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GENÉTICA
MOLECULAR 2012/2013
HUMANA
Segundo de Medicina 1ª
CONTENIDO
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
25. Traducción del mensaje genético. Características generales del código genético.
Particularidades del código genético mitocondrial. Relación codon-anticodon. Efecto de las
mutaciones en el DNA sobre la proteína traducida.
26. Estructura secundaria y propiedades funcionales del RNA de transferencia.
Mecanismos de acción de las aminoacil-tRNA sintetasas.
27. Síntesis ribosómica de la cadena peptídica: estructura y composición de los
ribosomas. Etapas de la traducción y factores proteicos de regulación implicados. Agentes
inhibidores de la traducción.
28. Metodología en Genética Molecular (VII): Utilización de plasmidos y fagos como
vectores de clonación y reconocimiento por tests de resistencia a antibioticos. Clonación
de organismos superiores.
29. Regulación de la transcripción de genes de tipo II. Factores de transcripción
inducibles (activadores y represores). Concepto y función de coactivador, correpresor,
complejo remodelador de la cromatina.
30. Modificaciones covalentes de las histonas y el DNA: Mecanismos generales de
activación y represión de la transcripción. Silenciamiento génico, impronta genómica,
formación de heterocromatina.
31. Papel como factores de transcripción de la superfamilia de receptores nucleares
para hormonas, vitaminas y metabolitos: Aspectos estructurales, familias, ligandos y
elementos de respuesta.
32. Mecanismos de regulación post-transcripcionales: Corte y empalme alternativo del
mRNA. Degradación del mRNA. Interferencia del RNA.
33. Regulación de la traducción a nivel de la iniciación: Fosforilación del factor eIF2.
Señalización a través del sistema mTOR: Activación de 4EBP, y S6 -quinasa.
34. Metodología en Genética Molecular (VIII): Utilización de plásmidos como
vectores de expresión: productos de DNA recombinante usados en medicina.
35. Metodología en Genética Molecular (IX): Terapia génica. Terapia con células
madre. Terapia con anticuerpos anti-receptor.
36. Genética metabólica. Regulación de la expresión génica de los enzimas del
metabolismo de carbohidratos y lipidos. Receptores y ligandos naturales o sintéticos
relacionados.
37. Regulación del crecimiento y proliferación celular. Cascadas de señalización. Papel
de las quinasas y GTPasas.
38. Mecanismos generales de transformación tumoral: Mecanismos de activación de
proto-oncogenes: oncogenes celulares y virales.
39. Inactivación de genes supresores de tumores y su incidencia en el control del ciclo
celular.
40. Bases moleculares de algunas enfermedades cancerosas: neurofibromatosis,
retinoblastoma. cancer de mama. cancer colorectal.
41. Bases moleculares de enfermedades relacionadas con defectos en receptores proteicos:
hipercolesterolemia familiar. Con defectos en proteínas estructurales: distrofia muscular de
Duchenne.
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ESTRUCTURA PRIMARIA
La forma “sin” es cuando la base está girada a la izquierda, mientras que la forma “anti”
es cuando está la base girada a la derecha.
El extremo 5`es la posición del fosfato colocado en el carbono 5`del nucleótido final. El
extremo 3`es la posición del OH en el carbono 3`del otro extremo. En un ácido nucleico
hablamos de 5`a 3`.
En los años 20 del siglo XX, LEVENE había determinado que la 2-desoxiribosa era el azúcar de
los nucleótidos del DNA. Pero se equivocó al decir que mientras el DNA animal contenía
nucleótidos de desoxiribosa, el vegetal contenía nucleotidos de ribosa.
Este modelo sugería moléculas monótonas y rígidas que dificílmente podrían transmitir la
información genética.
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El modelo para el DNA del Tetranucleotido plano de LEVENE empezó a ponerse en entredicho
cuando en 1950 CHARGAFF (1905-2002), en la Universidad de Columbia, describió sus leyes
de complementariedad de bases. Entre ellas:
El pionero en la aplicación de esta técnica a la estructura del DNA fue ASBURY en 1938,
indicando que parecía una fibra periódica con un espaciado regular de las bases de 0.33 nm.
Paralelamente PAULING había propuesto un modelo de triple hélice con los fosfatos hacia el
interior y las bases hacia fuera, con reminiscencias del modelo del Tetranucleótido.
Todos los pasos anteriores que acabamos de comentar, ayudaran a WATSON (1928- ) y CRICK
(1916-2004) (Universidad de Cambridge) a descubrir en 1953 la estructura secundaria del DNA.
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ENZIMAS NUCLEASAS
Son enzimas que hidrolizan los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos in vivo e in vitro.
Estas enzimas están presentes en todas las células de nuestro organismo. Su asentamiento
celular en los lisosomas. En mamíferos, el páncreas es un importante productor. Otro es el
intestino, donde llevan a cabo la digestión de los ácidos nucleicos de la dieta.
Clasificación principal:
- Desoxirribonucleasas (DNasas)
- Ribonucleasas (RNasas)
Los RNA, al ser cadenas simples, son más sensibles a la rotura de sus enlaces fosfodiester.
DESSOXIRRIBONUCLEASAS DNAasas
Hidrolizan los enlaces fosfodiester en el DNA. Si actúan sobre los enlaces externos se llaman
exonucleasas, sobre los internos endonucleasas.
5’-G†A-A-T-T-C- 3’
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1- Formas cruciformes
Se puede formar si tenemos una estructura secundaria.
Cuando se da un acercamiento de palíndromo o similar,
cuando los extremos son pseudopalindromicos, se
sustentaría la estructura de cruz por puentes de hidrogeno
entre bases complementarias, sin embargo hay partes en
las que no se pueden formar puentes de hidrogeno y se
abre.
2- Triples hélices
Pueden formar una triple hélice, las secuencias de DNA de
solo purinas, unidas a otras de solo pirimidinas, utilizando
además de las uniones de Watson-Crick, las uniones
Hoogsteen.
3- Superenrollamientos
Tipos de sobrenrollamiento:
- sobre proteínas: toroidal, espiral o de forma cilíndrica y con dos direcciones: dextrógiro que es
positivo o levógiro que es negativo.
- sobre sí mismo: plectonémico o interenroscado y también con dos direcciones pero con signos
al revés: dextrógiro que es negativo o levógiro que es positivo.
Nuestro DNA está en contacto con histonas (se enrollan sobre ellas) formando nucleosomas
tipo toroidal.
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Una molécula de DNA superenrollada es más compacta que una molécula de DNA relajada de
la misma longitud. Por tanto, cuando se somete p. ej. a electroforesis ó a centrifugación el DNA
superenrollado, se desplaza más rápidamente al fondo del gel en un caso o del tubo en otro, que
el DNA relajado.
La forma fisiológica es la superenrollada. En una electroforesis el DNA relajado se va a arriba y
el superenrollado se va abajo.
Nº DE GIROS DE UN DNA
Lk = Tw + Wr
Así, si queremos que Lk sea siempre 5
Sin superenrollamientos será:
5 = 5 (dex +) + 0 (DNA relajado)
Con superenrollamientos toroidales será p.e.:
5 = 2 (dex +) + 3 (dex +), es decir: [2+(3+)=5]
Con superenrollamientos plectonémicos será p.e.:
5 = 8 (dex +) + 3 (dex-), es decir: [8+(3-)=5]
A medida que bajo en una electroforesis, el Lk disminuye. Por eso arriba del todo estarán los
relajados, sin superenrollamientos.
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LAS TOPOISOMERASAS
Hemos dicho en el tema 1 que son desoxirribonucleasas-endonucleasas. Desenrollan el
DNA superenrollado eliminando superenrollamientos.
Las Top I: inducen roturas temporales en una hebra, lo que permite que la cadena no
cortada, pase a través de la rotura antes de que esta se repare. Se elimina un
superenrollamiento y se aumenta el nº de enlace (Lk) en 1.
Las Top II: inducen roturas temporales en ambas hebras a través de las cuales pasan un
segmento del DNA duplex no cortado antes de volver a sellar la rotura. Necesitan la
energía del ATP. Se eliminan dos superenrollamientos y se aumenta el nº de enlace en
2.
Así, las topoisomerasas cortan y reparan el DNA de manera continua hasta miles de
veces por segundo, dando lugar a topoisomeros mas desenrollados con un Lk más alto.
Lk = Tw + Wr
Ej: 32 = 32 + 0 DNA relajado
32 = 36 +4(-) DNA con 4 superenroll plect
Top I Top II
33 = 36+3(-) 34 =36+2(-)
El Lk aumenta en 1 El Lk aumenta en 2
Serán Topoisomeros entre sí, los DNAs que varían en el nº de enlace Lk, es decir los
aquí presentes con Lk: 32, 33 y 34.
TOP I
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TOP II
En todo caso se inhibe el desenrollamiento del DNA y su replicación, lo que lleva a causar
muerte celular o apoptósis.
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TEMA 3: ESTRUCTURA DE LA
CROMATINA
EL DNA PROCARIOTA
Recordemos que los procariotas no tienen núcleo y su DNA por tanto, no está delimitado en él.
El DNA de E. coli, es de doble hebra, circular y está superenrollado y comprimido formando un
complejo unido a un centro proteico llamado “nucleoide” a través de más de 40 sitios.
Este DNA tiene un tamaño de 4.639.221 pb ~4,6 x 10 6 pb (2 m) y 4.405 genes. Fue
secuenciado en 1997.
A diferencia de los procariotas que no tienen núcleo delimitado, los eucariotas si que poseen
núcleo delimitado por una membrana nuclear.
En ese núcleo y como sustancia amorfa dispersa en el, está la cromatina, que está formada por
una mezcla de DNA (35%), RNAa (5%) t proteínas (6%).
Las proteínas pueden ser del tipo histona: H1, H2A, H2B, H3, H4, o también del tipo no
histonico: como polimerasas de DNA y de RNA, topoisomerasas I, II; proteínas de regulación;
proteínas de citoesqueleto etc.
Por tanto es un DNA muy grande que además de estar superenrollado tiene que compactarse
con las proteínas histónicas formando estructuras de orden superior que veremos a continuación.
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Las histonas son de las proteínas eucariotas más conservadas de la célula lo que indica su papel
fundamental en el control de la estructura de la cromatina.
Hay 5 tipos de histonas. Son proteínas pequeñas (entre 11-15 de peso molecular salvo la H1 que
es casi el doble) con distinto número de residuos de aa. La composición de las mismas es
importante porque tienen un contenido de aa básico altos: la lisina y arginina.
Los tamaños de las histonas varían de una especie a otra. Realmente el tamaño de las histonas
varía muy poco.
Las proteínas histonas son sintetizadas en gran cantidad a partir de los múltiples genes que las
codifican como “genes de copias repetidas no en tandem”, que comentaremos en el tema 4.
En la replicación del DNA veremos que tanto las histonas viejas como las nuevas son repartidas
al azar entre las dos hebras del DNA, pero con muchas sutilezas….
Se forman dímeros por “apretón de manos”. La histona se retuerce con formato de hélice y con
esa conformación (conocido como formato alfa) permite que se formen dímeros entre H2A y
H2B, luego también H3 con H4.
La cola N-terminal es donde se acumulan los aa básicos. Estas colas al formar el nucleosoma
sobresalen y esas colas son las que contrarrestan la negatividad del esqueleto del DNA.
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Sobre esta unión se sitúa la H1 que es una histona de unión, las otras
se conocen como de nucleación.
ENSAMBLAJE DE UN NUCLEOSOMA
La H4 y la H3 que forman dos dímeros que en una primera fase dan lugar a un
tetrámero y es rodeado inicialmente por el DNA dejando libres a las colas de
las histonas y es después cuando la H2A y H2B formando 2 dímeros que
formarán un tetrámero y se introduce en el centro del nucleosoma y formando
el nucleosoma.
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Con estas cargas positivas las histonas se unen a los grupos fosfato negativos del DNA
contrarrestando su negatividad.
Pero a menudo las histonas resultan modificadas por metilaciones, acetilaciones, fosforilaciones
etc.
Así, en los temas 29-30 hablaremos de la acetilación de las lisinas de las histonas por la acción
de las enzimas acetilasas.
Pero adelantaremos, que estas enzimas acetilasas catalizan la transferencia de grupos acetilo
desde el acetil-CoA al NH3- terminal de los residuos de lisina. La adición de este grupo acetilo
genera un grupo amida sin carga. Este cambia sobre las lisinas, reduce drásticamente la afinidad
de todo el complejo de histonas hacia el DNA, facilitando su disoación.
También participan en el envolver y desenvolver, otras proteínas que son las remodeladores de
la cromatina que son proteínas de unión a DNA específica secundaria, al nucleosoma que
también afectación a la expresión de los genes.
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CARIOTIPO
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TEMA 4: CARACTERISTERÍSTICAS
GENERALES DE LA ORGANIZACIÓN
FUNCIONAL DEL ADN NUCLEAR Y
MITOCONDRIAL
GENOTIPO Y FENOTIPO
Otros contenidos de DNA. Los eucariotas siempre contienen mitocondrias, que poseen mtDNA,
distinto del genómico.
Otros contenidos de DNA: los procariotas muy a menudo contienen plásmidos, que son
pequeños DNA, distintos del DNA genómico.
En las bacterias, hay una serie de enzimas que se encargan de llevar a cabo de utilización de la
lactosa y en el genoma están los genes agrupados y regulados de forma metabólica. Las enzimas
del ciclo de Krebs están difusas y confusas entre los genes de nuestro organismo, sin embargo
en las bacterias esas enzimas próximas se encuentran agrupadas en los genes. Concepto de
operón.
En los eucariotas, el mRNA sólo sirve la producción de un tipo de proteínas, mientras que en las
bacterias es polistrónico y da lugar tras la transcripción para la producción de distintos tipos de
proteínas.
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Los intrones están solo en los genes eucariotas. En cuanto vemos intrones sabemos que es
eucariota. Los exones se nombran con número.
El DNA nuclear o genómico eucariota: 3,2 x 10^9pb, va a estar constituido por tres tipos de
elementos principales:
- Genes: 30%. Los genes que codifican para proteínas son como el 1,5%.
- Secuencias repetitivas: 45%.
- Otros elementos o zonas: 25%.
Tipos de genes:
- Genes de copia única o estructurales: suelen estar separados y cada uno codifica a un
mRNA que codifica a una proteína y suelen estar separados. Proporción 1,5%.
- Genes de muchas copias repetidas: suelen estar agrupados
o En tanden y se activan a la vez. Ej: los que codifican a los rRNAs.
o No en tanden sino con espaciadores. Ej: los que codifican a los tRNAs y a las
histonas. Estos últimos no poseen intrones. Proporción: 28%.
- Pseudogenes: carecen de intrones y se repiten moderadamente en el genoma, sin
función conocida. Proporción: 0,5%.
LOS PSEUDOGENES
Tenemos unos 20000 genes. Poseen una secuencia de nucleótidos muy parecida a la del gen
funcional pero que contiene muchas mutaciones que evitan su expresión adecuada.
1. Repeticiones en tanden (VNTRs) (DNA satélite) son múltiples copias dispuestas unas
a continuación de otras. La longitud varía desde 2 hasta 2000pb. Hay minisatélites de
25pb y microsatélites de 2-5pb. Son específicas de cada individuo y por ello se utilizan
como marcadores en investigaciones forenses o de enfermedades genéticas.
2. Repeticiones entremezcladas ampliamente (SINEs y LINEs) están dispersas por el
genoma. Muchas resultan de “transposición”: primero se duplican, a veces se
transcriben y después se mueven en el genoma como “transposones” (de origen viral y
móviles). Ej: secuencia Alu, 280pb, con 500000 copias.
3. Repeticiones en el centrómero: este elemento está en el centro del cromosoma e
interacciona con las fibras del huso durante la división celular. En el centrómero hay
una secuencia central de DNA muy repetida y rica en AT y asociada con proteínas no-
histónicas para formar el cinetocoro.
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4. Repeticiones en los telómeros: estas son regiones del ADN de los extremos de los
cromosomas que poseen una secuencia repetitiva no codificadora que retrasa la pérdida
de secuencias codificadoras durante la replicación del DNA. En humanos es la
secuencia: 5`TTAGGG3`y se repite unas 2000 veces, veremos su importancia en el
tema 6 de replicación telomérica. La enzima que la replica se llama telomerasa y su
alteración puede producir cáncer.
- Zona promotora o promotor: está situado delante de cada gen. Hay genes que tienen
más de un promotor.
- Zonas finales de los genes: son zonas que se transcriben pero no se traducen: 5`UTR y
3`UTR.
- Zonas de inicio de replicación: son zonas de reconocimiento para que se lleve a cabo
este proceso pero estas zonas no llegan a replicarse.
- Otras…
Un gen tiene exones, intrones entre medias, con la secuencia promotora o secuencia de DNA
reguladora. Los exones son los que por expresión darán lugar a las proteínas.
El gen más grande nuestro es como la cantidad de genes de un procariota. Pero el tamaño medio
de un gen es de 27000pb. El mínimo de exones es 1, pero el número máximo es de 178.
ESTUDIOS DE SINTÉNIA
Por ejemplo una parte del cromosoma humano 9 se relaciona con una
parte del cromosoma 2 del ratón etc.
LAS MITOCONDRIAS
Las mitocondrias son orgánulos semi-autónomos con maquinaria genética propia que sintetiza:
su mtDNA, sus RNAs (2 rRNA 16 y 23 S de tamaño, 22tRNA) y algunas proteínas propias.
Tienen un aspecto oval de unos 2 micras de longitud y 0,5 micras de diámetro y doble
membrana.
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La membrana externa contiene poros que pueden dejar pasar grandes moléculas.
El DNA genómico del núcleo puede traducirse a RNA. El núcleo envía su RNA al citoplasma
para el síntesis de proteínas, mientras que la mitocondria con su DNA da lugar a RNA y es
capaz la propia mitocondria de sintetizar unas 13 proteínas sin necesidad de que salgan los
ARNs al citoplasma. El resto de las proteínas que necesita las importa del citoplasma.
Cada mitocondria se reproduce por fisión binaria durante la división de la célula que la contiene.
Antes, su mtDNA se replica y las moléculas de mtDNA filiales se separan en dos mitocondrias
que se transfieren aleatoriamente a las células hijas.
El origen del mtDNA es desconocido podrían ser vestigios del DNA de bacterias ancestrales
que invadieron el citoplasma de la células y se convirtieron…
EL mtDNA humano
El mtDNA humano es de doble hebra circular de 16560pb y 37 genes. De estos genes, 28 están
localizados en la denominada cadena pesada H, y los otros 9, en la denominada cadena L.
De los 37 genes:
- Hay 2 genes que codifican 2 rRNAs de 23S y 16S y están situados exclusivamente en la
cadena H.
- Otros 22 genes codifican 22tRNAs y están repartidos entre las dos hebras.
- Los restantes 13 genes, codifican 13 mRNAs que van a producir proteínas de la cadena
respiratoria y también están repartidas en ambas cadenas.
- Además, los genes mitocondriales no poseen intrones. Están muy empaquetados y con
cierta superposición.
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Los estudios se dispararon a finales de los años 50. Se quiere explicar el fenómeno
semiconservativo.
Hay una hebra que se replica que se la llama hebra patrón que es la que se replica de forma
complementaria y la hebra nueva es la cadena cebadora o hebra replicada. Es una hebra a partir
de la cual se va cebando con nucleótidos y creándose.
Las dos hebras se separan y se replican por separado en sentido 5`a 3`. En organismos inferiores
a veces se replica una y luego la otra. En los tres procesos, siempre van a tomar esta dirección
de 5` a 3`. De forma universal, los nucleótidos que entran son desoxinucleósidos trifosfatos. La
cadena cebadora se va elongando o cebando por la entrada de nucleósido trifosfatos. Se forma el
enlace entre el 3`con el 5`para formar el enlace nucleotidido y sale pirofosfato.
Las dos hebras se tiene que abrir a la par: es lo que se llama horquilla de replicación. Al abrirse
las dos hebras, la dirección de replicación es siempre 5`a 3`. En una hebra que es la hebra
conductora la replicación es fácil de entender y es continua, pero en la otra se detectó que la otra
hebra se sintetiza de forma discontinua por fragmentos de Okazaki. Se vio que para los
procariotas esos fragmentos son de 1000-2000 nucleótidos para los procariotas mientras que
para los eucariotas son de 100-200 nucleótidos.
Aparte de haber DNA replicado había RNA que tiene un cometido. Ese RNA está en la hebra
conductora delante que solo tiene uno, pero en la hebra
retardada que es la que se sistema de forma discontinua,
tenemos los RNA delante de cada fragmento en el extremo
5`, es decir, tiene tantos ARN como fragmentos de
Okazaki haya.
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DNA polimerasas: hay al menos 12 tipos. Los más conocidos son 5: alfa, beta, delta, épsilon y
gamma.
La alfa inicia la síntesis de ambas hebras y también su elongación. Es decir, por poseer su
propia actividad primasas crea cebadores de RNA (uno o muchos según la hebra) y por su
actividad polimerizadora sintetiza fragmentos cortos de DNA. No tiene actividad exonucleasa
3`a 5`.
Las tareas de la alfa se ceden luego a las delta y épsilon. La delta es responsable del resto de la
elongación y la épsilon de la eliminación de cebadores y reparación.
Ambas sí tienen actividad exonucleasa 3`a 5`. Pueden reparar errores.
OTRAS ENZIMAS
Las Mcm y la DNA ligasa funcionan básicamente como en procariotas. Las SSB y las ídem.
Las Mcm son helicasas que actúan en la separación de las dos hebras del DNA y la DNA ligasa
catalizando la formación de enlaces fosfodiéster 3`-5`en la hebra que se replica en fragmentos y
requiere un grupo hidroxilo libre en el extremo 3`de un fragmento y un grupo fosfato en el
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Las SSB (single strand binding) y la DNA ligasa funcionan básicamente como en proc.
Las SSB son helicasas que actuan en la separación de las dos hebras del DNA y la DNA ligasa
catalizando la formación de enlaces fosfodiéster 3’-5’en la hebra que se replica en fragmentos y
requiere un grupo hidroxilo libre en el extremo 3’de un fragmento y un grupo fosfato en el
extremo 5’del siguiente fragmento. También participan las polimerasas I y II ya comentadas en
el tema 2.
CICLO CELULAR
La replicación a nivel celular. La replicación se produce en la fase S del ciclo celular. Toda
célula tiene en su ciclo celular: G1, S, G2 y M. Entre M y S están las fases G1 y G2 que son de
reposo activo. En la fase de replicación S, la célula tiene un mensaje para dividirse (de
replicación), tiene que estar en la fase G1 previamente (se prepara) o en una fase G0 (de
latencia) que son células que no se dividen.
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Cuando tenemos las dos hebras separados, Mcm se separan para que no haya
proceso duplicado de replicación. Se produce la replicación del DNA.
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El aparato de replicación parece tener una capacidad intrínseca poco conocida de pasar a través
de los nucleosomas sin desplazarlos del DNA. De hecho, estamos empezando a aprender cómo
se duplica un nucleosoma.
El octámero de histonas del nucleosoma se reparte entre las dos hebras del DNA en la
replicación. Cuando la horquilla de replicación atraviesa un nucleosoma el octámero de histonas
se rompe en un tetrámero H3-H4 y dos dímeros H2A-H2B.
Algunos tetrámeros H3-H4 permanecen asociados al DNA viejo al azar mientras que todos los
dímeros H2A-H2B se liberan del DNA viejo a medida que la horquilla de replicación avanza.
Se forman H3-H4 nuevos que se unen al DNA replicado nuevo llenando los “espacios” libres.
En cuanto a los dímeros H2A-H2B la mitad van a ser nuevos pero la otra mitad son viejos.
Ambos tipos de dímeros se añaden al azar completando los nucleosomas.
histonas y también las liberan, ensamblándolas solo en contexto apropiado. Ej, NAP1 que
transporta y carga dímeros (H2A-H2B) y CAF1 que carga tetrámeros (H3-H4 recién
sintetizado)
Estas chaperonas de histonas con la carga histónica (+) que transportan, son dirigidas hacia el
DNA recién replicado mediante interacción específica con la denominada “abrazadera
deslizante eucariota PCNA”. Estas abrazaderas se liberan detrás de la horquilla de replicación
y permanecen en el DNA el tiempo suficiente para que las chaperonas finalicen su función.
El trabajo de carga y descarga es continuo en nuestro organismo y sobretodo en las células que
se están dividiendo, se lleva a cabo por las chaperonas de histonas.
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TEMA 6: REPLICACIÓN Y
MANTENIMIENTO DE LOS
TELÓMEROS
Los telómeros (telos: final; meros: parte) son los extremos de los cromosomas eucariotas. Son
regiones de ADN no codificante cuya función principal es la estabilidad estructural de los
cromosomas en las células eucariotas, protegiéndolos del ataque de nucleasas y evitando las
fusiones entre ellos.
Están formados por una secuencia repetitiva de DNA (en humanos es 5’ TTAGGG 3’ que se
repite unas 2.000 veces) y proteínas especializadas. El extremo 3’ de telómero no tiene cadena
complementaria y se denomina saliente 3’.
Secuencia
repetida del
telómero
Saliente 3’
¿Por qué no se puede hacer una cadena complementaria 5’ – 3’ a ese saliente 3’? pues, porque
antes allí ha habido un cebador de RNA creado por la DNA polimerasa alfa para inicio de
replicación 5’ - 3’ y posteriormente eliminado por la DNA polimerasa épsilon.
La cadena hija tiene así un extremo 5’ más corto tras la replicación y por ellos los cromosomas
irían acortándose progresivamente a lo largo de la vida.
Cuando se vuelve a replicar necesita otro cebador que después es eliminado y así la hebra
replicada es más corta. Es uno de los hechos que denotan el envejecimiento de nuestras células.
Esto nos pasa de forma natural.
Una subunidad de RNA llamada TERC “Telomere RNA Component” que proporciona
un molde 3’ AAUCCC 5’ (en mamíferos) para emparejar a la secuencia 5’ TTAGGG 3’
presente en el telómero.
Y otra subunidad que es una enzima llamada TERT “Telomere Reverse Transcriptase”
que proporciona la actividad enzimática
Por tanto la telomerasa es una transcriptasa inversa especializada que lleva su propio
molde de RNA y es capaz de sintetizar DNA a partir de RNA
La primeras transcriptasas inversas fueron descubiertas en retrovirus
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Acción de la telomerasa:
Hemos conseguido alargar (n veces) el extremo de la hebra 5’ – 3’, es decir, que actúa sobre el
saliente 3’ ha salido la telomerasa que hace unas 8 repeticiones.
IMPORTANCIA DE LA TELOMERASA
La acción de la telomerasa añadiendo DNA nuevo en los telómeros es muy llamativa. Choca
con la idea de que un individuo nace y muere con la misma cantidad de DNA. Efectivamente no
es DNA codificante de genes, pero es DNA.
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Cuando es inactiva los telómeros se acortan después de cada división celular hasta el momento
en que la célula deja de dividirse y muere. Es un hecho de envejecimiento.
Además se ha visto que la telomerasa está activa en el 90% de todos los tipos de cáncer,
contribuyendo así a la “inmortalidad” de esas células cancerosas. Mientras que la no actividad
telomerasa funciona como un mecanismo antitumoral en ratones.
INHIBIDORES DE LA REPLICACIÓN
Hay dos grupos principales de agentes inhibidores de la replicación que se usan como agentes
antitumorales:
De estos ya hemos hablado en el tema 2, estos agentes inhiben la actividad topoisomerasa que
está incrementada en procesos tumorales uniéndose a estas enzimas de forma irreversible, así
impidiendo la eliminación de los sobrecruzamientos del DNA, su desenrolle, y por tanto su
replicación.
Estos agentes disminuyen la actividad telomerasa que también está incrementada en procesos
tumorales.
El más estudiado es un lípido con una secuencia parecida a la que se repite en los telómeros y
puede competir con la secuencia de los telómeros. Están estudiando si son capaces de inhibir la
acción de la telomerasa eliminando esos elementos. Los otros son ciclos más o menos grandes
que son como una especie de vacunas contra la telomerasa. Está en fases experimentales y no se
utilizan en humanos.
Se lleva a cabo por la DNA polimerasa gamma que es la específicamente mitocondrial. Tiene
actividad polimerasa y también exonucleasa correctora 3`a 5`.
En la mayor parte de las células, la replicación del mtDNA no tiene lugar exclusivamente en la
fase S celular como en el DNA nuclear, sino que ocurre a lo largo de todo el ciclo celular.
No obstante, el número total de moléculas de DNA del orgánulo se debe multiplicar en cada
ciclo celular para mantener constante el DNA del orgánulo.
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Hay dos orígenes de replicación uno para cada cadena O H y OL (Origen de la cadena pesada y
origen de la cadena ligera respectivamente).
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TEMA 7: METODOLOGÍA EN
GENÉTICA MOLECULAR (I)
¿QUÉ ES UN VECTOR?
Es un nombre genérico para determinados DNA de tamaño variable capaces de ser insertados
con un fragmento de otro DNA foráneo o exógeno “inserto”. Los fines pueden ser múltiples,
entre ellos la “clonación” de ese inserto.
El ADN vector presenta una zona sensible a la enzima de restricción donde se incorpora el
inserto del DNA exógeno. Puede tener varios insertos.
PLÁSMIDOS
Los plásmidos son los vectores más comunes para clonar. Pueden
integrar DNA exógeno de tamaños entre 1-2Kb, con un límite de
10Kb.
Polinker que es una zona muy sensible. Zona de ADN que tiene una secuencia que coincide con
la sensibilidad a distintas enzimas de restricción (puede afectarse por varias)
El plásmido más sencillo tiene un DNA de doble hebra, con un origen de replicación teórico y
tiene una zona de resistencia a la tetraciclina, una zona de resistencia a la ampicilina que es una
plásmido de resistencia a dos antibióticos. Las S o serpientes son el corte de tres enzimas de
restricción diferentes que se llaman EcoRI, SALI y PSTI
La zona es sensible a varias enzimas que es un Polinker. Hay zonas sensibles a distintas enzimas
de restricción y abajo está la secuencia completa del polinker.
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BACTERIÓFAGOS O FAGOS
Recordemos que los virus son elementos genéticos encerrados en cubiertas proteicas. Se pueden
desplazar de una célula a otra, pero no son capaces de crecer de forma independiente ya que no
tienen maquinaria para la biosíntesis proteica y tienen que utilizar el de la célula que les
hospeda. Hay virus de DNA y virus de RNA.
Hay varios bacteriófagos muy utilizados como vectores, por ejemplo: el fago lambda y el fago
M13:
- El fago lambda: presenta una cabeza que contiene el DNA, porque este ADN finaliza en
sitios “cos” que son reconocidos por el sistema de empaquetamiento de la cabeza, el
cual procede a seccionarlos y a insertar el DNA. Este fago presenta también una cola
que le permitirá unirse a la célula hospedadora bacteriana.
El fago lambda es un fago de DNA de doble hebra de 48Kb que contiene varias docenas de
genes, la parte central no es indispensable para la multiplicación y puede ser reemplazada por un
DNA foráneo.
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CÓSMIDOS
Los cósmidos son vectores artificiales híbridos entre plásmidos y fago lambda.
Un cósmido utiliza el mecanismo de empaquetamiento del DNA del fago lambda mediante la
incorporación de sitios “cos”. Estos sitios sirven para que el cósmido pueda ser empaquetado en
la cabeza del fago lambda.
Por tanto, un cosmido puede entrar por ejemplo en E. coli como un fago lambda y después
multiplicarse como un plásmido.
Los cosmidos presentan genes de resistencia a antibióticos como los de los plásmidos sitios de
restricción en los que se puede incorporar un DNA foráneo de hasta 48Kb. Se usan porque se
pueden insertar insertos más grandes.
Como vectores de clonación los YAC poseen mayor capacidad de inserción (1Mb) que los
BAC.
Los BAC están basados en plásmidos y pueden insertar DNA de menor longitud 300Kb, pero
son más estables que los YAC.
YAC
Tiene un origen de replicación, un centrómero, y zonas teloméricas. Además tiene una 3 zona
sensible a enzima de restricción. Su primer paso sería cortar por aquí y se separar una primera
parte del YAC (brazo izquierdo) y nos quedaría un telomero, zona A, ori y cen, luego
tendríamos otra zona (brazo derecho) que contiene el gen B y otra zona telomérica. Entre estos
dos fragmentos (brazos) es donde se introduce una megabase para clonarlo.
BAC
Se parece al plásmido. Por tanto, tiene un origen de replicación y zonas sensibles antibióticos.
Zonas de plásmido F que les da estabilidad. Cuando se corta en una zona, incluye un gen que se
utiliza después en transducción, se abre y se introduce el adn inserto que queramos. Como es
más pequeño, pues es más estable, pero puede incluir tamaños mucho más pequeños que el
YAC.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Las primeras enzimas de restricción se aislaron de bacterias, ya que estas las fabrican para
defenderse contra los virus de DNA que quieren parasitarlas.
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Las bacterias mediante estas enzimas cortan determinados enlaces fosfodiéster en zonas
palindrómicas del DNA del virus. Además, para no cortar su propio ADN, lo metilan (sobre C y
A).
Es decir las enzimas de restricción reconocen secuencias cortas de DNA bicatenario como
dianas para la escisión. Cada enzima de restricción posee una diana particular, por lo general
entre 4-6pb.
El corte tiene lugar sobre determinado enlace fosfodiester en cada una de las cadenas.
Consiguiéndose extremos desiguales o iguales (romos) (se cortan enlaces uno frente al otro).
Un palíndromo: se lee lo mismo que del 5`a 3`como del 3`a 5`. Tiene un eje de simetría. La
EcoRI tiene una secuencia 5`GAATTC3`con 3`CTTAAGG5´. El corte es donde está la flecha
roja y es un corte desigual. Pero en la HaeIII tenemos un corte romo igual.
• Las primeras enzimas de restricción se aislaron de bacterias, ya que estas las fabrican
para defenderse contra virus de DNA que quieren parasitarlas.
• Tipo I: pueden cortar determinado enlace fosfodiester de una zona palíndromica del
DNA si este no está metilado. Pero también pueden solo metilarlo. Es decir pueden
cortar y metilar.
• Tipo II: solo cortan determinado enlace fosfodiester de una zona palindrómica del DNA
si este no está metilado.
Los extremos iguales se agarran peor con la ADN ligasa (dificultan su acción), se ligan mejor
los extremos desiguales.
ADN LIGASA
Tras la acción de una enzima de restricción puede venir la acción de una DNA lígasa. O también
directamente para unir determinado fragmento a los extremos como por ejemplo en la
replicación.
La DNA ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster 3’-5’en cada una de las hebras de
un DNA y requiere un grupo hidroxilo libre en el extremo 3’ y un grupo fosfato en el extremo
5’.
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Como cortamos con EcoRI introducimos un oligo con la secuencia de sensibilidad a la EcoRI.
Ese oligo se introduce y después cortar a través de él por su sensibilidad. Se une con T4 ligasa,
la ligasa forma enlaces fosfodiéster. Tenemos que saber hacer el enlace fosfodiéster 5`a 3`. El
otro paso es saber cortar, cortamos como si fueramos EcoRI, con extremos desiguales. Este
nuevo corte que no tenía antes sensibilidad a EcoRI, ahora sí y se puede introducir en un vector
con la sensibilidad EcoRI. La sensibilidad del oligo y el vector tienen que coincidir.
Se quiere introducir el oligo, tiene sensibilidad a EcoRI, pero también una zona palindrómica
sensible a la PvuII que corta igual. Se corta por la EcoRI, luego se corta con PuvII y se forma un
extremo romo. En el vector que queremos introducirlo tiene que haber esa misma característica
para poder introducirlo. Es decir, que el vector sea sensible a la EcoRI y la PuvII, así en
presencia de la ADN ligasa podamos introducir el oligo en el vector.
Se quiere introducir un polilinker. Introducimos un polilinker para después cortar a través del
polilinker, secuencia de ADN sensible a diferentes enzimas de restricción. Utilizamos de vector,
si queremos introdroducir con EcoRI, el vector tiene que ser sensible a EcoRI, el vector se ha
cortado y se ha abierto y queda abierto para introducir el polilinker, cuyos extremos han de ser
sensibles tambiéna EcoRI. Después la ADN ligasa encaja los extremos. Entonces el polilinker
puede ser útil para cortarlo después con otras enzimas.
Tras el corte con enzimas de restricción, podemos hacer una electroforesis e introducir esa
muestra del tubo que se corta con enzimas diferentes en los tres tubos. Vamos a obtener
diferentes tamaños de corte.
En electroforesis, en el gel de agarosa se mueven más rápido cuanto más pequeños los
fragmentos. El tamaño lo determina la enzima de restricción de cada uno.
Podemos identificar la acción de las enzimas sobre el DNA y hacernos una idea de las
posibilidades de actuación de las enzimas de restricción. Se tiñe después con bromuro de etidio.
Se observa de color rosita cuando induce la luz ulatravioleta.
ESQUEMA DE CLONACIÓN
Clonación en un plásmido que es sensible a EcoRI. Partimos del vector que es un plásmido, del
DNA que nos interesa cortarlo con EcoRI y se forman unos fragmentos. El plásmido se corta
con la EcoRI y se nos abre por los extremos desiguales. Entonces el DNA la cortamos con la
misma enzima de restricción y obtenemos unos fragmentos.
Al azar, por la acción de la ADN ligasa el vector ha unido con sensibilidad a EcoRI un
fragmento del DNA. Ese vector con el fragmento de ADN se llama vector recombinante. Es la
tegnología del ADN recombinante.
Este vector recombinante se introduce en una célula hospedadora como E. coli. En laboratorio
se hace mediante dos métodos:
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- Se la hace en una solución con Cl2Ca y se abren los poros y la célula hospedadora
puede captar el vector. Cruza la membrana plasmática por los poros y se introduce en la
célula. Se obtiene poca introducción.
- Se hace más la electroporación: se da una descarga eléctrica intensa pero corta en esas
condiciones se abren los poros y dejan pasar el vector. Casi siempre se utiliza la
electroporación con mayor eficacia.
Al final, tenemos que se reproducen pero en presencia de un antibiótico solo crecen las bacterias
que lleven en el plásmido el gen de resistencia a ese antibiótico.
Rompemos las células que sean, queremos tener separa el ADN del plásmido del de la bacteria.
Pasar separar el plásmido, es mediante por centrifugación que es sencillo. El ADN del plásmido
es más pequeño que el de la bacteria, luego en el tubo de centrifugación el ADN del plásmido
queda arriba. Luego, podemos sacarlo con EcoRI y tenemos toneladas de plásmidos con el
inserto que nos interesa. Hemos podido clonar el gen determinado utilizando el vector.
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TEMA 8: METODOLOGÍA EN
GENÉTICA MOLECULAR (II)
Por ambos métodos MAXAM Y GILBERT y SANGER, obtienen el premio Nobel en 1980.
Sanger era su segundo premio Nobel por la secuenciación de la primera proteína que fue la
insulina.
Utiliza reactivos químicos. Consiste en que se parte de DNA bicatenario y el primer paso es un
ADN pequeño de doble cadena. El primer procedimiento es la separación de las dos hebras del
DNA, subiendo la temperatura del medio se puede separar el DNA que es la desnaturalización
del DNA que aguanta altas temperaturas (a partir de 70º ya se desnaturaliza). Nos quedamos
con la hebra 5` a 3`.Entonces se marca la cadena con P32 con una técnica en el extremo 5`. A
continuación, se utilizan 4 reactivos que rompen de forma específica los 4 nucleótidos del DNA.
Un reactivo elimina las G.
El DNA se divide en 4 tubos. En un tubo, las que elimina las G, otras que elimina las A, las T y
otro que eliminas las C. Tenemos cuatro tubos, hacemos una electroforesis en gel de agarosa y
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en cada uno de los agujeritos introducimos la muestra de un tubo. Tienen radioactividad porque
está marcado el extremo 5`. Si ponemos el gel en contacto con una película fotográfica y
aparecen una serie de manchas. La primera mancha es igual en todas que es un control negativo
que no ha funciona el reactivo en cierto grado. Después, tenemos unas manchas distintas y las
leemos: sabemos el tamaño porque conocemos el tamaño del fragmento partida. Numeramos,
vamos leyendo y leemos de abajo a arriba es decir, de los más pequeños a los grandes. Leemos
de forma que la base que ha sido atacada por el reactivo tiene que ver con T o C y el primero se
desconoce, pero los siguientes podemos conocerlos según el tubo en el que se ha tratado.
Primero ataca G, segundo ataca mayor A y en parte G, tercero a T y en parte a C, el ultimo ataca
a C solo.
El de 1 nucleótido lo desconocemos, pero si aparece como el primero, tiene que ser que el
segundo nucleótido se destruya con el reactivo de ese tubo.
El de 2 nucleótidos, tiene que ser que el tercer nucleótido se destruya con el reactiva de ese tubo
y así sucesivamente.
5`X-T-T-G-…..3`
MÉTODO DE SANGER
Se basa en la replicación de una cadena patrón 3` a 5`. El primer es RNA, también conocido
como cebador. Sobre el pequeño DNA que es el complementario de la que se replica se alagar
con nucleótidos trifosfato y se forman enlaces fosfodiester y se separa pirofosfato y la hebra se
elonga y se polimeriza. Si hablamos de eucariotas, las enzimas que hacen esto son la polimerasa
alfa. Realmente se hacen polimerasa procariotas que se utilizaba como un fragmento.
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Este método nos va a poder ayudar en la determinación inicial de la hebra que se replica. Se
basa en la polimerasa creadora, en la hebra cebadora, y la inicial.
Sanger consiguió parar la replicación. Utilizó un nucleótido trifosfato que es el ddNTP que no
tenía OH sino un H solo de forma que al entrar este nucleótido, la hebra se encuentra que ya no
se puede seguir uniendo más trifosfatos nucleótidos. La cadena se paraliza.
Utilizamos una hebra 3`a 5`que va a ser copiada con un primer o cebador y se señaliza en rojo el
cebador porque se compra marcado la posición 5`. Se utilizan los nucleótidos trifosfato para
crear DNA y se utiliza los didesoxi y se añade en diferentes tubos: ddATP, aaCTP, ddGTP,
ddTTP. Luego al llegar al nucleótido correspondiente, la cadena de replicación se para detrás
del nucleótido didesoxi.
Cargamos el gel y dejamos que corran las muestras y cargamos el tubo. Lo único que vemos es
que podemos cuantificarlos porque tenemos un control de tamaños y empezamos a ver desde el
5`. Lo que tenemos es que si encontramos un primer será el tubo que acaba en ddCTP y por
tanto será G, así sucesivamente. Esta hebra nueva es la hebra replicada y está escrita en
dirección de 5`a 3`.
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El número de veces que una célula entra en este ciclo para dividirse es muy variable y depende
de múltiples factores, así, las células hamtopoyéticas o epiteliales tienen división casi continua;
las células hepáticas cada 30 días, las células del endotelio de vasos sanguíneo cada 3años,
etc…
En S cada hebra sirve de síntesis de otra nueva en el proceso de replicación. Las dos moléculas
de DNA permanecen unidas por el centrómero, dando lugar a 4 hebras, cada doble hebra
constituye una cromátida. Así, el número de cromosomas permanece constante, aunque se
duplica el contenido de DNA (2n, 4C).
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Los puntos de control del ciclo celular son tres y están al final de las fases G1, G2 y M
impidiendo que la célula entre en la fase siguiente hasta que se complete la fase anterior y solo
cuando las condiciones sean óptimas:
CICLINAS
La progresión del ciclo celular se realiza por una maquinaria molecular compleja cuyos
componentes fundamentales son proteínas de dos tipos: ciclinas y quinasas dependientes de
ciclinas (Cdk).
Las ciclinas sin las reguladoras más importantes de las Cdk. En ausencia de las ciclinas, las Cdk
no pueden realizar su actividad proteínas quinasa.
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La actividad de estas Cdks aumenta o disminuye a medida que la celula progresa a través del
ciclo celular, provocando cambios cíclicos en la fosforilación de diversas proteínas
intracelulares que inician o regulan los principales acontecimientos de ese ciclo.
Pero hay que resaltar que los niveles de las proteínas Cdk son constantes.
Las concentraciones de Cdks no varían. Las ciclinas G1 ayudan a controlar las actividades de
las ciclinas G1/S.
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En G1, en el punto de inicio se elevan las ciclinas de G1/S que le indica a la célula que el
entorno está bien para seguir. Rápidamente y antes de llegar antes se activan y se bajan y su
contenido se mantiene bajo hasta que comiendo G1 de nuevo.
Por último, las ciclinas M que son cuando célula pregunta si los cromosomas están unidos al
huso, se produce una subida ene l comienzo de G2 y una vez que estamos en M en relación con
APC/C disminuye. La activación de las ciclinas determinadas son las que producen el avance.
En el formato totalmente activo es como se estimulan los pasos completos celulares en los que
participan los complejos celulares.
Por ejemplo: un aumento de la actividad Cdk en el punto de control G2/M a través del complejo
Cdk-M aumenta la fosforilación de las proteínas que controlan:
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La segunda vía tiene lugar por la unión de proteínas inhibidoras de Cdk (CK1) como p27. La
unión de CKI induce una reorganización de la estructura del sitio activo de la Cdk volviéndola
inactiva. Este mecanismo se utiliza fundamentalmente en la regulación de los complejos Cdk-
G1/S y Cdk-S.
La p27 es una CKI que se une a ambos componentes deformando el sitio activo de la Cdk.
Además se inserta en el sitio de unión del ATP inhibiendo aún más la actividad del enzima.
La DNA polimerasa alfa y otras proteínas de replicación son reclutadas en el ORG, los
componentes anulares de las helicasas McM se activan como tales y el desenrollamiento del
DNA por las polimerasas I y II permite que empiece su replicación.
La fosforilación mediada por Cdk-S específicos de esta fase del ciclo y se activan por
fosforilación. Participan procesos de degradación. A posteriori por las vías comentadas.
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Este APC es un miembro de la familia de las enzimas ubiquitina ligasa que estimulan la
degradación de proteínas reguladoras específicas. Esto lo hacen transfiriendo a esas proteínas
varias copias de la pequeña proteína ubiquitina y así provocan su degradación proteolítica en los
proteosomas.
Este APC/C controla la fase de anafase. Controla el complejo Cdk-M. Tras unirse con otras
proteínas: Cdc20, el APC/C se activa. Tras activarse es cuando necesita la ayuda de E1 y E2 y
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de las unidades X de ubiquitina, en presencia de ellos se une a la cilina M todas las unidades de
ubiquitina y se provoca la degradación de la ciclina M en el proteosoma.
Cuando ambas ciclinas son degradadas, la mayoría de las Cdk de la célula se inactivan.
Entonces, muchas proteínas fosforiladas de la Cdk, son defosforiladas por diferentes fosfatasas
presentes en la anafase. Esta defosforilación es necesaria para la finalización de la fase M en las
últimas etapas de la mitosis y la citocinesis.
Otra proteína diana es la segurina. Esta proteína protege los enlaces proteicos que mantienen
unidas a las cromátidas hermanas al comienzo de la mitosis. La degradación de la segurina en la
transición metafaseanafase, activa una proteasa que separa a la cromátidas hermanas y
desencadena la anafase.
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En G1, tenemos que estar en un medio que sea favorable para la célula y en esas condiciones
son idóneas para que se forme el complejo inicial de las Cdk-G1, que ayudan al formato de
síntesis de las G1/S que estimula la síntesis de las ciclinas G1/S que son fundamentales para
pasar a la fase S. Cuando se facilita esta vía hay una síntesis de las ciclinas S que se favorece el
paso a S.
Esto se inhibe cuando hay un daño en el DNA cuando hay mutaciones y cualquier otra razón. Si
avanza, los complejos Cdk-M que puede ser inhibido porque no haya habido replicación del
DNA o con daño del DNA. El APC/C al final controla el final de mitosis y el comienzo de G1
luego el control de la síntesis de las ciclinas en la fase G1.
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Las mutaciones son errores de copia de bases puricas o piridimidinicas de los nucleótidos del
DNA durante el proceso de replicación. Como consecuencia, el DNA replicado no es una
réplica exacta del DNA parental.
Pueden ser espontaneas es decir en ausencia de cualquier agente inductor o inducidas por
agentes mutagénicos.
Esta baja frecuencia de mutación del DNA se debe fundamentalmente a la acción correctora
llevada a cabo por la exonucleasa 3`5`de algunas DNA polimerasas como delta y épsilon. Y
en el caso del mtDNA la gamma.
Ya veremos más adelante como estos cambios a nivel de replicación afectan la traducción
(alteración en proteínas).
TIPOS DE MUTACIONES
- Transición: sustitución de una purina por otra purina, o de una pirimidina por otra
pirimidina.
POR SUSTITUCIÓN
Transiciones: Transversiones:
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Por acción de agentes químicos como el ácido nitroso, hidroxilamina y agentes alquilantes
como el dimetil sulfosido se pueden inducir modificación de bases que producen mutaciones:
Por radiación ultravioleta o rayos X: se pueden inducir dímeros de timina en la misma hebra
de DNA.
Por agentes intercalantes: como la naranja de acridina, bromuro de etidio etc, se puede
producir estiramiento de las hebras del DNA y desparejamiento. No con el Gel Red.
TAUTOMERIZACIÓN
DESAMINACIÓN
Si tenemos una hebra con timinas, entre dos timinas, una de ellas se gira y se forman los enlaces
entre carbonos y se da la formación de dímeros de timina. Por lo que impiden la formación de
los enlaces de Watson y Crick, luego impiden la replicación posterior.
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MUTAGÉNESIS Y CARCINOGÉNESIS
Hoy en día se considera que ambas son manifestaciones implicadas en un mismo fenómeno
subyacente, es decir, al modificación estructural del DNA.
Por ello existe una prueba “test de Ames” que mide la tasa de mutación experimentaba por
bacterias expuestas a sustancias químicas sospechosas de ser carcinogénicas. Esto ahorra mucho
tiempo y el dinero que costaría al hacerlo en animales superiores.
E129: rojo allura; E128: colorante rojo que se usaba para colorear la carne de hamburgesas y
salchichas ha sido prohibido.
E211: benzoato de sodio; E214-219: parabenes, de ellos los E216,17 propil-paraben se usan
en cosmética.
TÓXICOS MEDIO-AMBIENTALES
Cerca de 3 millones de personas se envenenan cada año en el mundo por exposición directa a
agrotóxicos (pesticidas).
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prohibió en 1975 porque dejaba estériles a las aves, pero todavía hoy se detecta en el 88% de la
población.
En los pescados uno de los problemas es la concentración de metales como el mercurio. Otro,
los bifenilospoliclorados (a continuación), prohibidos hace tiempo pero presentes en muchos
mares.
El bisfenol A (BPA) presente en plásticos y resinas epoxi. Dosis de este, equivalente a niveles
de exposición cotidianos, actúan de forma estrogénica contribuyendo al desarrollo de obesidad,
dislipémia y resistencia a la insulina produciendo diabetes de tipo II.
HERENCIA MITOCONDRIAL
UN embrión hereda el DNA genómico tanto del núcleo del espermatozoide como del núcleo del
óvulo en la fecundación. Mientras que el mtDNA solo lo hereda del citoplasma del óvulo
porque el espermatozoide no tiene mitocondrias.
Por tanto, la herencia mitocondrial solo la transmite la madre a través del citoplasma del óvulo y
también las enfermedades relacionadas, mientras que los varones no las transmiten.
Los óvulos tienen alrededor de 100000copias del mtDNA (que representan el 30% del DNA del
óvulo). El número de copias de mtDNA de otras células varían entre 1000-10000.
Alrededor de 1 cada 200 niños presenta mutaciones en el mtDNA al nacer, pero en la mayoría
de los casos sólo padecen enfermedades leves o asintomáticas. Sin embargo, en uno de cada
6500 niños estas mutaciones inducen importantes patologíascitopatías mitocondriales.
CITOPATÍAS MITOCONDRIALES
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- (NARP): debilidad muscular neurogénica, ataxia, y retinitis pigmentosa. (gen: ATP 6).
HETEROPLÁSMIA Y MOSAICO
Desde el punto de vista del contenido en mtDNA las células de un organismo pueden ser:
homoplásmicas cuando todas tienen el mismo mtDNA o heteroplásmicas cuando contienen una
población mixta de mtDNA normal y patológico, ambos transmitidos a través de la madre. A
esto último se le llama heteroplasmia y complica la relación entre genotipo y fenotipo en las
mutaciones mitocondriales.
La heteroplasmia es distinta del mosaico. Este será relacionado con el DNA genómico y es
cuando un organismo tiene una mezcla de células con genotipos diferentes pero que se han
desarrollado a partir de un mismo zigoto. Los mosaicos pueden aparecer de forma natural como
resultado de una mutación en células que dan lugar a nuevos tejidos o pueden generarse en
laboratorio.
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La reparación directa implica la regeneración de la base dañada. Pero este mecanismo, aunque
es factible en muchas especies incluidos reptiles, anfibios y mamíferos marsupiales, no lo es en
mamíferos placentarios como los humanos.
En los animales que se da reparación directa, por ejemplo, la reparación de los dímeros de
timina formados por la luz UV, esta se basa en el reconocimiento del dímero por la enzima
fotoliasa que los escinde fotoquímicamente, mediante una reacción de transferencia electrónica
iniciada por la absorción de luz visible, recuperándose así las dos bases originales. La fotoliasa
tiene como coenzimas al FADH2 y a un cromóforo que absorbe la luz e inicia la transferencia
de electrones.
- Estas enzimas reconocen bases alteradas en el DNA (por ejemplo por desaminación) y
catalizan su eliminación por hidrólisis.
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- El hueco creado por la DNA glicosidasa es reconocido por esta enzima que elimina,
junto con la fosfodiesteresa, el enlace fosfodiéster originando una mella.
El tercer paso implica la maquinaria replicativa con las DNA polimerasas (delta y epsilon) y
con la DNA ligasa terminando de cerrar el hueco.
El resultado neto es que se empieza por ejemplo con una desaminación de una C y se termina
restaurando esa C.
Hemos visto que la lleva a cabo una enzima muy específica: la uracilo DNA glucosidasa que
recorre el DNA reconociendo como extraño el uracilo formado por la desaminación de la
citosina.
Si el DNA estuviese formado por U en lugar de T sería imposible diferenciar los residuos U
formados a partir de C, de los naturales y la mutación CU no podría repararse. Así que este
mecanismo de reparación se considera como una ventaja evolutiva.
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Además, en las células se reduce la posibilidad de que U se incorpore en la síntesis del DNA
gracias a otra enzima dUTP pirofosfatasa que elimina este nucleótido precursor
(UTPUMP+PPi).
De entrada hay que resaltar que los nucleótidos C-metilados representan alrededor del 3% en
humanos y las mutaciones de estos nucleótidos constituyen una tercera parte de las mutaciones
de una sola base que se han observador en enfermedades hereditarias humanas.
La reparación de estos nucleótidos metilados la lleva a cabo una DNA glicosidasas especial.
Para su reconocimiento por esta enzima hay un hecho y es que las 5-metil-citosinas se presentan
con mucha frecuencia en secuencias o isletas CG repetitivas y la glicosidasa especial reconoce
los apareamientos de bases erróneos cuando las C-metiladas por desaminación producen T que
se aparean con G y elimina estos T.
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Este tipo de reparación elimina grandes lesiones en el DNA que originan importantes cambios
en la estructura de la doble hélice del DNA como dímeros de pirimidina T-T, T-C, C-C
generados por la acción UV de la luz solar, enlaces covalentes con grandes moléculas de
hidrocarbonos como el compuesto carcinógeno benzopireno, etc.
Cuando se detecta una gran lesión, el esqueleto fosfodiester de la cadena que lo presenta es
cortado a cada lado de la distorsión por las enzimas endonucleasas del complejo (escinucleasas
o nucleasas de eliminación) y una DNA helicasa asociada al complejo, elimina toda esa zona
dañada.
Este gran complejo posee varias proteínas de reconocimiento de la lesión en el DNA y posterior
unión a esa lesión como las proteínas: XPA, XPC, HHR, RPA etc.
Además este gran complejo incluye endonucleasas especiales como la escinucleasa que
hidrolizan sendos enlaces fosfodiéster a ambos lados de la zona lesionada (concretamente a -22
y +6 en humanos). La escisionasa humana está formada por 6 subunidades funcionales que se
van asociando y separando durante el proceso
Resaltamos que algunas de las subunidades de la escisionasa del gran complejo permanecen en
el tramo monocatenario hasta ser desplazadas por las DNA polimerasas apropiadas según el
tamaño de la lesión y que seguidamente comentaremos.
En la distorsión hay unas proteínas de reconocimiento que se sitúan sobre la hebra dañada y
reconocen el fragmento que puede ser cortado. La nucleasa de eliminación o escisionasa que
corta y con la actividad de la DNA helicasa obtienen un fragmento que en parte está dañado y
no. En la hebra no dañada siguen las esciosionasas vigilando para que las DNA polimerasas
repliquen el fragmento correctamente y después participa una DNA ligasa y se terminado el
proceso.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Si el DNA está gravemente dañado en una gran extensión, los mecanismos de reparación de los
que hemos hablado resultan insuficientes.
En este caso, en la parte final de esta reparación, la célula utiliza DNA polimerasas “menos
estrictas” y menos precisas para reparar ese DNA dañado.
En humanos hay varios tipos de DNA polimerasas haciendo esto (incluido la beta comentada en
el tema 5) que carecen de actividad exonucleasa 3`5` pero son poco discriminantes con el
nucleótido que deben incorporar y así se equivocan menos. Se cree que por estos motivos estas
DNA polimerasas solo actúan añadiendo muy pocos nucleótidos. Están en estudio.
Aunque toda el DNA está bajo constante vigilancia para su reparación, el que está a punto de
transcribirse se repara antes: “transcripción acoplada a la reparación”, es decir, funcionan
rápidamente los dos sistemas de reparación (por base o por nucleótido) que hemos visto pero
solo en la cadena que se está transcribiendo.
La RNA polimerasa, enzima que transcribe el DNARNA (ya veremos, cuando estudiemos
estudiando la transcripción a partir del tema 18), reconoce la lesión del DNA y mediante unas
proteínas acopladas, dirige la maquinaria hacia esos sitios.
SÍNDROME DE COCKAYNE
En estos enfermos, la RNA polimerasa no puede actuar y se queda parada de forma permanente
en los sitios de DNA dañado correspondientes a los genes CSA o CSB.
Ahora diremos que es uno de los tipos de cáncer hereditario más comunes. Está causado entre
otros, por defectos en los genes MSH2, MLH1.
Se puede detectar por análisis de polimorfismo tipo VNTR que veremos en el tema 24.
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Rara enfermedad humana de la piel que la hace extremadamente sensible a la luz solar. Desde la
infancia la piel se va volviendo más seca y atrófica. Aparece la queratosis, los párpados se
agrietan y se producen úlceras en la córnea. Con frecuencia se desarrolló cáncer de piel en
muchas zonas.
Muchos pacientes mueren antes de los 30 años debido a metástasis de esos tumores.
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Cuando las dos cadenas de DNA se rompen, se produce un tipo de alteración muy peligroso ya
que no queda ninguna cadena patrón que permita la reparación precisa. Si esta doble rotura se
dejara de reparar, nos llevaría al fraccionamiento de los cromosomas en pequeños trozos.
Hay que indicar que la recombinación aparte de reparar el daño del DNA, también puede ser
una herramienta de intercambio de información genética.
Las proteínas que llevan a cabo la reparación por recombinación. Se sintetizan en grandes
cantidades en loa eucariotas y están dispersas por todo el núcleo. Aunque todavía se conoce
poco de ellas.
En respuesta al daño en el DNA estas proteínas convergen rápidamente en los sitios dañados y
forman “fábricas de reparación” en las que reparan conjuntamente estos daños.
Esta rápida movilización de proteínas de reparación hacia estos sitios, está estrechamente
controlada por la célula y requiere de otras proteínas adicionales que si estuvieran alteradas por
ejemplo en ciertos cánceres, causarían una reparación deficiente.
RECOMBINACIÓN NO HOMOLOGA
Es común en las células somáticas de los mamíferos y se puede considerar como una solución
rápida y “sucia”.
“Sucia” porque consiste en que los extremos rotos se vuelven a unir con la perdida de uno o más
nucleótidos. Esto parece asumible por la célula, al igual que vimos que se usan DNA
polimerasas “poco precisas” en la reparación de nucleótidos en una sola hebra.
Es posible, porque la porción del genoma que codifica proteínas (genes de copia única o
estructurales) es muy baja (aproximadamente 1,5%) y seguramente el daño no está incluido en
esa parte.
Se calcula que el hombre puede tener a la vejez > 2000 de esos daños en el DNA.
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LA RECOMBINACIÓN HOMOLOGA
Repara las roturas en la doble cadena que aparecen poco después de la replicación del DNA,
cuando las cromátidas hermanas todavía están unidas, restaurando así la secuencia original del
DNA.
Tiene lugar entre dos determinados segmentos de las dos cromátidas del DNA de secuencias
nucleotídica similar. Este proceso es esencial para la reparación sin errores del daño
cromosómico en todas las células.
Pero además, esta recombinación homóloga puede reorganizar las secuencias del DNA,
alterando el momento y el nivel de expresión del gen o genes relacionados.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
En la cromátida supeior, la cadena 5`3`en su extremo 3` tiene contacto con las proteínas
RecA en procariotas o su homologa Rad51 en eucariotas que la dirigen hacia la invasión del
dúplex inferior homologo.
Estas SSB se unen con fuerza en los largos agregados cooperativos a ese extremo 3`formando
un filamento de nucleoproteínas que sujeta una cadena sencilla y una doble hélice. Después
localizan una secuencia homóloga y la copian. El resultado es un heteroduplex
Tras esto, hay una migración de cadenas. Puede ser espontánea o ayudada por otras proteínas,
en este caso requiere energía en forma de ATP.
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PROTEÍNAS RecA
Una secuencia de DNA en un cromosoma homologo puede quedarse como “no funcional”
después de repararse utilizando el otro cromosoma homologo como patrón. A esto se le
llama “pérdida de heterozigosidad” y es un desafortunado efecto secundario de la versatilidad
de esta recombinación y puede darse en algunos cánceres humanos.
En humanos, las proteínas brca1 y brca2 codificados con los genes BRCA1 y BRCA2 a su vez
relacionados con el cáncer de mama, son proteínas de reparación adicionales. Se ha observado
que son capaces de unirse a las proteínas Rad51 esencial para la recombinación homóloga. Se
cree brca2 colabora en el transporte rápido de Rad51 a los lugares de daño y una vez en el sitio
adecuado la libera en su forma activa.
Una unión alterada de estas proteínas con Rad51 puede hacer que repare deficientemente o a
inactivarla. La acumulación de daño en el DNA puede, en una pequeña acumulación de células
dar lugar a un cáncer.
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Los mecanismos de reacción incluyen a las enzimas recombinasas (integrasas) que forman
uniones covalentes de gran energía y transitoriedad con el DNA aceptor para completar su
reordenación.
Es el ejemplo más estudiado que se conoce. Cuando este fago penetra en una bacteria dirige la
síntesis de una recombinasa codificada por el mismo: la integrasa lambda.
Esta integrasa se une a una secuencia específica del DNA del fago y también a una secuencia
del DNA de la bacteria con sitios de reconocimiento en ambos.
En respuesta a señales específicas, otro mecanismo permite que el DNA del fago salga de su
lugar de integración en el DNA de la bacteria y se multiplique rápidamente dentro de la
bacteria. Para ello se necesita otra enzima, la escisionasa.
Tenemos el bacteriófago lambda con unos extremos cos determinados. El cromosoma de E. coli
con extremos complementarios a los cos. Tras la introducción del fago en E. coli, participa la
integrasa que es capaz de poner en contacto del fago y E.coli. Se forma algunas uniones
heteroduplex y también hay una catálisis del corte y unión de la doble cadena. La integrasa sale
y se integra el DNA del fago en el cromosoma de E.coli.
La vía de la integración y de la escisión. E.coli infectado por un virus lambda. Por la actividad
integrasa del fago hace que se integre en el DNA de la bacteria el del virus y quede como un
profago. Es una vía de profago tranquila. Pero en un momento determinado, hay una inducción
y el DNA integrado se separa por la escisionasa y entonces ese DNA del fago hace que se
produzcan enzimas y proteínas infectivas. Esta es la vía lítica.
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Esta recombinación se puede utilizar para activar y también para desactivar genes (inactivación
“knockout”)
Hemos visto que cuando los lugares reconocidos en la recombinación especifica de sitio están
orientados de forma natural hay una integración y después puede haber o no una escisión.
Ahora vamos a ver que cuando esos lugares de reconocimiento están orientados de forma
inversa, la secuencia de DNA entre ellos es preferentemente invertida en lugar de escindida.
Muchas bacterias utilizan este tipo de inversión de la secuencia de DNA para controlar
inactivando la expresión de algunos de sus genes.
Por eso, las recombinasas bacterianas o víricas específicas de sitio como las integrasas y
escisionasas se han convertido en herramientas muy útiles en ingeniería genética.
Hay bacterias que tienen unos sitios del genoma que son sitios
de inversión. Cuando tenemos los sitios de inversión, una
secuencia inicial introducida como A-B, al integrarse en esos
sitios de inversión lo hace de forma contraria B-A,
produciendo inactivación del DNA y en algunos casos pueden
ser sacados por escisionasas.
Se requiere la inserción en la línea germinal del animal para que sea heredable, de dos
moléculas de DNA, diseñadas específicamente:
- Otro DNA que contenga el gen de interés a eliminar flanqueado por sitios de
reconocimiento (IoxP) para la recombinasa. Este DNA tiene que haber sido previamente
manipulado.
El ratón debe estar previamente modificado de tal manera que el gen de la recombinasa que se
le inserta, sea el único gen capaz de codificar este enzima. Es decir, hay que quitarle “el
natural”.
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Hay que tener en cuenta que si el gen de la recombinasa solo se expresa en hígado, el gen de
interés solo se elimina de allí y no de otros tejidos.
La inversión es prácticamente un promotor entero. Luego la regulación del promotor sobre las
proteínas de ese promotor son inactivadas.
De manera general un promotor que da lugar a un mensajero policistrónico que da lugar por la
traducción a la proteínas H2 y la proteína represora que es capaz de bloquear la activación de
otros genes. Pero la inversión del promotor bacteriano de formas artificiales no actúa como tal y
los dos genes resultan inactivos y no se genera el mensajero policistrónico. Luego al no
formarse la proteína represora no se inhiben los genes correspondientes.
- Otra que contenga el gen de interés, manipulado previamente para que esté flanqueado
por sitios de reconocimiento (loxP) para la recombinasa.
Estamos en un tejido específico, tenemos el gen de la recombinasa que tiene una zona
promotora y con una secuencia determinada para que sea propio del tejido en este caso del
hígado. Se activa el gen y por transcripción se forma un mensajero que fabrica la recombinasa
que se sintetiza solo en las células hepáticas.
El gen de interés que queremos eliminar, el gen de interés tiene los sitos loxP sitos de
reconocimiento de las recombinasas. La recombinasa activado es capaz de actuar sobre esos
genes de interés actuando sobre los sitios loxP y hace una escisión específica por recombinación
específica de sitio por inversión. El gen de interés es eliminado del cromosoma y se pierde
cuando la célula se divide.
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Cuando un organismo es atacado produce una respuesta inmunitaria natural, pero también una
adquirida: mediada por anticuerpos que es una respuesta humoral, respuesta mediada por
linfocitos T que es la respuesta celular.
Los anticuerpos humanos: M, D, G, A y E. Las cadenas pesadas pueden ser de 5 tipos y las
cadenas ligeras pueden ser de dos tipos.
La cadena ligera tiene unos 110 aa para las regiones varibles, la región constante son unos 110
aa para la cadena ligera, pero la cadena constante de la cadena pesada es de 330-440aa.
Las cadenas ligeras tienen dos dominios, pero las cadenas pesadas tienen 4 dominios. La
regiones variables se llaman VL para la ligera y VH para la cadena pesada. Las regiones
variables son las zonas de unión de antígenos. Las IgM y las IgE no presentan región bisagra y
tienen un dominio CH4 adicional.
La similitud existente entre los diferentes dominios sugiere que probablemente las cadenas de
anticuerpo surgieron durante la evolución gracias a una serie de duplicaciones génicas,
empezando por un gen primordial que codificaba un único dominio de 110aas de función
desconocida.
Esta hipótesis se ve favorecida por el hecho de que cada dominio de la región constante de una
cadena pesada y también la región bisagra está codificado por una secuencia codificante aislada
(exón) separadas por secuencias no-codificantes (intrón).
Se cree que la presencia de intrones puede haber facilitado las duplicaciones accidentales de
segmentos de DNA, que en el transcurso de la evolución, han dado lugar a los genes de los
anticuerpos.
Estamos en el terminal CHO. Nos podemos encontrar que el primer CH1 constantes, dominio
CH2 y CH3. Delante la región variable. Se transcribe todo el DNA, es decir, tanto los intrones
como los exones. El RNA primario tiene intrones y exones. Se necesita una elaboración gracias
al splicing de corte y empalme, ese proceso se eliminan los intrones.
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Tras la maduración del RNA nos queda solo el RNA maduro sin intrones. Tras la traducción
conseguimos la región constante de la cadena pesada. La parte anterior es la región variable, a
nivel de gen es más grande que incluiría el gen de la zona variable. Es decir, hablamos de genes
que incluyen la parte variable y constante aunque tienen entidad para transcribirse de forma
independiente.
El ser humano puede producir > 10 12 moléculas diferentes de anticuerpos en una situación
preinmune en ausencia de estimulación por antígenos.
Como los anticuerpos son proteínas y éstas codificadas por genes ¿Cómo puede el hombre
producir más anticuerpos que genes hay en su genoma?.
Un acercamiento a esto sería decir que debido a que las regiones variables de las cadenas ligeras
y pesadas de los anticuerpos se combinan formando el lugar de unión al antigeno, un animal que
tuviera 1000 genes que codifiquen cadenas ligeras y 1000 genes que codifiquen pesadas podría
combinar sus productos de 1000 x 1000 maneras diferentes formando 10 6 lugares de unión al
antígeno distintos.
Pero el hecho es que hay mecanismos genéticos únicos que dan esa diversidad y que veremos a
continuación:
2) Tras la estimulación por un antígeno, dichos genes pueden sufrir dos cambios
adicionales: mutaciones que aumentan la afinidad del lugar de unión al antígeno y
reordenaciones del DNA que cambian la clase de anticuerpo fabricada, originándose así
el repertorio secundario de anticuerpos IgG, IgA e IgE de alta afinidad.
Vamos a empezar con el repertorio primario que implica ensamblaje de segmentos génicos…
Cada tipo de cadena pesada y ligera esta codificado por un locus diferente situado en un
cromosoma diferente.
Estas reordenaciones, además de reunir los segmentos génicos individuales del gen que codifica
un anticuerpo, también activan la transcripción a partir del promotor del gen, mediante cambios
en las posiciones relativas de las secuencias activadoras y silenciadoras que actúan sobre el gen.
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Por tanto, una cadena completa de anticuerpo solo se puede sintetizar después de que se
produzca una reordenación del DNA.
Se ha observado que en una cadena ligera tenemos unos segmentos en la zona variable que son
los V (1-40) que engloba todo el dominio variable. Todos esos segmentos están formados por
zonas exónicas e intrónicas. En una cadena ligera nos encontramos segmentos de la zona
bisagra que son los segmentos J (1-5) y en una cadena ligera tenemos un dominio C constante
solo que puede tener más de un segmento.
Sobre los segmentos génicos, es donde tiene la recombinación génica específica de sitio. Hay un
reordenamiento del DNA durante el desarrollo de los linfocitos B.
Tenemos una reordenación previa y nos quedamos con V1, V2 y V3, tres zonas J: J3, J4 y J5; y
nos quedamos con la zona constante. Seguimos teniendo exones e intrones. Se produce una
transcripción especial con la creación de un transcrito primeria con solo la V3, J3, J4, J5 y C. Se
produce un splicing y se obtiene un mensajero sin intrones que solo tiene J3, V3 y C3 y ya
después por traducción se forma la inmunoglobulina de tipo cadena ligera.
Los mecanismos genéticos de producción de una cadena pesada son similares a los vistos para
una ligera. Pero aquí se necesitan además dos etapas de reordenación del DNA en lugar de una.
Inicialmente tenemos 40 segmentos V, 25 D (este segmento y parte del J, codifican la parte más
variable de la región V), 6 y un grupo de secuencias codificantes de la región C.
Cada uno de las reordenaciones posibles codifica una clase diferente de cadenas pesadas.
En una cadena ligera: cualquiera de los 40 segmentos V se pueden unir a los 5 segmentos J, de
forma que dicho locus puede codificar al menos 40x5=200 regiones variables V diferentes de
cadena ligera.
En una cadena pesada: cualquiera de los 40 segmentos V se pueden unir a cualquiera de los 25
segmentos D y a cualquiera de los 6 segmentos J, pudiendo codificar como mínimo
40x25x6=6000 regiones V diferentes de cadena pesada.
Se estima que un humano podría producir 320 regiones V, ligeras diferentes (200 k (kappa) y
120 lambda) y 6000 regiones VH pesadas diferentes. Estas regiones podrían luego combinarse
entre sí produciendo 320 x6000=1,9x10^6 lugares diferentes de unión al antígeno.
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Las uniones que tienen lugar entre segmentos génicos durante la recombinación VDJ, tiene en
cuenta las señales de recombinación que hay entre los segmentos y están mediadas por un
complejo enzimático denominado recombinasa VDJ del que forman parte dos proteínas
específicas de los linfocitos en desarrollo (Rag 1 y Rag2) así como enzimas reparadoras del
DNA dañado.
Las proteínas Rag 1 y Rag2 están codificadas por los genes del mismo nombre (RAG1 y
RAG2): recombinación activating gene).
Para llevarlo a cabo la recombinación VDJ, las dos proteínas se asocian entre sí, forma ndo el
complejo RAG que actúa como una endonucleasa introduciendo discontinuidades en la doble
cadena entre los segmentos génicos que deben unirse y sus secuencias de recombinación
flanqueantes.
A continuación. RAG inicia el proceso de unión y recluta enzimas de reparación que unen
extremos no homologos del DNA de doble cadena. A veces se pierde un numero variable de
nucleótidos de los extremos de los segmentos a recombinar. Esto aumenta la diversificación de
la unión y el peligro de no funcionalidad.
Junto al segmento V tenemos una reordenación entre V1 y J1, entre ellos deben existir unas
secuencias donde se apoyan las Rag. SE ha visto que tienen un mensaje cuantitativo: primero 7
pb, 23pb y 9pb. Esto es un mensaje cercano a V1. La región J1 a su vez es algo diferente donde
en la zona más anterior tiene una secuencia señal: 9pb, 12pb y 7pb.
Las proteínas Rag son capaces de unirse a esas secuencias de señal: una a la parte de V1 y otra a
la parte de J1. Se ha visto que tras esto hay un apareamiento de las proteínas Rag para llevar a
cabo la reordenación. A continuación el complejo Rag tiene capacidad endonucleasa y corta las
secuencias señales y nos quedan las secuencias V1 y J1. También actúan como enzimas
reparadoras y nos encontramos que también actúa como enzimas que unen los extremos no
homologos y así se reordenada V1 con J1.
Los humanos deficientes en alguno de los dos genes RAG o en los de enzimas de reparación de
extremos no homologos, son muy susceptibles a las infecciones ya que son incapaces de realizar
la recombinación VDJ.
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Los organismos unicelulares detienen de forma transitoria su ciclo celular e intentan reparar el
daño. Aunque no pueden repararlo todo, el ciclo celular se reanuda porque para ellos
aparentemente la vida con mutaciones, es mejor que no vivir.
En los organismos pluricelulares sin embargo, la salud del organismo tiene preferencias sobre la
vida de una célula. Así las células con graves daños en el DNA no intentan dividirse, sino que
se autoeliminan induciendo su muerte o apoptosis.
Cuando el DNA resulta muy dañado, varias proteínas quinasas son reclutadas en el lugar del
daño e inician una vía de señalización que provoca la detención del ciclo celular.
Las primeras quinasas que se localizan en el lugar del daño son ATM (proteína mutada de ataxia
telangiectasia) o ATR (proteína relacionada con la ataxia telangiectasia).
A continuación se reclutan y se activan por fosforilación de las anteriores, las proteínas quinasas
adicionales: Cjk1 y Chk2 dando lugar a la fosforilación de
la proteína reguladora de genes p53.
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Tenemos el DNA dañado. La primera acción es la activación de las quinasas ATM y ATR y
después las quinasas Chk1 y Chk2 que a su vez estas tienen otro mecanismo que controlan los
complejos de ciclinas no a nivel en el desarrollo de S sino en el desarrollo de la entrada en M.
La fosforilación de p53 y se activa y actúa como un anticancerígeno. Normalmente está
combinado con la ubiquitina Mdm2. La ubiquitina da lugar a un proceso de degradación.
Cuando el p53 se fosforila expulsa a la ubiquitina Mdm2, el p53 activo actúa sobre el promotor
de la proteína de p21 estimulando su producción y se obtiene el p21 que se une a los complejos
Cdk y los inactiva.
ATM es una de las proteínas quínasas que se activa en respuesta al daño en el DNA inducido
por diferentes radiaciones.
Los enfermos que padecen esta enfermedad son muy sensibles a los rayos X y cursan con
neurodegeneración, predisposición al cáncer e inestabilidad del genoma por falta de reparación
del DNA.
Ahora decimos que el daño en el DNA puede producir la inhibición de la actividad activadora
de la Cdc25 impidiendo la entrada en mitosis.
ULTIMAS CONSIDERACIONES
La función de detención del ciclo celular por p53 es un hecho fundamental de protección contra
el cáncer.
Si la respuesta de la célula al daño del DNA no funciona, este se acumula y lleva a un aumento
de la frecuencia de mutaciones y este cáncer.
Por lo menos en la mitad de todos los cánceres humanos se han identificado mutaciones en el
gen p53.
Por lo tanto, a menos que el daño en el DNA sea reparado, la respuesta al daño puede conducir a
la detención del ciclo celular y a la muerte celular.
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La hebra no tiene que transcribirse entera, solo ciertos genes, más o menos separados que se
necesitan en el momento. Por ejemplo si es necesario mucha proteína se transcribe mucho gen
que la codifica. Puede que también el gen se transcriba mucho menos porque solo necesitamos
una copia. En la transcripción no se necesita cebador. La primera base 5’ suele ser pppG ó
pppA.
El preRNA transcrito primario se madura en un proceso de tres fases en los mensajeros mientras
que los ribosómicos y de transferencia el proceso es más sencillo. El preRNA es una sola hebra
con enlaces fosfodiéster y 4 bases (A, C, G, U). La pentosa son ribosas completas (con OH en
2’). El preRNA tiene una estructura longitudinal única en la que se establecen puentes de
hidrógeno entre bases (por ejemplo entre A y U). va a presentar una estructura terciaria pero
forzada.
Los mensajeros suelen ser muy lineales (estructura lineal) mientras que los ribosómicos o de
transferencia tienen estructura secundaria. Al igual que en el DNA las bases que se unen deben
ser una anti y otra sin
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Polimerasa de RNA: polimerizan añaden nucleótidos por enlace fosfodiéster formando nuevos
RNA.
La información del RNA no se almacena de forma permanente (horas incluso solo minutos) por
eso es de menor gravedad que nos equivoquemos. La RNA polimerasa tiene una cierta
información correctora, si se equivoca puede retroceder y su centro activo lleva acabo una
reacción de escisión del nucleótido equivocado
Se encuentra delante del inicio del gen que se va a transcribir. Sus secuencias pueden estar en
las dos cadenas. El promotor está formada por varias secuencias:
La secuencia señal de inicio (INR) (zona +1) que puede ser distinto en las diferentes especies. A
la izquierda de esta secuencia (decir a la izquierda es lo mismo que decir “aguas arriba”)
podemos encontrar la secuencia TATA (-30), que no tiene que estar siempre. Esta caja TATA
ayuda al promotor a ser reconocida por la polimerasa (los promotores sin TATA suelen tener
una INR fuerte). También “aguas arriba” encontramos la secuencia BRE (-35)
“Aguas abajo”, a la derecha, encontramos la secuencia DPE (+30) pero es más rara.
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Existen una serie de factores generales de la transcripción que tienen que reconocer las
secuencias de la zona promotora para que la RNA polimerasa II cree mensajeros.
Reconoce BRE
Es un subfactor de TFD (TFIID). Reconoce la caja TATA
TFIIF, TFIIE y TFIIH actúan una vez se han reconocido las secuencias principales TATA y
BRE.
Empezamos en el inicio de la transcripción y la caja TATA. El TBP se sitúa sobre la hebra que
va a ser replicada y facilita la entrada de TFIIB. Ambas se unen al centro promotor permitiendo
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La caja TATA. Este promotor no tiene caja TATA. La secuencia de inicio de la transcripción
sería más potente. A ese nivel reconoce un determinado triplete, cuando no hay caja TATA la
polimerasa reconoce y se engancha mejor a la secuencia de inicio.
Sabemos que el DNA de las células eucariotas está empaquetado en nucleosomas, que a su vez,
están organizados en estructuras de cromatina de orden superior.
Por ello, para que tenga lugar el inicio de la transcripción se requiere el reclutamiento de otras
muchas proteínas que veremos en temas posteriores como:
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Los genes están en el DNA, pero los agentes epigenéticos controlan su expresión. La RNA
polimerasa con todos los factores de transcripción necesarios. Tenemos que en la zona
promotora que actúan los factores activadores o inhibidores. El mediador que informa.
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En un transcrito primario se han transcrito tanto los exones como los intrones.
Posteriormente esas proteínas van a ser transferidas para participar en la formación de la cap 5’,
en la maduración de ese transcrito primario y en la poliadenilación de la cola 3’.
La CTD contiene 52 repeticiones en tándem de secuencias de 7aas con dos Ser en cada
repetición.
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A la cola fosforilada de la RNA pol II en la posición de la Ser5 (hecho llevado a cabo por el
factor TFIIH) se unen tres enzimas que van siendo transferidas al mRNA naciente en el
momento adecuado:
- 1.- una enzima fosfatasa que elimina un grupo fosfato del extremo 5’ del RNA naciente.
- 2.-una guanil transferasa que añade un GMP mediante un enlace poco común 5’-5’ en vez
de 5’-3’ habitual.
La cap se une a un complejo proteico (CBC: cap binding complex) que ayuda al mRNA a ser
procesado correctamente y exportado al citosol.
La cap 5’ metilada tiene también un importante papel en la traducción de los mRNA maduros en
el cítosol como ya veremos.
En algunas especies, se podría añadir otro metilo en la base inicial del mRNA.
Los exones e intrones se reconocen porque se sabe que todo exón acaba en AG y empieza
generalmente en G. Se sabe que los intrones tienen tres tipos de secuencias:
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Son los RNA nucleares pequeños snRNA ricos en U y con un tamaño relativamente pequeño ~
200 nucleótidos.
Para el splicing principal 5 tipos: U1, U2, y el U4/U6*U5 en formato triple. Hay un segundo
splicing en el que no entramos.
Cada uno de estos snRNA, forma un complejo con al menos siete subunidades proteicas
(Complejos de ribonucleoproteínas snRNP: small nuclear ribonucleoprotein).
Los complejos snRNP se denominan con el nombre del snRNA unido al complejo de proteínas.
Por Ej: U1snRNP.
Los complejos snRNP constituyen el núcleo del espliceosoma que lleva a cabo el splicing.
Se ha observado que los snRNA pueden actuar solo como ribozimas (palabra de la contracción
de ácido ribonucleico y enzima). Altman y Cech (PN de química 1989) por el descubrimiento
de los ribozimas.
La G del extremo 5`-OH del intrón se une a través de su grupo fosfato al 2`de la ribosa de la A
del mismo intrón generando un lazo.
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Dicha cola actúa como regulador de la vida meda de estos mensajeros, cuanta más larga es la
cola, más larga es la vida del mensajero (horas).
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Estructuralmente, la RNA pol I es bastante similar a la pol II ya comentada, pero carece de cola
(CTD) con lo que en parte se explica que los transcritos de esta RNA pol I carezcan de cap 5´y
de cola poli-A.
Los RNAs sin esos atributos son no codificadores mientras los que lo poseen son mRNA
codificadores.
Esto ayuda a la célula a distinguir estor rRNA como productos génicos finales.
Los eucariotas tenemos 4 tipos de mRNA y en los ribosomas hay una copia de cada uno de
ellos. Tres (28S, 18S, 5.8S) se obtienen mediante modificación química y escisión de un único
RRNA precursor. El cuarto rRNA de 5S, es el más pequeño y se sintetiza a partir de un grupo
diferente de genes y de una diferente polimerasa la RNA pol III, y no requiere ninguna
modificación química.
Las protuberancias rojas en los cromosomas indican la posición de los genes que codifican los
rRNA. Estos patrones se han obtenido mediante tinción de los cromosomas con la solución
Giemsa y pueden observarse con el microscopio óptico.
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Posteriormente modificaciones
químicas y roturas producidas sobre
la estructura de los nucleótidos que
forman parte de ese RNA ribosómico
inicial. Regiones de rotura entre
medias.
MODIFICACIONES QUÍMICAS
Metilación a nivel del azúcar. Introducciones de metilos en la posición 2´ de la ribosa. Se han
observado alrededor de 100 nucleotidos metilados.
Todo ellos son mecanismos que están en estudios. Los RNA guía son miembros de los RNA
nucleoares pequeños (snoRNA). Los snRNA están unidos a
proteínas formando complejos snoRNP y contienen tanto las
secuencias guía como las enzimas modificadoras de rRNA, y
las que provocan la escisión del precursor hacia los tres
ribosomas maduros.
A continuación actúan una serie de enzimas que están relacionadas en parte con actividades de
la RNA pol I. Rompen el RNA y se obtienen los diferentes rRNA. El de 18S es el típico de la
subunidad pequeña, y el 28S, el 5.8S y el 5S conforman la subunidad grande.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
El nucleolo:
El nucleolo es el lugar donde se procesan los rRNA y donde se ensamblan, formando las
subunidades de los ribosomas. El nucleolo no tiene membrana, sino que consiste en una gran
agregado de macromoléculas incluyendo:
-los genes rRNA
-el rRNA precursor
-los rRNA maduros (3 tipos)
-las enzimas procesadoras del rRNA
-los snoRNP
-las proteínas de los ribosomas
-algunos ribosomas parcialmente ensamblados.
El tamaño del nucleolo refleja el número de ribosomas que está fabricando la célula. En el
nucleolo se fabrica también otros RNA y se ensamblan complejos RNA-proteína: como el
U6snRNP, el de la telomerasa, etc.
PAPEL DEL NÚCLEO/NUCLEOLO EN EL CICLO CELULAR:
Los genes rRNA también desempeñan un papel mportante e la formación del nucloelo.
- Durante la interfase, los cromosomas que tienen estos genes contribuye a las asas del
DNA del nucléolo.
- En M, cuando los cromosomas se condensan, el nucléolo desaparece.
- En la telofase, cuando los cromosomas recuperan su estad semidisperso, los extremos
de los cromosomas se reúnen (“coalescen”) y se vuelve a formar el nucléolo.
Para que tenga lugar este proceso es necesaria la transcripción de los genes rRNA mediante la
RNA polimerasa I.
Hay una relación entre el núcleo y el nucleolo, de tal manera que el núcleo transmite la
información del DNA y el nucleolo la usa para crear los ribosomas y el RNA.
Los humanos tenemos alrededor de 500 genes de tRNA repartidos por nuestrp genoma.
Son genes de muchas copias repetidas, como los de los RNAs, pero en lugar de estar como ellos
en tanden y activarse a la vez, estos no están en tanden sino con espaciadores.
Son genes no codificadores de proteínas, también como los rRNA y su producto final es tRNA.
En humanos, se han detectado 48tRNA con anticodones diferentes para transportar los 20 aas en
la síntesis de proteínas.
El producto principal de la RNA pol III son los tRNAs que representan aproximadamente el
15% del total de los RNAs y su función es transportar los aas para la síntesis proteica.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Son sintetizados en el núcleo en forma de precursores más grandes que van siendo recortados
hasta fabricar los tRNA maduros que tienen 80 nucleótidos de longitud.
Algunos precursores de tRNA contienen intrones que deben ser eliminados. Este proceso de
maduración es distinto al splicing de los mRNA porque está catalizado únicamente por
proteínas y requiere que el tRNA precursor esté plegado en el formato de hoja de trébol, ya que
si está mal plegado no puede ser procesado correctamente. Así que la maduración actúa como
un control de la calidad de la transcripción.
Los tRNAs presentan también varios puentes de hidrógeno intracatenarios (A-U y G-C) dando
lugar a regiones de doble cadena que facilitan el formato de hoja de trébol.
Tienen forma de hoja de trébol que es necesario para la maduración de los tRNAs. Participan en
la maduración proteínas enzimáticas como: suelen tener un extremo 5`más largo el transcrito
primario y se corta por una RNAsa corriente de especificidad baja. Todos los tRNA tienen en el
extremo 3`CCA. Cuando son transcritos tienen otras secuencias y una enzima ARNasa que
corta también en el extremo 3`.
En una segunda fase, se producen los cortes en los extremos, de forma que el extremo 5`se
queda corta y muchas veces una C. se añade en el extremo 3`el CCA. Mientras tanto se alteran
químicamente bases. En el anticodon. Se produce por último el splicing solo por rppteínas
enzimáticas, suele ser una endonucleasa de maduración poco específica y luego una ligasa de
tRNA.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Hay tres lugares de iniciación: 2 para la hebra pesada (H1 y H2) y 1 para la ligera L,
produciéndose 3 transcritos primarios diferentes, dos de ellos complementarios y
correspondientes a toda la longitud del mtDNA: 16, 5Kb.
Hay 3 promotores que están en la región no codificantes (ASA D). aún se desconoce si el inicio
en H1 y H2 depende de un mismo promotor o de dos independientes.
A partir del primer lugar de iniciación de la hebra pesada (H1) se transcribe el DNA que
codifca: el tRNAPhe, rRNA 16S, tRNA val y rRNA 23S y se detienen tras este último por la
participación de un factor transcripcional.
A partir del segundo lugar de iniciación (H2) localizado tras el tRNA Phe el transcrito primario
va más allá del anterior, completando el DNA mitocondrial.
A partir de lugar de iniciación de la hebra ligera L, se sintetiza un transcrito que solo codifica
8tRNA y 1mRNA.
Los 3 transcritos primarios sufren maduración para dar lugar a todos los rRNA, tRNA y mRNA
de la mitocondria.
No sufren splicing, pero algunos mRNAs tienen colas en 3`pero no Cap en 5`.
El transcrito H1el tRNA Phe, rRNA 16S, tRNA Val y rRNA 23S.
El transcrito L 8tRNA, 1 mRNA, RNA “no funcional” y un pequeño RNA que actúa de
cebador en la replicación de la hebra H.
INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
La α-amanitina es un veneno producido por la seta Amanita phalloides que inhibe la elongación
de la transcripción por la RNA pol II en eucariotas exclusivamente. Produce intoxicación muy
grave con deterioro de la función hepática, debido a la falta de producción de nuevos mRNAs
para la síntesis continua de proteínas
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- Una subunidad de RNA llamada TERC “TElomere RNA Component”, que proprociona
un molde 3ÀAUCCC5`(en mamíferos) para emparejar a la secuencia
5`TTAGGG3`presente en el telómero.
- Y otra subunidad que es una proteína llamada TERT “TElomere Reverse
Transcriptase”, que proporciona la actividad enzimática.
Por tanto, la telomerasa es una transcriptasa inversa especializada, que lleva su propio molde de
RNA y sintetiza DNA a partir de RNA.
ACCIÓN DE LA TELOMERASA
Las transcriptasas inversas se extrajeron de retrovirus por primera vez. Se empezado a sacar
partido y el tema de la telomerasa. Un retrovirus con su cubierta y un ácido nucleico se
introduce en la célula e introduce el RNA con Cap pero sin cola. Crea a partir del RNA una
hebra de DNA complementaria y después es capaz de eliminar el RNA porque tiene capacidad
RNAsa. Crea otra hebra de DNA así ya tenemos dos hebras de DNA. Así pues, ya es capaz de
insertarse en el DNA del hospedador para hacerlo necesita de otra enzima que tiene el retrovirus
que es la integrasa del virus.
Una vez integrado el DNA creado por la transcriptasa inversa, en el DNA de la célula
hospedadora, cuando se produce la replicación se producen copias del DNA y a partir de esas
copias se traducen a proteínas para formar las capsides y después el ensamblaje de los viriones.
Tiene dos actividades. Tiene capacidad polimerizadora y crea la hebra complementaria de DNA,
pero también tiene capacidad RNAsa y después elimina el RNA de molde. Finalmente crea la
otra hebra de DNA.
Los retrovirus son virus de RNA de hebra sencilla (+) con la enzima transcriptasa inversa. Este
DNA de doble hebra se incorpora al DNA de la célula hospedadora y se replica junto con ella.
Más tarde, el DNA vírico integrado se transcribe y se traduce en proteínas víricas que se
ensamblan.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Estos cDNA no poseen íntrones y aunque por ello son más pequeños que los DNA genómicos
relacionados, pero llevan toda la información codificadora de los verdaderos DNA.
Estos cDNA son por tanto muy apropiados para introducirlos como insertos en plásmidos en
lugar de fragmentos o genes de DNA genómico y utilizarlos en experimentos de clonación.
Estos cDNA son también muy apropiados para su manejo como sondas de hibridación en
experimentos de hibridación como veremos en el siguiente tema.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Si se quiere transcribir o traducir usando bacterias se deben usar cDNA porque las bacterias no
poseen la maquinaria precisa de escindir los intrones por “splicing”, ni tampoco pueden llevar a
cabo modificaciones post-traduccionales.
Como vector usaremos: plásmidos, virus, cósmidos y otros, con su genoma correspondiente.
Cualquiera de estos vectores se multiplicara fácilmente en bacterias y generara un gran número
de copias de esos fragmentos (Clonación).
- genómica si procede de DNA genómico, es decir el que contienen todas las células de un
mismo organismo. Por lo tanto se puede usar cualquier célula o tejido de ese organismo para
hacer esta genoteca.
Un papel de filtro se coloca sobre el medio de cultivo haciendo una copia o blot.
Las bacterias adheridas al filtro se lisan y los DNA de los plásmidos recombinantes tras
una desnaturalización alcalina, se analizan con una sonda de DNA específica y
complementaria al fragmento de DNA o gen que se busca.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Un clon se puede obtener por clonación o por PCR. A la izquierda para obtener clon genómico.
Y a la derecha tenemos el clon de cDNA. En la izquierda, purificamos el DNA de las células y
nos interesa el DNA específico que se quiere clonar y se hace una clonación acelular por PCR.
Se separan las cadenas con una fuerza básica alta y se utilizan os cebadores por ello se tienen
que conocer los extremos. Se hace PCR y obtenemos amplificado el DNA. Clonación sin
células y con DNA genómico. Son clones genómicos.
Mientras que en la derecha, purificamos el RNA total y extraemos el mensajero que nos
interesa. El mensajero hay una secuencia que queremos clonar. Conocemos la secuencia y
utilizamos un cebador y con la transcriptasa inversa. El cebador coincide con el de la PCR.
Conseguimos la hebra complementaria de cDNA y después separamos las cadenas e
introducimos un segundo cebador y amplificamos por PCR y obtenemos el cDNA.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Se puede utilizar el análisis Southern para establecer la culpabilidad en casos criminales “la
huella genética” de A. Jeffreys 1984.
Como sonda se utiliza una unidad repetida de las VNTRs ó microsatelites de entre 15 a 100
nucleótidos. El número de repeticiones de esa unidad es variable de un individuo a otro y se
transmite hereditariamente.
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“MICROCHIPS” DE DNA
Estos han comenzado a desarrollarse en los 90. Son soportes sólidos con muchos pocillos y cada
uno con un gen distinto. Estos genes se pueden introducir mediante la aplicación manual y
puntual de pequeñas cantidades de cada uno de ellos o se pueden comprar ya cargados.
Si se quiere determinar por ejemplo la expresión de cada uno de estos genes en un determinado
tejido, se extrae el RNA total de ese tejido y se utiliza como sonda aplicándola sobre cada uno
de esos genes en cada pocillo de la matriz. Esta sonda suele ir marcada con fluorescencia.
Se podría utilizar también como sonda el cDNA correspondiente, obtenido por transcriptasa
inversa y marcado con fluorescencia.
Se identifica el nivel de expresión de cada gen porque se conoce su posición exacta en el chip.
Vamos a ver un análisis de expresión de 1733 genes (DNA) en 84 muestras de RNA total de
tumores de mama de distintos pacientes.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Cada uno de nosotros presenta unas diferencias en la secuencia de nucleótidos en el DNA que
nos hace únicos, a eso se denomina polimorfismos.
Estos polimorfismos pueden ser usados como marcadores para la construcción de mapas
genéticos y análisis genéticos que permitan relacionar polimorfismos particulares con
determinadas enfermedades o con una cierta predisposición a una cierta enfermedad.
ALGUNAS DEFINICIONES
Alelo: es cada una de las secuencias alternativas de un gen determinado. Un individuo puede
presentar un máximo de dos alelos iguales o distintos para cada gen. Uno procederá de su padre
y otro de su madre.
Homozigoto: individuo que presenta dos alelos iguales para un gen determinado.
Heterozigotico: individuo que presenta dos alelos distintos para un gen determinado.
Lo más común es que esta clase esté relacionada con un sitio de restricción variable o
polimórfico y que el corte o no de ese sitio cause efectos genéticos. A esto se llama
polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP).
Ciertas enfermedades pueden cursar con variaciones que eliminen puntos de corte o generar
nuevos puntos de corte.
- por PCR diseñando cebadores que flanqueen el sitio de restricción. Tras esto, al producto
amplificado se le expone a la enzima de restricción apropiada y tras electroforesis en gel de
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agarosa se observan las bandas correspondientes a los fragmentos de tamaños distintos según
haya actuado o no la enzima en ese sitio de restricción.
Es decir, estos polimorfismos pueden servir como marcadores genéticos de genes vecinos
relacionados con enfermedades.
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Por tanto, hemos estudiado la herencia conjunta de un fenotipo humano especifico (una
enfermedad hereditaria) con un polimorfismo de un solo nucleótido.
FIBROSIS QUÍSTICA
El gen está ubicado en el cromosoma 7 (7q31) 1985; 230 kb y 24 exones. Se identificó por la
presencia de varios RFLPs cercanos.
Proteína: de 1480 aas que codifica un canal de iones cloruro (cystic fibrosis transmembrane
regulator CFTR) cuyo papel principal es la reducción de la concentración de cloruro sódico
intracelular, mejorando así, la calidad de las secreciones mucosas celulares.
Un 70% de pacientes son portadores de una deleción de un codón completo que codifica
fenilalanina en el aa 508 de la proteína del CFTR produciendo un canal disfuncional.
ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
Este gen contiene una secuencia de repetición CAG que da lugar a glutamina repetida n veces.
Entre 27-35 repeticiones de glutamina no causa la enfermedad pero a mas repeticiones si.
Además, se ha observado que cuantas más repeticiones se presenta más pronto se inicia esta
enfermedad.
¡Buscar el gen!
-minisatelites: con secuencias de entre 5 a decenas de pb (de 5 a 64) por término medio ~25
pb.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Además, en estos polimorfismos VNTR las repeticiones varían con mucha facilidad entre
individuos e incluso entre los dos alelos de un mismo individuo. Esto es debido a la gran
capacidad de recombinación del DNA.
De hecho se llaman “loci hipervariables” por tener de forma característica muchos alelos, por lo
que es poco probable que dos individuos no emparentados compartan los mismos.
Si los individuos que presentan una determinada enfermedad heredan casi siempre un SNP
concreto, es probable que el gen responsable de la enfermedad y el SNP estén cercanos en el
cromosoma.
Las frecuencias de aparición de los SNP en el genoma humano los torna útiles para el mapeo
genético.
Esto debería permitir la localización rápida de nuevos genes asociados a una enfermedad por su
vecindad a los SNP más cercanos.
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DNA: 5’ ATGACGATA......3’
3’ TACTGCTAT......5’
mRNA: 5’ AUGACGAUA.....3’
Fue la primera RNA polimerasa descubierta, lo consiguieron Ochoa y col en los años 50.
Paralelamente, Kornberg y col descubrieron la primera DNA polimerasa. Ambos obtuvieron el
PN en 1959 compartido por estos descubridores.
Ocho la describió como una RNA polimerasa bacteriana que no necesitaba molde y que usaba
ribonucleódiso difosfato como sustratos para producir un polinucleótido de secuencia aleatoria
cuya composición de bases se correspondía con la composición de ribonucleótidos del medio.
Aunque inicialmente se consideró que podría ser la RNA polimerasa transcripcional que se
estaba buscando, posteriormente se observó que no lo era. No obstante, esta enzima tuvo un
importante papel en la síntesis in vitro de los polinucleótidos sintetizados para el desciframiento
del código genético.
Fue llevado a cabo por los laboratorios de Khorana y de Nirenberg de forma paralela.
Obteniendo por ello el PN de Fisiología y Medicina en 1968. Inicialmente con 4 bases podría
ser: 4`1=4; 4^2=16; 4^3=64.
Khorana trabajó con la RNA pol de Ochoa en un sistema in vitro y creó pequeños
polinucleótidos de RNA, para su traducción utilizaba ribosomas, aas y factores de traducción.
Así por ejemplo (1º) creó uno con múltiples A; (2º) otro con múltiples AC y (3º) otro con
múltiples AAC. Observó que el primero traducía múltiples Lys, por tanto, el codón AAA
codificada lisina; el segundo empezaba por AC traducía múltiples Thr, y si por CA, His; y el
tercero si empezaba por AAC traducía múltiples Asn, si empezaba por ACA múltiples Thr y si
empezaba por CCA múltiples Gln. Rn la comparación de los tres pasos efectivamente ACA
codificaba Thr y CAC His y así sucesivamente.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
quedaba fijada con el complejo ribosoma-UUU, de lo que se deducía que UUU codifica Phe. Y
así sucesivamente…
Apoyándose en estos experimentos y otros se llegó a concluir que solo los tripletes o codones de
tres nucleótidos codificaban a los 20 aas.
En total hay 4^3=64 tripletes, de ellos 61 codifican a los 20 aas y los 3 restantes son de
terminación o stop (UAA, UAG, y UGA).
Para la mayoría de los aas hay más de un triplete. A esto se denomina “degeneración del
código”.
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Las dos primeros cumplen la relación normal: A-U; G-C; mientras que los otros dos: C-G/I; U-
A/G/I.
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Los seres humanos teneos alrededor de 500 genes de tRNA pero entre todos ellos, solo hay
representados 48 tRNAs diferentes. Es decir, 61 codones deben ser reconocidos por 48
anticodones de tRNA.
Esto es posible porque algunos amticodones pueden reconocer a más de un codón ya que el
apareamiento de la tercera base del codón (p. balanceo) es menos crucial que el de las otras dos.
Según estas reglas cuando la posición 5`del amticodón de un tRNA hay una
5`GCA3` 3`CGU5`
5`GCG3` 3`CGU5`
- Los 2 primeros codones pueden ser reconocidos por un tRNA con el anticodón
3`CGI5`o por un tRNA con el anticodón 3`CGG5`.
- El 3º codón puede ser reconocido por un tRNA con el anticodón 3`CGU5`exclus.
- El 4º codón puede ser reconocido por un tRNA con el anticodón 3`CGC5`exclus.
Por tanto, el número mínimo de tRNAs que se necesitarían para el reconocimiento de estos
cuatro codones de Ala serían 3tRNA.
2. Al ser más débil la interacción entre el tRNA y el mRNA, el primero se disocia más rápido
del segundo, con lo que se acelera la traducción o síntesis de proteínas.
-transición: es la sustitución de una purina por otra o de una pirimidina por otra.
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Mutación
-104- -104-
2. Mutaciones no silenciosas.
-106- -106
-104- Mutación
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3`DNA -TGA-
5`mRNA -ACU-
-108- -108-
-190 -190
Sigue la proteína
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La estructura primaria del tRNA se representa en la imagen (D) que corresponde a la secuencia
lineal de nucleótidos de RNA de la molécula.
La estructura secundaria del tRNA se establece gracias los enlaces de H de Watson y Crick que
se establecen entre las bases que mantienen una estructura de hoja de trébol. Presenta diferentes
brazos:
La estructura terciaria se establece a partir del plegamiento de la molécula que forma una
estructura compacta en forma de L que se mantiene gracias a la formación de enlaces de H
adicionales entre diferentes regiones de la molécula.
Hay al menos una aminoacil-tRNA sintetasa y un tRNA para cada aa (recordemos que hay
48tRNAs diferentes). En el caso de la Met inicial, esta Met tiene su propia aminoacil-tRNA
sintetasa específica y su tRNA específico que son distintos de los de las otras Met que siguen en
la proteína que se está sintetizando.
Pero es más común una aminoacil-tRNA sintetasa para varios tRNA relacionados que
transportan el mismo aa.
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El aa debe también presentar la máxima afinidad por el “bolsillo del centro activo de su
sintetasa”.
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Ellas mismas cambiando el aa cambiándolo del centro activo al centro de corrección es capaz de
detectar si están bien unidos o no. La terminación CCA es un tallo flexible que puede cambiar el
aa de un lugar de activación a otro sitio de corrección.
El tallo flexible CCA3`puede trasladar el aa de lugar dentro del “bolsillo” de la sintetasa y esta
enzima eliminarlo hidrolíticamente.
Hemos visto que pueden corregir, si está equivocada, la unión del aa al tRNA correspondiente,
porque estas enzimas tienen un “lugar de corrección” o “editing” en el que se eliminan por
hidrólisis los aa equivocados.
Existen dos tipos de aminoacil-tRNA sintetasas: tipo I y II. Las de tipo I son monoméricas y las
de tipo II son diméricas. Cada tipo se encargan de 10 de los 20 aa naturales, siendo para los de
tipo II más largos e hidrofóbicos.
Las de tipo I unen el aa al grupo hidroxilo 2`de la ribosa de la última base, mientras que las de
tipo II lo hacen al hidroxilo 3`. Además de poner unir los aa en caras diferentes de la estructura
terciaria del tRNA.
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La sub menor (40S) constituye el soporte sobre el que los tRNAs pueden aparearse
correctamente con los codones del mRNA.
La sub mayor (60S) cataliza mediante una peptidil transferasa propia la formación de los
enlaces peptídicos que unen a los aas formando una cadena polipeptídica.
SITIOS EN EL RIBOSOMA
Cuando las dos subunidades se unen, surgen unos sitios de unión. Hay un sitio que es una
localización determinado donde se asienta el mRNA.
Las cavidades que sustentan esos teóricos sitios, pues es una localización fundamental de
mRNA.
Los ribosomas se deslizan sobre el mRNA. Los tRNAs entran y salen. El que avanza en la
lectura del código son las dos subunidades del ribosoma y lo hacen de forma separada.
El factor de inicio 2 que es un factor que necesita GTP. El proceso gasta mucha energía y
necesitamos GTP y ATP en los procesos de traducción. El primer factor que llega en trans que
necesita GTP es el factor 2, que parece que reconoce de forma muy específica a ese tRNA que
porta la primera metionina.
Tiene que unirse al subunidad menor del ribosoma. Este precomplejo es básico para seguir. Una
vez unido la subunidad menor y el factor, necesitamos el mensajero, que tiene su caperuza. El
mensajero es reconoce por otras dos proteínas que llegan en trans la 4e y la 4g. Esta caperuza ha
cobrado una gran importancia porque es la forma de reconocerse por estas proteínas de factores
de iniciación.
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Se necesita también que la zona de la cola poliA que tiene que estar cercana a la zona de la
caperuza. Este proceso de retorcerse con todos los factores de iniciación, se coloca el complejo
a partir de la caperuza.
El que avanza es el ribosoma. En el reconocimiento del primer AUG se necesita ATP, se asienta
con el factor 2 que ayuda al reconocimiento, la energía es para el desplazamiento del complejo y
la proteína sale en forma GDP y sale el factor 2 y otros que entraron previamente.
Se une la subunidad mayor. A partir de este momento comienza la elongación, se une un nuevo
tRNA correspondiente al siguiente codón y se forma una primera unión entre los aas.
A veces la subunidad menor del ribosoma puede ignorar el primer codón AUG del mRNA y en
su lugar saltar al segundo o tercer AUG.
Esto puede provocar que a partir de una misma molécula de mRNA se pueden fabricar dos o
más proteínas que se diferencian en sus extremos N-terminales. Esto puede ser el caso de las
proteínas con la denominada secuencial señal en el NH2.
Estas proteínas con la secuencia señal o sin ella pueden ir a compartimentos celulares distintos
para su elaboración y metabolismo.
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ELONGACIÓN
Veremos que son las 2 subunidades del ribosoma las que se mueven.
TERMINACIÓN
Para poder formar cada nuevo enlace peptídico se rompen mínimo 4 enlaces fosfato
de alata energía:
POLIRIBOSOMAS O POLISOMAS
Realmente los ribosomas funcionan como polirribosomas que son agrupaciones de ribosomas
que están unidos a una misma molécula de mRNA y traducen de forma simultanea esa molécula
tanto en eucariotas como en procariotas.
La densidad máxima de ribosomas sobre un mRNA es de alrededor de 1 ribosoma por cada 80-
100 nucleótidos.
Cuanto más cerca del extremo 5’ del mRNA este el ribosoma, más corta será la proteína que va
formando. Contrariamente, cuanto más lejos este, será más larga.
El hecho que un mRNA pueda ser leído por varios polirribosomas permite formar varias copias
de la misma proteína a partir de un único mRNA.
Por término medio una proteína tarda en biosíntetizarse entre 20-60 segundos. Cada ribosoma
están separados por término medio de unos 80 nucleótidos.
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- Plegamiento
- Unión no covalente a cofactores
- Modificación covalente:
o Glicosilación
o Fosforilación
o Acetilación
o Hidroxilación de los aas Pro y Lys
o Unión de elementos lipídicos
o Metilación
o Formación de enlaces disulfuro etc…
- Unión a otras subunidades proteicas
- Procesamiento proteolítico y reordenación proteica.
Algunas proteínas son de uso interno para la célula que las produce y otras son para exportarlas
a otras células.
PLEGAMIENTO POST-TRADUCCIONAL
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TRADUCCIÓN MITOCONDRIAL
Los ribosomas mitocondriales son libres y más pequeños que los citoplasmáticos.
Las aminoacil-tRNA sintetasas proceden del citoplasma de la célula y son transportadas a las
mitocondrias.
INHIBIDORES DE LA TRADUCCIÓN
Son antibióticos actuando como inhibidores de distintas etapas de la traducción y por ello
causantes de su muerte. Solo algunos actúan en eucariotas. El estudio de estos inhibidores,
aparte de su importancia como medicamentos, ha ayudado mucho a la comprensión de las
etapas de la traducción.
A nivel de la Iniciación:
A nivel de la Elongación:
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• Tetraciclina: Se une a la subunidad 30S e impide la acción del EF-Tu uniendo los
aminoacil-tRNAs en el sitio A (en procariotas).
La toxina producida por la bacteria de la difteria es una proteína que modifica de forma
covalente al factor de elongación eucariota EF2 translocasa (análogo al EF-G procariota).
La toxina vegetal del ricino (rícina) es una proteína que inhibe también la elongación eucariota,
en este caso al eliminar una adenina crucial en el rRNA de 28S que forma parte de la subunidad
grande del ribosoma (60S).
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Primeramente incluimos el inserto en una de las dos zonas y teniendo en cuenta la resistencia
de la otra zona, crecemos con ese antibiótico y podemos detectar las colonias que llevan
plásmido que son las que crecen de las que no lo llevan.
En segundo lugar, crecemos estas colonias con plásmido en presencia de ese mismo antibiótico
(control) y en presencia de los dos antibióticos juntos. Comparando las placas, las colonias que
llevan plásmido con inserto son las que no han crecido en presencia de los dos antibióticos.
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Operón es un conjunto de genes contiguos que se transcriben como una unidad junto con los
elementos reguladores adyacentes que controlan su expresión (F. Jacob y J. Monod, premio
Nobel Fisiología y Medicina 1965).
En procariotas muchos genes están agrupados formando operones. En E. Coli de los ~4405
genes la cuarta parte está formando operones.
- Genes estructurales: codifican proteínas que se necesitan para el funcionamiento propio del
operón.
- Genes reguladores: codifican proteínas que interaccionan con los operadores y con los
promotores para estimular o inhibir la transcripción de los genes estructurales. Suelen tener su
propio promotor.
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Se introduce el inserto rompiendo la zona donde está el LacZ. Se introduce el inserto largo y
transfectamos las bacterias. Las bacterias se cultivan con agar y con cloranfenicol. El vector
tiene gen de resistencia a cloranfenicol y un operón Lac.
Las colonias con el inserto rompiendo el gen LacZ no tienen actividad galactosidasa y son
blancas.
Hay un promotor para cada transcripto primario. Los pre-mRNA son monocistrónicos.
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De los aproximadamente 25000 genes humanos se estima que un 8% (2000 genes) codifican
proteínas reguladoras de genes.
Sus secuencias reguladoras se pueden encontrar adyacentes al promotor, muy lejanas corriente
arriba, también corriente abajo o incluso dentro de algún intrón.
Estas proteínas unidas a sus secuencias respectivas pueden actuar como activadoras o represoras
y modificar a los factores generales de transcripción, a la RNA pol II directamente y/o al
denominado Mediador.
Mientras que el mediador y los factores generales de transcripción son los mismos para todos
los genes transcritos por la RNA pol II, las proteínas reguladoras y a la posición de sus
secuencias de unión en relación con el promotor son distintas para cada gen.
En el tema siguiente veremos que ciertas proteínas reguladoras también modifican la estructura
de la cromatina de esa región controlando de otra manera el inicio de la transcripción (complejo
remodelador de la cromatina).
En una proteína reguladora está separado el dominio de unión al DNA del dominio
activador/represor.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Una arginina forma también puede formar puentes de H con la G. La G puede ser reconocida
por: Arg, Ser, His y Lys.
Hay 4 tipos:
- Proteínas con formato con hélice giro hélice: formado por hélices alfa, la secuencia alfa
y otra hélice alfa. Podemos encontrarlo con 2 o 3 hélices, o formando dímeros de tres
hélices. La más estudiada son las proteínas homeo dominios que se relacionan con el
desarrollo embrionario de insectos.
- Proteínas con dedos de zinc: tiene hélices alfa, zonas abiertas y también hojas beta. Se
llaman así porque forma un conglomerado con el Zn donde son importantes las cisteínas
y las histidinas. Por ejemplo, los receptores de las hormonas esteroideas. También se
pueden formar dímeros: homodímeros o heterodímeros.
- La cremallera del leucina: suele ser en formato dímero con alfa hélice, zonas abiertas.
Las uniones son hidrofóbicas entres las leucinas.
- Proteínas hélice bucle hélice: suelen ser con formato dímero con alfa hélices, zonas
abiertas. Tienen por un lado aa cargados y otros con gran capacidad hidrofóbicas que
será la naturaleza de las uniones.
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COACTIVADORES O CORREPRESORES
Son proteínas que no se unen directamente al DNA sino que se ensamblan con otras proteínas
de regulación génica, en conjunto se denominan coactivadores o correpresores.
Sin embargo, estos términos pueden generar confusión porque abarcan una gran variedad de
proteínas incluyendo a los complejos de remodelación de la cromatina que a su vez incluyen
distintas actividades enzimáticas como veremos en el siguiente tema.
Algunas de estas proteínas no tienen actividad intrínseca por sí mismas sino que simplemente
actúan como “andamiaje” para atraer a otras proteínas que si tienen actividad.
El coactivador junto con las proteínas reguladoras que están unidas a las secuencias permiten
conjuntamente la activación de la transcripción del gen.
El correpresor conjuntamente con las proteínas reguladoras unidas a las secuencias de DNA
reprimen la transcripción del gen.
EL MEDIADOR
El Mediador es un complejo de gran tamaño formado por 25-30 subunidades proteicas que
permite que ciertas proteínas activadoras/represoras se comuniquen a través de él con la RNA
pol II y con los factores generales de transcripción. Estas interacciones ayudan a que la RNA
pol II se sitúe y se estabilice cerca de los genes específicos que posteriormente serán transcritos.
Otras proteínas no necesitan de la acción del Mediador ya que modifican directamente a los
factores generales de transcripción y a la RNA pol II.
Muchas proteínas de regulación génica actúan a través del denominado Mediador mientras que
otras modifican directamente a los factores generales de transcripción y a la RNA pol II.
Recordemos que el Mediador y los factores generales de transcripción son los mismos para
todos los genes transcritos por la RNA pol II, mientras las proteínas reguladoras con sus
respectivas secuencias de unión en el promotor o corriente arriba/debajo de este promotor,
pueden variar de tipo y/o localización para cada gen.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Es un gran complejo proteico de más de 10 subunidades que puede ser reclutado al inicio de la
transcripción para desplazar el DNA de su unión al nucleosoma, utilizando la energía de la
hidrólisis del ATP.
Cada ciclo de unión al ATP, hidrólisis de ATP y liberación de los productos ADP y Pi desplaza
al DNA respecto al octámero de histonas. Pero se necesitan muchos ciclos para que el DNA se
haga accesible a otras proteínas.
Las células tienen docenas de estos complejos remodeladores actuando de forma local solos o
con las chaperonas de histonas. Debido a la presencia de estos remodeladores la disposición de
los nucleosomas en el DNA puede ser muy dinámica y cambiar con rapidez de acuerdo con las
necesidades de la célula.
Algunos de estos complejos tienen subunidades que los orientan hacia ubicaciones particulares
como el segmento TATA de ciertos promotores. Determinador factores de transcripción
también pueden afectarles.
En distintas, simultaneas y seguidas hidrólisis del ATP, el DNA avanza y se despliega en parte
y hace que el octámero de histonas sea sensible a poderse desplazar.
Con la ayuda de las chaperona de histonas este complejo remodelador puede alterar el contenido
de los nucleosomas.
Con las chaperonas de histonas se puede producir un intercambio de dímeros H2A-H2B o bien
se produce un cambio del núcleo nucleosómico (octámero de histonas).
El complejo remodelador de la cromatina puede actuar solo y se sitúa en la zona cercana la caja
TATA y por la hidrólisis de ATP desplaza el DNA y lo abre. Puede estar funcionando con
chaperonas de histonas y cambiar totalmente el nucleosoma por dentro. O puede con las
chaperonas de histonas cambiar parcialmente los núcleos de nucleosomas.
Puede actuar con las enzimas que son las más importantes incluso más que el complejo
remodelador. Estas son las enzimas modificadoras de la histonas fundamentalmente acetilando y
desacetilando las histonas.
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Ciertos moduladores aportan enzimas acetiladoras que modifican covalentemente los extremos
N-terminales de las lisinas de las colas de las histonas, catalizando la transferencia de grupos
acetilo desde el acetil-CoA a esos residuos N-terminales de las lisinas. Las enzimas acetiladoras
se denominan: acetil-transferasas de histonas (HAT), acogen en su centro activo el N-terminal
de la lisina y lo acetilan.
Catalizan la transferencia del grupo acetilo de la acetil-CoA al N-terminal de lisina de las colas
de las histonas.
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Con estas reacciones, se pueden los grupos positivos de las histonas y se pierden las uniones con
los grupos fosfatos. Esto ayuda a la apertura del DNA.
Este cambio sobre las lisinas reduce básicamente la afinidad de la cola y de todo el complejo de
histonas hacia el DNA.
Además, los residuos de lisina acetilados, son reconocidos por un tipo de dominio de unión de
acetil-lisina, específico que se llama bromodominio. Este dominio especifico se haya presente
en algunos de estos complejos de remodelación de la cromatina y también el factor general de
transcripción TFIID y está especializado en reconocer esta marca particular de las histonas.
ESTRUCTURA DE UN BROMODOMINIO
Complejos correpresores:
Complejos coactivadores:
Hemos visto que las lisinas de las colas pueden acetilarse/desacetilarse. La acetilación elimina la
carga positiva de las lisinas mientras que la desacetilación la revierte.
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Las lisinas pueden también metilar/desmetilar en tres grados diferentes (mono, di, tri). Estas
metilaciones llevan a cabo las enzimas: metil-transferasas y su desmetilación las enzimas:
desmetilasas de histonas.
Una lisina metilada no puede ser acetilada y a la inversa. Esto es un mecanismo de control de la
acetilación de las lisina y de los mecanismos subsiguientes.
Este orden de entrada de los elementos se puede alterar, lo importante es que todos los
elementos participan conjuntamente para que se produzca la transcripción.
Esto tiene lugar por la metilación de la citosina (dando 5-metil citosina) en los múltiples pares
CG del DNA por las enzimas metil-transferasas de mantenimiento. Esta metilación
no altera al apareamiento de bases.
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SILENCIAMIENTO GÉNICO
Es una forma especializada de represión que puede propagarse por la cromatina y desactivar
numerosos genes sin necesidad de que cada uno porte sitios de unión para receptores
específicos.
La metilación del DNA sería también un marcador de las regiones del genoma que están
“silenciadas”.
Somos seres diploides y contenemos un grupo de genes heredados del padre y otros de la madre.
La expresión de una minoría de genes depende de ese origen diferencial.
Se suele usar la metilación del DNA como marca distintiva entre las dos copias de un gen que
de otro modo serían idénticas.
Se sabe que existe una oleada de desmetilación tras la fecundación y la metilación diferencial
posterior ayudaría a recordar el origen de ese gen.
Generalmente la impronta por metilación “silencia” pero a veces puede activar un gen.
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LOCALIZACIÓN DE RECEPTORES
- Útero
- Glándula mamaria
- SNC
- Sistema cardiovascular
- Hueso
- Sistema inmune
- Tracto gastrointestinal
- Tracto urogenital
- Riñón
- Pulmón
- Hígado
- Múltiples líneas celulares
5`CA/GGGTCAnnnTGACCT/CG3`
Tienen tres zonas: zona de unión al DNA, zona de unión a la hormona, y una zona que puede
ser activada o reprimida.
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DEDOS DE ZINC
El átomo de Zinc suele ir unido a cisteína o histidina. Entre zona alfa y beta. Generalmente hay
más de un dedo de zinc. El receptor para los estrógenos suele tener dos dedos de zinc.
El estradiol unido a su receptor reprime transcripcionalmente la expresión del gen del receptor
de insulina humana (hIR). Puede darse el efecto dosis y efecto temporal.
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Es una enfermedad autoinmune en la que se producen anticuerpos contra los propios complejos
RNA-proteína (sn-RNP) que participan en el splicing dificultando o inhibiendo totalmente su
acción.
Los anticuerpos forman complejos de alto PM con los snRNP que se depositan en vasos y
tejidos en especial en el riñón.
Los órganos responden con una inflamación, deposito anormal de tejidos conjuntivos,
esclerotización y pérdida final de función.
Muchos pacientes de Lupus presentan también anticuerpos contra otros antígenos nucleares
como: DNA, histonas, proteínas no-histonas, etc…
Las hemoglobinopatías se caracterizan por una deficiencia parcial (talasemia menor) o total
(talasemia mayor) en la síntesis de las cadenas alfa y beta de la globina.
En los genes de la globina puede haber múltiples mutaciones, entre ellas, las que provocan la
inactivación de los lugares de splicing existentes o la formación de otros nuevos
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SPLICING ALTERNATIVO
A partir de un mismo gen, además de perderse los intrones por splicing normal, los exones que
quedan se pueden cortar y empalmar en distintas combinaciones de exones y distinta ubicación
de colar para crear distintos mRNA maduros.
Así se generan distintas proteínas en función del tipo de tejido, del estado de desarrollo, de las
vías de señalización…
El pre-mRNA del gen de la calcitonina puede dar lugar a la expresión de dos proteínas distintas:
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El transcrito primario puede ser procesado de diversas maneras dando lugar a distintos mRNA
que a su vez originarán proteínas diferentes.
Las puntas de flecha roja indican los posibles sitios de escisión del pre-mRNA y adición de
colas poliA.
Hemos visto que las moléculas de RNA sufren un extenso procesamiento, ahora mismo que los
fragmentos sobrantes (intrones, secuencias de RNA 3`, o RNA mal procesado) se degradan en el
núcleo y que estas degradaciones debe completarse antes de la exportación al citoplasma.
Se estima que en mamíferos solo abandona el núcleo celular el 20% del RNA fabricado.
El mRNA maduro sale del núcleo al citoplasma a través de los poros nucleares y allí sufre
procesos de degradación y/o se une a los ribosomas para la traducción.
Cuando el mRNA llega al citoplasma puede activarse su degradación mediante los siguientes
mecanismos:
1.- Hay un acortamiento gradual de la cola poli-A mediante una exonucleasa y cuando la cola
poli-A llega a un acortamiento crítico (aproximadamente 25-30 nucleótidos en humanos) hay
dos vías divergentes:
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2.- Hay un mecanismo menos común, los sitios de unión de proteínas específicas en la
secuencia 3`UTR (región no codificante que no se va a traducir). Estos sitios unen nucleasas
específicas capaces de incrementar la velocidad de corte de la cola poli-A y la eliminación de la
caperuza a la vez.
El 5`UTR se extiende desde la caperuza 5`hasta el codón que inicia la síntesis de la proteína.
El 3`UTR se extiende desde el codón stop (donde termina la síntesis de una proteína) hasta el
inicio de la cola poli-A.
Se han localizado ciertas secuencias en los 3`UTR de ciertos mRNA que favorecen su
degradación a través de la unión a estas secuencias de determinadas proteínas reguladoras. Las
secuencias son: pentámeros AUUUA y dominios ricos en U (poliU).
Por ejemplo: el mRNA maduro del protooncogen C-myc tiene: 7 Pent y poli U.
Por ejemplo, en los ovocitos en maduración, la degradación se inactiva para que el ovocito
pueda tener grande cantidades de mRNAs y así prepararse para la fecundación.
Estos mRNAs con colas poli-A de entre 10-30 residuos, se almacenan en el citoplasma del
óvulo y no se traducen esperando el momento para hacerlo más adelante.
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Ese momento le llega al ovocito justo después de la fecundación que es cuando la célula más
necesita de esas proteínas codificadas por esos mensajeros.
Entonces una polimerasa poliA citosólica añade más poli-A al extremo 3`de esos mRNA
almacenados alargando su cola y así estimulando su traducción.
- miRNAs
- siRNAs
Se ha demostrado que los humanos tenemos aproximadamente 400 tipos diferentes de miRNA
que regulan aproximadamente 1/3 de genes humanos codificantes de proteínas.
MicroRNA (miRNA)
Un miRNA es generado por la RNA polimerasa II y se madura adquiere Cap y cola poli-A de
forma tradicional. Después toma estructura de doble cadena y se recorta de forma tradicional.
Todo esto tiene lugar en el núcleo.
Una vez en el citosol, la endonucleasa Dicer le vuelve a recortar dando lugar al denominado
miRNA de doble cadena. A este miRNA se le une la proteína Argonauta junto con otros
componentes de un complejo silenciador mediado por RNA, denominado RISC (RNA inducing
silencing complex). Este complejo corta y descarta una de las dos cadenas del miRNA. La otra
cadena, guía al RISC en la búsqueda de un mRNA diana que presente secuencias
complementarias en la zona 3`UTR, para aparearse con él.
Si la unión miRNA/mRNA diana es extensa la proteína Argonauta corta la cola poli-A del
mRNA diana y lo expone a rápida degradación por exonucleasas. El RISC se rehusa muchas
veces.
Su la unión es corta (de unos 7 nucleótidos) esto conduce a la inhibición de la traducción de ese
mRNA diana y a su transferencia a los “cuerpos P de procesamiento” donde finalmente es
degradado.
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Son estructuras citosólicas dinámicas formadas por grandes ensamblajes de mRNA y enzimas
donde tiene lugar la destrucción final de estos miRNA y de la mayoría de los mRNA.
Muchos de los elementos de interferencia que hemos visto tienen una segunda función como
mecanismo de defensa de la célula en la degradación de moléculas de RNA foráneas
particularmente las de cadena doble como las que han podido dejar los virus y transposones en
la célula, al menos de forma transitoria, tras infectarla. (Fire y Melo, Nobel de Medicina 2006).
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Es un mecanismo antiguo desde el punto de vista evolutivo que se da en una gran variedad de
organismos.
En esa respuesta de defensa participan los RNA de interferencia pequeños. (siRNA: smal
interfering RNA).
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Esto ofrece una gran esperanza médica. Hay en marcha ensayos clínicos.
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Vimos que este factor forma un complejo con GTP e interviene en la unión del metionil-tRNAi
a la sub ribosoma pequeña. Tras la formación del complejo de 43S y la búsqueda en el mRNA
del AUG, el eIF2 hidroliza GTP a GDP. Esto induce un cambio de su conformación y posterior
salida de la subunidad pequeña antes de que se incorpore la subunidad grande.
Ahora diremos que debido a que el eIF2 se une fuertemente al GDP es necesaria una proteína
intercambiadora de estos nucleótidos, esta es la eIF2B. Esta proteína libera el GDP permitiendo
que el eIF2 se pueda unir a otras moléculas de GTP y su reutilización.
¿Cómo se inhibe la traducción por este mecanismo?, la fosforilación del eIF2 inactiva al Eif2b y
lo atrapa, evitando que haga su función intercambiadora GDPGTP, disminuyendo así la
traducción.
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Parece que la mayor parte de la disminución de la traducción se debe a la fosforilación del eIF2
por parte de proteínas quinasas específicas que responden a distintos cambios en las condiciones
del entorno que incluyen una gran variedad de situaciones de estrés celular como: carencia de
factores de crecimiento, infección por virus, o choque térmico, etc…
(estado estable no proliferativo donde la velocidad de síntesis proteica total se reduce a una
quinta parte de la velocidad habitual en las células en proliferación).
La quinasa TOR está situada en las vías de señalización de los factores de crecimiento
extracelulares que se unen a receptores en la superficie celular y activan vías de señalización
intracelulares.
Estas vías también inducen el consumo de nutrientes y la producción de ATP necesario para
impulsar el aumento de la síntesis proteica.
En estas vías participa la PI3-quinasa, la cual añade un fosfato procedente del ATP en la
posición 3 de los fosfolípidos de inositol (PIP3) en la membrana plasmática.
Este PIP3 recluta 2 proteínas quinasas de la membrana a través de los dominios PH: la Akt
(PKB) y la PDK1 que conduce a la activación de Akt (PKB) por PDK1 y la quinasa TOR (en
uno de sus dos formatos).
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mTOR
La serina/treonina proteína quinasa TOR en mamíferos se llama mTOR y forma parte de dos
complejos proteicos:
- Uno de ellos contiene a la proteína quinasa raptor que es la diana de la rapamicina una
toxina bacteriana que la inactiva y que se utiliza clínicamente como fármaco
inmunodepresor y anticancerígeno (rifampicina). Mediante este complejo, mTOR
estimula el crecimiento celular promocionando la producción de ribosomas y la síntesis
de proteínas y también inhibiendo la degradación de estas proteínas.
- El otro complejo contiene la proteína rictor, que es insensible a la rapamicina y colabora
en la activación de Akt (PKB) inhibiendo la apoptosis.
mTOR activa muchas dianas celulares que estimulan procesos metabólicos y aumentan la
síntesis proteica.
Una de las dianas es la S6 quinasa (S6K) que fosforila a la proteína ribosómica S6, aumentando
la capacidad de los ribosomas para traducir un conjunto completo de moléculas de mRNA la
mayoría de las cuales codifican componentes ribosómicos.
Otra diana son las proteínas reguladoras de genes como Mye y otras muchas las cuales activan
la transcripción de múltiples genes que activan el metabolismo y el crecimiento celular.
Otra diana es la 4EBP que es un inhibidor de uno de los factores de inicio de la traducción el
eIF4E (que reconoce la Cap), la inhibición de este inhibidor 4EBP, aumenta la traducción.
Los nutrientes extracelulares como los aas también activan a mTOR mediante un mecanismo
desconocido.
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En este ejemplo el vector lleva insertado la secuencia codificante de la enzima DNA helicasa.
La transcripción de la secuencia de esta enzima está bajo el control de un promotor vírico que se
activa únicamente a temperatura = > a 37 ºC.
La proteína se analiza en los lisados de bacterias utilizando un gel de poliacrilamida con SDS.
Se observa que la helicasa se convierte en la proteína más abundante del lisado a esas altas
temperaturas.
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INSULINA PORCINA
Aislamiento de la insulina de páncreas de perross pancreatomizados. Antes de los años 70
se usaron métodos químicos. Obtención de insulina semisintética humana partiendo de la
insulina porcina. Se sustituía la Ala 30 de la cadena B por Thr para conseguir la insulina
“humanizada”.
Después de los años 70 se usó la tecnología del DNA recombinante aplicada a uso
industrial. Hay varias patentes, entre ellas crear un híbrido en un plásmido con promotor
apropiado que contenga el gen de la triptófano -sintetasa seguido del codón Met y seguido
del gen que codifica pata la proinsulina humana. En E. Coli se expresa entonces la
“proteína quimérica”: triptófano-sintetasa-Met-proinsulina. Se extrae de las bacterias y se
corta con bromuro de cianógeno que corta específicamente por debajo de la Met quedando
la proinsulina que luego también se corta.
Fragmento C de 33 residuos (de la Proinsulina: 33 +51 = 84 aa) iría unido al extremo NH2
de la cadena A y al COOH de la cadena B.
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Se comenzó por los años 90 en enfermedades monogénicas, es decir, causadas por eficiencia en
un solo gen. Ejemplo: inmunodeficiencia severa combinasa, fibrosis quística, distrofia muscular
de Duchenne, etc..
- Los genes terapéuticos se deben insertar en las células apropiadas. Hay enfermedades
que son concretas de un órgano, por lo que se tienen que insertar ahí, y eso es muy
complejo.
- Deben permanecer activos en el paciente durante mucho tiempo. Sabemos que los genes
se integran “mal” y casi siempre en zonas de heterocromatina, se silencian…por lo que
esto supone muchísimos problemas.
- Debe reducirse al mínimo cualquier efecto secundario adversi. Como decimos a
continuación, por el vector que los transporta puede haber muchos problemas cuando se
inyecta.
La utilización de virus de RNA (retrovirus) para la introducción de una copia sana de gen se ha
usado en muchos protocolos pero tiene muchos problemas.
Esto es así, porque el nuevo gen se integra de forma aleatoria en distintas partes del genoma, o
no se integra bien y además produce la proteína por muy corto periodo de tiempo antes de
desactivarse. Puede producir inflamación o incluso el desarrollo de cáncer.
- virus de DNA
- liposomas
-transposones y otros
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Se han usado:
- Retrovirus: tiene una expresión terapéutica estable. Inserción del genoma viral en la
célula huésped. Pero el gen terapéutico no puede exceder de cierto tamaño. El problema
es que se produce una inserción al azar y que hay posible recombinación con virus
endógenos.
- Adenovirus: genes terapéuticos más grandes. Localización extracromosómica del
genoma viral. No se inserta en el genoma. Puede dar respuesta inmune del hospedador,
que puede neutralizar el virus, además no produce una expresión a largo plazo.
- Virus asociados a adenovirus.
- VHS
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Estas células suponen en principio una fuente inagotable de material que podría ser usado en un
futuro no lejano para reemplazar y reparar diferentes tejidos humanos:
Peor pueden producir rechazo inmunológico y ciertos tumores benignos (teratomas) asociados a
la proliferación de estas células madre embrionarias (CME). Por ello sería mejor usar células
obtenidas del mismo donante a través de la clonación terapéutica que ya hemos comentado…
Estas CME en principio pueden ir hacia distintos tipos celulares. Esta idea teórica se está
intentando a llevar al laboratorio utilizando distintas hormonas que funcionan como factores de
transcripción.
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Utilizar las células madre que hoy en día se sabe que producen numerosos tejidos adultos
(células madre adultas) dirigiéndolas en cada caso al tipo celular especializado.
En el adulto las células madre son específicas de cada tejido y permanecen fieles a sus orígenes
y no inician la expresión de otro tipo celular distinto.
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Así, las células madre hematopoyéticas se pueden usar para sustituir células sanguíneas
alteradas por otras sanas.
Las células madre epidérmicas pueden expandirse en cultivo para la reparación de un tejido.
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Estamos ante una situación de resistencia a la insulina que in vivo se puede presentar en
mujeres expuestas a altas dosis de estrógenos tanto endógenos como ocurre en el embarazo,
como exógeno tras la toma prolongada por ejemplo de anticonceptivos orales o terapia
hormonal sustitutivas.
Estamos ante una situación de aumento de sensibilidad a la acción de la insulina inducida por
vitamina D. dado que datos epidemiológicos muestran que cuando hay deficiencia de vit D hay
entre otras patologías un aumento de diabetes I y II. La prevención de esta deficiencia con esta
vitamina o derivados de esta vitamina, podría mejorar notablemente no solo la salud ósea sino
prevenir ambos tipos de diabetes.
Esta subfamilia de receptores nucleares consta de receptores de baja afinidad (Kd microM)
mientras que los de las subfamilias 1 y 2 eran de alta afinidad (Kd nM).
Sus ligandos son ácidos grasos poliinsaturados o ciertos derivados lipídicos endógenos o
exógenos.
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subtipos alfa, beta/delta, gamma) representa una prometedora diana de drogas contra desordenes
metabólicos de la homeostasis de los lípidos y la glucosa.
EL RXR
El RXR con sus tres subtipos (alfa, beta y gamma), representa el primer receptor de esta
subfamilia.
Su reconocimiento por el ligando 9 cis retinoico (9cis AR) representó la primera adopción de un
receptor nuclear huérfano y dio pie a la llamada “endocrinología inversa”.
Después se ha observado que se puede unir a otros receptores nucleares de esta misma
subfamilia formando heterodímeros, entre ellos los PPARs que vamos a comentar a
continuación, pero también a miembros de la subfamilia 2: el receptor del ácido retinoico
(RAR) y el receptor de la vitamina D (VDR).
El PPARalfa se une y funciona como un sensor endógeno de ácidos grasos poliinsaturaos. Este
receptor se expresa en hígado, corazón, músculo y riñón. En estos órganos regula la oxidación
de los ácidos grasos y la síntesis de apolipoproteínas.
EL PPAR gamma
PPARgamma se expresa poco en el hígado y músculo esquelético pero en ellos también mejora
la sensibilidad a la insulina.
Este receptor también se expresa en macrófagos de células espumosas en ellas parece tener
actividad anti-aterogénica que involucra efectos anti-inflamatorios.
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Sin embargo, los resultados del estudio RECORD 2009 mostraron un leve aumento del riesgo
de infarto agudo de miocardio en los pacientes tratados con dos combinaciones: la rosiglitazona-
metformina y la rosiglitazone-sulfonilureas. También mayor riesgo de fracturas recibiendo
rosiglitazone que las otras dos.
Otro estudio posterior de 2010, concluyo que la rosiglitazone incrementava el riesgo de infarto
de miocardio y se suspendió su comercialización en 2010 por la Eropean Medicine Agency
(EMA).
Pero hay otros muchos factores afectando esta obesidad como el número o el tamaño de estos
adipocitos, hormonas, etc…
EL PPAR BETA/DELTA
Parece que se expresa ubicuamente y actúa como un sensor para ácidos grasos poliinsaturados y
partículas de lipoproteínas VLDL.
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PPARalfa
PPARgamma
FMOC-L-Leucine
PPARdelta
Dislipemias y aterosclerosis
GW 501516, KD3010
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La molécula señal activa al GPCR activando la proteína Gq. La subunidad Gq activada activa a
la fosfolipasa C-beta y que está anclada en la membrana y por ello actúa sobre un lípido de
membrana que es el PI 4,5-bifosfato que está enganchado en la membrana gracias al
diacilglicerol.
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Receptores tirosina
quinasa (RTK)
El factor común de los receptores es que tienen dominios tirosina quinasa y en algunos cortados
que no sé sabe que significado tienen. Los dominios extracelulares pueden ser dominios ricos en
cisteínas o bien dominios semejantes a inmunoglobulinas. A través de los dominios tirosinas
quinasas son capaces de autofosforilarse y trasmitir la señal.
La vía del factor EGF es el más estudiado y que se relaciona con el cáncer.
Ligandos que se unen solo a EGFR: el EGF, el factr de crecimiento transformate alfa (TFG-alfa)
y la anfiregulina.
Ligandos que se unen tanto a EGFR como a ErbB4: la betacelulina (BTC), el EGF de unión a
heparina (HB-EGF) y la epiregulina.
Ligandos que se unen a ErbB3 y ErbB4: las neuregulinas 1 y 2. Los que se unen solo a ErbB4:
neuregulinas 3 y 4.
Algunos de estos ligandos son producidos como precursores transmembrana que deben ser
liberados por proteasas de superficie (ADAMS: metaloproteasas-desintegrasas) para convertirse
en ligandos solubles.
Sos es un factor de intercambio de nucleótidos de guanina (también se llama GEF) se une a Ras
(proteína G pequeña) y abre su bolsillo o centro de unión a nucleótidos permitiendo la salida de
GDP y la entrada de GTP.
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En esta forma Ras unida a GTP se puede unir y activar a otras proteínas, incluidas las tres
proteínas quinasas que siguen.
Pero además Ras presenta una actividad GTPasa intrínseca, la cual le sirve para inactivarse a sí
misma, finalizar la señal y retornarla a su estado primitivo. Esta actividad es lenta pero se
incrementa mediante proteínas auxiliares llamadas proteínas activadoras de GTPasa (GAPs).
Así pues, Sos y las GAPs permiten el funcionamiento del ciclo de la proteína Ras a la velocidad
adecuada para permitir la continuación de la señal a un nivel adecuado.
En mamíferos hay tres proteínas Ras de 21 Kd, (H-, K-, N-Ras) que oscilan entre las formas
GTP (activa) y GDP (inactiva).
El protooncogen Ras es uno de las más frecuentes mutados en los tumores humanos pasando a
oncogen Ras. La mutación más frecuente de las proteínas Ras conlleva la pérdida de su
capacidad de hidrolizar el GTP y por ello, Ras permanece siempre en su forma activa
estimulando de forma continua la proliferación celular.
Sos activa a Ras y Ras activa a Raf o MAPKK (proteína quinasa-quinasa-quinasa activada por
mitógenos.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Raf activa) a MEK o MAPKK, que a su vez activa a ERK o MAPK y esta migra al núcleo y
activa por fosforilación a diversas proteínas nucleares que son factores de transcripción,
modulando así la expresión génica.
Estas proteínas nucleares son entres otras: c-fos, c-jun y c-myc que se encuentran de forma
normal en nuestras células y a que son el producto de los denominados protooncogenes. Pero
además estas proteínas también se pueden encontrar en forma mutada, como producto de
oncogenes, llamándose v-fos, v-jun y v-myc.
Estas proteínas nucleares cuando son fosforiladas pueden formar homo- o heterodimeros entre
si. Así, el heterodímero jun-fos, en formato de cremallera de leucina, constituye el factor de
transcripción AP-1. Mientras que el homodímero myc-myc, en formato de hélice-bucle-hélice,
constituye el factor de transcripción c-Myc.
La activación por mutaciones variadas y/o los fallos de ciertas proteínas de estas vías de
transducción de señales, pueden producir cáncer.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
RECEPTORES DE CITOQUINAS
Los ligandos son proteínas como la hormona del crecimiento, la prolactina, la EPO, el interferón
gamma y múltiples interleucinas
- Un dominio extracelular: posee dos pares de cisteínas unidas por puentes disulfuro,
múltiples residuos de asparagina que son sitios potenciales de glicosilación y el motivo
WS característicos de estos receptores
- Dominio transmembranal
- Dominio intracelular sin actividad tirosina quinasa
La unión del ligando dimeriza los receptores adyacentes e induce la interacción del dominio
transmembranal con miembros de las denominadas: tirosinas-quinasas intracelulares Janus
(JAKs).
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
Estas quinasas se fosforilan a sí mismas y fosforilan al receptor creándose sitios de unión para
miembros de los: traductores de señal y activadores de la transcripción (STATs) a través de sus
dominios SH2. Estas STATs son fosforiladas a continuación por las JAKs.
- Un dominio N-terminal
- Un dominio central que posee una zona de unión al DNA y
- Un dominio C-terminal que contiene:
o Dominio SH2 seguidos por una corta zona que contiene un residuo de tirosina
que es crítico para la activación por fosforilación producida por las JAKs.
o Y un dominio de transactivación que es la parte en la que se diferencian más los
miembros de esta familia.
Constituyen la familia: TGF-beta activinas, y proteinas de morfogénesis del hueso (BMP: bone
morphogenetic proteins)
Actúan como hormonas o como mediadores locales que regulan un amplio rango de funciones
biológicas: proliferación, diferenciación, apoptosis. En adultos están implicados en reparación
tisular y en la regulación de la respuesta inmune.
Los receptores presentan dominios serina/treonina quinasa y hay 2 tipos (I y II) estructuralmente
identicos pero diferentes en el orden de reclutamiento. Formandose finalmente un tetramero
(que no se ve en la Fig.)
Los receptores son inicialmente monoméricos, tras la unión de estos ligandos se dimerizan. Hay
dos tipos de receptores: 1 y 2 (TGFbeta tipo I y tipo II). Si primero hay uno, el siguiente es de
otro tipo, es decir, si el primero es tipo II el siguiente es tipo I. Es decir, siguen un orden para
formar los heterodímeros. La unión del TGF beta, el receptor reclutada y fosforila un receptor
de tipo I. Una vez activado, hay unos dominios serina/treonina quinasa que se activan y se
transmiten a otras proteínas smads que son proteínas que son los factores de reclusión latente. El
receptor de tipo I fosforilada reclutan y fosforila smads de dos tipos: 2 y 3. En este formato se
llama receptor Smad.
El oligómero smad 2/3 recluta otras proteínas reguladoras de la expresión génica y activa la
transcripción de genes diana específicos.
Los receptores de TGF-beta activados reclutan y fosforilan a Smad2 o 3. Mientras que los
receptores de BMP activados reclutan y fosforilan Smad1, 5 ó 8. Constituyendose en todos los
casos lo que se denomina: R-Smad
La R-Smad se disocia del receptor y se une a Smad4, en todos los casos (co-Smad) y el
complejo se transloca al núcleo donde reconoce determinado elemeto de respuesta en el DNA
(SMAD BE) y se asocia con otras proteínas reguladoras o cofactores regulando así la
transcripción de genes específicos.
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Zhao Hui Chen 1A Genética Molecular Humana Consuelo Calle
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La regulación del crecimiento celular tiene que ver con dos mecanismos fisiológicos: la
proliferación y la apoptosis.
La apoptosis o muerte programada es el proceso por el cual las células dañadas o que han
cumplido su ciclo vital, activan mecanismos que conducen a la muerte celular.
Una célula normal tiene que mantener un equilibrio entre ambos procesos.
Una célula cancerosa no mantiene ese equilibrio, tiene activada la proliferación y presenta un
bloque de la apoptosis entre otros hechos.
- Genes de respuesta temprana: entre ellos los de los protooncogenes: jun, fos, myc,
dando lugar respectivamente a las proteínas nucleares del mismo nombre.
- Genes de respuesta retardada: entre ellos los de los protooncogenes que codifican las
proteínas de las Cdks-ciclinas.
TRANSFORMACIÓN TUMORAL
Cada tumor se origina a partir de una única célula dañada, es decir de un clon procedente de una
célula en el que se han producido importantes cambios genéticos y bioquímicos en su DNA.
Como iremos viendo, estos cambios consisten en: distintos tipos de mutaciones de
protooncogenes y genes supresores de tumores, además de otras alteraciones genéticas como
alteraciones de la metilación, reordenamientos cromosómicos etc.
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Un protooncogén es un gen normal que codifica una proteína normal (c-x) generalmente
relacionada con la proliferación celular o la apoptosis.
Un oncogén es la forma mutada, que expresa una proteína anormal: oncoproteína (v-x) que :
1. Factores estimuladores del crecimiento celular. Ej: protoonc c-sis codifica la cadena B de
la proteína PDGF (f crec derivado de plaquetas). El oncogén respectivo codifica una cadena B
mutada que la hace hiperactiva.
5. Proteínas responsables de la activación directa del ciclo celular. Ej: protoonc c-bcl1
codifica a la ciclina D1 que ayuda a controlar las actividades de las ciclinas G 1/S. El oncogén
respectivo codifica una proteína que no ayuda a controlar esas actividades y el ciclo celular
avanza sin control.
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2. EL ONCOGÉN v-ErbB
Codifica un receptor sin dominio de unión de EGF que está continuamente estimulado en su
actividad tirosina-quinasa.
Este receptor carece del dominio de unión a EGF pero conserva su segmento transmembrana y
su dominio tirosina-quinasa.
En ausencia de señal extracelular fosforila sus proteínas dianas e impulsa así la proliferación
celular. Como proteínas oncogénicas está asociada con cánceres del epitelio glandular, de
mama, de estómago y de ovario.
3. EL ONCOGÉN v-RAS
El protooncogen Ras es uno de los más frecuentes mutados en los tumores humanos pasando a
oncogén Ras. La proteína mutada Ras presenta la pérdida de su capacidad intrínseca de
hidrolizar GTP. Así la Ras mutada permanece siempre activa estimulando de forma continua la
proliferación celular.
Como proteína oncogénica está asociada con el 50% de canceres de pulmón, y carcinomas de
colon y con el 90% de adenomas pancreáticos.
ONCOGENES VIRALES
Desde hacía tiempo se había observado que determinados virus causaban cáncer en los animales
que infectaban:
El primer virus tumoral el “virus del sarcoma de Rous (RSV)” fue descubierto en 1911 por
este investigador. Es un virus de RNA y consta de 4 genes. Tres son esenciales para la
replicación viral: v-gal v-pol v-env y el cuarto v-src se observó que causaba tumores en los
músculos y tejido conjuntivo de los pollos.
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Posteriormente se observó que las células humanas “normales” contenían el protooncogen c-src
(primer protooncogen descrito) que es homologo al anterior. En otros muchos eucariontes,
también existía c-src, lo que sugería que era un protooncogen celular esencial.
Ambos c-src y v-src codifican para la misma proteína de 60 kDa que participa en las cascadas
de señalización. Esta proteína src como producto del protooncogen c-src posee actividad
tirosina-quínasa normal, mientras que como producto del oncogen v-src está en forma mutada
hiperactiva.
Los virus al integrar su genoma vírico con el de la célula que infectan pueden captar ciertos
protooncogenes de esa célula y transformarlos por eliminación de los intrones en oncogenes
víricos.
Algunas proteínas producidas por estos oncogenes víricos pueden producir cáncer como el que
estamos comentando: El oncogén vírico v-src produce la proteína v-src unida a membrana, no
receptora, y con actividad tirosina-quinasa citoplásmico alterada que fosforila residuos de
tirosina de forma continua.
Durante la infección, el genoma vírico puede captar “parcialmente” este protooncogen del
genoma de la célula infectada, produciéndose una pérdida de la región que codifica a los últimos
aas.
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Este protooncogen modificado, puede proporcionar al virus una ventaja selectiva al favorecer
su crecimiento por eso tirosina-quinasa hiperactiva.
La proteína v-Src.
C-src es una tirosina quinasa unida a membrana, no receptora, que juega importantes papeles en
la mitosis, adhesión, invación, mtilidad y progresión celular.
C-src media mecanismos de traducción de señales de IGFs, insulina y otros que se integran en la
vía PI3k/AKT…
La forma mutada está en muchos cánceres humanos de mama, colorectal, pulmón, ovario y
hematológicos.
Los dos primeros por el decubrimiento del virus del sida (VIH).
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Solo unos pocos canceres humanos se han demostrado asociados con infecciones víricas:
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La versión mutada de ese gen supresor: -impide la síntesis de esa proteína antioncogénica.
El resultado es la perdida de la función supresora del gen lo que puede producir cáncer.
Mutaciones críticas para el cáncer (el protooncogen: mutación dominante y el gen supresor: mutación
recesiva).
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Vías de pérdida de función de un gen supresor: cambios genéticos y epigenéticos. Los hechos
epigenéticos y sobre todo el silenciamiento génico es importante en la supresión o inhibición del
gen supresor.
EL GEN SUPRESOR Rb
El gen supresor Rb codifica a la proteína Rb que es nuclear. Este gen se expresa solo en
homozigosis. Fue el primer gen supresor aislado. Su acción es inhibir la acción de la proteína
reguladora de genes E2F, inhibiendo así la división celular actuando en el punto de control G1/S
e impidiendo por tanto la progresión del ciclo celular.
El gen mutado produce una proteína Rb que no tiene esa capacidad inhibitoria y produce
retinoblastoma, un tumor de los retinoblastos (células precursoras de la retina) que se manifiesta
desde la infancia (1:20000 niños), el globo ocular se afecta y el tumor invade el cerebro.
EL RETINOBLASTOMA
Se conocen dos formas de la enfermedad, una hereditaria y la otra no. El gen está en el
cromosoma 13.
La hereditaria cursa con muchos tumores que afectan a los dos ojos. En estos enfermos
inicialmente se herede una mutación tipo deleción o con pérdida de función en una de sus dos
copias del gen Rb. La célula que porta esa mutación se hará cancerosa, cuando inactive la copia
que le queda correcta del gen Rb, dando lugar así al retinoblastoma.
La no hereditaria presenta afectación de un solo ojo y un único tumor. En estos enfermos tras el
nacimiento, ocasionalmente una célula inactiva una de sus dos copias del gen Rb. Raramente la
segunda copia del gen Rb se inactiva en la misma célula para producir un retinoblastoma.
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La proteína Rb junto a otras proteínas participa en los mecanismos que controlan la entrada en
el ciclo celular y el inicio de la fase S.
En ausencia de activación de una vía de crecimiento celular hay interacción proteína Rb/E2F
inhibiendo la acción de E2F.
Pero tras la activación de esta vía tiene lugar el aumento de expresión de genes tempranos como
Myc, este como factor de transcripción aumenta la expresión de genes de respuesta tardía,
incluyendo los que aumentan la actividad del complejo Cdk-G1, el cual a su vez fosforila a las
proteínas Rb.
Esta fosforilación inactiva a la proteína Rb, liberándose la proteína reguladora de genes E2F que
activa la transcripción de los genes de la transición G1/S, incluidos los genes de la ciclina G1/S
(ciclina E) y de la ciclina S (ciclina A).
Además las proteínas E2F también estimulan la transcripción de sus propios genes,
originándose otra retroalimentación positiva.
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El gen supresor p53 codifica a la proteína reguladora de genes p53. Este gen se expresa solo en
homocigosis. La acción de la proteína p53 es estimular la transcripción del gen que codifica la
proteína p21. Esta proteína se une a los complejos Cdk G1/S y Cdk –S e inhibe sus actividades,
ayudando así a bloquear la entrada en el ciclo celular.
A diferencia con la proteína Rb, la prot p53 es muy inestable y sus concentración en la célula es
muy aja como consecuencia de la interacción con otra proteína Mdm2.
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La proteína p53 en las vías de reparación del daño en el DNA. Y puede promover la reparación
del DNA, o lo contrario activar la vía apoptótica conduciendo a la muerte celular.
El 50% de los tumores humanos presenta mutación en este p53. Esta mutación provoca que no
se produzca la proteína p21, por tanto no se inhibe la entrada en el ciclo celular y la célula se
sigue dividiendo.
La persona que hereda una mutación en una copia del gen p53 padece el síndrome de Li-
Fraumeni y tiene una probabilidad elevada de desarrollar diversos tipos de cáncer.
La proteína p53 participa en vías de reparación del daño en el DNA activando la transcripción
de la proteína p21 impidiendo así, la entrada en el ciclo celular.
Es un defecto en el gen que codifica la proteína ATM su deficiencia. ATM es una de las
proteínas quinasas que se activa en respuesta al daño en el DNA inducido por diferentes
mecanismos.
Los enfermos que padecen esta enfermedad son muy sensibles a los rayos X y cursan con
neurodegeneración, predisposición al cáncer e inestabilidad del genoma por falta de reparación
del DNA.
En todos los canceres humanos están mutados el propio p53 o alguno de los componentes de la
vía del p53.
La proteína p53 parece necesaria para el desarrollo normal ya que los animales que les falta de
forma natural o experimental por “gene knoskout”, desarrollan cáncer muy pronto.
P53 proporciona una protección de tal calibre, que mutaciones de Ras y Myc no son suficientes
por sí solas para generar un tumor si no está mutado p53.
Vías de protección de la pro p53 para mantener bajo control el crecimiento de un tumor.
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1. Factores inhibidores del crecimiento celular. Ej: El gen supr c-dcc codifica una prot. de
adhesión celular que inhibe el crecimiento celular. El gen mutado es incapaz de codificar esa
proteína.
4. Proteínas que frenan el ciclo celular o producen apoptosis. Ej: los genes supresores: Rb y
p53 codifican proteínas inhibidoras de los complejos Cdk-ciclinas y actúan como freno en el
punto de control G1/S.
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Es muy común, provoca unas 60.000 muertes al año en USA, y representa alrededor del 10%
del total de muertes por cáncer.
El diagnostico suele darse a edades avanzadas (el 90% después de los 55 años).
Aparece en el epitelio que bordea el colon (intestino grueso) y el recto (la parte más baja del
intestino). Esta zona se renueva celularmente rápido ≈ 1 semana. Esta renovación depende de
las células progenitoras de las zonas profundas de los surcos del epitelio llamadas criptas
intestinales.
Estos podrían ser precursores, puesto que la progresión de la enfermedad es muy lenta 10-35
años. Si se extirpan estos pólipos, la incidencia posterior de tumor es muy baja.
Algunas veces pueden diferenciarse dos o más partes dentro de un mismo pólipo. Una
aparentemente normal, y la otra cancerosa, como si se hubieran producido a partir de un sub-
clon mutado dentro del clon original de células adenomatosas.
En los estadios siguientes, las células tumorales se transforman en invasoras, rompen la lámina
basal y se dispersan a través de la capa muscular que rodea al intestino (en un estadio
avanzado de adenoma, se ve que la masa muscular maligna invade el músculo antes de pasar a
los otros órganos).
Por último, forman metástasis hacia nódulos linfáticos, el hígado, el pulmón y otros tejidos.
Hay que resaltar que la mayoría de pacientes con cáncer colono-rectal no presenta la forma
hereditaria. Pero más del 80% de estos tumores (aunque no en las células normales) tienen
inactivadas ambas copias del gen Apc mediante mutaciones adquiridas a lo largo de la vida.
En ambos casos, y en otra predisposición hereditaria, existe una gran inestabilidad genética
cromosomica.
La deleción o inactivación del gen supresor de tumores Apc que codifica a la proteína Apc, es
un componente inhibidor de la vía de señalización Wnt / β-catenina.
Apc actúa uniéndose a la catenina- producto del protooncogén del mismo nombre y
componente de otra vía. Esta unión induce la degradación de esta última e impide que migre al
núcleo donde actúa como regulador transcripcional para mantener el estado de célula
progenitora en las criptas intestinales.
El hecho de que Apc también puede interaccionar con otros componentes celulares como los
microtúbulos, abre más posibilidades. En este sentido, la pérdida de Apc aumenta la frecuencia
de defectos en el huso mitótico que comportan anormalidades en los cromosomas.
En ausencia de señal Wnt (proliferativa), la catenina-β está inhibida. Esto sucede porque, en
esta situación, APC forma un complejo que fosforilia y ubiquitiniza a la catenina-β. Esto
permite la degradación en los proteosomas de la catenina-β.
Así, los genes que van a través de esta vía, que necesita la acción de la catenina-β, quedan
inactivados. En el complejo formado por la APC, incluye una proteína quinasa responsable de la
fosforilación, una enzima que ubiquitina y a la axina, que en esta situación se encuentra
inactiva.
Con señal Wnt, la catenina-β está activa. En esta situación, la unión de Wnt a los receptores de
membrana activa axina, que se une a éstos e impide que hace que el complejo formado por Apc
fosforile y ubiquitine a la catenina-β.
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El Apc, que es un gen supresor de tumores, se encuentra mutada en más del 80% de los cánceres
humanos de colon. Cuando esto sucede, generalmente, no está mutada también la catenina-β, y
viceversa
La mutación de p53, que también es un gen supresor de tumores, se encuentra en un 60% de los
casos.
Hechos epigenéticos como la metilación, que se relaciona con genes de reparación del DNA,
también está implicada en cánceres humanos.
En este 2º tipo de predisposición hereditaria al tumor colorectal, esta se incrementa sin que
aumente el número de pólipos. Tampoco hay alteraciones cromosómicas en las células
cancerosas del tumor.
En un cierto porcentaje cursan con una mutación espontánea en el gen Apc y tienen gran
tendencia a perder esa heterozigosis. También suelen ser deficientes en el sistema de corrección
de errores de apareamiento en el DNA.
Las mutaciones se encuentran en algunos genes que codifican componentes clave en los
sistemas de reparación de la doble cadena de DNA. En este sentido, en situación de normalidad
las proteínas Muts y Mutl rastrean nuestro DNA en búsqueda de muescas y eliminan la zona
dañada de la cadena mientras que aquí no lo hacen.
NEUROFIBROMATOSIS (NF)
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NF2 tiene una incidencia mayor (1:35000) y presenta menores signos de los antes citados. El
rasgo más característico es el desarrollo ya en la juventud de tumores que implican al octavo
nervio craneal (neuromas acústicos). También se pueden presentar cataratas subclínicas.
En NF1, hay algún caso de pequeño retraso en el aprendizaje. Pero en ambos tipos, la mayoría
de individuos llegan a adultos con vida normal.
GENÉTICA DE LA NEUROFIBROMATOSIS
NF1 presenta herencia autosómica dominante y variabilidad de expresión dentro de una misma
familia.
- El gen relacionado está en el brazo largo del cromosoma 22. El gen abarca 110 Kb y consta
de 17 exones.
- El gen normal codifica a la proteína merlina que es una proteína del citoesqueleto, que podría
estar relacionada con los hechos auditivos antes citados. El gen mutado deja de codificar a esa
proteína.
No hay tratamiento eficaz.
LA PROTEÍNA MERLINA
Es un miembro de una familia de proteínas intracelulares: ERM (nombre por los tres miembros
iniciales).
El dominio N-terminal se une a la cara citoplásmica de algunas glucoproteinas transmembrana.
El dominio C- terminal a los filamentos de actina. Estas uniones mediados por las proteínas
ERM entre el citoesqueleto de actina y la matriz extracelular es sensible a un gran número de
señales recibidas por la célula.
Estos datos del mecanismo de acción de las proteínas ERM son una prueba de la existencia de
sistemas de retroalimentación que conectan elementos estructurales celulares con el control del
crecimiento celular.
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CÁNCER DE MAMA
Entre un 15-20% de las mujeres con cáncer de mama tiene antecedentes familiares. Hay 2 genes
principalmente relacionados: BRCA1 y BRCA2 que son supresores de tumores.
El BRCA1 está mutado en el 40-50% de las familias con cáncer de mama autosómico
dominante de aparición precoz. El BRCA2, en el 30-40% de estas familias.
Ambos genes mutados han perdido su función reparadora de DNA y las células que los
presentan primero cursan con una gran inestabilidad genética que lleva a su presentación
primero en heterozigosis y posteriormente en homozigosis.
Cuando se presenta cualquiera de estas mutaciones hay mayor riesgo de aparición de otros
canceres como el de ovario.
El 70% de los canceres de mama son ER positivos (ER+), es decir que depende de los
estrógenos para desarrollarse.
Estos canceres responden a las terapias antiestrogenicas, bien sea con tamoxifeno (un
antiestrogeno), o con inhibidores de la aromatasa como el exemestano.
Sin embargo, hay un porcentaje de las pacientes que desarrollan resistencia a estos tratamientos
hormonales y en las que la enfermedad no se para sino que avanza.
En estos casos, desde hace aprox una década se añadía el trastuzumab (un anticuerpo contra el
factor de crecimiento epidemal EGF).
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Lo último es en su lugar usar el everolimus (un anticuerpo contra el mTor). Este tratamiento
está en fase experimental (Baselga y col). Este tratamiento triplica el tiempo sin progresión de la
enfermedad.
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Un adulto con una dieta baja en colesterol sintetiza, por término medio, unos 800 mg de
colesterol al día. La colesterolemia optima ~ 200 mg/dl
Las apoproteínas, que son el componente proteico de las lipoproteínas se sintetizan y secretan
por el hígado y el intestino.
El gen que codifica este receptor está en el brazo corto del cromosoma 19 consta de 18 exones
que se corresponden estrictamente con las unidades estructurales de la proteína de este receptor.
Esta proteína tiene un peso de (115 Kd) y consta de 6 tipos de dominios diferentes.
La síntesis del receptor que capta LDL está sujeta a retro- regulación. Es decir, cuando abunda
el colesterol dentro de la célula dejan de sintetizarse nuevos receptores.
La regulación es a nivel transcripcional. El promotor del gen que codifica este receptor tiene un
elemento de respuesta SER “elemento regulador de esteroles” al que se le une el factor de
transcripción “elemento regulador de esteroles” (SREBP). Este factor solo se une al promotor
cuando son bajos los niveles de colesterol, potenciando la transcripción. Cuando son altos es
degradado y no actúa.
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HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR
Se han detectado mutaciones en el receptor de LDL relacionadas con todos los pasos del
proceso de endocitosis.
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Su nombre se debe al neurólogo francés del mismo nombre que la describió por primera vez en
1861.
Ambas son causadas por mutaciones en el mismo gen, el gen de la distrofina, localizado en los
años 80, en el brazo pequeño del cromosoma X.
En la DMD los síntomas empiezan a los 3-5 años, y son de debilidad muscular motora
progresiva que les lleva a la silla de ruedas en la juventud y a una muerte muy temprana.
EL GEN DE LA DISTROFINA
Las deleciones son lo más común con dos puntos principales. Uno en los primeros 20 exones. El
otro entre los 45-53 exones.
Las deleciones que causan DMD suelen alterar el marco de lectura. Mientras que las que causan
DMB no lo hacen.
LA PROTEÍNAS DISTROFINA
Es una proteína muscular que se sitúa cerca de la membrana muscular como un dímero, y enlaza
a la actína intracelular y a la laminina extracelular a través de un complejo glucoprotéico de
varias subunidades.
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Albert Szent-Gyorgyi
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