Inmunohistoquímica:

Bloqueos y artefactos en IHQ.

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Bloqueos y artefactos en IHQ

Bloqueos y artefactos en inmunohistoquímica.

La interpretación de los resultados en inmunohistoquímica involucra una serie de conocimientos más
allá de saber sobre la metodología. Es importante reconocer que hay diversos factores que se deben
considerar al evaluar una lámina, dentro de los que se encuentran el patrón de tinción de las células,
la especificidad, sensibilidad de los anticuerpos, la distribución de los antígenos en los tejidos y
los procesos previos a la Unión Ag-Ac como son la fijación y la recuperación de antígenos.

Selección de anticuerpos.
Existen 4 recursos que ayudan en la selección de anticuerpos para confeccionar nuestro panel de
laboratorio.
▪ Proveedor.
▪ Bases de datos en línea.
▪ Literatura publicada.
▪ Establecimientos como control de calidad.
Con respecto a los proveedores, hay una gran cantidad de ellos que vende reactivos confiables que se
validan por experiencia propia y recomendaciones de los distintos laboratorios que trabajan con ellos.
Sin embargo, hasta los mejores suministran anticuerpos caracterizados de forma incompleta o
incluso incorrecta.

¡Importante!
Por otra parte, los reactivos aprobados por FDA no necesariamente son mejores a los
no aprobados. Pero en algunas ocasiones es requerido seleccionarlos bajo este criterio.
Ahora bien, es importante recordar que la empresa siempre dirá que es la mejor, puesto que su
objetivo es vender. Así que depende del profesional, realizar la correcta elección en base a la función,
desventajas, recursos, etc.

Marcaciones inespecíficas.
Las marcaciones inespecíficas pueden ser provocadas por los siguientes factores:
▪ Tipo de tejido (tejidos muy hemorrágicos tienden a generar mayor fondo).
▪ Procesamiento pre-analítico.
▪ Proceso analítico.

Marcación falso-positiva.
Corresponde a la falsa identificación de la proteína o diana objetivo. Las causas más comunes
corresponden a:
▪ Fondo inespecífico.
▪ Enzimas endógenas.
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▪ Error en la concentración de anticuerpos.

▪ Pigmentos.
▪ Artefactos de corte y/o secado.
▪ Señales “pseudoespecíficas”.

Marcación falso-negativa.
Corresponde a la falta de marcación de la proteína objetivo o diana. Sus causas más comunes son:
▪ Mala fijación del tejido.
▪ Concentración de anticuerpo muy diluida o mal estandarizadas.
▪ Mala elección de recuperación antigénica.
▪ Uso de anticuerpo inapropiados o denaturados (con fallas de fabricación, tipo de clon o para
procedimiento inadecuado).
▪ Fijación deficiente con pérdida de antígenos o difusión de estos.
▪ Presencia de antígeno en una densidad menor a los niveles de detección de IHQ.
Con respecto a los falsos positivos y
negativos, es muy importante tener en cuenta
que la concentración elevada del
anticuerpo genera un efecto en la
reacción del anticuerpo en el tejido. Por
ejemplo, el carcinoma de pulmón no expresa
el factor de transcripción PAX-8, pero al
aumentar la concentración del anticuerpo
genera un patrón de tinción nuclear.
A. Adenocarcinoma de pulmón papilar.
B. 1:250 (recomendada).
C. 1:100.
D. 1:50.
E. 1:25 (patrón nuclear-citoplasmático).
F. 1:10 (patrón nuclear-citoplasmático).
Así como la concentración del anticuerpo
puede generar efectos inesperados,
marcación inespecífica y/o falsos resultados,
también lo hace una recuperación
antigénica deficiente.
Como ejemplo de lo anterior, podemos
observar un linfoma de células del manto y un
tumor de células pequeñas, los cuales fueron
recuperados en tiempos diferidos:
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▪ A y B: linfoma de células del manto marcado con ciclina D1. A: RA 20 min, citrato pH 6. B:
RA 30 min, Tris pH 10.
▪ C y D: tumor de células pequeñas marcado con TTF-1. C: RA 30 min, Tris pH 10; D: RA 8 min,
Citrato pH 6.

Marcación pseudoespecífica.
Es una caracterización de señal bastante restringida en un compartimento celular, pero en realidad
corresponde a un falso positivo.
La mayoría de los marcadores IHQ tienen una localización subcelular bien definida, pero existen
excepciones que se identifican en una localización subcelular inadecuada. Por ejemplo, la sinaptofisina
posee un patrón citoplasmático granular, pero puede generar uno de tipo nuclear pseudoespecífico.
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Fig. 1 Importancia de la identificación del compartimiento subcelular adecuado inmunoteñido

para identificar la señal falsa positiva "pseudoespecífica". (A) Señal apropiada
predominantemente membranosa en cáncer de mama infiltrante con anticuerpos contra el
receptor transmembrana HER2. (B) Señal citoplásmica granular apropiada en melanoma
con anticuerpo HMB-45, que identifica el marcador premelanosomal gp100. (C) Señal
nuclear apropiada en el carcinoma de pulmón con anticuerpos contra el factor de
transcripción nuclear TTF-1. (D) señal membranosa inapropiada observada con anticuerpos
contra la sinaptofisina en el adenocarcinoma de pulmón. Este anticuerpo debe producir una
señal citoplásmica granular, y este patrón "pseudoespecífica" representa claramente una
inmunotinción positiva falsa (aumento original × 200).

Tinción pseudoespecífica: Caso progesterona Clon SP2.

Un raro caso de tinción pseudoespecífica en el mismo compartimento ocurrió cuando se identificó una
señal falso-positiva de este clon (SP2) en tumores de receptor de progesterona negativo. Esto se
puede observar como tinción de intensidad leve a moderada, además de otros componentes que se
marcan.
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Por lo tanto, es importante revisar continuamente la literatura, ya que algunos reactivos que
presentan fallas aún son comercializados por las empresas.

Tinción de fondo no específica.

Generalmente representan uniones del anticuerpo al tejido por mecanismos distintos a la unión
paratope-epítope objetivo. Esto puede producirse por diversas causas que incluyen:
▪ Interacciones Ac 1° y 2° con proteínas séricas.
▪ Interacciones iónicas entre Ac-Tejidos.
▪ Interacciones de los sistemas de detección y moléculas endógenas.
Estas tinciones generan una gran cantidad de fondo o precipitado, llamado también ruido de
imagen, que interfiere en la interpretación y puede generar incapacidad para visualizar el antígeno de
interés en su ubicación celular apropiada. Esta señal generalmente se puede bloquear con cualquier
proteína que no tenga afinidad por el objetivo (antígeno buscado), previo a la incubación del
anticuerpo.

Algunos reactivos de bloqueo son: suero normal, gelatina y leche descremada (buena
calidad).

Interacciones hidrofóbicas inespecíficas.

Aunque las interacciones hidrofóbicas son esenciales en la unión Ag-Ac, estas fuerzas pueden
promover la unión no específica. La mayoría de las proteínas tienen algún grado de hidrofobicidad
debido a cadenas laterales neutras en varios aminoácidos. En cuanto a esto se recomienda:
▪ Evitar el suero normal o albúmina de suero bovino (BSA) porque reduce las uniones.
▪ La selección del suero es importante para evitar uniones con los Ac 1°.
▪ Actualmente, son poco utilizados los reactivos de bloqueo debido a que los Ac 1 y 2° traen
incluidos algún bloqueador en su composición.
▪ Los detergentes no iónicos también pueden reducir las interacciones hidrofóbicas inespecíficas.
▪ El suero debe ser idéntico a la especie del Ac 2° o una especie no relacionada con ninguno.

Tipos de buffer de bloqueo de proteínas.

Tipo de suero Características
En dilución 1-5% (p/v), contiene anticuerpos, albumina y otras proteínas
Suero normal que se unen a sitios reactivos inespecíficos y previene la unión con los
Ac 2°.
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No usar ya que bloquearía los sitios de unión inespecíficos para el Ac

Suero de especie de Ac 1° 1° pero sería reconocido por el Ac 2° junto a los anticuerpos
específicos-Ag diana.
Son reactivos individuales o incorporados en reactivos de Ac/Buffer
lavado.
▪ Contienen proteínas como BSA al 1-10%, gelatina o pueden ser
leche en polvo descremada (1-5% p/v).
▪ Son económicas.
▪ Están presentes en exceso a comparación del Ac por lo que
compiten con estos para unirse a sitios no específicos de la
Solución de proteínas muestra.

ES IMPORTANTE QUE ESTAS SOLUCIONES ESTÉN LIBRES DE

PRECIPITADOS O CONTAMINANTES QUE INTERFIERAN EN LA
DETECCIÓN IHQ

POSTERIOR A LA APLICACIÓN DEL BLOQUEO, SE ELIMINA EL

Buffer comerciales pre-
formulados
EXCESO Y SIN LAVAR, SE APLICA EL ANTICUERPO PRIMARIO.
Contienen gran cantidad de proteínas purificadas únicas o compuestas,
patentadas. Existen muchas opciones disponibles que funcionan mejor
que gelatina, caseína u otras.
PRESENTAN UNA MEJOR VIDA ÚTIL QUE LAS SOLUCIONES
CASERAS.

Fig. 2 Inmunohistoquímica CD14. (A) Anticuerpo policlonal CD14 anti-humano en amígdala humana, utilizando
protocolo de fábrica. (B) Bloqueo con suero animal durante 15 min a temperatura ambiente, previo a anticuerpo
primario.
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El bloqueo es posterior a la recuperación antigénica y bloqueo de peroxidasa endógena,

donde se realiza incubación entre 5 a 15 minutos. No requiere lavado por arrastre con
buffer, solo se debe sacar exceso.

Interacciones iónicas inespecíficas.

Estas interacciones ocurren por la carga neta opuesta que
existe entre el anticuerpo usado y el tejido estudiado,
generando el fondo. Las fuerzas de Van der Waals e
interacciones débiles tipo dipolo contribuyen al efecto.
El tampón diluyente del anticuerpo puede reducir las
interacciones. Pero la unión Ac-Ag depende de las mismas
fuerzas, por lo que grandes modificaciones de pH pueden
afectar la especificidad de la tinción.
Debido a la especificidad de la unión Ac-Ag, se ven más
afectados los Ac monoclonales que los policlonales.
Por lo general, son interacciones inespecíficas normales, a
niveles que no son influyentes para ser observados como fondo.
Solo cuando las diluciones del anticuerpo son muy bajas, es
decir son muy concentradas, se ve aumentada pudiendo
visualizarse en al microscopio.

Interacciones con enzimas endógenas.

Debido a que la técnica IHQ requiere métodos enzimáticos, siempre será necesario realizar un bloqueo
previo de las enzimas endógenas.

Enzima Descripción
Se encuentra en riñón, hígado, áreas hemorrágicas, etc. Los reactivos
de bloqueo son formulados con soluciones de peróxido de hidrógeno
Peroxidasa endógena en concentración de 3-10% y su objetivo es saturar la enzima
endógena.
Se encuentra en intestino, riñón, tejido linfoide, placenta, entre otros
y se bloquea con Levamisol 1-5 mM. La forma intestinal no se afecta
Fosfatasa alcalina por este bloqueo y se cambia por ácido acético al 1%. Los FFPE casi
endógena no la expresan y se elimina en el procesamiento, a excepción de
placenta e intestino. Los bloqueos son más empleados en el uso de
tejidos congelados.
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Se encuentra en hígado, riñón, corazón, cerebro y pulmón. El bloqueo

consiste en una incubación previa con estreptoavidina/avidina.
Biotina endógena Posterior a esto, se realiza una incubación adicional con biotina para
bloquear los sitios libres que quedan de la estreptoavidina. Luego se
realiza la incubación con el Ac 1°.

Fig. 3 Bloqueos de peroxidasa endógena. (A) Peroxidasa endógena sin bloquear en un corte de riñón. (B) Bloqueo
con peróxido de hidrógeno al 3% en metanol por 15 min, previo al anticuerpo primario.

Receptores Fc.
Se expresan en monocitos, macrófagos, células B,
células dendríticas, neutrófilos y plaquetas. Por lo
tanto, se encuentran en:
▪ Bazo, amígdalas, médula ósea y sangre de frotis.
▪ Similares a MHC, comprenden el 1% de las
proteínas de membrana.
No generan un artefacto de técnica, aunque existe
evidencia disímil, pero si generan un mayor fondo en
tejido congelado. Su bloqueo se basa en la utilización
de anticuerpos que sean solo porciones Fab o Fab’2 y
no inmunoglobulinas completas.
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Artefactos.
Los artefactos pueden ser provenientes del tejido y/o la manipulación previa a la técnica
inmunohistoquímica. Estos generan problemas en la interpretación. Algunos artefactos pueden ser:
▪ Desprendimiento de tejidos.
▪ Arrugas y manchas por altas temperaturas.
▪ Mala fijación.
▪ Burbujas de agua.
▪ Recuperación antigénica.
▪ Soluciones de cromógeno antiguas.
▪ Difusión incompleta del anticuerpo en el tejido.
▪ Pigmentos no bloqueados/eliminados.

Artefacto Descripción/Causas
Generan superposición del mismo sobre el resto del tejido, con una
consiguiente precipitación de cromógeno que puede ser mal interpretado o
impedir la visualización. Se puede producir por:
▪ Tejidos muy celulares.
Desprendimiento de
▪ Cortes gruesos.
tejidos ▪ Tejidos mal procesados.
▪ Temperaturas elevadas en la RA o tipo de proteólisis.
▪ Cortes mellados, con burbujas o mal adheridos (con agua residual
para el proceso de secado).
Se producen arrugas y manchas de fondo en corte de tejido debido a alta
Altas temperaturas exposición a temperatura con método RA en microondas con buffer EDTA
(pH 8.0). Ocurre con p53, por ejemplo.
Una pobre fijación o sobrefijación puede dar lugar a resultados falsos
positivos/negativos debido a la absorción pasiva de la proteína sérica y la
difusión del antígeno. Dichos falsos positivos son comunes en el centro
de grandes bloques de tejido o en todos los tejidos en los que se retrasó
la fijación.
Mala fijación El artefacto técnico por mala fijación del tejido que da como resultado
cortes incompletos, fragmentación e impedimento de visualización. Se
potencia con la RA que ocurre a altas temperaturas.

LA FIJACIÓN INCOMPLETA PUEDE GENERAR INMUNOMARCAJE

INCOMPLETO POR PÉRDIDA DE ANTÍGENOS.
Esto puede generar artefactos producto de los cambios de temperatura y
Recuperación también las atas temperaturas que involucra el proceso. Si se compara a
antigénica Dako y Ventana en este proceso, se tiene que:
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▪ Dako realiza en la recuperación antigénica con EDTA la

desparafinación con un detergente enzimático (pH 8.0 – 9.0 por 20
minutos a 97° C).
▪ Ventana® realiza desparafinación con detergente enzimático a 75°
C y posteriormente la recuperación con EDTA (pH 8.0 – 9.0) a 97°
C entre 8-90 minutos.
La presencia de burbujas de agua mal secadas puede producir artefactos ya
Burbujas de agua que los cortes al pasar por la estufa eliminan por evaporación el agua
dejando sectores vulnerables a desprendimiento por RA posterior.
Sucede con mezclas de DAB+H2O2 sobrantes de procedimientos
anteriores. Debidamente refrigerado puede utilizarse por hasta 2 semanas
Soluciones de posterior a la preparación, a menos que cambie su coloración de levemente
parda a turbia o violácea. En estos casos, cualquier proceso oxidativo del
cromógeno reactivo generará fondos de superposición sobre el tejido. Esto también
antiguas ocurre con preparaciones más concentradas del producto. Se observa como
un atrapamiento en el tejido, cuando los lavados posteriores a la aplicación
de DAB son deficientes.
En presencia de pigmentos que interfieran se puede emplear un cromógeno
de un color que permita la distinción de los pigmentos naturales. Por
Pigmentos ejemplo, Fast Red para diferenciar de melanina.
Por otro lado, se puede realizar un blanqueamiento previo al procedimiento
IHQ.

También se pueden producir artefactos por la difusión incompleta del anticuerpo en el tejido
(superficies no plana), desparafinación incompleta y burbujas en incubación con Ac 1°.

Fig. 4 Artefactos de IHQ. Se observan artefactos por burbujas de agua mal secadas, donde producto de la
evaporación del agua quedan sectores vulnerables al desprendimiento.
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Fig. 7 Artefactos en IHQ. (superior izquierda) Arrugas y manchas de fondo por exposición a altas temperaturas.
(superior derecha) Artefacto por mala fijación que resulta en cortes fragmentados. (inferiores) Recuperación
antigénica en Dako y Ventana.

Fig. 5 Artefactos en IHQ. (A) CD45 en amígdala, presenta difusión incompleta del anticuerpo en el tejido. (B)
CD45 en amígdala, presenta desparafinación incompleta. (C) CD20 en amígdala, presenta artefactos por
burbuja en incubación con anticuerpo primario.