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Universidade Federal do Rio de Janeiro - Escola de Química

Engenharia de Processos Químicos e Bioquímicos

Modelagem Cibernética da
Produção de Ácido Cítrico
por Yarrowia Lipolytica

Ana Luiza Campos


Felipe di Napoli Garcia

Prof.ª Maria Alice Zarur Coelho

Junho de 2019
Introdução

Existem modelos dinâmicos na literatura capazes de descrever a metabolismo


para produção de ácido cítrico. Porém, alguns modelos estão apenas disponíveis para
representar as vias metabólicas baseadas nos balanços de massa e diferentes
configurações cinéticas. Entretanto, o modelo cibernético permitiu a extensão da
otimização através da inclusão da regulação interna para identificar as etapas
controladoras e os fluxos metabólicos (Yalcin, 2007).

A levedura Yarrowia lipolytica é utilizada extensivamente devido a sua


capacidade de acumular grandes quantidades de produtos importantes de seu
metabolismo, como por exemplo, ácido cítrico, lipídeos, eritritol, etc. Em condições de
excesso de carbono e limitação de nitrogênio, ácido cítrico é produzido (Sauer, 2008)

O ácido cítrico é um ácido orgânico comercialmente importante, amplamente


usado na indústria alimentícia, farmacêutica e de bebidas. É um produto muito
explorado em bioprocessos através dos quais mais de 90% da produção mundial é
obtida por fermentação. Muitos microrganismos podem ser empregados para produção
de ácido cítrico. Dentre eles, a Y. lipolytica possui a vantagem de ser mais resistente a
altas concentrações de substrato que os fungos, além de facilitar o controle do processo
(Yalcin, 2007).

Os modelos que aplicam a análise de controle metabólico, geralmente, não são


muito precisos, pois a capacidade de predição de resultados a partir dos modelos
depende qualitativamente dos dados fornecidos, uma vez que se tratam mais de um
conjunto de técnicas pré-estabelecidas para localização dos pontos de análise de
sensibilidade do que um método de modelagem. (Varner e Ramkrishna, 1999). Com
isso, o modelo cibernético é vantajoso, porque permite tanto a inclusão de fatores
genéticos quanto parâmetros de influência externa, tido como efetores globais de
modificação

Assim, neste trabalho propõe-se a modelagem cibernética da produção de ácido


cítrico pela levedura não-convencional Yarrowia lipolytica. Este tipo de abordagem
para produção de ácido cítrico utilizando glicose como substrato não é relatada
facilmente na literatura
Lista de variáveis

GLI: Glicose
G6P: Glicose-6-fosfato
F6P: Frutose-6-fosfato
E4P: Eritrose-4-fosfato
ERY: Eritritol
MAN: Manitol
GA3P: Glicerolaldeído-3-fosfato
PYR: Piruvato
X: Biomassa
AcC: Ácido Cítrico

Taxas Reacionais

As taxas reacionais, baseadas nos substratos das reações, têm seus modelos
criados a partir daqueles utilizados por Ramkrishna & Varner (1999), como é visto
abaixo. Genericamente, assume-se que e são constantes de taxa e saturação para as
enzimas que consomem um determinado substrato e que e são constantes de taxa e
saturação relativas à indução da produção da enzima por um determinado substrato.

𝑒1 𝐺𝐿𝐼 𝐺𝐿𝐼
𝑟1 = 𝜇1𝑚𝑎𝑥 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 𝑟𝑒1 = 𝛼1 ∗
𝑒1 𝐾𝐺𝐿𝐼 + 𝐺𝐿𝐼 𝐾𝑒1 + 𝐺𝐿𝐼

𝑒2𝑎 𝐺6𝑃 𝐺6𝑃


𝑚𝑎𝑥 𝑟𝑒2𝑎 = 𝛼2𝑎 ∗
𝑟2𝑎 = 𝜇2𝑎 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 2𝑎
𝑒2𝑎 𝐾𝐺6𝑃 + 𝐺6𝑃 𝐾𝑒2𝑎 + 𝐺6𝑃

𝑚𝑎𝑥
𝑒2𝑏 𝐺6𝑃 𝐺6𝑃
𝑟2𝑏 = 𝜇2𝑏 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 2𝑏 𝑟𝑒2𝑏 = 𝛼2𝑏 ∗
𝑒2𝑏 𝐾𝐺6𝑃 + 𝐺6𝑃 𝐾𝑒2𝑏 + 𝐺6𝑃

𝑒3𝑎 𝐹6𝑃 𝐹6𝑃


𝑚𝑎𝑥 𝑟𝑒3𝑎 = 𝛼3𝑎 ∗
𝑟3𝑎 = 𝜇3𝑎 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 3𝑎
𝑒3𝑎 𝐾𝐹6𝑃 + 𝐹6𝑃 𝐾𝑒3𝑎 + 𝐹6𝑃

𝑚𝑎𝑥
𝑒3𝑏 𝐹6𝑃 𝐹6𝑃
𝑟3𝑏 = 𝜇3𝑏 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 3𝑏 𝑟𝑒3𝑏 = 𝛼3𝑏 ∗
𝑒3𝑏 𝐾𝐹6𝑃 + 𝐹6𝑃 𝐾𝑒3𝑏 + 𝐹6𝑃

𝑚𝑎𝑥
𝑒3𝑐 𝐹6𝑃 𝐹6𝑃
𝑟3𝑐 = 𝜇3𝑐 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 3𝑐 𝑟𝑒3𝑐 = 𝛼3𝑐 ∗
𝑒3𝑐 𝐾𝐹6𝑃 + 𝐹6𝑃 𝐾𝑒3𝑐 + 𝐹6𝑃
𝑒4 𝐸4𝑃 𝐸4𝑃
𝑟4 = 𝜇4𝑚𝑎𝑥 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 𝑟𝑒4 = 𝛼4 ∗
𝑒4 𝐾𝐸4𝑃 + 𝐸4𝑃 𝐾𝑒4 + 𝐸4𝑃

𝑒5 𝐺𝐴3𝑃 𝐺𝐴3𝑃
𝑟5 = 𝜇5𝑚𝑎𝑥 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 𝑟𝑒5 = 𝛼5 ∗
𝑒5 𝐾𝐺𝐴3𝑃 + 𝐺𝐴3𝑃 𝐾𝑒5 + 𝐺𝐴3𝑃

𝑒6𝑎 𝑃𝑌𝑅 𝑃𝑌𝑅


𝑚𝑎𝑥 𝑟𝑒6𝑎 = 𝛼6𝑎 ∗
𝑟6𝑎 = 𝜇6𝑎 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 6𝑎
𝑒6𝑎 𝐾𝑃𝑌𝑅 + 𝑃𝑌𝑅 𝐾𝑒6𝑎 + 𝑃𝑌𝑅

𝑒6𝑏 𝑃𝑌𝑅 𝑃𝑌𝑅


𝑚𝑎𝑥 𝑟𝑒6𝑏 = 𝛼6𝑏 ∗
𝑟6𝑏 = 𝜇6𝑏 ∗ ( 𝑚𝑎𝑥 ) ∗ 6𝑏
𝑒6𝑏 𝐾𝑃𝑌𝑅 + 𝑃𝑌𝑅 𝐾𝑒6𝑏 + 𝑃𝑌𝑅

(falar sobre os modelos que catalisam a transferência de grupos(transferases)?)

Variáveis cibernéticas locais

O estudo do mapa metabólico proposto na (citar figura) resulta em uma


realização topológica com cinco vias elementares divergentes (citar Figura). As
variáveis cibernéticas locais complementares serão da forma:
𝑟2𝑎 𝑟2𝑎
𝐴,𝑙
𝑢2𝑎 = 𝑟 𝐹6𝑃 𝐴,𝑙
𝑣2𝑎 = 𝐹6𝑃
2𝑎 𝑟2𝑏 𝑟2𝑎 𝑟2𝑏
𝐹6𝑃 + 𝐸4𝑃 𝑚𝑎𝑥(𝐹6𝑃 , 𝐸4𝑃 )

𝑟2𝑏 𝑟2𝑏
𝐴,𝑙
𝑢2𝑏 = 𝑟 𝐹6𝑃𝑟 𝐴,𝑙
𝑣2𝑏 = 𝐹6𝑃
𝑟2𝑎 𝑟2𝑏
2𝑎 2𝑏
𝐹6𝑃 + 𝐸4𝑃 𝑚𝑎𝑥(𝐹6𝑃 , 𝐸4𝑃 )

𝐵,𝑙 𝑟2𝑏 𝐵,𝑙 𝑟2𝑏


𝑢2𝑏 = 𝑣2𝑏 =
𝑟2𝑏 + 𝑟3𝑎 𝑚𝑎𝑥(𝑟2𝑏 , 𝑟3𝑎 )

𝑙 𝐴,𝑙 𝐵,𝑙 𝑙 𝐴,𝑙 𝐵,𝑙


𝑢2𝑏 = 𝑢2𝑏 ∗ 𝑢2𝑏 𝑣2𝑏 = 𝑣2𝑏 ∗ 𝑣2𝑏

𝐵,𝑙 𝑟3𝑎 𝐵,𝑙 𝑟3𝑎


𝑢3𝑎 = 𝑣3𝑎 =
𝑟2𝑎 + 𝑟3𝑎 𝑚𝑎𝑥(𝑟2𝑏 , 𝑟3𝑎 )
𝑟3𝑎 𝑟3𝑎
𝐶,𝑙
𝑢3𝑎 = 𝑟 𝐸4𝑃 𝐶,𝑙
𝑣3𝑎 = 𝐸4𝑃
3𝑎 𝑟3𝑏 𝑟3𝑐 𝑟3𝑎 𝑟3𝑏 𝑟3𝑐
+ + 𝑚𝑎𝑥(𝐸4𝑃 , 𝐺𝐴3𝑃 , 𝑀𝐴𝑁 )
𝐸4𝑃 𝐺𝐴3𝑃 𝑀𝐴𝑁
𝑙 𝐵,𝑙 𝐶,𝑙 𝑙 𝐵,𝑙 𝐶,𝑙
𝑢3𝑎 = 𝑢3𝑎 ∗ 𝑢3𝑎 𝑣3𝑎 = 𝑣3𝑎 ∗ 𝑣3𝑎

𝑟3𝑏 𝑟3𝑏
𝐶,𝑙
𝑢3𝑏 = 𝑟 𝐺𝐴3𝑃 𝐶,𝑙
𝑣3𝑏 = 𝐺𝐴3𝑃
3𝑎 𝑟3𝑏 𝑟3𝑐 𝑟3𝑎 𝑟3𝑏 𝑟3𝑐
𝐸4𝑃 + 𝐺𝐴3𝑃 + 𝑀𝐴𝑁 𝑚𝑎𝑥(𝐸4𝑃 , 𝐺𝐴3𝑃 , 𝑀𝐴𝑁 )
𝑟3𝑐 𝑟3𝑐
𝐶,𝑙
𝑢3𝑐 = 𝑟 𝑀𝐴𝑁 𝐶,𝑙
𝑣3𝑐 = 𝑀𝐴𝑁
3𝑎 𝑟3𝑏 𝑟3𝑐 𝑟3𝑎 𝑟3𝑏 𝑟3𝑐
𝐸4𝑃 + 𝐺𝐴3𝑃 + 𝑀𝐴𝑁 𝑚𝑎𝑥(𝐸4𝑃 , 𝐺𝐴3𝑃 , 𝑀𝐴𝑁 )

𝑟6𝑎 𝑟6𝑎
𝑙
𝑢6𝑎 = 𝑟 𝑋𝑟 𝑙
𝑣6𝑎 = 𝑋
𝑟6𝑎 𝑟6𝑏
6𝑎 6𝑏
𝑋 + 𝐴𝑐𝐶 𝑚𝑎𝑥( 𝑋 , 𝐴𝑐𝐶 )

𝑟6𝑏 𝑟6𝑏
𝑙
𝑢6𝑏 = 𝑟 𝐴𝑐𝐶 𝑙
𝑣6𝑏 = 𝐴𝑐𝐶
6𝑎 𝑟6𝑏 𝑟6𝑎 𝑟6𝑏
𝑋 + 𝐴𝑐𝐶 𝑚𝑎𝑥( 𝑋 , 𝐴𝑐𝐶 )

Variáveis Cibernéticas Globais

São as variáveis que refletem a influência dos componentes do meio de cultivo e das
condições ambientais sobre a topologia do modelo proposto. Assim, são relevantes os
seguintes fatores:

 A fonte de nitrogênio, que deve ser limitada a um mínimo para que haja
produção de ácido cítrico sem que, com isso, a manutenção das funções
fisiológicas da célula;
 O pH, que pode desviar o metabolismo da produção de ácido cítrico para
produção de polióis;
 A concentração do substrato utilizado como fonte de carbono (glicose), que terá
influenciará na produção de biomassa e na produção/degradação de produto;

Assim, teremos as seguintes variáveis cibernéticas globais:

 Para reproduzir os efeitos dos desvios de pH e mudança de pressão osmótica


resultante da adição de NACl, temos:

𝑔 𝑘𝑝𝐻 𝑁𝑎𝐶𝑙 𝑀𝑛+2


𝑉4 = ( )( )( )
𝑝𝐻 + 𝑘𝑝𝐻 𝑘𝑁𝑎𝐶𝑙 + 𝑁𝑎𝐶𝑙 𝑘𝑀𝑛+2 + 𝑀𝑛+2

𝑔 𝑘𝑝𝐻 𝑘𝑁
𝑉6𝑎 = ( )( )
𝑝𝐻 + 𝑘𝑝𝐻 𝑁 + 𝑘𝑁
 Para contabilizar os efeitos do substrato no crescimento celular e o meio
deficiente em nitrogênio, que leva à produção de ácido cítrico:

𝑔 𝐺𝐿𝐼 𝑘𝑁 𝑂2
𝑉6𝑏 = ( )( )( )
𝑘𝐺𝐿𝐼 + 𝐺𝐿𝐼 𝑁 + 𝑘𝑁 𝑂2 + 𝑘𝑂2

Variáveis Cibernéticas Completas

Então, podemos escrever as variáveis cibernéticas completas como o produto da


variável local pela variável global. Assim, tempo as seguintes variáveis:

𝑢1 = 1 𝑣1 = 1
𝐴,𝑙 𝐴,𝑙
𝑢2𝑎 = 𝑢2𝑎 𝑣2𝑎 = 𝑣2𝑎
𝑙 𝑙 𝑔
𝑢2𝑏 = 𝑢2𝑏 𝑣2𝑏 = 𝑣2𝑏 ∗ 𝑉2𝑏
𝑙 𝑙 𝑔
𝑢3𝑎 = 𝑢3𝑎 𝑣3𝑎 = 𝑣3𝑎 ∗ 𝑉3𝑎
𝐶,𝑙 𝐶,𝑙
𝑢3𝑏 = 𝑢3𝑏 𝑣3𝑏 = 𝑣3𝑏
𝐶,𝑙 𝐶,𝑙 𝑔
𝑢3𝑐 = 𝑢3𝑐 𝑣3𝑐 = 𝑣3𝑐 ∗ 𝑉3𝑐
𝑔
𝑢4 = 1 𝑣4 = 𝑉4
𝑢5 = 1 𝑣5 = 1
𝑙 𝑙 𝑔
𝑢6𝑎 = 𝑢6𝑎 𝑣6𝑎 = 𝑣6𝑎 ∗ 𝑉6𝑎
𝑙 𝑙 𝑔
𝑢6𝑏 = 𝑢6𝑏 𝑣6𝑏 = 𝑣6𝑏 ∗ 𝑉6𝑏

Balanço das variáveis de estado

Neste trabalho, considerou-se apenas o piruvato (PYR) como produto do


crescimento celular, assim, o balanço de geração de célula será feito apenas para ele.

A única fonte de carbono utilizado foi a glicose (GLI), que entra na célula por
difusão a uma taxa que é mostrada abaixo. Além disso, saem da célula ácido cítrico,
manitol e eritritol. Suas respectivas taxas difusivas são mostradas abaixo.
 Difusão de moléculas

𝑅𝐺𝐿𝐼 = 𝐾𝑑,𝐺𝐿𝐼 ∗ (𝐺𝐿𝐼 − 𝜌 ∗ 𝐺𝐿𝐼𝑒𝑥𝑡 )


𝐺𝐿𝐼
𝐷𝐺𝐿𝐼 = 𝑅𝑑,𝐺𝐿𝐼 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥
𝑅𝐴𝑐𝐶 = 𝐾𝑑,𝐴𝑐𝐶 ∗ (𝐴𝑐𝐶 − 𝜌 ∗ 𝐴𝑐𝐶𝑒𝑥𝑡 )
𝐴𝑐𝐶
𝐷𝐴𝑐𝐶 = 𝑅𝑑,𝐴𝑐𝐶 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥
𝑅𝑀𝐴𝑁 = 𝐾𝑑,𝑀𝐴𝑁 ∗ (𝑀𝐴𝑁 − 𝜌 ∗ 𝑀𝐴𝑁𝑒𝑥𝑡 )
𝑀𝐴𝑁
𝐷𝑀𝐴𝑁 = 𝑅𝑑,𝑀𝐴𝑁 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥
𝑅𝐸𝑅𝑌 = 𝐾𝑑,𝐸𝑅𝑌 ∗ (𝐸𝑅𝑌 − 𝜌 ∗ 𝐸𝑅𝑌𝑒𝑥𝑡 )
𝐸𝑅𝑌
𝐷𝐸𝑅𝑌 = 𝑅𝑑,𝐸𝑅𝑌 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥

Onde ρ representa a densidade celular e o subscrito “EXT” denota o metabólito


externo à célula. Kd,xxx representa o coeficiente de difusividade de cada metabólito
pela membrana celular.

 Balanço externo

𝑑𝐺𝐿𝐼𝑒𝑥𝑡 𝐺𝐿𝐼
= 𝐺𝐿𝐼𝑒𝑥𝑡 − 𝑅𝑑,𝐺𝐿𝐼 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥 ∗𝑋
𝑑𝑡
𝑑𝐴𝑐𝐶𝑒𝑥𝑡 𝐴𝑐𝐶
= 𝑅𝑑,𝐴𝑐𝐶 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥 ∗𝑋
𝑑𝑡
𝑑𝑀𝐴𝑁𝑒𝑥𝑡 𝑀𝐴𝑁
= 𝑅𝑑,𝑀𝐴𝑁 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥 ∗𝑋
𝑑𝑡
𝑑𝐸𝑅𝑌𝑒𝑥𝑡 𝐸𝑅𝑌
= 𝑅𝑑,𝐸𝑅𝑌 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥 ∗𝑋
𝑑𝑡
 Balanço interno

𝑑𝐺𝐿𝐼 𝐺𝐿𝐼
= 𝑅𝑑,𝐺𝐿𝐼 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥 − 𝑟1 ∗ 𝑣1
𝑑𝑡
𝑑𝐺6𝑃
= 𝑟1 ∗ 𝑣1 − 𝑟2𝑎 ∗ 𝑣2𝑎 − 𝑟2𝑏 ∗ 𝑣2𝑏
𝑑𝑡
𝑑𝐹6𝑃
= 𝑟2𝑎 ∗ 𝑣2𝑎 − 𝑟3𝑎 ∗ 𝑣3𝑎 − 𝑟3𝑏 ∗ 𝑣3𝑏 − 𝑟3𝑐 ∗ 𝑣3𝑐
𝑑𝑡
𝑑𝐸4𝑃
= 𝑟2𝑏 ∗ 𝑣2𝑏 + 𝑟3𝑎 ∗ 𝑣3𝑎 − 𝑟4 ∗ 𝑣4
𝑑𝑡
𝑑𝐸𝑅𝑌 𝐸𝑅𝑌
= 𝑟4 ∗ 𝑣4 − 𝑅𝑑,𝐸𝑅𝑌 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥
𝑑𝑡
𝑑𝑀𝐴𝑁 𝑀𝐴𝑁
= 𝑟3𝑐 ∗ 𝑣3𝑐 − 𝑅𝑑,𝑀𝐴𝑁 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥
𝑑𝑡
𝑑𝐺𝐴3𝑃
= 𝑟3𝑏 ∗ 𝑣3𝑏 − 𝑟5 ∗ 𝑣5
𝑑𝑡
𝑑𝑃𝑌𝑅
= 𝑟5 ∗ 𝑣5 − 𝑟6𝑎 ∗ 𝑣6𝑎 − 𝑟6𝑏 ∗ 𝑣6𝑏
𝑑𝑡
𝑑𝑋
= 𝑟6𝑎 ∗ 𝑣6𝑎 ∗ 𝑋
𝑑𝑡
𝑑𝐴𝑐𝐶 𝐴𝑐𝐶
= 𝑟6𝑏 ∗ 𝑣6𝑏 − 𝑅𝑑,𝐴𝑐𝐶 ∗ 𝑉𝑓𝑙𝑢𝑥
𝑑𝑡

 Balanço de enzimas

𝑑𝑒1
= 𝑟𝑒1 ∗ 𝑢1 − 𝛽 ∗ 𝑒1
𝑑𝑡
𝑑𝑒2𝑎
= 𝑟𝑒2𝑎 ∗ 𝑢2𝑎 − 𝛽 ∗ 𝑒2𝑎
𝑑𝑡
𝑑𝑒2𝑏
= 𝑟𝑒2𝑏 ∗ 𝑢2𝑏 − 𝛽 ∗ 𝑒2𝑏
𝑑𝑡
𝑑𝑒3𝑎
= 𝑟𝑒3𝑎 ∗ 𝑢3𝑎 − 𝛽 ∗ 𝑒3𝑎
𝑑𝑡
𝑑𝑒3𝑏
= 𝑟𝑒3𝑏 ∗ 𝑢3𝑏 − 𝛽 ∗ 𝑒3𝑏
𝑑𝑡
𝑑𝑒3𝑐
= 𝑟𝑒3𝑐 ∗ 𝑢3𝑐 − 𝛽 ∗ 𝑒3𝑐
𝑑𝑡
𝑑𝑒4
= 𝑟𝑒4 ∗ 𝑢4 − 𝛽 ∗ 𝑒4
𝑑𝑡
𝑑𝑒5
= 𝑟𝑒5 ∗ 𝑢5 − 𝛽 ∗ 𝑒5
𝑑𝑡
𝑑𝑒6𝑎
= 𝑟𝑒6𝑎 ∗ 𝑢6𝑎 − 𝛽 ∗ 𝑒6𝑎
𝑑𝑡
𝑑𝑒6𝑏
= 𝑟𝑒6𝑏 ∗ 𝑢6𝑏 − 𝛽 ∗ 𝑒6𝑏
𝑑𝑡

Onde β é um parâmetro de decaimento da enzima. Neste modelo, não foi


especificada a taxa de síntese de enzima constitutiva, porque foi considerado todas
induzidas por substrato.

Referências

YALCIN, Seda Karasu; Bozdemir M. Tijen – Citric Acid production by yeasts:


Fermentation conditions, process optimization and strain improvement

KAMZOLOVA SV, Morgunov IG, Aurich A. Lipase Secretion and citric acid
production in Yarrowia Lipolytica yeast grown on animal and vegetable fat. Food
technology and Biotechnology. 2005.

SAUER M, Porro D, Mattanovich D. Microbial production of organic acids: expanding


the markets. Trends in Biotechnology. 2008

RANE KD, Sims K.A. Production of citric acid by Candida lipolytica Y1095: Effect of
glucose concentration on yield and productivity. Enzyme and Microbial Technology.
1993.

TOMASZEWSKA, L.; RYMOWICZ, W.; RYWINSKA, A.; Mineral Supplementation


Increases Erythrose Reductase Activity in Erythritol Biosynthesis from Glycerol by
Yarrowia lipolytica. Appl Biochem Biotechnol. v.172. p.3069–3078. 2014.
VARNER, J.; RAMKRISHNA, D.; Metabolic Engineering from a Cybernetic
Perspective: Aspartate Family of Amino Acids. Metabolic engineering. v.1. p. 88-116.
1999