma X, incluyendo una deleción intersticial de
Xp22.3 y una duplicación de Xq13.3-q21.2 (28,29).
B. Deficiencia combinada de hormonas hipofisarias
La deficiencia combinada de hormonas hipofisarias, se caracteriza por presen-

tar deficiencia de una o más de las hormonas tróficas hipofisarias (TSH, ACTH,
FSH, LH), además de deficiencia de GH. Aunque la mayoría de los casos son espo-
rádicos, se han descrito varias familias en las que se sugiere un modo de herencia
autosómico recesivo (tipo I) y una forma ligada al cromosoma X (tipo II) (1).
Algunos de los supuestos casos autosómicos recesivos presentan anomalías anató-
micas con una silla turca pequeña o alargada. El grado de expresión fenotípica de
las diferentes deficiencias en las hormonas tróficas hipofisarias presenta variabili-
dad inter o intrafamiliar.
Los loci responsables de la mayoría de los casos de estas enfermedades heredi-
tarias no han sido todavía establecidos, excepto para el subtipo autosómico recesi-
vo debido a mutaciones en el gen Pit1 que asocia específicamente déficit de GH,
prolactina y, en ocasiones, TSH, con normalidad del resto de la función hipofisaria
y, más recientemente, para el subtipo debido de mutaciones en el gen Prop1 cau-
santes de deficiencias en GH, TSH, prolactina, FSH y LH, y del gen Lhx3 causan-
tes de deficiencia, asimismo, en GH, TSH, prolactina, FSH y LH.
La similitud de este fenotipo humano con la de los ratones enanos «Snell» y
«Jackson», en los que el fenotipo autosómico recesivo es causado por mutaciones
en el locus Pit1, condujo al análisis del gen de Pit1 en las familias afectas con
deficiencias de GH, prolactina y TSH. La producción de una proteína truncada en
homocigosis por la mutación R172X se asocia a un fenotipo muy llamativo en el

que predomina déficit de TSH con cretinismo congénito (30,31). Una mutación «mis-
sence» R158P en el dominio específico POU, bien en homocigosis o en heteroci-
gosis con el otro alelo nulo origina en los pacientes la ausencia de secrección de GH
y prolactina junto con una deficiencia parcial de TSH y un tamaño de la hipófisis
normal (32). Por último, una mutación «missence» de novo se ha descrito en un
paciente heterocigoto con el fenotipo de enanismo panhipopituitario (33). Esta muta-
ción está localizada más allá del dominio de unión al ADN (R271W) y, curiosa-
mente, la proteína mutante parece tener un efecto dominante negativo que inhibe la
unión al ADN de la proteína normal. No obstante, el hallazgo de la misma mutación
en otra familia japonesa en la que varios portadores no presentaban fenotipo algu-
no, ha puesto en cuestión la significación biológica de ese efecto dominante nega-
tivo (34).
Un segundo ratón mutante, denominado «enano Ames», el cual es no alélico,
pero fenotípicamente similar a la mutación que exhibe el ratón enano Snell, define
un segundo locus para el enanismo. Tras la localización del gen de Prop1 en el ratón
Ames por Sornson et al. en 1996 en el ratón (16), se ha podido localizar el gen en el
ser humano en el brazo largo del cromosoma 5 (5q). Recientemente, Wu et al. han
demostrado la existencia de mutaciones en el gen Prop1 del ser humano (35). Todas
parecen mutaciones hipomórficas o amórficas y las variantes alélicas descritas hasta
ahora incluyen dos sustituciones simples de aminoácidos, R120C y F117I (35), y una
deleción de dos pares de bases en el exón 2 (301delAG) que conduce a un error de
lectura desde el codón 101 con un codón de finalización prematuro en 109 (35). Más
recientemente, Cogan et al. (36) analizaron 10 casos familiares y 21 esporádicos de
deficiencia combinada de hormonas hipofisarias. Demostaron que de los casos
familiares estudiados, cinco fueron homocigotos y uno heterocigoto para la muta-
ción 301delAG, mientras que entre los 21 casos esporádicos estudiados, encontra-
ron la misma mutación en dos casos en homocigosis y en un caso en heterocigo-
sis(36). Por tanto, esta mutación puede ser la causa más frecuente de deficiencia
combinada familiar de hormonas hipofisarias.
C. Alteraciones embriológicas
Entre el amplio número de alteraciones embriológicas y algunos otros síndro-

mes genéticos que cursan con déficit asociado de hormona de crecimiento, se cono-
cen las bases moleculares siguientes:
Holoprosencefalia
Se trata de una malformación de la línea media asociada con frecuencia a labio

leporino o hendidura palatina y que cursa con alteraciones del desarrollo del tracto
olfatorio y de los globos oculares, así como déficit motores y psíquicos y grados
variables de hipofunción hipotalámica. Pueden presentar déficit aislado o combi-
nado de GH. La mayoría de los casos son esporádicos o secundarios a cromosomo-

patías (trisomía 13, 13q-, 18p-, 7q-), pero el 30 % son familiares con transmisión
autosómica dominante o recesiva. Recientes estudios han demostrado mutaciones
en genes que codifican señales de migración neuronal, ZIC2 en 13q32 (37) y Sonic
Hedgehog en 7q36 (38), como responsables de dos tipos de holoprosencefalia.
Existen al menos otros dos loci implicados en este cuadro, HPE1 localizado en
21q22.1, y HPE2 en 2p21, pero los genes responsables no han sido aislados toda-
vía.
Síndrome de Rieger
Se caracteriza por la existencia de displasia del iris, hipodontia, atrofia óptica y

déficit de GH ocasional (39). Se hereda de modo autosómico dominante con expre-
sión variable. Se trata de un síndrome heterogéneo en el que se han descrito al
menos dos genes implicados: RIEG1 (4q25-q26) (40) y RIEG2 (13q14) (41).
Displasia septo-óptica o síndrome de Morsier
Cursa con hipoplasia del nervio óptico acompañada o no de anomalías del sep-
tum pellucidum y del cuerpo calloso. El grado de insuficiencia hipofisaria varía
desde un déficit aislado de GH hasta situaciones de panhipopituitarismo. La diabe-
tes insípida suele estar presente en más de la mitad de los casos. La alteración pare-
ce radicar en el hipotálamo. Se trata de una entidad casi siempre esporádica, aunque
algunos casos sugieren una herencia monogénica autosómica recesiva.
Recientemente, se han implicado mutaciones en el gen HESX1 como causantes de
algunos casos de displasia septo-óptica (42).
Síndrome de ectrodactilia-displasia ectodérmica-labio leporino
También denominado síndrome EEC. Se ha demostrado herencia tanto autosó-

mica dominante [EEC1 (7q11.2-q21.3)] como autosómica recesiva [EEC2] (43,44). El
cuadro clínico queda definido por el nombre del síndrome, a lo que se asocia défi-
cit de GH con ausencia del septum pellucidum en algunos casos.
Anemia de Fanconi
Entidad nosológica que se hereda de un modo autosómico recesivo y se carac-

teriza por anemia, leucopenia, trombocitopenia, talla baja, hiperpigmentación cutá-
nea, anomalías del pulgar, malformaciones cardíacas y renales y, ocasionalmente,
déficit de GH. Se distinguen ocho grupos bien diferenciados por estudio de com-
plementación celular (A-H) (45), cada grupo probablemente debido a una anomalía
genética específica (46). Se han identificado los genes mutados en los grupos A, C y
G (47-49). El gen del grupo D (FANCD) se localiza en el cromosoma 3 (3p22-26) (50).
Síndrome de Bloom
Se trata de una anomalía que se hereda con patrón mendeliano autosómico rece-
sivo que cursa con exantema facial teleangiectásico, hipersensibilidad lumínica con
piel hipo e hiperpigmentada y predisposición al padecimiento de procesos malig-
nos. El gen responsable se ha aislado por clonación posicional desde el brazo largo
del cromosoma 15 (15q26.1) (51), aunque se desconoce el mecanismo por el cual
puede aparecer déficit de GH.
Síndrome de Aarskog
Talla baja, hipertelorismo y anomalías del escroto caracterizan a este síndrome,

habiéndose demostrado un patrón de herencia recesivo ligado al cromosoma X. El
cuadro está causado por mutaciones en el gen FGD1, que codifica una proteína
implicada en transducción de señales importantes para el crecimiento durante el
desarrollo (52).
II. Hipocrecimiento por resistencia genética a la hormona

de crecimiento
En 1966 Laron et al. publicaron los casos de tres hermanos con elementos clí-
nicos y bioquímicos de deficiencia de hormona de crecimiento (GH), pero en los
que se detectaban niveles extremadamente elevados de GH (53). En los dos años
siguientes, los mismos autores diagnosticaron 22 pacientes similares de descen-
dientes de judíos orientales (54). El diagnóstico de resistencia a la hormona de creci-
miento se efectuó tanto por los niveles elevados de GH como por la incapacidad de
la hormona de crecimiento administrada exógenamente para incrementar los nive-
les plasmáticos de factor de IGF-I. (55,56).
En 1984 se demostró que esta enfermedad es debida a la existencia de una ano-
malía en el receptor de GH que conduce a un síndrome de resistencia a esta hor-
mona (57). La clonación (58) y caracterización (59) del gen de rGH y la introducción de
nuevas técnicas de biología molecular, han proporcionado la identificación de una
serie de defectos moleculares en dicho receptor de GH.
El consenso internacional sobre la nomenclatura a emplear, así como los crite-
rios taxonómicos del síndrome de insensibilidad o resistencia a la GH, se efectuó en
1993 (60). Los nombres más comúnmente empleados en la actualidad son los de sín-
drome de Laron, síndrome de resistencia primaria a la GH o síndrome de insensi-
bilidad primaria a la GH, diferenciándolo, de este modo, de los síndromes de resis-

tencia secundaria a la GH.
Hasta la fecha, se han diagnosticado varios cientos de pacientes. Los análisis
genéticos demuestran la existencia de un modo de herencia autosómico recesivo (61).
Un listado más detallado puede obtenerse a partir de una revisión reciente de este
síndrome (62).
Los niños pequeños se asemejan a los afectos de deficiencia aislada hereditaria
de GH; poseen cabello ralo y la cabeza parece grande debido a la falta de desarro-
llo de los huesos faciales, así como a la acromicria. No obstante, el perímetro cra-
neal se encuentra por debajo del tamaño normal (63). Todo ello proporciona la apa-
riencia típica de frente prominente, nariz en «silla de montar» y mirada en «puesta
de sol».
Si no reciben tratamiento, como ocurre en la mayoría de los pacientes con sín-
drome de Laron, la talla adulta se sitúa entre 119 y 142 cm en varones y entre 108
y 136 cm en mujeres (64).
El gen del rGH localiza en el brazo corto del cromosoma 5 (p13-p12) (65). Está
compuesto de 620 aminoácidos, una secuencia señal de 18 aminoácidos, y con-
formado por 9 exones, con una extensión de 87 Kb. Los exones 2 a 7 codifican
el dominio extracelular de 246 aminoácidos. El exón 8 corresponde al dominio
transmembrana, conformado por 24 aminoácidos. Finalmente, los exones 9 y 10
corresponden al dominio intracelular, quedando conformado por 350 aminoáci-
dos.
La forma clásica de resistencia a la GH tipo 1a es debida a la existencia de mu-
taciones del rGH. Hasta la fecha, se han descrito una amplia variedad de ellas: sin
sentido, error de lectura, y de empalme, afectando tanto a exones como a intro-
nes (66-74).
La mayoría de las anomalías se localizan en el dominio extracelular del recep-
tor (exones 3-7 e intrones 2-7), dando lugar a la ausencia de niveles circulantes de
GHBP (75,76). Solamente se han descrito dos publicaciones con anomalías en el
dominio transmembrana (exón 8) (71,72), y otras dos mutaciones en el dominio intra-
celular (exón 10) (74). Se han descrito tres hermanos con una anomalía post-receptor,
aún no bien definida (76).
La demostración de niveles séricos bajos de GHBP en los parientes de pacien-
tes con síndrome de Laron ayuda a identificar los portadores heterocigotos por ano-
malías en el dominio extracelular del rGH (77,78). Por el contrario, la existencia de
niveles séricos de GHBP normales o elevados en pacientes con síndrome de Laron
implica la existencia de una anomalía, ya en el dominio transmembrana, ya en el
dominio intracelular, ya post-receptor de GH (síndrome de Laron tipo b o c).
Anomalías Post-receptor de GH
La primera familia descrita con esta anomalía se comunicó en 1993. El test de

estimulación de IGF-I no produjo respuesta de IGF-I, aunque produjo una elevación
de IGFBP-3, (76) demostrando que la última vía está intacta. La naturaleza de esta
anomalía no se ha dilucidado todavía.
Deleción del gen de IGF-I
Recientemente, Woods et al. (79) describieron un varón, hijo de progenitores

consanguíneos, con talla baja extrema, en el que se demostró la existencia de una
deleción homocigota de los exones 4 y 5 del gen de IGF-I. El paciente mostraba:
marcado retraso del crecimiento, perímetro craneal pequeño, acromicria, hipogo-
nadismo, retraso del desarrollo motor, hipoglucemia en la infancia, niveles séricos
elevados de GH (94 mg/mL) y bajos de IGF-I, que no se incrementaron tras la
administración de hormona de crecimiento humana.
Pigmeos
Los pigmeos parecen tener una disminución en el número de receptores de GH,

lo que podría constituir la anomalía primaria. En una revisión reciente, Merimee y
Laron (80) afirman que la talla baja de los pigmeos africanos es debida primariamen-
te, quizás exclusivamente, a una deficiencia de IGF-I por deficiencia del rGH. Dado
que los pacientes con síndrome de Laron son más bajos que los pigmeos y sus nive-
les de IGF-I también más bajos, los pigmeos podrían tener una anomalía genética
diferente, probablemente menos completa. El conjunto de las alteraciones metabó-
licas reflejan una disminución en receptores de hormona de crecimiento, incluyen-
do una disminución de los niveles séricos de GHBP, lo que indica la posibilidad de
una anomalía en el dominio externo del receptor de GH.
Resistencia a IGF-I
Existen muy pocas referencias sobre tallas bajas que puedan enmarcarse en esta
categoría. En el caso clínico comunicado por Bierich (81) de un niño con un retraso
severo de crecimiento y niveles elevados de IGF-I y, el de Momoi et al. (82), en una
niña con hallazgos similares, no se ha podido demostrar una base molecular.
III. Hipocrecimiento por anomalías en genes de los gonosomas
Se conocen al menos ocho genes localizados en la región pseudoautosómica

(PAR) del brazo corto de los cromosomas X e Y (83,84). La PAR del brazo corto
(PAR1) está conformada por 2.500 kb de longitud. Las PAR de los cromosomas X
e Y presentan una homología del 99 %. La asociación de talla baja y deleciones
tanto del brazo corto del cromosoma X, como del brazo corto del cromosoma Y,
sugiere la presencia de un gen para la talla en los 700 kb distales de PAR1, ya que
los pacientes con una única copia de esta región presentan talla baja.
Se ha clonado un gen desde un segmento crítico de 170 kb de PAR1, que se ha
denominado SHOX (short stature homeobox-containing gene). Dicho gen codifica
proteínas de 292 y 225 aminoácidos y se ha encontrado delecionado al menos en 36
pacientes con talla baja y reorganizaciones en el Xp22 o en el Yp11.3. Entre 91
pacientes con talla baja idiopática sin otras complicaciones, Rao et al. (85) sólo
encontraron uno con una mutación sin sentido en el gen SHOX, detectando, asi-
mismo, una mutación similar en otros cuatro miembros de la familia, en tres gene-
raciones, afectos de talla baja.
La causa de la talla baja en las pacientes con síndrome de Turner puede ser
explicada, al menos en parte, por la pérdida del gen SHOX, debida a la ausencia de
un cromosoma X.
Además, los casos con talla baja y deleción del brazo largo del cromosoma Y
(46, XYq-) apoyan la hipótesis de la presencia de uno o más genes de crecimiento
en el brazo largo del cromosoma Y. En efecto, mediante la realización de estudios
genéticos de pacientes varones con deleciones parciales del Yq, una región cuya
presencia o ausencia tiene un marcado efecto sobre la talla, se ha logrado cartogra-
fiar por diferentes investigadores en la porción proximal del brazo largo del cro-
mosoma Y, cercana al centrómero, un gen que se denomina «Control de
Crecimiento en el cromosoma Y», Growth Control in the Y, (GCY) o gen específi-
co del crecimiento en el cromosoma Y (86-88), habiéndose empleado marcadores con
secuencias específicas para el cromosoma Y completo, capaces de definir la lesión
del punto de ruptura.
Los estudios moleculares en una translocación cromosómica X; Y [46, X,
der(X)t(X;Y) (p22.3; q11.2)] en una mujer con deleción de la región pseudoauto-
sómica (Xp22.3) que presentaba una talla normal, sugieren que el gen específico de
crecimiento del cromosoma Y (CGY) en el Yq puede compensar el gen SHOX de
crecimiento perdido (89).
Se presume que puedan existir más genes que intervengan en la regulación del
crecimiento humano en los gonosomas, por lo que es menester que las investiga-
ciones en esta línea continúen desarrollándose.
IV. Hipocrecimiento de origen prenatal
El enanismo primordial constituye un retraso de crecimiento de origen prenatal

que continúa en el periodo postnatal y que se subdivide en dos grandes grupos,
según se asocie o no a microcefalia. Una forma específica de enanismo primordial
no microcefálico es el síndrome de Russell-Silver, que asocia unos rasgos cranio-
faciales típicos con facies triangular, orejas prominentes, posibilidad de asimetría en
miembros y clinodactilia del quinto dedo de las manos. La causa de este cuadro es
probablemente heterogénea y quizá la mayoría de los casos se deben a mutaciones
dominantes de novo. Se ha sugerido la posible implicación en el fenotipo de un
locus en 17q25 basado en alteraciones cromosómicas recurrentes (90). Sin embargo,

la primera pista sobre una de las posibles bases moleculares reales de estos cuadros
fue la observación de disomía uniparental materna del cromosoma 7 en un indivi-
duo homocigoto para una mutación causante de fibrosis quística siendo sólo la
madre portadora (91). Este paciente, al igual que otros descritos posteriormente, pre-
sentaba retraso de crecimiento intrauterino y postnatal no justificable por su fibro-
sis quística. Posteriormente, se detectó la existencia de disomía uniparental mater-
na del cromosoma 7 en el 10 % de los pacientes con enanismo primordial del tipo
del síndrome de Russell-Silver (92). Por consiguiente, los resultados indicaban la
existencia de uno o varios genes en el cromosoma 7 reguladores del crecimiento y
sometidos a impronta gamética, bien genes potenciadores del crecimiento que se
expresen sólo desde el cromosoma de origen materno, o bien genes represores del
crecimiento que se expresen sólo desde el cromosoma paterno. El hallazgo de un
caso familiar de síndrome de Russell-Silver (madre e hija) con una duplicación en
tándem de la región 7p13-p11.2, permitió definir el intervalo crítico del cromoso-
ma 7 a una región que contiene los genes IGFBP1, IGFBP3 y GRB10 (growth fac-
tor receptor-binding protein 10) (93). Posteriormente, se ha encontrado una duplica-
ción similar en un paciente, cuya caracterización molecular ha demostrado la
inclusión de los genes citados y el origen materno de la región duplicada (94). Por
tanto, parece que el retraso de crecimiento que se produce en estos cuadros se debe
probablemente a la existencia de uno o varios genes represores del crecimiento que
se expresan exclusivamente desde el cromosoma materno en condiciones normales
y cuya expresión se encuentra aumentada en casos de disomía uniparental materna
o de duplicaciones maternas de la región. El gen GRB10 es un candidato óptimo
dado que se encuentra en el intervalo crítico de las citadas duplicaciones y que el
ortólogo de ratón (gen Meg1/Grb10, localizado en el cromosoma 11) tiene expre-
sión exclusiva desde el cromosoma materno y está probablemente implicado en los
defectos de crecimiento que se observan en los ratones con duplicaciones del cro-
mosoma 11 y deficiencia recíproca (95). La función de la proteína GRB10 también es
sugerente, dado que se une al receptor de insulina y al receptor de IGF-I (IGF1R) a
través de un dominio con homología a Src (SH2), e inhibe la actividad tirosín-qui-
nasa asociada al receptor, actividad que está implicada en las acciones promotoras
del crecimiento de la insulina, IGF-I e IGF-II. (96)
Consideraciones finales
En resumen, en las últimas dos décadas hemos asistido a la identificación, carac-
terización y secuenciación de múltiples genes, localizados tanto en los autosomas
como en los gonosomas, involucrados en la regulación del crecimiento humano.
Asimismo, se han identificado mutaciones en muchos de ellos que conducen a la
producción de patología del crecimiento por defecto o por exceso.
El hipocrecimiento armónico de base genética puede ser debido a una deficien-
cia de GH, aislada o combinada, a una resistencia a la acción de la misma, a una
anomalía del gen de IGF-I y, tal vez, a una resistencia a la acción de éste; condu-
ciendo, en cualquier caso a una deficiencia en IGF-I y, por ende, a una talla baja.
Existen además genes reguladores del crecimiento que son dependientes de dosis y
presentan sistemas de control epigenéticos del tipo de impronta gamética. La alte-
ración de estos genes se asocia con trastornos del crecimiento de origen prenatal.
Por último, se han identificado genes relacionados con el crecimiento en los gono-
somas, aunque todavía se requiere más investigación.
En conclusión, la patología del crecimiento humano por defecto incluye nume-
rosas enfermedades cuya base molecular es conocida en la actualidad, y es de espe-
rar que la lista vaya aumentando en los próximos años. El clínico debe aproximar-
se a su conocimiento para un mejor diagnóstico y consejo genético apropiados.
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18
Patología molecular de la hiperplasia
suprarrenal congénita
B. Ezquieta, E. Cueva, F. J. Fernández, J.M. Varela, y C. Jariego
Introducción
El término Hiperplasia Suprarrenal Congénita (HSC) engloba todos aquellos
déficit enzimáticos de carácter hereditario que dan lugar a una disminución en la
síntesis del cortisol y a la consiguiente estimulación del eje hipotálamo-hipófisis-
suprarrenal. Se han descrito cuadros clínicos por la deficiencia de los enzimas
implicados: 3`hidroxiesteroide deshidrogenasa, 17_hidroxilasa, 21-hidroxilasa
(21-OH) y 11`hidroxilasa, siendo todos ellos de carácter autosómico recesivo; reco-
nociéndose, al menos a escala bioquímica, tanto formas neonatales como formas no
clásicas o tardías de cada una de estas deficiencias. Los distintos pasos metabólicos
de la síntesis del cortisol tienen lugar en distintos compartimentos celulares (mito-
condria, citoplasma, microsomas); siendo debida la hiperplasia lipoide al déficit
hereditario de la proteína de transporte requerida para dicho cambio de comparti-
mento (proteína StAR). Las bases moleculares de las formas severas, neonatales, de
HSC se conocen para cada uno de los déficit, conociéndose la localización, estruc-
tura y mutaciones de los genes implicados en cada uno de ellos (1). Este estudio está
centrado en el análisis genético molecular de la deficiencia de esteroide 21-hidro-
xilasa, por ser la causa mayoritaria de HSC (90-95 % de los casos; para una revisión
reciente del tema, véase White y Speiser 2000) (2).
La deficiencia de 21-OH es una enfermedad monogénica autosómica recesiva.
Se debe a mutaciones en un solo gen, el gen de la esteroide 21-hidroxilasa, y ello,
tanto en sus formas severas como tardías. Las enfermedades con este patrón de
herencia suelen presentar una misma alteración en los dos alelos mutados (los
pacientes son homocigotos), y ello ocurre generalmente por consanguinidad. A dife-
rencia de estas otras enfermedades, en la deficiencia de 21-OH, los enfermos fre-
cuentemente son «heterocigotos compuestos». Sólo en el caso de mutaciones fre-
cuentes, y por supuesto, en el caso de consanguinidad, los enfermos son
homocigotos. Los portadores de esta deficiencia presentan un solo cromosoma

mutado y, en principio, no manifiestan signos clínicos, aunque sí una respuesta ele-
vada del metabolito marcador de esta deficiencia, 17-hidroxiprogesterona, en el
test de Synachten. En ocasiones se ha descrito la presencia de signos clínicos de
hiperandrogenismo en niños portadores, definidos tanto a nivel molecular como
bioquímico (1,3).
La incidencia de las formas clásicas es de aproximadamente 1:10.000 a
1:15.000, lo que supone una elevada frecuencia de portadores (1:50 a 1:60) con
variaciones significativas según las zonas geográficas (2,4,5). Las formas tardías se
presentan con una frecuencia de 1:1.000 (frecuencia de portadores 1:15). Aunque,
sobre la base de datos hormonales, se han estimado incidencias superiores, del 1%
en el área Mediterránea (4,6,7), e incluso de 1/40 y 1/50 en zonas de la antigua
Yugoslavia, Italia y España; estos datos podrían estar magnificados, como está
poniéndose de manifiesto al disponer de los datos moleculares. De cualquier mane-
ra, las formas tardías de 21OHD constituyen una de las enfermedades autosómicas
recesivas más frecuentes en humanos. Es especialmente llamativo el hecho de que,
incluso las formas severas que pueden comprometer la vida, y con ello autolimitar
la diseminación de estos alelos, sean tan frecuentes. Ello podría ser debido al pecu-
liar mecanismo de producción de las mutaciones que existe en este gen por la exis-
tencia de un pseudogén; y/o a una posible ventaja de los heterocigotos portadores,
como recientemente se está volviendo a plantear (8,9).
El gen responsable del déficit se denomina CYP21B y se encuentra localizado
en el brazo corto del cromosoma 6, en la región III del complejo mayor de histo-
compatibilidad (HLA, Fig. 18.1. A). Muy próximo a él se encuentra su pseudogén
(o gen no funcional), CYP21A, que tiene una homología del 96 % (Fig. 18.1. B). Este
pseudogén presenta una serie de mutaciones que impiden su expresión y/o su fun-
cionalidad. Los genes CYP21B y CYP21A se encuentran muy próximos uno del
otro, a una distancia de 30 kb (kb: 1.000 pares de bases) y dispuestos en tándem con
los genes C4A y C4B (Fig. 18.1. B) que codifican para el cuarto componente del
complemento y también presentan una homología importante (2,6,10).
El gen CYP21B tiene 3,2 kb, está constituido por 10 exones y da lugar a un
mRNA de aproximadamente 2 kb. La proteína tiene 500 aminoácidos y contiene
como grupo prostético el grupo HEM. Es una monooxigenasa de esteroides en posi-
ción 21, de localización microsomal. Son dominios importantes para su funcionali-
dad, la región de anclaje a la membrana del microsoma y la región de centro activo
donde se unen los sustratos, 17OHP y progesterona (Fig. 18.2). CYP21B se expre-
sa en el tejido suprarrenal dando lugar al enzima específico. También se ha detec-
tado su expresión en linfocitos (Zhou et al. 1997), así como una actividad 21 hidro-
xilante inespecífica, que podría parcialmente compensar la deficiencia suprarrenal
severa en el adulto.
La gran mayoría de las mutaciones que causan deficiencia de este enzima son el
resultado de dos tipos de mecanismo: la recombinación asimétrica en la meiosis,
que se ve favorecida por la región duplicada de 30 kb existente en el locus de la 21-
OH, que origina deleciones (Fig. 18.3. A); y la conversión génica que introduce en
PATOLOGÍA MOLECULAR DE LA HIPERPLASIA SUPRARRENAL… 265
A Brazo corto del cromosoma 6
Locus HLA
A C B CYP 21 B DR DQ DP
Clase I Clase III Clase II
B Gen de la 21-Hidroxilasa
30 kb
C4 A CYP 21 A C4 B CYP 21 B
Pseudogén Gen funcional
esteroide
21-hidroxilasa
Figura 18.1. (A) Esquema del cromosoma 6 de humanos, en que se indica la localización del
gen de la esteroide 21-hidroxilasa en el locus HLA. Nótese que B y DR son los antígenos HLA más
próximos por lo que su informatividad ha sido de utilidad en el seguimiento del gen 21-OH.
(B) Esquema del locus de la 21-OH; CYP21B es el gen funcional, CYP21A en humanos es un
pseudogén (homólogo al gen funcional pero incluye mutaciones en su secuencia que lo hacen
«no funcional»). Las flechas bajo los correspondientes genes indican la dirección de expresión,
véase que en el caso de C4 (factor 4 del complemento) ambos genes se expresan, aunque la pro-
teína tiene distintas propiedades hemolíticas y antigénicas.
el gen funcional mutaciones puntuales (Fig. 18.3. B), por transferencia de las mis-
mas desde el pseudogén. El mecanismo de la conversión génica, que no está com-
pletamente establecido, fue descrito en levaduras en sistemas que requieren diver-
sificación, como las proteínas de apareamiento. Los datos existentes en humanos
sobre este mecanismo han sido aportados por el propio gen de la 21-OH. Estas
mutaciones puntuales se denominan microconversiones para diferenciarlas de las
conversiones grandes que involucran a varios exones o a la totalidad del gen.
La recombinación asimétrica y la manera en que se generan las deleciones y
duplicaciones están esquematizadas en la Figura 18.3. A. Las deleciones y duplica-
ciones del pseudogén mantienen un gen funcional por lo que, per se, no son las alte-
raciones responsables del déficit. En algún caso una determinada mutación puntual,
17-OHP
NADP + NADPH
e- Arg356Trp
11-Deoxicortisol
P450reduc Triple mut ex 6
Pro453Ser
P450c21 Val281leu
1le172Asn HEM e- NADP+
Pro30Leu
b5 NADPH
Deleción
Conversión
655 AoC-G
Gln318Stop Centro activo y/o interacción con reductasa
306insT Unión de grupo prostético (HEM)
Deleción 8pb Anclaje a la membrana
Mutaciones que dan lugar a Dominios de la proteína cuyos aminoácidos

ausencia de la proteína mutados dan lugar a pérdida de la funcionalidad
Figura 18.2. Esquema de la proteína esteroide 21-hidroxilasa ubicada en la membrana micro-

somal junto a sus enzimas auxiliares. Sobre la proteína se indican las mutaciones localizadas en
los dominios cuya funcionalidad afecta esencialmente a la actividad enzimática. En el recuadro
externo se recogen las mutaciones que darían lugar a una carencia de la proteína.
Val281Leu, se asocia a la duplicación de CYP21A. Las tradicionalmente denomi-

nadas «deleciones del gen 21-OH» corresponden con un híbrido pseudogén-gen no
funcional que es el resultado de una recombinación intragénica.
Las deleciones y conversiones grandes dan cuenta de aproximadamente un 25-30
% de los alelos mutados (11,12,13). Cuando el mecanismo de conversión génica actúa
sobre una región limitada de la secuencia del gen funcional el cambio introducido
en el gen funcional se comporta como una aparente mutación puntual. La aplicación
de la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permi-
te el estudio de estos alelos que presentan mutaciones puntuales, y que constituyen
un elevado porcentaje de los alelos mutados, 70-90% en las formas severas y tardías
respectivamente.
En la Figura 18.3. B se recoge el esquema de la estructura del gen con sus diez
exones o zonas codificantes, y regiones intrónicas o no codificantes. En él se indi-
can las 10 mutaciones descritas en el pseudogén, que cuando son transferidas a
CYP21B lo inactivan. Todas ellas se encuentran en la región codificante excepto la
mutación 655 A o C –G que se localiza en el intrón 2 y afecta al procesamiento del
RNA mensajero, que como veremos es la mutación más frecuente en las formas
severas. Las mutaciones específicas en el gen dan lugar a una pérdida de la activi-
dad enzimática de la esteroide 21-OH más o menos severa, que según su grado se
A Generación de deleciones y duplicaciones de CYP21B y A
C4A CYP21A C4B CYP21B
C4A CYP21A C4B CYP21B
1 2
1 Puntos de recombinación
C4A CYP21A C4A CYP21A C4B CYP21B

Duplicación del pseudogén
C4B CYP21B
Deleción del pseudogén-gen
2
C4A 21A-21B
Híbrido pseudogén-gen denominado clásicamente deleción del gen 21-OH
B Microconversiones de CYP21B
Exones
I II III IV V VI VII VIII IX X
3
1 2 Del8pb 7 10
8
Pro30Leu 655G 4 306insT Pro453Ser
6 Stop318
mutación de procesamiento 1le172Asn
9
5 Val281Leu
Arg356Trp
Mutaciones severas
Mutaciones leves Ile236Asn/Val237Glu/Met239Lys
Figura 18.3. (A) Esquema de la recombinación asimétrica y de las duplicaciones y deleciones

del gen. Los puntos 1 y 2 son los puntos de recombinación que dan lugar a estas entidades. La
recombinación por delante de C4A (punto 1) da lugar a las deleciones y duplicaciones del pseu-
dogén, que mantienen en su estructura un gen funcional. La recombinación intragénica (punto 2)
da lugar a un híbrido pseudogén-gen no funcional. (B) Esquema del gen 21-OH con sus diez exo-
nes o zonas codificantes y regiones intrónicas. Se indican las mutaciones puntuales que existen
el pseudogén de la 21-OH y por conversión génica pueden transferirse a CYP21B haciéndolo no
funcional. Las mutaciones subrayadas dan lugar a una afectación moderada de la actividad enzi-
mática y se asocian con formas leves o tardías de la deficiencia. El resto de mutaciones afectan
de forma severa a la enzima y se encuentran primordialmente en formas clásicas de 21-OHD (ver
correlación genotipo-fenotipo).
puede correlacionar con las distintas formas clínicas (11,12,13), como se comentará
más adelante al discutir las relaciones genotipo-fenotipo. De cualquier manera,
también se han descrito, mediante secuenciación (véase revisión White y Speiser
2000 (2)), otras mutaciones del gen no atribuibles a los mecanismos indicados.
El planteamiento molecular aplicado al tratamiento de la Hiperplasia
Suprarrenal Congénita es todavía muy limitado en lo que se refiere a la terapia géni-
ca. A nivel experimental, se ha conseguido rescatar mediante transgénesis de
CYP21B humana a ratones deficientes en 21-hidroxilasa (14). Por el momento exis-
ten dificultades importantes para este tipo de abordaje, derivadas de la necesidad de
mantener un nivel elevado de funcionalidad en el tejido específico para suprimir los
andrógenos ya que los resultados obtenidos han requerido inoculación intrasupra-
rrenal y la actividad se ha mantenido únicamente siete días. La terapia sustitutiva es
efectiva y económica y se han centrado esfuerzos en conseguir definir nuevos abor-
dajes farmacológicos combinando el bloqueo del receptor de andrógenos y la inhi-
bición de la aromatasa con niveles reducidos de glucocorticoides (15).
El tratamiento prenatal de la HSC sí se ha visto beneficiado muy directamente
por la aportación del diagnóstico molecular. El tratamiento prenatal persigue frenar
la suprarrenal fetal mediante dexametasona administrada a la madre para evitar la
virilización de las niñas afectas. La efectividad del tratamiento, debidamente ini-
ciado, dosificado y pautado, fue descrita por Forest et al (16) y recientemente confir-
mada (17); Speiser et al. (18) señalan la utilidad del diagnóstico molecular en la defi-
nición de la situación de enfermo, sano ó portador del feto a riesgo. Si bien parece
ser importante el tratar los embarazos a riesgo, también es importante no mantener
un tratamiento que no es necesario, y en ambos aspectos es el análisis molecular el
que nos permitirá definir tanto los portadores de mutaciones severas como la situa-
ción de afecto-sano-portador del feto.
En este estudio se presentan los resultados del análisis del gen de la 21-hidroxi-
lasa en población española y se analizan las relaciones genotipo-fenotipo. El análi-
sis se plantea en formas severas y tardías de la deficiencia tanto en estudios de tipo
familiar como en diagnósticos prenatales, discutiéndose las aportaciones del abor-
daje molecular al estudio de estos pacientes.
Pacientes y métodos
Sujetos
Trescientas quince familias (367 pacientes, 923 individuos) con al menos un

caso afecto de deficiencia de 21-OH de las distintas formas clínicas (109 pierde-sal
PS, 26 virilizantes simples VS y 180 no clásicas o tardías NC) procedentes de dis-
tintas Comunidades (Andalucía, Cataluña, País Vasco, Navarra, Valencia, Castilla
León, Castilla La Mancha, Murcia, Asturias, Extremadura, Aragón) del ámbito
nacional. También hemos estudiado 60 casos de pacientes con hiperandrogenismo
y 17OH progesterona (17OHP) en test de Synachten en el rango de portadores del
déficit de 21-OH (7), que se discuten brevemente en el apartado relativo a las apor-
taciones del análisis molecular. En 23 familias se realizó estudio de muestra prena-
tal, 11 muestras de vellosidad coriónica y 12 de líquido amniótico.
Métodos
Análisis directo del gen de la esteroide 21-hidroxilasa
Las deleciones del gen se estudian mediante la técnica de Southern (13). El

polimorfismo que gen y pseudogén presentan para determinados enzimas de res-
tricción (Taq I, Bgl II, Kpn I, entre otros) permite estimar la intensidad relativa
(mediante densitometría) de los fragmentos generados cuando el ADN genómico de
cada paciente es tratado con estos enzimas. En esta técnica, los fragmentos de ADN
se separan en una electroforesis según su tamaño molecular y son transferidos, tras
ser desnaturalizados, a un soporte (membrana de nailon) que nos permite su reve-
lado con la sonda específica del gen, en este caso pC21/3c marcada radiactivamen-
te. El empleo de varios enzimas de restricción permite excluir la posibilidad de
interpretar incorrectamente como deleciones, patrones que podrían ser debidos a
una conversión de una zona que incluyera los sitios de restricción analizados.
El estudio de las microconversiones o mutaciones puntuales se hizo mediante
PCR e hibridación específica de alelo (13,19). La amplificación específica del gen se
realizó utilizando como zonas de especificidad el exón 3, que tiene una deleción de
8 pares de bases, y el exón 6 que tiene una triple mutación (ambas en el pseudogén
CYP21A). El gen completo se amplifica en fragmentos solapantes que son desna-
turalizados y fijados sobre membranas de nailon. De esta manera, en forma parale-
la, se estudian sobre estas membranas las distintas mutaciones mediante hibridación
específica de alelo (ASO). En esta técnica se utilizan pequeñas sondas u oligonu-
cleótidos marcados específicos de las secuencias normal y mutada que hibridarán
específicamente con las secuencias correspondientes.
El análisis de los alelos no caracterizados mediante el cribado de las mutaciones
más frecuentes se hizo mediante una técnica de screening basada en el polimorfis-
mo que presenta la cadena sencilla de ADN a la presencia de cambios puntuales y
posterior secuenciación (20).
Análisis indirecto de CYP21B mediante microsatélites en la región HLA
La ubicación del gen 21OH en el locus HLA (Fig. 18.2. A) hace que su haploti-
paje sea de utilidad en el análisis indirecto de esta enfermedad. Aparte de los pro-
blemas de recombinación y mutaciones de novo, estos marcadores presentaban
algunos inconvenientes, especialmente en el caso de muestras prenatales (21), como
la frecuente homocigosidad de B, la falta de expresión de DR en amniocitos, y el
requerimiento de análisis mediante Southern para A y B, técnica que exige cantida-
des grandes de ADN de calidad o pureza elevada). Ello llevó a que se planteara en
este estudio la utilización de nuevos marcadores, planteamiento que se recoge en el
estudio de Ezquieta et al (22). La amplificación de la región que incluye el microsa-
télite se hace utilizando oligonucleótidos cebadores marcados radiactivamente ó
con fluorescencia, y su posterior resolución se realiza mediante electroforesis en
condiciones desnaturalizantes en acrilamida o mediante electroforesis capilar utili-
zando el secuenciador automático ABI prism 310 (20).
Resultados y discusión
Análisis del gen de 21-OH en población española
El análisis directo del gen de la 21-OH mediante Southern y PCR-ASO nos ha

permitido la caracterización de una gran mayoría de los alelos mutados (93%, 236/
265 cromosomas de formas clásicas y 84 %, 302/360 cromosomas de formas no clá-
sicas).
La distribución de mutaciones se muestra en la Tabla 18.1. Hemos estudiado de
formas separada las formas clásicas y tardías, ya que las mutaciones no se distribu-
yen por igual en dichos grupos, y el porcentaje de las distintas mutaciones dentro
de una serie global se ve muy influenciado por el número de pacientes de cada una
de las formas que se incluyan. La mutación más frecuente en formas severas es el
cambio 655 A ó C en el alelo normal por G (30%) en el intrón 2 originando un sitio
de procesamiento incorrecto en el ARNm); hecho también descrito en otras pobla-
ciones de distintas razas. Algunos alelos que han presentado esta mutación han
mostrado, de forma adicional, una segunda mutación (13) (doble microconversión),
Val281Leu o Pro453Ser. Este hecho pone de manifiesto la importancia de estable-
cer la segregación de alelos cuando se analiza el gen de la 21-OH a la hora definir
Tabla 18.1. Frecuencia y distribución de las mutaciones del gen 21-OH en población
española
Formas clásicas Formas tardías

265 alelos 360 alelos
Deleciones 15% 5%
Conversiones 15%
intrón 2G 30% 5%
del8pb 3% 1%
Ile172Asn 5% 2%
Exón6 (3x) 0,8% 0%
306 insT 3% 0,8%
Gln318Stop 14% 4%
Arg356Trp 4% 2%
Pro30Leu 1% 3%
Val281Leu 2,6% 60%
Pro453Ser 0% 4%
las mutaciones existentes en un determinado individuo. Ello tiene también trascen-

dencia al estimar el porcentaje de cromosomas caracterizados, se trataría de dos
mutaciones pero de un solo cromosoma caracterizado; y al pretender establecer
correlación genotipo-fenotipo, en la que sólo pueden valorarse aquellos pacientes
con dos alelos caracterizados, no dos mutaciones caracterizadas que podrían estar
en el mismo alelo. Estas consideraciones han de aplicarse también a los cromoso-
mas que presentan conversiones que incluyen varios exones del gen y por ello dan
resultado positivo para varias mutaciones.
Las deleciones y conversiones grandes dieron cuenta, en conjunto, de un 30%
de los alelos severos. El resto de mutaciones severas, excepto la mutación
Gln318Stop (14 %), resultaron ya menos frecuentes (0,8 al 4 %). Comparativamente
con otras poblaciones, la distribución de mutaciones en población española no es
distinta salvo en la mutación mencionada, que en otras poblaciones se presenta en
el 4 % de los alelos. Determinadas áreas de nuestra geografía han mostrado esta
mutación con elevada frecuencia (9). Otra de las mutaciones severas, aunque mucho
más infrecuente, 306insT, fue documentada por primera vez por nuestro grupo en
un paciente con una forma pierde-sal en heterocigosis con una deleción (13), y ha sido
posteriormente detectada en otros pacientes. Estos pacientes, por otro lado, mostra-
ron en el análisis indirecto idénticos marcadores polimórficos, sugiriendo un origen
común y reciente de este alelo mutado en nuestra población. Todos estos pacientes
procedían de Castilla La Mancha. Estas particularidades mencionadas, en las muta-
ciones Stop318 y 306insT en nuestra población, parecen poner de manifiesto la
importancia del mecanismo de diseminación de mutaciones en este gen por un efec-
to fundador (9). Recientemente se ha vuelto a poner en relevancia la existencia del
efecto fundador en la diseminación de las mutaciones de este gen y la posible ven-
taja en los heterocigotos portadores (8).
La mutación más frecuente en formas tardías fue Val281Leu (60 %), al igual que
en otras poblaciones. Esta mutación junto a las mutaciones Pro453Ser y Pro30Leu,
constituye el grupo de alteraciones que producen una afectación moderada de la
actividad enzimática (ver correlación genotipo-fenotipo). Como puede verse en
la Tabla 18.1., las formas NC también mostraron mutaciones severas, en este caso
en uno solo de los cromosomas; este hecho tiene trascendencia en cuanto al conse-
jo genético en estas pacientes y será analizado más abajo.
Las formas virilizantes simples, por constituir un grupo reducido en esta serie
(26 pacientes), no se han separado para el estudio de frecuencias en formas clásicas
y se han analizado junto a las formas pierde-sal. Queremos señalar que estos pacien-
tes presentaron la mutación Ile172Asn con una frecuencia superior (25 % de los cro-
mosomas, 50 % de los pacientes; ver a continuación correlación genotipo-fenotipo).
El estudio de las mutaciones más frecuentes permite caracterizar la gran mayo-
ría de los alelos mutados pero no su totalidad y ha de recurrirse a técnicas comple-
mentarias de análisis como el SSCP y la secuenciación (20). Este tipo de abordaje nos
ha permitido caracterizar nuevos alelos mutados: 64insT, mutación severa de des-
plazamiento de la fase de lectura encontrada en homocigosis en un paciente con una
forma pierde-sal en que aparentemente no existía consanguinidad y en el que el
tipaje de microsatélites nos permitió documentar dicha consanguinidad; e His61Leu

y Met283Val en pacientes con formas leves de la deficiencia en heterocigosis com-
puesta con mutaciones severas (23).
Correlación genotipo-fenotipo
Los estudios de actividad enzimática de los alelos mutados se realizan in vitro.

La mutación se introduce en el gen mediante mutagénesis dirigida, expresándose
posteriormente y evaluando la actividad del enzima mutado frente a un control, que
proviene de la expresión, también in vitro, del gen normal. De esta manera se ha
definido como mutación severa del gen de la 21-OH, aquella que deja una actividad
residual menor o igual que el 1%. Se incluyen también como mutaciones severas
aquellas que, en homocigosis, se asocian invariablemente con formas pierde-sal.
Son, por ello, mutaciones severas: las deleciones y conversiones grandes; las muta-
ciones que dan lugar a que aparezca un codón de parada, tanto porque el cambio de
base genere un codón de parada (Gln318Stop), como porque suponga una inserción
o deleción de base/s y el consiguiente desplazamiento de la fase de lectura con la
aparición del «Stop» (deleción 8pb y 306insT); mutaciones de cambio de amino-
ácido que se ubican en el dominio de centro activo (Arg356Trp y triple mutación del
exón 6); y la mutación que afecta al procesamiento del mRNA (655 A/C a G). La
mutación de cambio de aminoácido, Ile172Asn, da lugar a un enzima con una acti-
vidad residual del 1-2 % y se asocia con formas virilizantes simples.
Las mutaciones se consideran leves cuando el enzima mutado in vitro muestra
una actividad igual o menor al 25 % y/o sus constantes enzimáticas se ven afectadas
(velocidad máxima, especificidad de sustrato). Estas mutaciones son: Val281Leu,
Pro30Leu y Pro453Ser. La mutación Arg339His es también una mutación leve aun-
que no se debe al mecanismo de microconversión y es más infrecuente. En la Figu-
ra 18.2., se esquematiza la esteroide 21-hidroxilasa con sus enzimas auxiliares en la
membrana microsomal, indicando la ubicación de las mutaciones de cambio de
aminoácido en los correspondientes dominios funcionales de la proteína: centro
activo (triple mutación en exón 6 y Arg356Asn), unión a membrana (Ile172Asn y
Pro30Leu) y unión de grupo prostético (Val281Leu y Pro453Ser).
Para el estudio de la correlación genotipo-fenotipo los pacientes se agrupan
según combinen en su genotipo dos mutaciones severas, una mutación leve y una
severa o dos mutaciones leves (11,12,13). Según definió Speiser et al. (11) la afectación
enzimática esperada de la combinación de dos mutaciones severas sería total (acti-
vidad nula), mientras que sería parcial cuando se combinaran dos mutaciones leves
o una mutación leve y una severa. El estudio de correlación genotipo-fenotipo sólo
puede hacerse sobre los pacientes completamente genotipados (mutaciones carac-
terizadas en ambos alelos paterno y materno). En nuestra serie son 260 los pacien-
tes de los que se presenta este análisis (Tabla 18.2.). En conjunto, podemos afirmar
que existe una fuerte, aunque no total, relación (248/260, el 95 % de los pacientes
mostraron el fenotipo esperado). Todos los pacientes con dos mutaciones severas
Tabla 18.2. Correlación genotipo-fenotipo para los 260 enfermos en que el estudio
molecular permitió el genotipaje completo (caracterización de las mutaciones de ambos
alelos)
• Severa/Severa 112 formas severas (100%)

(112 pacientes)
60 formas leves (90%)
• Severa/Leve
(67 pacientes)
7 formas severas (5 VS)
76 formas leves (94%)
• Leve/Leve
(81 pacientes)
5 formas crípticas
95% (248/260 correlación genotipo-fenotipo)
(112/112) mostraron formas clásicas. Los pacientes con dos mutaciones leves nunca
mostraron una forma severa y la gran mayoría de ellos (76/81) mostraron una forma
NC; los cinco pacientes restantes presentaron una forma críptica. Las formas críp-
ticas sí manifiestan bioquímicamente la deficiencia, tanto su 17OHP basal como
tras estímulo con ACTH es alta; la falta de relación estaría, no entre los hallazgos
moleculares y el déficit enzimático, sino entre el grado de déficit enzimático y el
hiperandrogenismo generado por esos andrógenos en exceso. De cualquier manera,
se han contabilizado como falta de correlación genotipo-fenotipo.
Las formas virilizantes simples presentaron mayoritariamente una heterocigosis
compuesta para Ile172Asn y mutación severa (13/26), aunque tres pacientes mos-
traron Val281Leu en heterocigosis con una mutación severa. La mutación
Ile172Asn mantiene in vitro una actividad residual, aunque reducida, que podría
justificar la producción mínima de aldosterona que previniera la pérdida de sal y por
ello se asociaría fuertemente con las formas pierde-sal. Una forma virilizante sim-
ple mostró la mutación de procesamiento del intrón 2 en sus dos alelos (13) este
hecho, que ha sido descrito en otras series (11,12), se atribuye a un cierto grado de pro-
cesamiento alternativo correcto del ARNm en estas pacientes. El resto de pacientes
homocigotos para esta mutación en nuestra serie (18 pacientes) presentaron formas
pierde-sal.
Los heterozigotos compuestos para mutación leve y severa presentaron mayori-
tariamente (60/67) una forma leve, como podíamos esperar del déficit enzimático
parcial producido por este genotipo. En este grupo se encontró una mayor disper-
sión, ya que se encontraron siete pacientes con formas CL, todos ellos con
Val281Leu en el alelo leve; cabe señalar que dos de ellas fueron formas VS sin sín-
drome pierde-sal como se ha comentado más arriba. No podemos excluir que exis-
tiera una segunda mutación severa no caracterizada en el alelo portador de la
Val281Leu. Esta heterocigosis compuesta para mutación severa y leve (Val281Leu)
en pacientes con formas pierde-sal se ha descrito en otras series de otras poblacio-
nes (11). Cabe señalar que en este grupo de mutación leve/severa también se encon-
traron formas crípticas y oligosintomáticas. Recientemente hemos descrito
(Martínez Olmos et al. 1997) una forma oligosintomática en dos hermanas, cuyo
genotipo fue 655G (severa)/Val281Leu (leve).
La fuerte correlación genotipo-fenotipo en esta enfermedad ha llevado a algunos
autores (12) a considerar que el genotipaje de mutaciones puede ser más relevante que
la propia categorización clínica de estos pacientes. Ya que, según argumentan, la
severidad clínica puede estar condicionada por el estrés y otros factores ambienta-
les y queda oscurecida por factores relacionados con el sexo. Los niños pueden ser
diagnosticados y tratados antes de que aparezcan los signos clínicos y el tratamien-
to prenatal ha de plantearse siempre que exista un feto a riesgo de presentar dos
mutaciones tipo severa/severa.
Aportaciones del análisis genético molecular

en la deficiencia de 21-OH
De manera general, tanto en formas tardías como neonatales, el análisis mole-

cular nos ha permitido realizar el diagnóstico de portadores. Hemos de señalar que
un 20% de los portadores genotipados (con mutación caracterizada mediante aná-
lisis del gen) presentaban unos valores de 17OHP tras estímulo con ACTH en el
rango de la normalidad. El análisis molecular nos ha permitido confirmar el diag-
nóstico en la gran mayoría de los casos, con algunas salvedades.
Un importante porcentaje (38 %) de las formas tardías ha presentado en uno de
sus alelos una mutación severa, es decir, que se encuentran a riesgo de, si tienen des-
cendencia con otro portador de mutación severa, tener un hijo/a con una forma neo-
natal, pierde-sal o virilizante simple. De hecho, incluso en formas crípticas y oligo-
sintomáticas de la deficiencia hemos constatado a nivel molecular en algún caso la
existencia de mutación severa en uno de los alelos (24). Teniendo en cuenta que en
esta enfermedad es posible realizar tratamiento prenatal, que evita la masculiniza-
ción de genitales externos en la niñas afectas y prevenir el síndrome pierde-sal si se
conoce la situación de afecto del feto varón o niña, habría de plantearse adecuada-
mente el consejo genético de estas pacientes.
Por otro lado, la realización del análisis molecular nos ha permitido perfilar
mejor los dinteles diagnósticos del test de Synachten, separando formas clínicas que
podrían ser susceptibles de distinto seguimiento, tratamiento, etc. Los denominados
hiperandrogenismos funcionales son pacientes que presentan signos clínicos de
virilización sin hiperandrogenemia bioquímica y en los que únicamente la 17OHP
tras estimulación con ACTH es superior a la normalidad, aunque situándose en el
rango definido para portadores (7). En el análisis molecular realizado a estos pacien-
tes no se encontraron en ningún caso dos alelos mutados, aunque sí resultaron por-
tadores de la deficiencia con una frecuencia superior a la población normal (1/3 vs
1/15). Los resultados de este estudio sugieren que: si se encuentran unos niveles de
17-OHP tras estímulo con ACTH por debajo de 12 ng/ml es muy probable que no
se trate de una forma tardía; que si se detectan unos niveles entre 12 y 16 ng/ml, se
encuentran por encima del 95 % de los portadores genotipados, pero en ellos se ha
podido documentar la existencia de pacientes con dos alelos mutados; y que las for-
mas tardías con diagnóstico molecular que evidencia la presencia de dos alelos
mutados presentaron niveles superiores de este metabolito. En dos de estas formas
tardías la 17O-HP tras el estímulo con ACTH fue de 17 y 18 ng/ml. El resto, pre-
sentó niveles superiores a 20 ng/ml.
En cuanto a las basales de 17-OHP, no permiten el diagnóstico de portadores en
ningún caso, y sí pueden permitir el diagnóstico de forma tardía (no en todos los
casos), que habría de confirmarse con el test de ACTH. Azziz et al (7) sugieren que
cifra de 17-OHP basal por encima de 5ng/ml permiten efectuar el diagnóstico.
Algunas formas tardías presentan 17-OHP basal en el rango, o próxima, a la norma-
lidad y sólo son diagnósticas con el test de estimulación. Una paciente homocigota
para Val281Leu mostró una basal de 2,4 con un test de estimulación de 21 ng/ml.
Las aportaciones del estudio molecular en las formas clásicas de la deficiencia
en lo que se refiere al diagnóstico, son por lo general, únicamente de tipo confir-
matorio, aunque en algunos casos de HSC con 17-OHP elevada y 11-deoxicortisol
superior a la normalidad que plantearon dudas sobre si se trataba de un déficit de
21-OH o de 11-OH, se pudo constatar que existían alteraciones moleculares en el
gen de la 21. Los valores altos de 11-deoxicortisol, metabolito por debajo del blo-
queo enzimático, pueden ser debidas a la interferencia del 21-deoxicortisol (meta-
bolito no fisiológico cuya concentración se hace relevante en aquellos casos en que
la 17-OHP se encuentra muy elevada y es hidroxilada en posición 11) y a una cier-
ta inhibición de la 17-OHP sobre la 11-hidroxilasa. Otro tipo de interferencias en
la determinación de 17-OHP, que son especialmente importantes en neonatos han
podido llevar en alguna ocasión al diagnóstico de forma virilizante del déficit de
21 con valores de 17-OHP entre 10-20 ng/ml, que a nivel molecular no se ha evi-
denciado como tal. La trascendencia de estos hechos se plantea especialmente en
el consejo genético y diagnóstico prenatal en estas familias. El diagnóstico mole-
cular mediante análisis directo del gen permite evitar estos problemas. El diag-
nóstico prenatal constituye otra importante aportación del análisis molecular al
estudio de la HSC y se describen a continuación los resultados de dicho estudio en
nuestra población.
Diagnóstico prenatal
El tratamiento prenatal en la HSC por deficiencia de 21-OH se plantea en la

embarazada a riesgo de tener un hijo con una forma clásica de la deficiencia (fami-
lia que tiene ya un caso afecto o en pareja de portadores de mutación severa). De los
23 estudios de muestras prenatales realizados por solicitud de endocrinólogos,
genetistas y ginecólogos de distintos hospitales del ámbito nacional incluidos en
este trabajo, sólo en 17 casos se daba esta circunstancia, y lo que es más importan-
te, en sólo 10 de los 17 casos se había iniciado adecuadamente el tratamiento pre-
natal. El resto de casos eran parejas en que la madre presentaba una forma tardía de
la deficiencia y en cinco de los casos se había iniciado un tratamiento que no hubie-
ra sido necesario.
En referencia concreta a aquellos casos en que el diagnóstico prenatal tuvo que
definir si el tratamiento había de ser retirado o mantenido (10 casos de los que 6 fue-
ron niñas): dos eran niñas afectas en las que el tratamiento se mantuvo y evitó la
virilización neonatal (25), y en cuatro se pudo retirar el tratamiento, tres de ellas eran
portadoras. La constatación de que se trate de un niño, sea o no afecto, o de una niña
portadora o sana nos lleva a retirar el tratamiento. En lo que se refiere a los casos
que hubieran requerido tratamiento prenatal previo al diagnóstico molecular por
estar éste indicado, hemos de reseñar que en dos de los casos se trató de niños afec-
tos: una niña afecta recibió tratamiento unicamente a partir de la 21 a semana
(momento en que se contactó con nuestro laboratorio para el estudio molecular y en
ella no se pudo prevenir la virilización; el otro fue un varón en el que se hubiera reti-
rado el tratamiento y en el que el diagnóstico molecular permitió prevenir el sín-
drome pierde-sal al nacimiento).
Los estudios prenatales se realizaron por dos abordajes distintos y complemen-
tarios que permiten una mayor fiabilidad de los resultados, ambos han de ser
concordantes para marcar la actitud a seguir: un análisis directo del gen (13,19) y un
análisis indirecto mediante microsatélites en la región HLA (22). Estos marcadores
fueron desarrollados por nuestro grupo para solventar algunos de los problemas que
presentaban los tradicionales marcadores indirectos, antígenos HLA. La utilidad de
estos microsatélites se describe en Ezquieta et al. (22). La heterocigosidad (probabi-
lidad de que un individuo presente dos alelos distintos) de estos marcadores es muy
elevada (0,62-0,76) y por ello, su informatividad. El análisis indirecto permite
seguir aquellos alelos no caracterizados pero además es útil como elemento inde-
pendiente de confirmación del diagnóstico que se hace por análisis directo. La alta
heterocigosidad de estos marcadores ha permitido la detección de contaminación
con tejido materno de una de las muestras prenatales estudiadas.
Los errores descritos en el diagnóstico prenatal de 21-OH a nivel molecular
hasta el momento han sido atribuidos a distintos motivos como la contaminación de
la muestra prenatal con tejido materno o la recombinación entre el gen mutado y los
marcadores HLA utilizados. Los marcadores de tipo microsatélite pueden ayudar a
reducir o solventar estos problemas. Su gran informatividad permite que puedan
seguirse los cromosomas no caracterizados, detectar contaminación de tejido
materno y recombinaciones. Sin olvidar la utilidad adicional de permitirnos definir
el diagnóstico prenatal mediante dos abordajes independientes, solventando los
problemas de errores en el diagnóstico directo de 21-OHD por alelos no amplifi-
cables así como errores de la PCR de 21-OH, que también han sido descritos
(Donohue et al (10). De cualquier forma, ambos abordajes análisis directo e indirec-

to han de aplicarse para un correcto diagnóstico de enfermos, portadores y mues-
tras prenatales.
Estos datos en conjunto muestran que el análisis del gen 21-OH es de gran uti-
lidad en la HSC también en población española, tanto en diagnóstico de portadores
como prenatal; que la distribución y frecuencia de alelos mutados es similar a la
encontrada en otras poblaciones aunque presenta algunas peculiaridades que ponen
de manifiesto la existencia de un mecanismo de distribución de alelos por «efecto
fundador», ya sugerido por otros autores, que junto al mecanismo de conversión
génica, contribuiría a la elevada frecuencia de alelos mutados para esta deficiencia.
También se ha podido comprobar la existencia de una fuerte correlación genotipo-
fenotipo y la utilidad diagnóstica del análisis.
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19
Terapia celular de la diabetes mellitus
B. Soria Escoms
Introducción
La diabetes mellitus consiste en un conjunto de síndromes metabólicos cuya
característica común es el aumento de la glucosa sanguínea, se trata de una enfer-
medad crónica que tiene tratamiento pero no tiene curación. Tanto en la diabetes
tipo 1 (insulino-dependiente) como en la tipo 2 (no-insulino dependiente) hay un
déficit en la liberación de insulina. Dicho déficit es especialmente grave en la ti-
po 1, en la que por un proceso autoinmune hay una pérdida de la población celular
beta de los islotes de Langerhans. Los diabéticos tipo 1 son subsidiarios del trata-
miento con insulina durante toda su vida. Los estudios de tipo prospectivo y epide-
miológico (DCCT (1), UKPDS (2)) han demostrado que el control intensivo de la glu-
cemia disminuye de forma significativa la aparición de complicaciones
microvasculares (retinopatía, nefropatía, neuropatía). El tratamiento intensivo
intenta reproducir el control fisiológico (permanente, preciso y regulado) de la glu-
cemia sanguínea, para ello el paciente debe someterse a un control permanente de
la glucemia y a la administración intensiva (4-6 veces día) de insulina, la tarea que
el páncreas endocrino realiza de forma continua es sustituida por la conducta de un
paciente entrenado y motivado, como afirma María de Alva (3), diabética y
Presidenta de la International Diabetes Federation: «my brain is my pancreas». Sin
embargo, este tratamiento precisa de pacientes muy motivados.
La curación de la diabetes tipo 1 sólo puede venir de la reposición de la pobla-
ción celular beta. Hasta ahora, el trasplante de islotes pancreáticos había tenido un
éxito limitado, sin embargo, la introducción de un nuevo tratamiento inmunosupre-
sor es capaz de resolver la dependencia de insulina por períodos de más de doce
meses (4). Este nuevo protocolo supone un claro avance en el trasplante de islotes,
sin embargo deja dos puntos abiertos: en primer lugar los diabéticos trasplantados
necesitan terapia inmunosupresora continua y en segundo lugar, para cada diabéti-
co se necesitan de dos a tres donantes. Dado que las cifras de donantes, incluso en
países como España, con un alto nivel de donación de órganos, nunca alcanzarán las
necesidades de la población de diabéticos tipo 1, se impone la necesidad de buscar
otras fuentes de células beta para poder ser trasplantadas. Dichos procedimientos
terapéuticos utilizan los conceptos, métodos y conocimientos que pueden englo-
barse en lo que entendemos por ingeniería celular.
¿Qué es la ingeniería celular?

La ingeniería celular es un nuevo campo interdiciplinar que aplica los principios
de la ingeniería y de las ciencias de la vida a la obtención de sustitutos biológicos
para restaurar, mantener o mejorar la función tisular (5). Los avances considerables en
Ciencia de los Materiales, Genética Molecular, Biología del Desarrollo, Biología
Molecular y Celular, junto con un conocimiento más profundo de la fisiología de las
células, tejidos y órganos, han permitido que por primera vez se plantease la obten-
ción de células y tejidos para su implante en humanos. En muchas ocasiones la in-
geniería celular imita los procesos biológicos del desarrollo intrauterino o de la
reconstrucción fisiológica de tejidos para la consecución de sus objetivos. Las técni-
cas de ingeniería celular han permitido hasta el momento la obtención de piel artifi-
cial, tendones, ligamentos, etc. Cabe preguntarse si las nuevas técnicas de ingeniería
celular pueden ser útiles para generar nuevas células beta que trasplantadas al pacien-
te consigan normalizar la glucemia y evitar las complicaciones de la enfermedad.
Obtención de células beta artificiales mediante técnicas

de bioingeniería
Ingeniería de células de origen tumoral
Las primeras propuestas consistieron en transfectar líneas de origen tumoral

con los genes de aquellas proteínas que no se expresan adecuadamente y por lo
tanto, normalizar un fenotipo defectuoso. Por ejemplo, es muy frecuente que las
líneas tumorales presenten un umbral demasiado bajo para la glucosa (en el rango
sub mM), esto es debido a que expresan las isoformas I-III de la hexokinasa, que
posee una mayor afinidad por glucosa. La transfección con el gen de la glucokina-
sa (hexokinasa IV) permite obtener un patrón de respuesta a la glucosa en el rango
fisiológico. Existen varias líneas celulares de origen tumoral derivadas a partir de la
célula beta por irradiación (células RINm5F, INS-1, etc.) o por transformación viral
mediante SV40 acoplado al promotor de la insulina (células `TC). También pueden
utilizarse líneas tumorales de origen neuroendocrino, que comparten con la célula
beta una serie de propiedades, como por ejemplo, el procesamiento, almacena-
miento y secreción de péptidos. La línea AtT-20, derivada de la adenohipófisis de
TERAPIA CELULAR DE LA DIABETES MELLITUS 281
ratón, puede ser transfectada con el gen de la insulina, con lo que se obtiene la línea
AtT-20 ins (6). La facilidad con la que ciertas líneas celulares pueden ser transfecta-
das de forma reiterada permite la «ingeniería iterativa», es decir, la transfección con
otros genes como el de la glucokinasa y el del transportador GLUT-2 (7). Mediante
este procedimiento se ha generado una línea celular que responde a la glucosa en el
rango fisiológico, si bien posee una cinética de secreción sin primera fase (Fig. 19.1).
Las líneas tumorales presentan, no obstante, una serie de problemas no bien resuel-
tos, como por ejemplo, la inestabilidad del fenotipo, la expresión de genes no dese-
ados, y sobre todo su proliferación incontrolada ya que son de origen tumoral. Con
el fin de controlar la proliferación se ha propuesto la utilización de genes cuya
expresión es sensible a la presencia de un determinado ligando, como la tetracicli-
na (8), o a la temperatura.
Producción de insulina en otros tejidos
La producción de insulina en otros tejidos (producción ectópica) puede conse-

guirse mediante la transfección de células no beta con el gen de la insulina huma-
AtT-20
hlns
Glut-2
GK
Línea celular secretora

de insulina
Insulina
Insulina
Sólo 2.a fase
0 30 5 10 15
Tiempo, min Glucosa, mM
Figura 19.1. Bioingeniería de líneas celulares neuroendocrinas. La línea celular AtT-20 proce-
dente de la pituitaria anterior es tranfectada de forma progresiva («iterative engineering») con el
gen de la insulina humana (hIns), el del transportador de glucosa (Glut-2) y el de la glucoquinasa
(GK). La nueva línea celular responde a glucosa a concentraciones fisológicas aunque no está
presente el primer pico de la secreción bifásica de insulina.
na. Por ejemplo, se pueden tomar fibroblastos de un paciente, transfectarlos con el

gen de la insulina y reinyectárselos al propio paciente. Este sistema genera una
liberación basal, constitutiva y no regulada, de insulina. Siempre que no se alcan-
cen niveles muy altos de insulinemia basal (peligro de hipoglucemia), la insuline-
mia basal no permite enfrentarse a los aumentos de glucemia postprandial pero
quizás le permita el mantenimiento de la glucemia basal. Es decir, la dependencia
de insulina no desaparece, pero puede utilizarse alguna insulina rápida, incluso de
las nuevas formulaciones de insulina inhalada, en el control de la glucemia post-
prandial. La ventaja de estos procedimientos es que no necesitan inmunosupresión.
Los inconvenientes son: no se ha conseguido una expresión estable por periodos
prolongados, el fibroblasto carece de los enzimas para transformar la proinsulina
en insulina y, lo que es más importante, el fibroblasto carece de la maquinaria para
procesar, almacenar y secretar insulina, por lo que la secreción no es una secreción
regulada. El peligro de un aumento no controlado de la insulinemia basal, y de
hipoglucemia severa, es una de las complicaciones más graves del tratamiento
mediante insulinas.
Quizás, el problema más difícil de resolver en la terapia celular de la diabetes
mellitus es la reproducción de la liberación finamente regulada de la insulina en
respuesta a las variaciones de glucosa. A diferencia de otras endocrinopatías caren-
ciales en las que la presencia de la molécula puede considerarse aceptablemente
buena para un rango amplio de concentraciones en el caso de la insulina el meca-
nismo es extraordinariamente preciso y debe ajustarse a lo que en cada momento
necesita el organismo. Este planteamiento hizo que se pensase en la utilización de
otras estrategias para conseguir la secreción regulada de insulina en estructuras
ectópicas. Por ejemplo, la transfección de hepatocitos con un gen quimérico con-
sistente en la fusión del promotor de la piruvato quinasa o de la fosfoenolpiruvato
carboxiquinasa con el gen estructural de la insulina. Dado que la expresión de
ambos enzimas hepáticos está regulada por glucosa, los aumentos extracelulares
de glucosa se traducirían en la expresión hepática de insulina. La principal difi-
cultad de esta propuesta terapéutica es que lo que está regulado por la glucemia es
la expresión del gen y no la liberación de la hormona. Como la síntesis de proteí-
nas es un proceso lento (30-60 min) en la práctica el sistema de retroalimentación
funciona como un «loop» demasiado lento generando periodos de hiperglucemia e
hipoglucemia intensas.
Esta dificultad puede resolverse mediante la transfección de células endocrinas
intestinales en las que la liberación hormonal esté regulada por glucosa, como ocu-
rre con las células K encargadas de la liberación de GIP (polipéptido insulinotrópi-
co dependiente de glucosa) en presencia de glucosa. El gen quimérico resulta de la
fusión del promotor del GIP con el gen estructural de la insulina. Este procedi-
miento impide la progresión de la diabetes experimental en ratones (9). No obstante,
el epitelio intestinal está en continuo recambio lo que impide una acción prolonga-
da de la terapia. Alternativamente, puede conseguirse el control farmacológico de la
secreción proteica mediante un procedimiento que permite la liberación rápida y
pulsátil de proteínas terapéuticas (10). Para ello se diseña el precursor proteico de
forma que se almacena formando agregados en el retículo endoplásmico. La secre-

ción puede estimularse mediante un fármaco que produzca desagregación y permi-
ta la acción de las furinas, proteasas ubicuas que rompen el enlace peptídico que une
la proteína terapéutica al dominio de agregación condicional. Por último, la obser-
vación casual de que las células eucariotas pueden capturar DNA crudo del ambien-
te e incorporarlo a su maquinaria de producción de proteínas ha hecho que se
empiece a utilizar la inyección de ADN crudo en la musculatura esquelética. La
electroporación puede utilizarse in vivo para facilitar la incorporación del gen de la
insulina al músculo esquelético. Este procedimiento posee en este momento las
mismas dificultades descritas para la transfección de otros tipos celulares como los
fibroblastos.
Ingeniería celular de precursores. Estímulo y control del crecimiento, regene-

ración y neogénesis de islotes
La masa celular ` aumenta por diferenciación a partir de células precursoras del

epitelio ductal del páncreas, aunque parece ser que tras el nacimiento la replicación
de células beta preexistentes es el principal mecanismo de aumento de la masa
celular. La posibilidad de que ambos mecanismos coexistan en el adulto ofrece la
posibilidad de aprovechar dicha capacidad en la prevención o en el tratamiento de
la diabetes. Susan Bonner-Weir et al (11) han desarrollado un protocolo de cultivo que
permite la obtención de islotes pancreáticos a partir de las células ductales de pán-
creas de donantes. En síntesis, consiste en cultivar las células en monocapa duran-
te 1-2 semanas en un medio que contiene factor de crecimiento de queratinocitos,
nicotinamida e ITS (insulina + transferrina + selenio) hasta que las células estén casi
confluentes. A continuación son transferidas a un medio con una preparación de
matriz extracelular (Matrigel®) durante 1-7 semanas. El principal obstáculo de este
procedimiento es que se consigue una proliferación muy limitada y por lo tanto no
se alcanza la cantidad de material necesaria para un trasplante. Otros autores han
utilizado células beta procedentes de neonatos con PHHI, hiperinsulinemia e hipo-
glucemia persistente de los neonatos. En este cuadro clínico debido a una mutación
del canal de potasio regulado por ATP (12), las células beta están permanentemente
despolarizadas, lo que provoca la entrada continua de calcio y la liberación per-
sistente de insulina. Desgraciadamente el canal mutado es insensible a diazóxido
por lo que los recién nacidos con este cuadro precisan de una pancreatectomía del
95% para resolver la hipoglucemia en la que se encuentran. A partir de las células
beta obtenidas tras la pancreatectomía se ha desarrollado una línea celular que res-
ponde a concentraciones fisiológicas de glucosa (13). El procedimiento incluye la
transfección con el gen del canal K ATP y con el gen que codifica el factor de trans-
cripción PDX-1. PDX-1 es un factor de transcripción que juega un papel central en
la diferenciación de la célula beta pancreática y en la regulación de la expresión de
la insulina.
Clonación terapéutica y diferenciación in vitro de células beta
El descubrimiento de que la información contenida en el ADN de una célula

adulta puede ser reprogramada, de forma que se puede desarrollar un mamífero
superior a partir de la información contenida en el núcleo de una célula de una oveja
adulta (14), ha cambiado el paradigma existente hasta el momento. Las células adul-
tas-diferenciadas mantienen su estado diferenciado gracias a que han silenciado
muchos de sus genes, se supone que por procesos de metilación. Una célula dife-
renciada sólo expresa un determinado menú de su repertorio de genes, sin embar-
go, una célula totipotencial puede aún expresarlos todos y, por lo tanto, dar lugar a
cualquier tipo celular de los aproximadamente 200 que existen en un organismo
adulto. En el caso de Dolly se consiguió la totipotencialidad, el núcleo transferido
dio lugar a todos los tipos celulares, incluyendo las células germinales. La clonación
reproductiva permite la obtención de transgénicos para la producción de sustancias
con aplicaciones biotecnológicas (péptidos hormonales, etc.) o de órganos para su
trasplante en humanos (xenotrasplante). En la actualidad y, dado el número de mal-
formaciones asociadas al proceso, puede afirmarse que intentar la clonación repro-
ductiva humana sería una aberración criminal e irresponsable. No así la clonación
terapéutica que abre la posibilidad de obtener in vitro células y tejidos que pueden
ser utilizados en terapia celular de enfermedades como la diabetes, el Parkinson, etc.
Nuestro grupo ha demostrado que es posible obtener células que contengan y libe-
ren insulina a partir de células embrionarias de ratón. Dichas células normalizan la
glucemia en animales diabéticos (15). En síntesis, la clonación terapéutica consta de
cuatro pasos: a) Transferencia del núcleo de una célula procedente de un paciente
(por ejemplo de un fibroblasto o de la piel) a una célula receptora que puede ser un
ovocito humano, no humano (se ha ensayado con éxito los ovocitos de ternera) u
otros tipos celulares con pluripotencialidad suficiente; b) Diferenciación in vitro
hacia el tipo celular deseado; c) Selección clonal; y d) Maduración y diferenciación
terminal.
En teoría, la diferenciación in vitro puede promoverse generando unas condi-
ciones ambientales similares a las del desarrollo embrionario. Por ejemplo, la pola-
ridad, los factores de crecimiento o la presencia de matriz extracelular (16). Sin
embargo, la obtención de poblaciones celulares puras exige la utilización de técni-
cas de selección clonal eficientes. En general, los métodos de selección clonal se
basan en la expresión de determinadas proteínas en la membrana celular y la selec-
ción mediante FACS («fluorescence activated cell sorting»). Se puede conseguir
una selección más específica utilizando la selección en base a la expresión de mar-
cadores genéticos representativos del tipo celular que se desea seleccionar (17,18). La
metodología, que nosotros hemos adaptado para la selección de células que con-
tengan insulina consiste en transfectar las células con un gen quimérico formado
por la fusión funcional del promotor de la insulina acoplado a un gen de resisten-
cia a la neomicina (Fig. 19.2). Así, aquellas células que contengan el complejo de
transcripción que activa la expresión de dicho gen, tendrán también activado la
expresión del gen de resistencia a la neomicina. Este procedimiento ha permitido
la obtención de cardiomiocitos (17) y de precursores neurales (18) a partir de células

madre embrionarias.
Trasplante de células beta obtenidas a partir de células

madre embrionarias
El método descrito previamente ha permitido la obtención de una línea celular
que no sólo contienen insulina, sino que posee secreción regulada de la misma. El
procedimiento de obtención que se sumariza en la (Fig. 19.2), y consiste en:
a) Transfección mediante electroporación o lipofección de células madre

embrionarias con un constructo similar al descrito en la (Fig. 19.2). Dicho
constructo está diseñado para que exprese el gen de resistencia a la neomici-
na sólo en aquellaos tipos celulares que expresan insulina.
b) Selección mediante higromicina de las células transfectadas.
c) Diferenciación in vitro con formación de cuerpos embrionarios y cultivo en
monocapa.
d) Selección de clones resistentes a neomicina (y que por lo tanto están expre-
sando insulina).
e) Maduración de clones que expresan insulina (2 semanas en 10 mM nicoti-
namida y alta glucosa 25 mM + 5 días en 10 mM nicotinamida y 5 mM glu-
cosa).
f) Caracterización del clon en términos de contenido de insulina, secreción y
liberación de la misma en respuesta a distintos secretagogos.
g) Trasplante a animales diabéticos.
El clon que se seleccionó en este estudio tenía un contenido de insulina corres-

pondiente aproximadamente al 80 % del contenido de insulina de islotes de ratón (15).
Se comprobó además, que la incubación en bajas concentraciones de glucosa ace-
leraba el proceso final de maduración, ya que el contenido de insulina de los islotes
y las respuestas de secreción basal e inducida por concentraciones estimulatorias de
glucosa (16,7 mM) o tolbutamida (100 μM), iba aumentando con los días de incu-
bación en glucosa. Al final, obtuvimos unas células cuya liberación basal de insuli-
na era la mitad de la de los islotes de raton, y que en respuestas a secretagogos, te-
nían una secreción de insulina que correspondía aproximadamente al 55 % de la
secreción de islotes de ratón. Cuando estas células se trasplantaron en un modelo de
animal se comprobó que eran capaces de mantener normoglicémicos a dichos ani-
males desde los primeros dos días del trasplante y durante todo el tiempo que duró
el estudio (19).
En base a lo anteriormente expuesto (20), pueden postularse las siguientes pre-
dicciones en relación con el trasplante de islotes pancreáticos y el uso de células
madre en ingeniería celular y diabetes mellitus:
R1 mESC
Transfección
h Ins prom B-geo PGK/Hygro
+ Higromicina
Clones resistentes
a higromicina
Diferenciación in vitro
+ Neomicina
Clones resistentes
Células con bajo contenido en insulia
a Neomicina
2 semanas Nic
Maduración
5 días Nic-baja glucosa
Células con alto contenido en insulina
Figura 19.2. Diagrama de flujo del proceso de diferenciación desde células madre embrionarias
pluripotenciales (mESC) a células que contienen insulina. NIC: nicotinamida (modificado de Soria
et al (20).
1. En un futuro próximo se observará un aumento en los trasplantes de islotes

para el tratamiento de la diabetes tipo 1.
2. A corto y medio plazo se desarrollarán nuevos métodos para la obtención in
vitro de células beta, bien a partir de precursores, como las células ductales,
o a partir de células madre.
3. La clonación terapéutica, autorizada ya en países como el Reino Unido,

EEUU. y Japón, se extenderá a otras regiones permitiendo el tratamiento de
la diabetes mellitus mediante células ` producidas «a medida».
4. A medio plazo se dispondrá de métodos para la diferenciación a partir de
células madre del adulto. Una vez resuelta la expansión necesaria para gene-
rar una masa notable de células beta será factible tanto el alotrasplante como
el autotrasplante.
5. La ingeniería celular permitirá la modificación de las células con el fin de
hacerlas más resistentes al ataque inmunitario, a la apoptosis, etc.
6. Se desarrollarán terapias inmunosupresoras que permitirán suprimir la res-
puesta autoinmune en la diabetes tipo 1, lo que permitirá el trasplante de
células beta con efectos secundarios mínimos.
7. El desarrollo de técnicas de encapsulación permitirá la tolerancia al alotras-
plante de células beta pancreáticas.
En suma, junto con la biología molecular y el conocimiento de la estructura y

función del genoma humano, la ingeniería celular puede convertirse en la nueva
revolución biomédica del siglo XXI.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado, en parte gracias a Ayudas del Ministerio de

Ciencia y Tecnología (PM99-0142), Fundació Marató TV3 (99-1210), Fundación
Salud 2000 y Juvenile Diabetes Foundation (1-2000-575).
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20
Aproximación genética
a los pseudohermafroditismos
M. L. Gaspar
Determinación y diferenciación sexual. Pseudohermafroditismos

El proceso de determinación sexual de un feto comprende aquellos eventos
genéticos que producen un desarrollo gonadal masculino o femenino. La diferen-
ciación sexual se refiere a los siguientes eventos morfogénicos y fisiológicos que
finalmente establecen la funcionalidad sexual, el dimorfismo sexual y las caracte-
rísticas sexuales secundarias. Los genitales se desarrollan durante el primer trimes-
tre de vida intrauterina, bajo la influencia de hormonas esteroideas sexuales, por lo
que como consecuencia de alteraciones en la síntesis o acción de estas hormonas
pueden existir cambios en el desarrollo sexual normal del feto.
Prácticamente todas las etapas de la diferenciación sexual están determinadas
genéticamente, por lo que cada una de ellas puede fallar como consecuencia de la
mutación de los genes correspondientes. Estas mutaciones ocasionan cuadros de
indefinición sexual en grados diversos, que conllevan la aparición de pseudoher-
mafroditismo. Se llama pseudohermafroditismo o estado intersexual a aquellas enti-
dades en las que los genitales externos del individuo son ambiguos o son discor-
dantes con el sexo gonadal o el cromosómico del sujeto.
El pseudohermafroditismo masculino es una patología de la diferenciación
sexual en la que se produce una incompleta diferenciación de los genitales mascu-
linos (ductos genitales y/o genitales externos) en presencia de gónadas masculinas
Abreviaturas utilizadas: Dihidrotestosterona (DHT); Factor inhibidor de tumor de Wilms

(«Wilms tumor inhibiting factor», WT-1); Factor esteroidogénico («steroidogenic factor-1», SF-1);
Hiperplasia adrenal congénita (HAC); Hipoplasia de células de Leydig (HCL); Hormona antimulle-
riana («mullerian inhibiting substance», MIS); Hormona gonadotropina coriónica (HCG); Hormona
luteinizante (HL); Reacción de polimerasa en cadena (PCR); Receptor de andrógenos (RA); Receptor
de HL (RHL); Secuencias de reconocimiento esteroideo (SER); Síndrome de Feminización Testicular
(Tfm).
o de tejido testicular en individuos genotípicamente varones (46,XY). Está causa-

do por fallos en el proceso secuencial de desarrollo embrionario del testículo.
Normalmente durante la vida embrionaria en presencia de un testículo funcional los
conductos de Muller regresan por acción de la hormona antimulleriana (o «mulle-
rian inhibiting substance», MIS) y los conductos mesonéfricos y el sinus urogeni-
tal se diferencian hacia genitales externos e internos masculinos por acción de la
testosterona y la dihidrotestosterona (DHT). Si en este periodo de la vida embrio-
naria no se produce una adecuada exposición a hormonas testiculares (testosterona
y MIS), o el individuo es genéticamente incapaz de responder a ellas, el proceso de
diferenciación de genitales masculinos no se produce o lo hace parcialmente, oca-
sionando la aparición de pseudohermafroditismo masculino. La causa más fre-
cuente de pseudohermafroditismo masculino en ausencia de gónadas disgenéticas
es el Síndrome de feminización testicular (Tfm) o Síndrome de insensibilidad a los
andrógenos, ocasionado por mutaciones en el gen que codifica para el receptor de
andrógenos (RA) (1). La segunda causa más frecuente de pseudohermafroditismo
masculino es el déficit de 17` hidroxilasa, que ocasiona un defecto en la biosínte-
sis de testosterona, lo que produce un cuadro de pseudohermafroditismo incomple-
to con insuficiencia adrenal (2).
El pseudohermafroditismo femenino es una patología de la diferenciación sexual
en la que se produce una diferenciación de genitales externos masculinos en ausen-
cia de tejido testicular, en individuos que son genotípicamente hembras (46,XX). En
estos pacientes se encuentran genitales internos femeninos junto con grados diver-
sos de virilización en genitales externos.
Está producido por exposición del feto femenino a un exceso de ambiente
androgénico durante el embarazo. De esta forma, los andrógenos masculinizan los
genitales externos, pero el feto conserva sus ovarios, y derivados mullerianos. La
causa más frecuente de este cuadro es la hiperplasia adrenal congénita (HAC) pro-
ducida por déficit de 21 hidroxilasa (3), y la segunda causa más frecuente se debe a
un exceso materno de andrógenos, generalmente a consecuencia de tumores ovári-
cos.
Las principales causas de pseudohermafroditismo se resumen en la Tabla 20.1.
En todos estos cuadros se produce la mutación en alguno de los genes relevantes en
alguna etapa concreta de la síntesis o acción de los andrógenos y/o la MIS. El cua-
dro clínico que presenta cada uno es muy variable, pero el patrón de niveles hor-
monales de los pacientes afectados es orientativo del diagnóstico, que finalmente se
confirma por la detección directa de las mutaciones correspondientes. La presencia
de las mutaciones de alguno de estos genes se determina por técnicas de biología
molecular, como son el análisis de polimorfismo conformacional de ADN de cade-
na sencilla (SSPC), o la reacción de polimerasa en cadena (PCR), que permite
amplificar el ADN de los distintos exones, intrones y regiones promotoras de los
genes, que son posteriormente secuenciados. Por último, la función anómala de la
proteína mutada se demuestra por la introducción del ADNc portador de la muta-
ción correspondiente en células carentes de la proteína nativa, o por la producción
de animales transgénicos con el ADNc mutado.
APROXIMACIÓN GENÉTICA A LOS PSEUDOHERMAFRODITISMOS 291
Tabla 20.1. Causas genéticas de pseudohermafroditismo
1) Déficit de respuesta testicular a la gonadotropina coriónica y a la hormona luteinizante.

(por mutaciones en su receptor).
2) Déficit enzimáticos en la biosíntesis de cortisol/testosterona.
3) Anomalías en la acción de los andrógenos.
a) por defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona.
b) por resistencia a la acción de los andrógenos (mutaciones en su receptor).
4) Defectos síntesis o acción de la h. antimulleriana.
Déficit de respuesta testicular a la gonadotropina coriónica

y a la hormona luteinizante: mutaciones del gen de su receptor
El desarrollo sexual masculino está regulado por la hormona gonadotropina
coriónica (HCG) y la hormona luteinizante (HL), que actúan en la gónada indife-
renciada del feto por unión al receptor de HL (RHL) presente en las células de
Leydig. Mutaciones que inactivan el RHL causan una inadecuada diferenciación
fetal de células de Leydig en el testículo, lo que ocasiona una aplasia o hipoplasia
de estas células (Hipoplasia de células de Leydig, HCL).
La HCL es una patología autosómica recesiva, causada por mutaciones en el gen
que codifica para el RHL. Se han localizado mutaciones a lo largo de todo el gen de
RHL, que incluyen mutaciones puntuales, inserciones y delecciones (4). El RHL es
una proteína transmembrana, con un gran dominio extracitoplásmico, siete domi-
nios transmembranales unidos por tres lazos intracelulares y tres extracelulares, y
una cola intracitoplásmica. Esta proteína está codificada en el cromosoma 2p21, y
consta de 11 exones. Los 10 primeros codifican todo el dominio N-terminal extra-
celular, que es donde se encuentra el lugar de unión a la hormona, mientras que el
exón 11 codifica la región C-terminal, que comprende el resto de los dominios. La
mayoría de las mutaciones descritas en el gen de RHL, sobre todo las inserciones y
delecciones, o las mutaciones puntuales ocasionando cambios sin sentido, ocasio-
nan diversos grados de pérdida de actividad del RHL, desde su total falta de función
hasta una menor capacidad de unión a sus ligandos (4). En general corresponden a
mutaciones en el dominio extracelular del RHL que afectan al sitio de unión de la
HL o la HGC con el receptor y al anclaje de la proteína a la membrana. La exten-
sión de la mutación correlaciona con el cuadro clínico porque las manifestaciones
clínicas en pacientes homocigóticos correlacionan con la actividad residual de sus
correspondientes RHL (5). El cuadro clínico de los sujetos 46,XY afectos, es por
tanto de espectro variable, que va desde formas leves de hipogonadismo masculino,
que se presentan como niños varones con falo hipoplásico e hipospadias al naci-
miento, o como adultos con micropene, a formas graves, con cuadros completos de
pseudohermafroditismo masculino, con genitales externos femeninos y criptorqui-
dia, junto con ausencia de derivados mullerianos y de células de Leydig maduras en
los testículos. Las alteraciones analíticas características incluyen bajos niveles séri-
cos de testosterona, incluso tras estimulación con HGC, con niveles normales de
precursores esteroideos y niveles elevados de HL. En mujeres homocigotas las
Tabla 20.2. Manifestaciones clínicas de mutaciones del gen del RHL
Mutaciones Individuos Individuos

46, XY 46, XX
Activadoras Pubertad precoz familiar Asintomáticos

o esporádica
Inactivadoras
Defectos severos Hipoplasia de células de Leydig Amenorrea u oligomenorrea
Poliquistosis ovárica
Defectos leves Micropene y/o hipospadia No descrito
mutaciones del RHL causan cuadros de hipogonadismo hipergonadotrópico, con

amenorrea u oligomenorrea primaria, ovarios quísticos e infertilidad (4).
Algunas mutaciones del gen del RHL, que pueden ser esporádicas, producen
activación constitutiva del RHL. En general estas mutaciones ocasionan cambios
puntuales de aminoácidos del 6.o dominio transmembrana y del tercer lazo intrace-
lular del RHL (codificado por el exón 11). Esta activación constitutiva del RHL oca-
siona pubertad precoz en niños, esporádica o familiar (pubertad precoz familiar en
varones, autosómica dominante). En la Tabla 20.2 se resumen las manifestaciones
clínicas de las diversas mutaciones del gen del RHL (4).
Por último, recientes descripciones de casos de HCL que muestran un RHL nor-
mal, aportan evidencias sobre una posible heterogeneidad genética, aún por carac-
terizar, en esta entidad (6).
Déficit enzimáticos en la biosíntesis de andrógenos

Producidas por mutaciones de genes de enzimas que participan en la biosíntesis
de la testosterona, que tiene varios pasos en común con la del cortisol, y que oca-
sionan diversos cuadros de pseudohermafroditismo femenino o masculino, con alte-
raciones fenotípicas muy variables, y que en general se asocian con defectos en la
síntesis de otras hormonas esteroideas, lo que ocasiona adicionalmente otras pato-
logías asociadas.
Los principales defectos enzimáticos en la síntesis de cortisol/testosterona se
resumen en la Tabla 20.3. Todos aquellos en los que se produce un defecto final en
la síntesis de cortisol (3` hidroxiesteroid-dehidrogenasa, 17_ hidroxilasa, 21 hidro-
xilasa, 11` hidroxilasa) causan incremento en la secreción de ACTH y excesivo cre-
cimiento adrenal, junto con un aumento en la producción de andrógenos, produ-
ciendose así distintos síndromes de hiperplasia adrenal congénita (HAC) (3), que
presentan importante patología de insuficiencia adrenal o distintos grados de nefro-
patía, junto con cuadros de pseudohermafroditismo femenino (las cuatro enzimas)
y masculino (21 hidroxilasa, 11` hidroxilasa).
De entre estos defectos enzimáticos, señalaremos aquí únicamente la hiperpla-
sia adrenal congénita producida como consecuencia de mutaciones del gen de la
Tabla 20.3. Principales defectos en la síntesis de cortisol/testosterona
Enzima Hormona Hormona Anomalía en la En mujeres Patología

deficitaria deficitaria acumulada diferenciación sexual (46, XX) asociada
En varones (ambos sexos)
(46, XY)
Cuadros que cursan con hiperplasia adrenal congénita y pseudohermafroditismo

3` hidroxiesteroid Progesterona Dihidro Feminización, Hirsutismo Nefropatía con
–dehidrogenasa –epiandrosterona ginecomastia pérdida de sal
17_ hidroxilasa Cortisol Corticosterona Feminización variable, Fenotipo Hipertensión,
y aldosterona y desoxi- hipogonadismo prepúber alcalosis
corticosterona y ginecomastia con amenorrea hipocaliémica
21 hidroxilasa Cortisol 17OH-progesterona Asintomáticos, Virilización Insuf. Adrenal

y aldosterona pubertad precoz
11` hidroxilasa: Cortisol 11-Desoxicortisol Asintomáticos Virilización Hipertensión

y aldosterona
Cuadros que cursan con pseudohermafroditismo masculino únicamente

17/20 liasa Testosterona 17OH-progesterona Genitales ambiguos Asintomáticas
en neonato o
feminización
17` hidroxiesteroid Testosterona Androstenediona Fenotipo femenino, Asintomáticas

APROXIMACIÓN GENÉTICA A LOS PSEUDOHERMAFRODITISMOS
–dehidrogenasa: neonatal, virilización

en pubertad
293
21-hidroxilasa, que es la primera causa de pseudohermafroditismo femenino (95%

de los casos) (3). La incidencia de formas graves de la enfermedad es de 1 en 10.000,
pero la de formas leves llega hasta 1 en 1.000. Se han descrito mutaciones que van
desde grandes delecciones del gen hasta mutaciones puntuales, incluyendo aquellas
que afectan a regiones reguladoras que impiden la transcripción. La HAC por défi-
cit de la 21-hidroxilasa es una enfermedad autosómica recesiva, en la que está alte-
rada la síntesis de cortisol y aldosterona y se produce un acúmulo de 17-hidroxi-
progesterona, que se deriva hacia una anómala producción de testosterona. Las
enfermas afectas presentan un cuadro clínico de insuficiencia adrenal grave y pseu-
dohermafroditismo femenino, con grados variables de virilización. Resulta funda-
mental el diagnóstico temprano de la entidad, que en los casos severos tiene una
importante tasa de mortalidad debido a la insuficiencia adrenal que se produce en
las primeras semanas de la vida. Este diagnóstico se hace mediante determinación
por RIA de la 17-hidroxiprogesterona, junto con ecografía abdominal/pélvica, para
iniciar tratamiento sustitutivo con corticoides y mineralocorticoides que evite la
insuficiencia adrenal. La mejora en el manejo clínico de estas enfermas ha elevado
el número de ellas que llegan a presentar embarazos con fetos heterocigotos nor-
males, por lo que se comienza a plantear el tratamiento muy temprano (incluso pre-
natal) de los fetos femeninos que portan estas enfermas, para evitar la insuficiencia
adrenal y prevenir la ambigüedad genital (7). En sujetos varones homocigotos se pro-
ducen manifestaciones de insuficiencia adrenal, junto con cuadros de pubertad pre-
coz en grado variable (3).
Algunos de los defectos enzimáticos en la síntesis del cortisol/testosterona cur-
san con pseudohermafroditismo masculino, que se presenta en ausencia de otras
patologías (17/20 liasa, 17` hidroxiesteroid-dehidrogenasa) (2,8), o junto con cuadros
de insuficiencia adrenal o nefropatía pierde sal e hipertensión (3` hidroxiesteroid-
dehidrogenasa, 17_ hidroxilasa). Todos ellos se transmiten en forma autosómica
recesiva, y en general se presentan como cuadros de genitales ambiguos al naci-
miento, con grados variables de virilización/feminización en la pubertad, que a
menudo condicionan cambios de sexo en ese momento o tratamientos quirúrgi-
co/hormonales.
Anomalías en la acción de los andrógenos
a) Defectos en el metabolismo intracelular de la testosterona: mutaciones del gen

de la 5_ reductasa-2.
La testosterona es sintetizada en el testículo, pero en sus células diana es con-
vertida en un metabolito más activo, la dihidrotestosterona (DHT), por acción del
enzima 5_ reductasa-2. Mutaciones en el gen de este enzima impiden la formación
de DHT a partir de testosterona (8). Como la testosterona regula negativamente la pro-
ducción de HL en la hipófisis, ésta presenta también niveles normales, y no se pro-
duce un exceso ni de testosterona ni de estrógenos. La presencia de niveles norma-
les de testosterona y la ausencia de DHT y de hiperestrogenismo son los que condi-

cionan el fenotipo del cuadro, ya que la testosterona es responsable de la formación
durante la vida embrionaria de estructuras testiculares (epidídimo, vasos deferentes
y vesícula seminal) a partir de los conductos wolffianos mientras que la DHT es la
responsable de la masculinización de genitales externos y de los derivados del seno
urogenital, que en su ausencia tienen aspecto femenino. Así, estos pacientes tienen
un fenotipo externo general femenino con una falsa vagina, clítoromegalia/hipospa-
dias y testículos abdominales o inguinales, pero en ausencia de útero y trompas de
Fallopio y en ausencia de ginecomastia. En la pubertad estos sujetos pueden presen-
tar un grado variable de virilización en respuesta a la testosterona producida, que
pueden condicionar cambios de sexo (si fueron educados como niñas) y/o trata-
mientos hormonales y quirúrgicos en ese momento. Los pacientes presentan niveles
normales de testosterona, HL y estrógenos, y ausencia o bajo nivel de DHT. La acti-
vidad enzimática reducida puede demostrarse en biopsias tisulares o en cultivos de
fibroblastos, y la presencia de mutaciones puede mapearse directamente por aisla-
miento y secuenciación del ADN de los 5 exones del gen, siendo las mutaciones más
frecuentes cambios puntuales localizados en cualquiera de los exones.
b) Resistencia a la acción de los andrógenos: mutaciones del gen de

su receptor
Mutaciones del gen del RA causan una resistencia a la acción de los andrógenos,
y ocasionan el llamado síndrome de feminización testicular (Tfm) o de insuficien-
cia androgénica (1). El gen del RA se encuentra en el cromosoma X, por lo que los
cuadros clínicos de pseudohermafroditismo masculino producidos por mutaciones
del gen de RA se presentan como cuadros ligados al sexo, con afectación clínica
únicamente en varones y siendo las hembras portadoras asintomáticas.
Las mutaciones del gen del RA afectan la diferenciación sexual masculina
andrógeno-dependiente en diversos grados (9). Existen cuadros severos de insensi-
bilidad de andrógenos que presentan un fenotipo externo femenino completo, inclu-
yendo una vagina corta y cerrada. Se encuentran testículos, que pueden ser abdo-
minales, inguinales o en los labios mayores, en ausencia de otros órganos sexuales
internos. En los casos parciales el fenotipo varía en un espectro desde cercano al
femenino hasta el masculino normal con signos de poca virilización, que incluyen
o no la presencia de ginecomastia, junto con hipospadias y criptorquidia. Estas for-
mas parciales pueden dividirse en varios cuadros según la forma de presentación,
que van desde el síndrome de Reifenstein hasta formas que se presentan únicamen-
te como varones con azoospermia, o muy leves como varones normales fértiles con
baja virilización. El grado de afectación está en relación con la actividad del RA: en
las formas graves el RA está completamente inactivado, y en las parciales o leves
existe una actividad residual variable (1). Sin embargo, se han descrito diferentes
niveles de afectación clínica entre sujetos de la misma familia que portan diferen-
tes mutaciones, o en individuos no relacionados que presentan la misma mutación.
Existen también descripciones de cuadros de pseudohermafroditismo 46,XY oca-
sionados por una mutación puntual en el RA producida de novo en el individuo

afectado, que presenta un mosaicismo tisular (10). Se han descrito también casos de
mutaciones somáticas del gen RA en cáncer de próstata metastásicos, en los que se
produce un RA con afinidad más relajada, y que puede ser anormalmente estimula-
do por otros ligandos (9). Finalmente, aunque no produce un cuadro de pseudoher-
mafroditismo, es también relevante la demostración de que la anormal expansión de
una determinada región de poliglutaminas en el primer exón (dominio de transacti-
vación) del RA es la causante de la atrofia muscular espino-bulbar ligada al sexo
(síndrome de Kennedy ) (11).
En pacientes con mutaciones en el RA existe un defecto de inhibición de la pro-
ducción hipofisaria de HL por la testosterona circulante. El patrón hormonal carac-
terístico incluye por tanto niveles plasmáticos elevados de HL, que produce un
excesivo nivel de testosterona y de estrógenos. La actividad del RA presente in vivo
en pacientes afectos de IA se comprueba de diversas formas, que incluyen el cálcu-
lo de la asociación máxima A-RA y de las constantes de asociación y disociación
(Bmax, la Kd) del andrógeno al RA, así como el cálculo de la termolabilidad de la
formación de los complejos A-RA. La mutación se demuestra, como en el caso de
los otros defectos genéticos, aislando el ADN de los exones/intrones del RA
mediante técnicas de PCR y por posterior secuenciación de los fragmentos ampli-
ficados. Por último, la introducción y expresión de la forma mutante del receptor en
células eucariontes (que no lo expresan espontáneamente) permite la demostración
final de la causalidad de la mutación.
El receptor de andrógenos es una proteína nuclear, que actúa como un factor de
transcripción, y que pertenece a la familia de los receptores esteroideos. Se trata de
una familia de proteínas que presentan una estructura similar. Están compuestas por
diferentes dominios que guardan una importante homología entre los distintos com-
ponentes de la familia: Un dominio carboxi-terminal para la unión a sus correspon-
dientes ligandos (dominio de unión hormonal), un dominio central, para la unión al
ADN (dominio de unión al ADN, con dos regiones «Zinc finger») a través de
secuencias específicas de reconocimiento que se encuentran en sus genes diana
(secuencias de reconocimiento esteroideo, SRE), y un dominio amino-terminal,
más variable, para la unión de diferentes factores de transcripción que modulan o
regulan su actividad (dominio de transactivación). Estos receptores actúan como
dímeros (en general homodímeros), o tetrámeros. Los receptores esteroideos se
encuentran normalmente en el núcleo de las células diana, donde las hormonas
esteroideas llegan por difusión a través de la membrana. La unión a sus ligandos
produce un cambio conformacional en los receptores, que exponen los sitios espe-
cíficos para dimerización y para unión al ADN, de forma que el receptor adquiere
así su forma activa, capaz de activar los genes que presenten sus SRE. Existen
modelos animales del síndrome de feminización testicular. En concreto las muta-
ciones del RA causantes de estos cuadros en rata (12) y en ratón (13) fueron descritas y
caracterizadas en el momento de identificarse la secuencia de los genes correspon-
dientes, y son representativas de dos de los posibles tipos y localizaciones de las
mutaciones humanas. En el caso del modelo de rata (12), la mutación se encuentra en
la región de unión al ligando, afecta a un residuo crítico en esta unión y produce un

cuadro de feminización, en presencia de una proteína con muy baja afinidad por sus
ligandos. Un buen número de las mutaciones descritas en humanos son semejantes
a ésta, aunque afectan a diferentes residuos de aminoácidos, lo que condiciona si se
mantiene una cierta actividad hormonal residual y el fenotipo correspondiente. En
el caso del modelo de ratón (13), la mutación se encuentra en la región amino-termi-
nal de transactivación de la proteína, y se trata de una deleción puntual de una base
que produce un corrimiento en el marco de lectura y origina una proteína truncada,
que carece de región de unión a la hormona y al ADN. Sin embargo, se ha demos-
trado que el ARN mensajero (ARNm) que presenta esta mutación es capaz de tra-
ducir una proteína más corta originada por iniciación interna de la traducción en un
lugar de la secuencia del ARNm posterior al codón de terminación. Este dato con-
cuerda con la descripción de una proteína RA más corta en el ratón Tfm y con el
hecho de que en sujetos normales se ha demostrado la presencia de una proteína RA
más corta, en cantidades muy inferiores a la forma completa, y con menor actividad
funcional (14). Estas mutaciones han sido también encontradas en humanos, aunque
el tipo (inserción o deleción con cambio en la fase e interrupción de lectura, o muta-
ción puntual con cambio de residuo) y posición de la mutación son variables, lo que
condiciona la actividad residual del RA y por tanto su fenotipo. De hecho, existe
una base de datos en la que se reflejan todas las mutaciones descritas en humanos
hasta la fecha, a la que se puede acceder por internet (15). En el caso de mutaciones
puntuales con cambio de residuo, si la mutación está en el dominio de transactiva-
ción la proteína resultante puede unir los ligandos normalmente y reconocer las
SRE en sus genes diana, pero no ser capaz de activarlos. Si la mutación está en el
dominio de unión a los ligandos o al ADN de sus genes diana, tampoco podrá acti-
varlos o lo hará ineficientemente. En el caso de proteínas truncadas, la posible acti-
vidad del RA dependerá de la presencia de la forma corta del RA, que a su vez solo
será posible si la mutación de parada se encuentra en el primer exón antes del lugar
de reiniciación interna.
Mutaciones de los genes implicados en la acción de la hormona

antimulleriana
En el feto masculino los derivados del conducto de Muller regresan durante la vida
fetal por acción de la MIS, producida por las células de Sertoli fetales. Los defectos
en el gen de esta hormona o en el de su receptor causan cuadros característicos en los
que estas estructuras han diferenciado hacia trompas y útero. Se trata de varones con
fenotipo externo masculino, que virilizan en la pubertad, pero que presentan adicio-
nalmente útero y trompas, y constituyen el llamado síndrome de conductos mulleria-
nos persistentes (16). Los testículos pueden ser intraabdominales o estar en el canal
inguinal, en el escroto o en hernias inguinales. Estos sujetos presentan niveles nor-
males de HL, testosterona y estrógenos. La enfermedad se produce en forma familiar
(autosómica recesiva) o por mutaciones esporádicas en sujetos sin historia familiar.
Recientemente se han descrito otras mutaciones que afectan la producción de

MIS. La transcripción de MIS está regulada positivamente por el receptor nuclear
SF-1 (steroidogenic factor-1). La unión de este factor al gen de MIS es activada a
su vez por el factor WT-1 (Wilms tumor inhibiting factor), e inhibida por acción del
factor DAX-1 (Dossage sensitive sex reversal gene 1). Defectos en los genes de los
factores SF-1 y WT-1 condicionan una menor transcripción de MIS.
El factor SF-1 controla también el desarrollo de los ejes hipotalámico-pituitario-
gonadal y adrenal, y su mutación produce en ambos sexos insuficiencia adrenal,
junto con el cuadro de pseudohermafroditismo masculino (17).
El gen WT-1 está compuesto por 10 exones que codifican una proteína con cua-
tro motivos «Zinc finger» con actividad reguladora transcripcional positiva de cier-
tos genes y reguladora negativa de tumores. Se pueden producir cuatro isoformas
por edición (splicing) diferencial, una de las cuales (producida edición alternativa
en el intrón 9) presenta tres aminoácidos extra entre dos de los dominios «Zinc
finger» (isoforma KTS). Las mutaciones en el gen WT-1 se asocian a patología
neoplásica (tumor de Wilms, mesotelioma, leucemias, carcinoma de mama) o no neo-
plásicas, dando lugar a cuadros sindrómicos característicos. Entre éstos destacare-
mos: 1) el Síndrome de Denys Drash, que asocia nefropatía mesangial difusa pre-
coz, con cuadros de pseudohermafroditismo masculino y tumor de Wilms y que está
ocasionado por mutaciones puntuales heterocigotas del gen WT-1, en los exones 8
y 9 (región Zinc finger 2 y 3), que producen proteínas truncadas que se comportan
como dominante negativo, como se demuestra en el modelo de ratón transgénico en
el que el animal heterocigoto reproduce la enfermedad (18); y 2) el Síndrome de
Frasier, que asocia glomeruloesclerosis focal-segmental, gonadoblastoma y pseu-
dohermafroditismo masculino, y que está ocasionado por mutaciones en el sitio de
edición del exón 9 de la proteína WT-1, impidiendo la producción de la forma KTS
de la proteína (19). Finalmente, se ha demostrado también la presencia de este tipo de
mutaciones del gen WT-1 en niñas heterocigotas que presentan cuadros de glome-
ruloesclerosis focal-segmental de aparición temprana (20).
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21
Patología molecular de la neoplasia
endocrina múltiple (MEN-1,
MEN-2A, MEN 2B) y del Carcinoma
medular de tiroides
M.a J. Lorenzo Benayas
Introducción
La neoplasia endocrina múltiple (MEN) (1) es un síndrome cancerígeno que se

caracteriza por la presencia de tumores en dos o más glándulas endocrinas en el
mismo paciente. En un principio se conocía con el nombre de adenopatia endo-
crina múltiple, pero debido a que algunos pacientes desarrollan verdaderos tumo-
res o hiperplasia de la glándula endocrina afectada, finalmente se denominó
MEN.
Existen dos tipos principales de neoplasia endocrina múltiple, la de tipo 1 (MEN
1) y la de tipo 2 (MEN 2) que se diferencian en las glándulas endocrinas afectadas
(Tabla 21.1). El MEN 1, también denominado síndrome de Wermer, se caracteriza
por el desarrollo de hiperplasia o tumores en las glándulas paratiroideas, en las
células de los islotes pancreáticos y en la pituitaria anterior (1,2). El MEN 1 se here-
da de una forma dominante, se localiza en el cromosoma 11q13 (3), y el gen respon-
sable se ha identificado recientemente (4). El MEN 2, también conocido con el nom-
bre de síndrome de Sipple, se caracteriza por la presencia de tumores en las células
C de tiroides (carcinomas medulares de tiroides, MTC), en la médula adrenal (feo-
cromocitomas, Pheo) e hiperplasia o adenomas de las paratiroides (PTH) (1,5). El gen
que predispone al MEN 2 es el proto-oncogen ret, localizado en el cromosoma
10q11.2, que codifica a un receptor de membrana con actividad tirosina quinasa (5-
7). Aunque el MEN 1 y el MEN 2 son síndromes diferentes, en algunos pacientes se
ha descrito la presencia de tumores asociados a ambos síndromes, por ejemplo,

tumores pituitarios y feocromocitomas. No se sabe si esta coincidencia se debe al
azar (8) o si es un nuevo tipo de MEN “mixto”.
Tabla 21.1. Glándulas endocrinas afectadas en el síndrome MEN
MEN 1 MEN 2
Paratiroides Células C del tiroides

Pituitaria anterior Médula Adrenal
Islotes pancreáticos Paratiroides
Corteza adrenal
Neoplasia endocrina múltiple de tipo 1

Características clínicas
Las manifestaciones clínicas del MEN 1 se relacionan con la glándula en la que

se va a desarrollar la hiperplasia o los tumores y a sus productos de secreción (2,9,10).
El hiperparatiroidismo primario es la característica clínica más común y apare-
ce en más del 95 % de los pacientes con MEN 1.
La incidencia de tumores en las células de los islotes pancreáticos en pacientes
con MEN 1 varía de un 30 % a un 80 % dependiendo de las series de pacientes ana-
lizados. La mayoría de estos tumores producen cantidades excesivas de hormonas,
como por ejemplo, gastrina, insulina, glucagón o péptido intestinal vasoactivo
(VIP) y están asociados con distintos síndromes clínicos. Los tumores secretores de
gastrina, los gastrinomas, representan cerca del 50 % de los tumores de los islotes
pancreáticos asociados a MEN 1 y son la principal causa de muerte en pacientes con
MEN 1. Los tumores de las células secretores de insulina, los insulinomas, repre-
sentan el 30 % de todos los tumores pancreáticos que presentan los pacientes con
MEN 1. Y, en menor proporción, los pacientes con MEN 1 pueden también desa-
rrollar tumores secretores de glucagón, los glucagonomas; tumores secretores de
VIP, VIPomas y tumores secretores de polipéptido pancreático, Ppomas.
La incidencia de tumores pituitarios en pacientes con MEN 1 varia entre un 15%
a un 90 % dependiendo de la serie de pacientes estudiada (9). Aproximadamente el
60 % de los mismos secretan prolactina, el 25 % secretan hormona de crecimiento,
el 3 % secretan adrenocorticotropina y el resto son no funcionales.
Además de estos tumores, los pacientes con MEN 1 pueden desarrollar tumores
carcinoideos en el bronquio, tracto gastrointestinal, páncreas y timo; tumores en la
corteza adrenal, lipomas, tumores tiroideos, angiofibromas faciales y colagenomas.
Bases moleculares del MEN 1
El gen causante del MEN 1 está localizado en el cromosoma 11q13 (3). Es un gen
supresor de tumores, está formado por 10 exones con una región codificadora de
PATOLOGÍA MOLECULAR DE LA NEOPLASIA ENDOCRINA MÚLTIPLE 303
1830 pb y codifica a una proteína de 610 aminoácidos, a la que se ha denominado

MENIN4.
Hasta la fecha se han descrito 262 mutaciones diferentes en el gen responsable
del MEN 1 (11). El 56 % de estas mutaciones se deben a pequeñas delecciones o
inserciones, de las cuales el 48 % producen un desplazamiento en la pauta de lectu-
ra. El 22 % son mutaciones puntuales con cambio de sentido y el 5 %, restante, se
caracterizan por ser mutaciones que modifican los sitios de corte y empalme. El
75 % de estas mutaciones producen la inactivación del gen, lo que sugiere que el
gen responsable del MEN 1 es un gen supresor de tumores. Por otra parte, las muta-
ciones presentes en el gen MEN 1 no sólo se caracterizan por ser muy diversas sino
también por encontrarse muy repartidas a lo largo del gen.
Diferentes estudios clínicos han puesto de manifiesto que no existe una correla-
ción entre las diferentes mutaciones presentes en el gen MEN 1 y las manifestacio-
nes clínicas asociadas al MEN 1. Así, por ejemplo, un estudio realizado en 5 fami-
lias con MEN 1, caracterizadas por la presencia de la misma mutación en el gen
MEN 1 (una delección de 4 pares de bases en los codones 210 y 211), demostró que
aunque todos los miembros de las diferentes familias desarrollaron tumores de las
paratiroides, sólo los miembros de las familias 1, 3, 4 y 5 desarrollaban gastrinomas,
mientras que los miembros de la familia 2 desarrollaban insulinomas. Por otra parte,
toda las familias, excepto la 1, presentaban prolactinomas, mientras que sólo los
miembros de la familia 1 desarrollaron tumores carcinoideos. Por otra parte, tam-
bién se ha mostrado que miembros pertenecientes a una misma familia pueden
desarrollar tumores diferentes.
La proteína MENIN
El gen causante del MEN 1 codifica a una proteína denominada MENIN for-
mada por 610 aminoácidos, de localización nuclear (12) y de función desconocida. La
mayoría de las mutaciones en el gen MEN 1 originan proteínas MENIN truncadas,
es decir, más cortas e inactivas, y carentes de las señales de localización nuclear pre-
sentes en el extremo carboxilo terminal. Como ya hemos mencionado la función de
la proteína MENIN se desconoce, pero su localización nuclear hace pensar que esta
proteína tenga un papel cómo regulador de la transcripción o que intervenga en la
replicación del DNA o en el ciclo celular.
Detección del MEN 1
Aunque el MEN 1 es una enfermedad poco común, su diagnóstico es importan-

te ya que al heredarse de una forma autosómica dominante el 50 % de la descen-
dencia de un paciente con MEN 1 tiene la probabilidad de desarrollar la enferme-
dad. Aunque se puede realizar el análisis genético del MEN 1 para identificar a los
individuos portadores de la mutación y, en consecuencia, con un elevado riesgo de
padecer la enfermedad, la ausencia aparente de correlación entre el genotipo y el

fenotipo, junto con la gran diversidad de mutaciones presentes en la región codifi-
cadora del gen MEN 1 hace que el análisis mutacional para el diagnóstico de MEN
1 no se esté llevando a cabo. En consecuencia, su diagnóstico se está realizando
mediante estudios clínicos, bioquímicos y radiológicos.
Neoplasia endocrina múltiple de tipo 2
Características clínicas
La neoplasia endocrina múltiple de tipo 2 (MEN 2) es un síndrome cancerígeno

que se hereda de una forma autosómica dominante y que se caracteriza por la pre-
sencia de tumores y de anomalías en el desarrollo en cuatro tejidos diferentes: las
células “C” del tiroides, la médula adrenal, las paratiroides y el plexo nervioso
autonómico intestinal.
Dependiendo del tejido afectado, el MEN 2 se ha subdividido en tres varieda-
des clínicas diferentes, el MEN 2A, el MEN 2B y el cáncer medular de tiroides
familiar (FMTC) (5,13) Tabla 21.2. El MEN 2A se caracteriza por la presencia tumo-
res en las células “c” del tiroides denominados carcinomas medulares de tiroides
(MTC), en las células de la médula adrenal denominados feocromocitomas
(PHEO) y por el desarrollo de hiperplasia o adenomas de las paratiroides (PTH).
El MEN 2B se caracteriza por la presencia de MTC, de PHEO y de determinadas
anomalías asociadas al desarrollo Tabla 21.2. Finalmente, el FMTC se caracteri-
za sólo por la presencia de MTC. Todos los pacientes con MEN 2 desarrollan
MTC. Los feocromocitomas se desarrollan en un 50 % de los pacientes con MEN
2A y MEN 2B y solo un 25 % de los pacientes con MEN 2A desarrollan hiperpa-
ratiroidismo.
Tabla 21.2. Variedades clínicas del MEN 2
Tumores asociados Fenotipo
MEN 2A MEN 2B FMTC
MTC + + +
PHEO + (50 %) + (50 %) –
PTH + (25 %) – –
AD – + –
* Hiperplasis del ganglio entérico, neuromas de la mucosa oral y conjuntiva. anomalias mús-
culoesqueléticas.
Bases moleculares del MEN 2
El gen causante del MEN 2 es el proto-oncogen ret que se encuentra localizado

en el cromosoma 10q11.26. Mutaciones germinales en el proto-oncogen ret se han
encontrado en la mayoría de los pacientes con MEN2 (6,7,14,15).
El proto-oncogen ret está formado por 21 exones y codifica a un receptor de
membrana con actividad tirosina quinasa denominado RET (Fig. 21.1). RET está
formado por una región extracelular, una región transmembrana y una región intra-
celular. La región extracelular se caracteriza por poseer un dominio de homología a
cadherinas (Cad) y una región rica en el aminoácido cisteina (Cys). La región intra-
celular contiene el dominio con actividad tirosina quinasa, que se encuentra dividi-
do en dos regiones TKa y TKb mediante un pequeño péptido formado por 28 ami-
noácidos.
Estudios clínicos ponen claramente de manifiesto que las variedades clínicas del
MEN 2 están fuertemente asociadas a diferentes mutaciones puntuales presentes en
el proto-oncogen ret, que producen la sustitución de aminoácidos específicos. Todas
las mutaciones son dominantes a escala celular y producen la activación constituti-
va del receptor (16).
Codón Mutado Variedad Clínica
Cad
MEN 2A MEN 2B FMTC
609, 611, 618,

Cys
620, 630, 631, 634 98% (634) - 88%
TM
TKa
768,790/791,
804,844,891 - - + (4%)
TKb 883 - 3% -
918 - 94% -
Figura 21.1. Características principales de la proteína codificada por el proto-oncogen ret y loca-
licación de las mutaciones germinales en las diferentes variedades clínicas del MEN 2. Cad,
dominio parecido a cadherinas; Cys, región rica en cisteinas; TM, región transmembrana; TK,
dominio con actividad tirosina quinasa
Las mutaciones presentes en el proto-oncogen ret se pueden dividir en tres gru-

pos (Fig. 21.1):
a) Mutaciones que afectan a los residuos de cisteínas, presentes en el dominio
extracelular del receptor, y que están codificadas por los codones 609, 611,
618, 620, 630 y 634. Estas mutaciones son las responsables del 98 % de los
casos de MEN 2A y de la gran mayoría de los casos de FMTC.
b) Mutaciones que afectan a los codones 768, 790, 791, 804, 844 y 891, pre-
sentes en el dominio con actividad tirosina quinasa del receptor y que son res-
ponsables de aproximadamente un 4% de los casos de FMTC.
c) Mutaciones que afectan a los codones 883 y 918, presentes también en el
dominio con actividad tirosina quinasa del receptor, y que están asociadas
exclusivamente a pacientes con MEN 2B.
Efectos de las mutaciones de ret en el MEN 2
Estudios bioquímicos y moleculares utilizando construcciones de DNA que con-

tenían el gen ret normal y el mutado en el MEN 2A (Cys 634 Arg) o en el MEN 2B
(Met 918 Thr) han puesto de manifiesto que estas mutaciones conducen a la acti-
vación constitutiva del receptor (16,17).
Las mutaciones en cisteinas presentes en el MEN 2A activan al receptor porque
causan la dimerización del mismo en ausencia del ligando (16,17). Estudios clínicos,
muestran que existe una gran correlación entre el codón de cisteina mutado y el
fenotipo asociado al MEN 2A (14). De hecho, las mutaciones que implican al codón
634 están presentes en la mayoría de los pacientes con MEN 2A que desarrollan,
además de MTC, feocromocitomas e hiperplasia de las paratiroides, mientras que
mutaciones presentes en los codones 609, 611, 618 y 620 son más frecuentes en
familias con MEN 2A que desarrollan MTC e hiperplasia de las paratiroides o en
familias con FMTC.
Las mutaciones presentes en el dominio tirosina quinasa de ret , también activan
al receptor en ausencia del ligando, pero en este caso no producen la dimerización
constitutiva del mismo (16,17), sino que conducen a cambios en su conformación res-
ponsables de su activación. La mutación Met 918 Thr, que tiene lugar en la mayo-
ría de los pacientes con MEN 2B, no sólo activa de forma constitutiva al receptor,
sino que también cambia su especificidad por el sustrato (18). Así, se ha comprobado
que RET 2B fosforila de forma preferente a sustratos específicos de proteínas cito-
sólicas con actividad tirosina quinasa, mientras que el RET normal fosforila a sus-
tratos específicos de receptores de membrana con actividad tirosina quinasa (18).
Aunque en la actualidad no se conoce el por qué diferentes mutaciones en ret
están asociadas a diferentes fenotipos, se piensa que puede ser debido a uno o varios
de estos mecanismos:
a) Activan a RET con diferente intensidad.
b) Activan a RET en un tiempo erróneo.
c) Activan a RET en un tejido no adecuado.

d) Activan rutas de transducción de señales diferentes.
De hecho, estudios realizados in vitro sugieren que el fenotipo asociado a

pacientes con FMTC puede estar relacionado con una pequeña activación del recep-
tor, capaz de inducir solamente el desarrollo de MTC. Por otra parte, se ha descrito
que las mutaciones presentes en pacientes con MEN 2A y MEN 2B son capaces de
producir una gran activación del receptor, lo que induciría posiblemente la aparición
de feocromocitomas en estos pacientes. Finalmente, las anomalías asociadas al
desarrollo presentes en pacientes con MEN 2B se explicarían por la capacidad que
tiene el receptor mutado, RET 2B, de activar nuevas rutas de señalización. Lo que
carece de explicación es la ausencia de hiperparatiroidismo en pacientes con MEN
2B.
Detección del MEN 2
Ya que el número de mutaciones distintas en ret responsables del MEN 2 son

pequeñas, el análisis genético es el método más efectivo y menos invasivo para
detectar a los portadores genéticos asintomáticos (19,20), siendo éste el método de
diagnóstico que se utiliza preferentemente en clínica. Siempre se aconseja que el
análisis genético se realice a niños de corta edad.
Con la realización de este test genético, los miembros no portadores de la muta-
ción, así como sus descendientes, podrán ser excluidos de los estudios bioquímicos
a los que tienen que ser periódicamente sometidos todos los miembros pertene-
cientes a familias con un historial de MEN 2 claramente definido. Por otra parte, los
portadores genéticos se considerarán de alto riego de desarrollar un MTC, y estarán
sujetos a las decisiones médicas pertinentes.
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22
Mecanismos moleculares implicados
en el hipotiroidismo congénito.
Terapia génica en enfermedades
tiroideas
Pilar Santisteban
Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo

congénito
El hipotiroidismo congénito primario es una enfermedad con una incidencia de

1/ 3.000-4.000 recién nacidos. Antes de 1974, el hipotiroidismo congénito era una
de las causas más frecuentes de retraso mental en los niños. La introducción de pro-
gramas de screening ha llevado al diagnóstico precoz y al tratamiento con hormo-
nas tiroideas con la consiguiente reducción del daño mental. Todos los casos de
hipotiroidismo congénito cursan con niveles elevados de tirotropina (TSH) como
consecuencia de la producción de niveles reducidos de hormonas tiroideas. Aunque
existen casos de hipotiroidismo congénito causados por defectos hipotalámicos o
hipofisarios, en esta revisión nos vamos a centrar sólo en las alteraciones de la pro-
pia glándula y más concretamente en la disgenesia tiroidea ya que el 85% de los
casos de hipotiroidismo congénito son debidos a este problema. Dentro de los casos
de disgenesia, un 35-40% corresponde a ausencia de la glándula (agenesia tiroidea),
un 30-45% a una glándula pequeña y situada sublingualmente (ectopia tiroidea) y
en un 5% la glándula es extremadamente pequeña (hipoplasia tiroidea). La mayo-
ría de estos casos son esporádicos, aunque se han descrito algunos casos de disge-
nesia hereditaria familiar.
Los fenotipos observados en la disgenesia sugieren como causa principal alte-
raciones en la organogénesis de la glándula tiroidea. La morfogénesis de esta glán-
dula comienza con la formación de un brote de origen endodermal en la región pos-
terior del suelo de la faringe. Esta formación, que va a dar lugar a las células
foliculares productoras de hormonas tiroideas, migra dorso-caudalmente hasta
alcanzar la pared anterior de la tráquea, donde emerge con otros tipos celulares.
Como causas más específicas de la disgenesia se han definido las alteraciones en el
desarrollo del tiroides y las alteraciones en los genes que afectan a la síntesis de las
hormonas tiroideas.
El conocimiento que se tiene actualmente sobre las causas de las disgenesias
tiroideas ha surgido como consecuencia de la identificación y clonación de los
genes que codifican por los factores de transcripción tiroideos. Para entender la
implicación de estas proteínas en la morfogénesis tiroidea vamos a dividir este tra-
bajo en tres apartados: 1) Factores de transcripción específicos de tiroides, 2) Su
expresión durante el desarrollo de la glándula tiroidea, 3) Función de los factores de
transcripción tiroideos: Generación de ratones knock-out y 4) Factores de trans-
cripción tiroideos en el hipotiroidismo congénito.
Factores de transcripción específicos de tiroides
Los factores de transcripción son proteínas nucleares cuya función es esencial

en la regulación de la expresión génica uniéndose a secuencias específicas de ADN
en los promotores de los genes que regulan. Tres factores de transcripción específi-
cos de tejido tiroideo han sido identificados y clonados (1-3). Estos factores deno-
minados Thyroid Transcription Factor 1, 2 (TTF-1, TTF-2) y Pax-8 se unen a
secuencias de ADN de los promotores de los genes tiroideos Tiroglobulina (Tg),
Peroxidasa Tiroidea (TPO), Receptor de TSH (TSH-R) y el transportador de yodo
dependiente de sodio (Sodium Iodide Symporter o NIS) (Fig.1). Su característica
más importante es que son genes homeóticos que pertenecen a familias de proteí-
nas con dominios de unión al ADN muy conservados y que tienen una importancia
decisiva en procesos de desarrollo, proliferación y diferenciación celular.
1. Factor de transcripción TTF-1
Este factor de transcripción tiroideo fue el primero en clonarse (1). Se une a los
promotores de los genes Tg, TPO, TSH-R y NIS activando su transcripción
(Fig.22.1). Por ello su expresión es decisiva para que estos genes se expresen en las
células foliculares tiroideas. Aunque inicialmente se identificó solo en tiroides (1),
hoy se sabe que se expresa también en las células parafoliculares (células C) y en las
paratiroideas (4), en el cerebro embrionario de rata y en el pulmón embrionario y
adulto (5, 6). El hecho de que este factor se expresase en otros tejidos, hizo a los inves-
tigadores de las distintas áreas estudiar más en detalle su función. En las células C
regula la expresión del gen de la calcitonina y se ha descrito como un posible sen-
sor de calcio (7). La función extratiroidea más importante de este factor es la que ejer-
ce en el pulmón. Se ha demostrado que este factor se une a los promotores de los
genes que codifican por las proteínas surfactantes de pulmón (SP) A, B y C y por la
proteína secretada por las células de la Clara (CCSP) activando su transcripción (6).
MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN EL HIPOTIROIDISMO… 311
Pax-8 +1
–1950 –170 –100
A TATAAAA Tg
UF
TTF-1 TTF-1 TTF-1 TTF-2 TTF-1

Pax-8 Pax-8 +1
–5500 –5200 –150 –120 –90 –60 –30
NF-1 TATATG TPO
TTF-1 TTF-1 TTF-2 TTF-1

HNF3`
–68
–4200 –3100 –210 –200 –100
TSH-R
TTF-1 TTF-1 IRE TTF-1 CREB

TTF-1 TTF-1 SSBPs
+1
–2495 CREL-BF –2260 –550 –420 –245 –124
AATATAT rNIS
Pax-8 Pax-8 NTF-1 TTF-1
A
UF TTF-1 NF-1 TTF-2 Pax-8
CREB NTF-1 CREL-BF IRE SSBPs
Figura 22.1. Representación esquemática de los promotores de los genes tiroideos Tiroglobulina
(Tg), Peroxidasa Tiroidea (TPO), Receptor de TSH (TSH-R) y Transportador de yodo (NIS). Se indi-
can las posiciones a las que se unen tanto los factores de transcripción específicos de tiroides
(TTF-1, TTF-2 y Pax-8) como factores ubicuos (UFA, NF-1) y factores dependientes de la inducción
por insulina (IRE) o AMPc (CREL-BF y CREB). Para mas información véase referencias 9 y 20.
El desarrollo proximal del tiroides y el pulmón, junto con su procedencia común de

origen endodérmico, sugiere que la expresión de TTF-1 pueda ser la respuesta a una
activación posicional específica del endodermo anterior. El gen del factor TTF-1 es
un gen homeo-box que se ha denominado Tift -1 y que se localiza en el cromosoma
14 humano y en el cromosoma 2 de ratón.
2. Factor de transcripción TTF-2
El factor TTF-2, a diferencia de TTF-1, se une y transcribe sólo los genes de Tg y

TPO (Fig.1). Su clonación (2) y los diferentes estudios de expresión han indicado que
este factor se expresa en el tiroides embrionario y adulto solo en las células foliculares
y no en las células C. También se expresa, durante el desarrollo embrionario, en la hipó-
fisis anterior. El gen del factor TTF-2 es un gen de la familia fork-head que se ha deno-
minado Tift-2 y se localiza en el cromosoma 9 humano y en el cromosoma 4 de ratón.
3. Factor de transcripción Pax-8
Este factor se une a los promotores de Tg, TPO y NIS, compartiendo las
secuencias de unión con TTF-1 (Fig.22.1). Además de en tejido tiroideo, se
expresa en el sistema nervioso central durante el desarrollo embrionario y en el

sistema excretor (riñón) de embriones y adultos. Al igual que TTF-2, el gen Pax-
8 no se expresa en las células C del tiroides. El gen del factor Pax-8, es un gen
paired-box que se localiza en el cromosoma 2 humano y en el cromosoma 2 de
ratón.
Desarrollo de la glándula tiroidea y expresión de TTF-1, TTF-2 y Pax-8
Como se comentó en la introducción, las células foliculares tiroideas proceden

de la invaginación del endodermo faringeo a partir del día 8-8.5 del desarrollo
embrionario del ratón y de la rata (8). El primordio tiroideo migra hasta alcanzar su
destino final delante de la traquea entre los días 13-14 del desarrollo embrionario de
ambos animales. Solamente en el día 15 embrionario (E15), una vez completado el
proceso de migración, las células foliculares se diferencian y comienza a detectar-
se la función tiroidea.
Los estudios de expresión de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en rata, demuestran que
estos factores se expresan muy al comienzo de la morfogénesis tiroidea en el día
embrionario (E) 8.5, en aquellas células epiteliales cilíndricas que forman una
invaginación en el suelo de la faringe primitiva al nivel del primer y segundo arco
branquial y que posteriormente proliferan y migran hacia abajo. Sin embargo, en
contraste con la aparición temprana de los anteriores factores, la expresión de sus
genes dianas Tg, TPO, TSH-R y NIS aparece varios días después en el día embrio-
nario E15 (5). Así podemos decir que la expresión de los factores de transcripción
específicos de tiroides antecede a la expresión de los marcadores específicos de la
función tiroidea. Ello les ha definido como los genes responsable no solo en la
organogénesis del tiroides sino también de los procesos de diferenciación (9). El
retraso temporal entre la expresión de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 y la de sus genes
diana durante el desarrollo del tiroides en la rata sugiere que deben de existir otra
serie de eventos adicionales, aún no identificados, que ayuden a la determinación
del fenotipo tiroideo diferenciado. Esos eventos deben ocurrir entre los días E13 y
E15.
En humanos, el proceso de organogénesis también está bien definido y en la
Tabla 22.1 se recoge un resumen del conocimiento que se tiene actualmente sobre
la expresión de los anteriores factores de transcripción y el proceso de organogéne-
sis [tomado de Macchia et al. (10)].
Función de los factores de transcripción tiroideos:

Generación de ratones knock-out
El estudio de la función de estos factores in vivo ha sido consecuencia de la

reciente generación de ratones knock-out. Generando ratones en los que se anula
la expresión de los factores de transcripción tiroideos se puede conocer su fun-
Tabla 21.1. Organogénesis del tiroide.
Estado embrionario Genes Diferenciación

Ratón Humano Formación TTF-1 Pax-8 TTF-2 tiroideos funcional
E 8.5 20 d Formación de la bolsa primitiva tiroidea – – – – –
E 9.5 28 d Migración + + + – –
E 11.5 6-7 s Supervivencia/Proliferación de las células precursoras + + + – –
E 15.5 8s Final de la migración. Inicio de las funciones diferenciadas + + + + +
E 17.5 13-14 s Expansión de la población de células diferenciadas + + (+?) + +
Expresión de los factores de transcripción tiroideos durante la organogénesis del tiroides. E: Estado embrionario. d: día, s: semana. Los genes tiroideos son Tg, TPO, TSH-R y
NIS. La expresión de los factores de transcipción se ha estudiado sólo en ratón. La interrogación significa que en el caso de TTF-2 quedan estudios por hacer y que se ha descri-
to una down-regulación en ese periodo embrionario (Ref. 2) de la que aún no se conoce en detalle su significado.
MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN EL HIPOTIROIDISMO…
313
ción estudiando el fenotipo del ratón al que se le ha anulado el gen motivo de

estudio.
Así la generación de un ratón en el que el gen del factor TTF-1 se ha anulado
(knock-out de TTF-1) (11) ha indicado la importancia decisiva de este factor en la
morfogénesis del tiroides. El ratón homocigoto nulo para TTF-1 (Tift1 -/-) presen-
ta agenesia de tiroides y falta total de desarrollo pulmonar con desarrollo anormal
de las áreas ventrales del cerebro y ausencia de hipófisis. El animal se desarrolla en
el útero materno y muere al nacer por falta de proteínas surfactante y por tanto inca-
pacidad para respirar. La agenesia de tiroides, tanto de células foliculares como
parafoliculares, demuestra la importancia decisiva de esta factor en el desarrollo del
tiroides.
De la misma manera, la generación de un ratón en el que se ha anulado la expre-
sión de Pax-8 (Pax-8 -/-) ha indicado que esta factor es decisivo en la formación de
las células foliculares y que no afecta al desarrollo de las células parafoliculares. Su
expresión es siempre concomitante con la de TTF-1. El fenotipo de los ratones
knock-out de Pax-8 muestra un retraso en el crecimiento y son hipotiroideos. Los
animales cuando nacen presentan hipoplasia tiroidea y no se detectan folículos,
muriendo al destete (12). Si durante las primeras semanas después del nacimiento se
les administra hormonas tiroideas la vida de las camadas se alarga varias semanas
más.
Finalmente la generación de un ratón nulo para TTF-2 (Titf2 -/-) demuestra que
la función de este factor es la de controlar la migración del primordio tiroideo desde
su posición sublingual inicial hasta su posición final en la traquea reprimiendo la
diferenciación final de las células tiroideas hasta que la migración haya tenido lugar.
Hay que destacar que los ratones nulos para este factor de transcripción presenta
disgenesia tiroidea (tanto ectopia como agenesia) y además paladar hendido, lo que
les impide succionar durante la lactancia y mueren por falta de alimentación (13).
Factores de transcripción tiroideos en el hipotiroidismo congénito
En los últimos años se ha estudiado la implicación de los factores de transcrip-

ción en patología tiroidea humana, tanto en trastornos hereditarios de la génesis
glandular como en procesos de malignización y desdiferenciación tiroideos.
La premisa de que TTF-1 era el principal regulador de la transcripción de Tg
llevó a estudiar su posible participación patogénica en un caso familiar de bocio
congénito por defecto de síntesis de Tg. Es bien conocido que los bocios congéni-
tos son muchas veces consecuencia de defectos en el gen de Tg. Sin embargo, se ha
puesto de manifiesto otra de las causas posibles de la bociogénesis congénita: la
expresión reducida del factor de transcripción TTF-1 (14). La paciente portadora de
este defecto, estudiada a los 15 años por primera vez, presentaba un bocio de carac-
terísticas compresivas e hipotiroidismo. Su desarrollo físico y mental habían sido,
sin embargo, normales. Dos hermanos presentaban una clínica similar, lo que suge-
ría una naturaleza recesiva de la enfermedad. Los estudios bioquímicos y molecu-
lares del tejido tiroideo demostraron niveles muy reducidos del ARN mensajero de
Tg junto a niveles virtualmente indetectables de TTF-1. Se comprobó, además, la
incapacidad de las proteínas nucleares de este tejido para unirse a la secuencia con-
senso para el factor TTF-1 en el promotor de Tg. De forma compensatoria y a tra-
vés del efecto estimulador de la TSH, los niveles de expresión de TPO se encontra-
ban muy elevados. Si bien las causas moleculares últimas de la falta de expresión
de TTF-1 no fueron determinadas. Este trabajo establece que los defectos de trans-
cripción tiroideos pueden ser la causa de trastornos dishormonogénicos, como lo es
el defecto de síntesis de Tg y no solo de defectos de disgenesia tiroidea.
También se ha publicado que la haploinsuficiencia de TTF-1 (deleción de 1 de
los 2 alelos del gen) origina una disfunción tiroidea leve junto a distrés respiratorio
neonatal (15). El recién nacido, que presentaba una glándula in situ de tamaño nor-
mal, era eutiroideo pero mantenía niveles de TSH elevados, por lo que recibió tra-
tamiento sustitutivo. El problema respiratorio neonatal con infecciones y atelecta-
sias pulmonares durante la infancia, se explica por una síntesis disminuida de
proteínas surfactantes del pulmón, de las que TTF-1 es un potente inductor.
Son varios los trabajos que se han comenzado con objeto de estudiar el posible
papel de TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en los trastornos disgenésicos del tiroides que con-
ducen a hipotiroidismo congénito. Como acabamos de explicar, el estudio del feno-
tipo tiroideo de los ratones a los que se ha delecionado artificialmente cada uno de
estos factores de transcripción ha demostrado que los tres desempeñan un papel
esencial en la morfogénesis del tiroides (11-13). Por este motivo y gracias al conoci-
miento actual de la secuencia completa de los genes que codifican tanto TTF-1
como Pax-8 y TTF-2, se ha comenzado el screening de mutaciones en casos de dis-
genesia tiroidea (agenesias, ectopias e hipoplasias) detectados en el screening neo-
natal del hipotiroidismo congénito. La técnica utilizada es el SSCP o detección de
polimorfismos conformacionales en el ADN de cadena simple. Los primeros resul-
tados en relación a TTF-1 han sido negativos en un total de 76 pacientes incluidos
en 2 estudios distintos (16, 17).
Sin embargo, recientemente se ha comunicado que mutaciones en el gen de
Pax-8 son la causa de algunos casos de ectopia tiroidea e hipoplasia (18). Se estudia-
ron 149 pacientes con hipotiroidismo congénito y 120 controles. Uno de los pacien-
tes con hipoplasia y tiroides sublingual presentaba niveles altos de TSH y normales
de T4. Los niveles de Tg circulante eran altos lo que sugería un defecto en la orga-
nización folicular del tiroides. Era heterocigoto para una mutación en el codon 108
del exon 3 del gen Pax-8. Esta mutación crea un codon de terminación (stop codon)
lo que predice la síntesis de una proteína truncada que contiene solo los 100 prime-
ros aminoácidos del dominio paired de la proteína Pax-8. Es una mutación de novo
ya que ni los padres ni los hermanos la presentaban. Un segundo paciente con hipo-
plasia tiroidea, altos niveles de TSH y bajos de T4 era heterocigoto para una muta-
ción en el codón 31 del exón 2 de gen Pax-8. Los demás miembros de la familia no
estaban afectados y eran homocigotos para el codón del gen normal. Finalmente se
ha descrito tres miembros de una familia afectados de hipoplasia severa que tienen
la misma mutación en el codón 62.
Todas estas mutaciones conducen a una proteína Pax-8 no funcional incapaz de

unirse a los promotores de los genes Tg y TPO y por tanto incapaz de transcribir-
los. El 100% de concordancia entre las mutaciones de Pax-8 y la existencia de dis-
genesia (18) sugiere un papel causal de este gen en el hipotiroidismo congénito aun-
que en una minoría de los casos examinados (5 de 149).
Se ha publicado recientemente, en dos hermanos no gemelos, la primera muta-
ción de TTF-2 (19). Estos hermanos presentan además de agenesia de tiroides, pala-
dar hendido, atresia bilateral de coanas, epiglotis bífida y cabello "erizado". Los
padres eran sanos y no estaban emparentados entre si. Al recibir T4 desde el naci-
miento el desarrollo físico e intelectual eran normales. La mutación detectada es una
mutación sin sentido (misssense mutation) en el nucleótido 196 del codón 65 del
gen humano de TTF-2. Este codón da lugar a un aminoácido muy conservado en el
dominio forkhead de unión al ADN de la proteína TTF-2. Esta mutación da lugar a
una proteína TTF-2 no funcional incapaz de unirse y transcribir a los promotores de
los genes que regula (Tg y TPO). Hay una relación causal entre ésta mutación y la
agenesia de los pacientes, siendo esta causa genética de agenesia la primera y única
descrita hasta el momento.
La identificación y caracterización de esta serie de factores de transcripción que
participan en la génesis inicial del tiroides abre el camino hacia el conocimiento
detallado del complejo programa de expresión de genes necesarios para la forma-
ción y maduración funcional de la glándula tiroidea.
En conclusión, los trabajos resumidos en esta revisión sugieren que el hiporti-
roidismo congénito puede ser una enfermedad hereditaria. Además teniendo en
cuenta los estudios de las mutaciones encontradas en los factores de transcripción
TTF-1, TTF-2 y Pax-8 en pacientes con hipotiroidismo congénito, junto con la
generación de las lineas de ratones en las que se ha anulado la expresión de estos
genes hace pensar en una estrecha relación entre estos factores como causa del
hipotiroidismo congénito. Aunque es obvio que faltan por clonar nuevos genes y
realizar nuevos estudios para aclarar el origen de esta enfermedad. Otro aspecto que
deberá estudiarse en un futuro próximo es el origen multigénico de esta enferme-
dad. Esta hipótesis está siendo estudiada originando lineas de ratones que son hete-
rocigotos múltiples para alelos nulos de Titf1, Titf2 y Pax8, ninguno de los cuales en
heterocigosis produce fenotipo anormal tiroideo.
B. Terapia génica en enfermedades tiroideas

Uno de los objetivos más actuales en terapias génicas para el tratamiento de car-
cinomas es la búsqueda de nuevas aproximaciones experimentales que impliquen la
menor toxicidad posible. Los cánceres con alta recurrencia después de tratamientos
con radio- o quimioterapìa representan clínicamente un reto para la búsqueda de
nuevas terapias. En este sentido se tiende a desarrollar tratamientos más localizados
y efectivos que sustituyan a tratamientos más tóxicos que puedan afectar al orga-
nismo entero. Para conseguir este objetivo, se están explorando aproximaciones
moleculares basadas en transferencia selectiva a células tumorales de genes tera-

péuticos o de promotores específicos para localizar la expresión del transgen en
células tumorales. Estas aproximaciones experimentales están en fase de desarrollo
con resultados muy prometedores.
Actualmente se está desarrollando una nueva terapia basada en el uso del gen
tiroideo NIS. Este gen codifica por la proteína responsable de la captación de
yodo, una característica específica de la célula epitelial tiroidea y el primer paso
en la síntesis y secreción de hormonas tiroideas (20). Tras la clonación en 1995 de
este transportador (21), el estudio de la expresión de este gen y su uso en terapia
génica han revolucionado muchos aspectos de esta tecnología. La expresión de
este gen se describió inicialmente como específica de tejido tiroideo, aunque se
ha demostrado posteriormente que también se expresa en la glándula salival,
mamaria y en la mucosa gástrica (20). Basándose en la función de la proteína NIS
de captar iodo, estudios muy recientes han estado encaminados a la sobre-expre-
sión del transportador NIS en células tumorales y tratarlas posteriormente con
I123 o con Tecnecio Tc99 para diagnóstico por imagen. Adicionalmente, si la
expresión de NIS en células tumorales puede exceder a la expresión existente en
células tiroideas diferenciadas, la acumulación de I 131 puede resultar en más de
50.000 cGy de dosis de radiación ionizante. De esta forma la radioterapia con I 131
debería eliminar específicamente las células que expresan el transportador de
iodo.
Con esta idea trabajos recientes han expresado el tranportador NIS en células
tumorales de varios orígenes (melanoma, mama, colon etc.) obteniendo resultados
muy prometedores. La forma de expresión de NIS ha sido usando vectores retrovi-
rales (22) o adenovirales (23). Ambos tipos de vectores tienen ventajas e inconvenien-
tes, aunque actualmente el uso de ambos está bien aceptado. Con el uso de estos
vectores se han expresado altas concentraciones de NIS en células tumorales com-
probándose que dichas células captaban iodo radiactivo. De esta manera se ha podi-
do hacer un seguimiento por imagen del tumor, tras inyección de las células que
sobre-expresan NIS a ratones atímicos y posteriormente se han tratado los anima-
les con I131 con resultados muy prometedores en cuanto a la desaparición de tumo-
res que sobre-expresan NIS (22, 23).
Este tipo de terapia se ha usado, como se ha mencionado, en varios tipos celu-
lares (22, 23) y puede ser también usada en células tumorales tiroideas. Una parte de
los tumores diferenciados de tiroides retienen cierta capacidad de concentrar yodo,
lo que permite el uso de radioyodo como tratamiento para los pacientes que pre-
sentan cáncer recurrente y metastásico. Sin embargo, un alto porcentaje de los
tumores de tiroides diferenciados, así como los dediferenciados, pierden la capaci-
dad de concentrar yodo. Este hecho reduce considerablemente las posibilidades de
ser tratados de forma efectiva. Por ello se está usando también en cáncer de tiroides,
la terapia alternativa de sobre-expresión de NIS con el uso de vectores virales, aun-
que no hay de momento trabajos publicados al respecto.
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Índice analítico
ERRNVPHGLFRVRUJ
5-alfa-reductuasa-2, 294 III, 20
mutaciones del gen, 295 replicación, 15, 16
Ácidos, superenrollamiento, 8
desoxirribonucleico,1 vectores de, 183
nucleicos, 1, 2 ADNasa I, 157
Ribonucleico mensajero, 1 ADNcopia (ADNc), 158, 162, 163, 176,
Activación 182, 183, 185
de los aminoácidos, 57 ADNcs, 157, 158, 168
génica, 107 ADNdc, 157, 158, 168, 173, 182, 184,
Activator-Recruited Cofactor (ARC), 51 185
Actividad ADNpol I, 158
estrella, 159 ADNr, 142, 143, 144, 155, 155, 156, 181,
peptidiltransferasa, 62 190, 216
Activinas, 238 Aminoácidos, activación de los, 57
Adaptadores de policlonaje, 184 AMV polimerasa, 162
ADN, 1, 69 AN,
circular, 167 de cadena doble, 168, 169
conformaciones del, 7 de cadena simple, 168
copia, 162 secuanciación, 172
de cadena sencilla, 167, 170 Andrógenos, déficit enzimáticos en la bio-
de doble cadena, 163, 167 síntesis, 292
desenrollamiento, 8 Anemia de Fanconi, 250
dominio de unión al, 72 Aneuploidías, 150
estructura dimensional del, 7 Animales transgénicos, 223
exonucleasa, 161 Anomalías postreceptor de GH, 252
ligasa, 162, 186 Antibióticos, 62
lineal, 167 Anticuerpos, 90
mitocondrial, 13 antiinsulina, 95
polimerasa(s), 22, 157, 178 antitiroideos, 97
de T7, 161 contra células de los islotes (ICA), 95
I, 157, 161 monoclonales, 142, 144
Antígeno, 83, 84 Biorreactores, 198

mayor de histocompatibilidad (MHC), airlift, 199
238 de fibra hueca, 200
T, 237 de lecho fluido, 201
Antioncogenes, 108 Biosíntesis de proteínas, 59
Apoptosis, 115, 117, 119, 120, 124 Botellas rodantes, 222
ARC (Activator-Recruited Cofactor), 51 BrEt, 178
ARN, Bromuro de etidio, 166, 168, 169, 170
clases de, 28 BTK, 244
de cadena
mixta, 158
sencilla, 170 Cáncer, 99
simple, 157, 158 de colón familiar, 111
de transferencia (ARNt), 29, 35, 55, 56, CAP (Catabolite gene Activator Protein), 49
57, 59, 60 Carcinoma medular de tiroides, 301
procesamiento, 36 Caspasas, 120, 125
degradación del, 39 Catabolite gene Activator Protein (CAP),
estructura, 27 49
mensajero (ARNm), 1, 29, 30, 55, 56, 59 Cebador, 162, 163, 174
molde, 162 Cebadores, 175, 178
poliadenilado, 167 Célula(s),
polimerasa, 42, 43, 163 B16, 149
II, 43, 46, 51, 131 beta,
procesamiento del, 29 artificiales, 280
ribosómico (ARNr), 1, 29, 37 clonación tarapéutica y diferenciación,
transferencia (ARNt), 1 284
transporte del, 39 obtenidas a partir de células madre
ARN molde, 162 embrionarias, 285
ARNasa trasplante de, 285
H, 162 C127, 216
I, 176 CHO (Chinese Hamster Ovary), 145, 222
P, 176 citolíticas naturales, 82
T1, 176 de origen tumoral, ingeniería de, 280
U2, 176 dependientes de anclaje (ADC), 150
ARNdc, 168 diana, 137
ARNpol, 160 eucariotas, 63, 148
ARNpolia, 163 eucarióticas de mamífero, 189
Autotolerancia, 81 hospedadoras, 187, 190
Azul de metileno, 168 musculares, 76
pluripotenciales mesenquimales, 137
Bacillus subtilis, 188 CHO, 146
Bacteriófagos, 184, 185 Citosinas, 82
Bad, 122 Citocromo c, 121, 122, 126, 176
Batch, 204, 205 Citoquinas, 100, 123
record, 212 Clonaje, 181
Bax, 121, 122, 123 posicional, 176
Bc12, 121, 122, 123, 125, 126 Cloranfenicol, 63
BCLR, 90 Cluster de la GH, 245
BCLRL (receptor de la célula B), 84 Coactivadores, 51, 53
Bclxl, 121 Código genético, 55, 56, 189
ÍNDICE ANALÍTICO 323
Codón, 55, 59, 60, 171 genética,

Codones, 56, 62 de hormona de crecimiento, 244
Complejo Déficit de 21 hidroxilasa, 290
de Golgi, 66 Deleción clonal, 91
de iniciación, 59, 60 Desenrollamiento del ADN, 8
principal de histocompatibilidad (MHC), Desnaturalización, 178
86, 93 Diabetes mellitus,
Concatameros, 234 terapia celular, 279
Conformaciones del ADN, 7 tipo I, 95
Control, Dietil-aminoetil-sephadex (DEAE), 201
de la actividad proteica, 70 Diferenciación,
de la degradación de los ARNm, 70 celular, 69, 73
de la transcripción, 70 etapa de, 77
del procesamiento postranscripcional, 70 Dimerización de proteínas, 73
del transporte de los ARN mensajeros, 70 dominio de, 72
traducional, 70 Displasia, septo-óptica, 250
Correpresores, 51 Dominio de transactivación AF-2, 51, 53
Cósmidos, 184, 185 Dominio Visagra, 51
Cre-loxP, 234 Downstream, 217, 220, 222
Cremallera de leucina, 72 DRIP (vitamine D Receptor Interacting
Cribado, 190 Proteins), 51
Cromatina, 10, 22, 131
Cromatografía,
de filtración molecular, 220 E. coli, 157
de intercambio iónico, 220 ECOtPA, 146
Cultivo(s), 151 EGF, 149
batch EGTA; 158
alimentado, 152 Elastasa pancreática del tipo I, 236
o discontinuo, 151 Electroporación, 186
semi-continuo, 152 Endonucleasa, 158, 159, 161
continuo, 151, 152 de ADN, 157
in vitro, 147 de restricción, 158
procariotas, 195 Enfermedades,
autoinmunes, 94
de Graves, 97
DAGH, tiroideas, terapia génica, 316
11, 247 Enhancers, 229, 239
1A, 246 Envejecimiento, 13
1B, 247 Enzima(s),
IA, 246 de restricción, 158, 159, 160, 173
IB, 247 de tipo II, 159, 182
II, 247 Sau3A, 182
III, 247 inmovilizadas, 144
Dedos de zinc, 72 T4 polinucleótido, 176
Deficiencia, quinasa, 173, 176
aislada de GH familiar, 246 Er, importación al, 65
combinada de hormonas hipofisarias, 248 Eritromicina, 63
de 21-OH, 263 Eritropoyetina, 177
análisis genético molecular, 274 Escherichia coli, 145, 188
diagnóstico prenatal, 275 Estado estacionario, 152
Estreptomicina, 63 de la esteroide 21-hidroxilasa,

Estructura dimensional del ADN, 7 análisis indirecto, 269
Estudios farmacogenómicos, 177 resultados y discusión, 270
Eucariotas, 45, 53, 57 de la somatostatina, 245
Exo III, 158 del factor de transcripción hipofisario
Exones, 156 número 1, 246
Exonucleasa(s), 157, 158, 161 del receptor de GHRH, 243, 246
5 ‘flecha 3’, 161 estructural, 223
III, 157 eucarióticos, 130, 156
h, 157, 158 GHI, 243
Expresión génica, 70, 73 mutadores, 112
Extensión, 178 p53, 111, 112
procarióticos, 156
Rb9, 110
SHOX; 254
Factor(es)
supresores, 108
IX, 142
tiroideo NIS, 317
VIII, 142
Genotecas, 145, 162, 182, 183
VIII, 143
de ADNc, 182, 183
de crecimiento epidérmico (EGF), 189
GMP (Good Manufacturing Practices),
de transcripción, 77, 104, 310
191, 211
Pax-8, 311
Golgi, complejo de, 66
TTF-2, 311
Gonadotropina coriónica, 291
TFII-B, 46
déficit de respuesta testicular a la, 291
de coagulación, 143
Graves, enfermedad de, 97
de crecimiento, 103, 149
Guía de fabricación, 212
receptores de, 103
de progresión, 100
de terminación, 62
Harvest, 218, 220, 222
musculares reguladores, 77
Helicasa(s), 17, 19, 24
FADD (Fas activating death domain), 119,
Hélice-bucle-hélice, 72
120
Hélice-giro-hélice, 71
Fago h, 157, 185
Hemoglobina, 176
Fagocitos, 82
Heterocariosis, 150
Fanconi, anemia de, 250
HGH, 143, 146
Fas activating death domain (FADD), 119,
Hibridación, 168, 169, 170, 172, 174, 178,
120
179
Fibroblastos, 74
de los AN, 191
Fibrosis quística, 129
Hipercrecimiento, 243
Fragmento Klenow, 158
Hiperplasia adrenal congénita, 263, 268,
de la ADNpol I Secuenasa, 161, 174
290, 292
tratamiento, 268
Hipocrecimiento, 243, 244
Gen(es), de origen prenatal, 254
APC, 111 por anomalías en genes de los gonoso-
de GHRH, 245 mas, 253
de IGF-I, deleción del, 253 por resistencia genética a la hormona de
de la 21-hidroxilasa, en población espa- crecimiento, 251
ñola, 268 Hipotiroidismo congénito, 309
de la 21-OH, 265 terapia génica, 309
Histona(s), 10, 21 Klenow, fragmento, 158

acetilasa, 22 Knock-out, 224, 238
desacetilasa, 22 de Pax-8, 314
HLA, 87, 92 de TTF-1, 314
Holoenzima, 42, 44
Holoprosencefalia, 249
Hormona(s) Layout, 203
antimülleriana, 297 Lentivirus, 134, 135
mutaciones de los genes implicados en Leucemia,
la acción de la, 297 linfoblástica aguda, 108
de crecimiento, 177, 243, 243 mieloide crónica, 108
deficiencia genética, 244 Levaduras, 189
hipocrecimiento por resistencia genéti- Ligasas, 159, 164
ca a la, 251 de ADN, 159, 163
recombinante, 216 Linfocitos, 93
hipofisarias, B, 85, 86, 88, 90
deficiencia combinada, 248 T, 74, 86, 87, 89, 90, 95
luteinizante, 291 T citotóxicos, 123
déficit de respuesta testicular, 291 T y B, 83
tiroideas, 49, 72, 309 Linfoma de Burkitt, 107
Hospedadores, Liposomas,
eucarióticos, 189 aniónicos, 187
procarióticos, 188 catiónicos, 187
Lisosomas, importación a los, 66
ICAM-1, 92
IGF, 149 MAP quinasas, 106
IGF-I, resistencia a, 253 Marcadores fenotípicos de selección, 184
Importinas, 65 Master cell bank, 192, 217
Inflamación, 82 Mastocitos, 82
Información genética, 6 Matriz nuclear, 22
Ingeniería de células de origen tumoral, MCB, 217
280 Médula ósea, 84, 93, 137, 139
Inhibina, 238 MEF-2 (Myocyte Enhancer Factor 2), 77
Inmunidad, MEFs (muscle Enhacer Binding Factors),
adaptativa, 82, 88 78
adquirida, 81 MEN 1,
innata, 81, 88, 90 bases moleculares del, 302
Inmunodeficiencia severa combinada de tipo I, 302
(SCID)- X1, 129, 137 MEN 2, bases moleculares, 305
Inmunoglobulinas, 82, 84, 107 Metástasis, 100
Insulina, 142, 143, 146, 176, 177 MhC (complejo principal de histocompati-
producción en otros tejidos, 281 bilidad), 87, 93
Interacción hidrofóbica, 220 Microcarriers, 200
Interferón _ humano, 189 Microinyección pronuclear, 223
Interferones, 176, 177 Microportadores, 200
Interruptores moleculares, 70-71 Microsatélites, 113
Intrones, 33, 156, 188 Mioblastos, 76, 77
Isosquizómeros, 160 MioD, 74, 77, 78
Miogénesis, etapas de, 75 Peroxinitrito, 125, 126

Miogenina, 77, 78 Pfu polimerasa, 162
mitocondrias, importación a las, 65 Pigmeos, 253
MMLV polimerasa, 162 Plásmidos, 184, 185
Mrf4, 77 Poli-A polimerasa, 163, 176
Mrf4, 78 I, 16
Multitray, 200 II, 16
Muscle Enhancer Binding Factors (MEFs), III, 16, 19
78 Polimerasa(s), 15, 16, 162
Mutágenos, 101 5 ‘flecha 3’, 161
Myf5, 77, 78 I, 16
Myocyte Enhancer Factor 2 (MEF-2), 77 II, 16, 19
de ácidos nucleicos, 189
de ADN (ADNpol), 160
Naranja de acridina, 168 de AN, 162
Necrosis, 115 eucarióticas, 23
Neogénesis de islotes, 283 termorresistentes, 162
Neoplasia endocrina múltiple, (MEN) Polinucleosomas, 22
de tipo 1, 302, 304 Primers, 178
de tipo 2, 304 cebadores, 183
patología molecular, 301 Procariotas, 57
NIS, 310 Poliferación/migración,
NO, 125, 126 etapa de, 77
sintasas, 124 Promotores, 163, 229, 239
Normas Proteínas, 55
GMP, 192 antiapoptóticas, 104
USP, 202 biosíntesis de, 59
Northern, 168, 170 con homeodominio, 71
Nucleasa(s), 157 del complemento (CR), 82
BA131, 158 dimerización de, 73
SI, 157 reguladoras, 75
Núcleo, importación al, 65 transportadoras de péptidos, 89
Nucleosoma(s), 10, 21, 22, 117, 131 Tus, 20
Proto-oncogén(es), 99, 101, 103, 105,
107
Oncogén(es), 99, 101, 102, 123 activación de, 105
c-H-ras, 236 ras, 236
supresores, 109 Providentia stuartii I (PstI), 160
Oncoproteína, 103 Pseudohermafroditismos,
Oncorretrovirus, 132, 135 aproximación genética, 289
Operón lactosa, 48 determinación y diferenciación sexual,
Óxido nítrico, 124 289
femenino, 290
masculino, 289
P53, 123 PstI (Providentia staurtii I), 160
Patología molecular, 263 Puromicina, 69
Pax-8, 310
PCR (Polymerase Chain Reaction), 11,
162, 175, 177, 178, 179, 205, 223 Quimeras, 234
PDGF, 149 Quimiostato, 152
Quinasas, Secuenasa, 161, 174

de ácidos nucleicos, 164 Secuenciación,
del fago T4 (T4 quinasa), 164 automática con fluorocromos, 175
de ácidos nucleicos, 172
del ADN, 175
Radioiodo, 317 del ARN, 175
Ratón(es), enzimática, 174
enanos Snell y Jackson, 248 por degradación enzimática, 176
knock-out, 234 por el método de degradación química,
nulo para TTF-2 (Titf2), 314 175, 176
Reacción en cadena de la polimerasa por el método enzimático, 175
(PCR), 11, 177, 179 por hibridación, 175
Receptor, Secuencias reguladoras, 223
del antígeno de las células T (TCR), 86 Selección clonal, 83
de retinoides, 50 Sensores biológicos, 144
interating protein (RIP), 119 SHOX, 244
Receptores, Síndrome(s),
nucleares, 50 de Aarskog, 251
huérfanos, 50 de Bloom, 251
Regeneración, 283 de conductos müllerianos persistentes, 297
Regulación, de Denys Drash, 298
de todo o nada, 203 de ectrodactilia-displasia ectodérmica-
PID, 203 labio leporino, 250
Regulación de la iniciación, 48 de feminización testicular, 290
Replicación del ADN, 15, 16 de Frasier, 298
Replisoma, 19 de insensibilidad primaria a la GH, 251-
Represores, 47 252
Respuesta inmunitaria, 83 de Laron, 251, 252
Retinoblastoma, 110 tipo b o c, 252
Retinoides, 149 de Morsier, 250
Retrovirus, 133 de resistencia primaria a la GH, 251
R-hFSH, 142, 222 de rieger, 250
R-hGH, 142, 221 de Russell-Silver, 254, 255
Ribonucleasa de Turner, 254
A (ARNasa A), 158 Sistema(s)
H (ARNasa H), 158 Cre/lox P, 224
T1, 176 de perfusión, 152
Ribosoma(s), 59, 63 HLA, 87
RIP (receptor interacting protein), 119 inmune, 81, 90, 99, 137, 139
RNA polymerase Associated Protein, 47 principal de histocompatibilidad (MHC),
Roller 87
bottles, 217 Sondas, 145
cell, 219 SOP (Standard Operating Procedures), 212
Southern, 168, 170, 191
blot, 223
Salmonella, 188 Spiracel, de Sterilin, 200
Sau3AI (staphilococus aureus cepa 3AI), Splicing de ARNm, 216
160 Standard Operating Procedures (SOP), 212
Screening, 190 Staphilococus aureus cepa 3AI (Sau3AI),
del ADN, 173 160
Subclonaje, 181, 183 Transducción, 187

Superenrollamientos del ADN, 8 Transferasa terminal, 157, 162
Sybr-Green, 168, 169, 178 Transferencia, 132
génica, 130
horizontal, 102
T3R_, 50 vertical, 102
T3R`, 50 Transformación,
Taq polimerasa, 162 con bacteriófagos, 186
TATA, 47, 131 con CaCl2, 186
TCR, 87, 90, 91, 92 con fosfato cálcico, 186
(Receptor del antígeno de las células), 86 Trasgén, 223
Telomerasa, 25 Trasgénico(s), 144, 229
Terapia génica, 129, 137, 139, 177 Transportador de yodo dependiente de
en enfermedades tiroideas, 316 sodio, 310
hipotiroidismo congénito, 309 Transportador NIS, 317
Terapia proteica, 177 TRAP (Thyroid hormone Associated
Termocicladores, 179 Proteins), 51
Testosterona, 294 Tripsinizaciones, 218
Tetraciclina, 63 TTF-2, 310
TFII Tth polimerasa, 162
A, 47
B, 47
Thermus aquaticus, 162 Upstream, 217, 222
Thyroid hormone receptor Associated Utilities, 203
Proteins (TRAP), 51
Thyroid receptors responsive elements, 50
Thyroid transcription factor, 310 Vector(es), 132, 133, 134, 139
Timo, 93 de ADN, 183
Tiroides, carcinoma medular de, 301 de clonaje, 183
TLCR, 86 de expresión, 183
TNF-RI associated death domain virales eucarióticos, 184
(TRADD), 119 virales para células eurcarióticas, 185
Tolerancia adaptativa, 90 Vent polimerasa, 162
Tolerancia B, 93 Virus eurcarióticos modificados, 185
Topoisomerasa(s), 9, 17 Virus SV40, 237
II, 19, 20
TRADD (TNF-RI associated death
domain), 119, 120 WCB, (working cell bank), 192, 217
Transcripción, 41, 131
inversa, 136
Transcriptasas reversas, 162 Xenotrasplante(s), 226, 227
Este libro es el resultado final de un curso sobre introducción a la biotecnología,
que tuvo lugar en la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense.
En el mismo se pretende hacer una puesta al día de los conceptos básicos de
la «nueva biotecnología» para los profesionales biosanitarios, dada la importancia
creciente que está adquiriendo esta ciencia. Como estos profesionales necesitan
refrescar y poner al día toda una serie de conocimientos, se realiza primeramente
un repaso a la bioquímica de los procesos que conducen a la síntesis proteica,
con un breve recuerdo a las bases de la información genética, con especial hincapié
en el ADN y su replicación, a la estructura del ARN, la traducción del mensaje
genético y la regulación del mismo. Ésta parte es necesaria para entender el
lenguaje del resto del contenido.
Para completar la primera parte del libro, hay un capítulo sobre el reconocimiento
de antígenos y los genes que los regulan, otro sobro oncogenes y genes mutadores,
otro sobre apóptosis y su regulación génica y finalmente, uno sobre las bases de
la terapia génica, que aunque en sus comienzos presenta grandes expectativas.
Todos los autores de ésta parte, son profesores de bioquímica y biología molecular
de la Facultad de Medicina de la Universidad Complutense y de la Universidad
Autónoma de Madrid.
En el segundo gran capítulo del libro, se hace una introducción a la biotecnología.
Hay dos lecciones sobre ingeniería genética y otras dos más sobre la producción
industrial de fármacos recombinantes. Estas lecciones están escritas por los
responsables de la planta de producción de GH, por técnicas de ADN recombinante
en células de mamíferos de Laboratorios Serono, en Madrid, con sobrada experiencia
pesonal en los temas que tratan.
La tercera parte del libro aborda las bases moleculares de las enfermedades
endocrinas y abarca, desde las técnicas generales para crear ratones transgénicos
o KO (aquellos en los que se elimina selectivamente algún gen de su genoma)
que permiten la constatación de las actividades potencialmente pleyotrópicas de
los mismos, a la descripción individualizada de los aspectos genéticos de una
serie de enfermedades endocrinas que comprenden desde las alteraciones del
crecimiento a la Hiperplasia Suprarrenal Congénita, la Diabetes Mellitus, los
pseudohermafroditismos, las Neoplasias Endocrinas Múltiples (MEN) y el hipotiroi-
dismo congénito.
ISBN 84-7978-543-8
9 788479 785437

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BIOTECNOLOGÍA APLICADA

«No está permitida la reproducción total o parcial de este libro,

© Jesús A. F.-Tresguerres, 2003

Ediciones Díaz de Santos, S. A.

Diseño de cubierta: Ángel Calvete

Alfredo Martínez Mogarra. Dpto. Isabel Roncero. Dpto. Bioquímica y

David Martínez-Selva. Unidad de Juan Miguel Ruiz Albusac. Dpto.

Francina Munell. Unidad de Inves- Bernat Soria Escoms. Instituto de

Tomás Pino. Unidad de Investigación Elena Vara. Dpto. Bioquímica y Bio-

José Regueiro. Dpto. Inmunología. José Manuel Varela. Servicio de Bio-

La biotecnología es la ciencia que se ocupa de la utilización de procesos bioló-

Genética molecular, con un interés clínico diagnóstico e ingeniería genética, con

1. Concepto de información genética. Ácidos nucleicos, estructura

Flujo de la información génica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

2. Replicación del ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3. Estructura y procesamiento del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4. Mecanismo de la transcripción: regulación de la iniciación . . . . . . . 41

5. Síntesis de proteínas: Traducción y transporte . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

6. Fundamentos de regulación de la expresión génica. Diferenciación

Regulación de la actividad de las proteínas reguladoras . . . . . . . . . . . . 75

7. Genes para la presentación y el reconocimiento de antígenos . . . . 81

8. Oncogenes. Proteínas tumorales. Mecanismos de activación de

Funciones de los proto-oncogenes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

Muerte celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

10. Terapia génica en células somáticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

Logro de la terapia génica en la inmunodeficiencia severa combinada

11. Introducción a la Biotecnología y generalidades sobre cultivos

12. La ingeniería genética I. Herramientas y Metodología . . . . . . . . . . . 155

Transcriptasas reversas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162

13. La ingeniería genética II. Proteínas recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 181

14. Producción industrial de fármacos recombinantes . . . . . . . . . . . . . . 195

Parámetros de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

16. Biología molecular y endocrinología: El ejemplo de los animales

18. Patología molecular de la hiperplasia suprarrenal congénita . . . . . 263

Análisis del gen de 21-OH en población española . . . . . . . . . . . . . . 270

19. Terapia celular de la diabetes mellitus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279

20. Aproximación genética a los pseudohermafroditismos . . . . . . . . . . 289

21. Patología molecular de la neoplasia endocrina múltiple

22. Mecanismos moleculares implicados en el hipotiroidismo

ÍNDICE ANALÍTICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

Flujo de la información génica

Figura 1.1. Características de la transferencia de información desde ADN a proteínas en célu-

La transferencia de la información génica es un proceso más sencillo en las

de pacientes intervenidos quirúrgicamente, a los que trató con ácido clorhídrico. El

Desoxiadenosina-5’-trifosfato (dATP) Desoxiadenosina-5’-trifosfato (dTTP)

El ADN como molécula portadora

El conocimiento que el ADN contiene la información genética es una adqui-

La estructura tridimensional del ADN muestra una

En 1953, James Watson y Francis Crick (3) describieron la estructura tridi-

Conformaciones del ADN

La conformación B-ADN descubierta por Watson y Crick (3) y citada en el párra-

de bases y bajo diferentes condiciones físicas se pueden encontrar las conforma-

Desenrollamiento y superenrollamientos del ADN

Hodgking se tratan con uno o más inhibidores de la topoisomerasa II acompañados

Aspectos estructurales y funcionales de la cromatina

Aspectos estructurales y funcionales del ADN

genómico. La utilización de sondas es un procedimiento de gran valor en el diag-

Características generales de la replicación

Figura 2.1. Inicio de la replicación del ADN.

Doble hebra de ADN original

Molde Molde de la hebra retardada

Una molécula de la holoenzima de la ADN polimerasa III cataliza la formación

disponibilidad de los sitios de unión a dnaA, así como la concentración de dnaA.