T Uce 0008 098

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
“Estudio de hidrólisis en aceite de coco virgen (Cocus nucífera) mediante el uso de lipasas
inmovilizadas aplicando el diseño de superficie de respuesta”
Autor: Israel Bolívar Cachago Chávez
isralcach@hotmail.com
Trabajo de investigación para optar por el grado de QUÍMICO DE ALIMENTOS
TUTOR: Dr. Eduardo Mayorga
emayorga@uce.edu.ec
Quito, Abril 2015

Cachago Chávez, Israel Bolívar (2015). Estudio de
hidrólisis en aceite de coco virgen (Cocus nucífera)
mediante el uso de lipasas inmovilizadas aplicando
el diseño de superficie de respuesta. Trabajo de
investigación para optar por el grado de Química de
Alimentos. Carrera de Química en Alimentos.
Quito: 95
ii
DEDICATORIA
A mis padres por todos estos años de amor, dedicación y trabajo, y que juntos transmiten en mi
valores y fortaleza para enprender en cualquier desafio de la vida.
A mis hermanos por su compañía y confianza en todo momento, y a mi hermana por la alegría que
me brinda.
A mis tios por la motivación y por la felicidad que mostraron al verme realizado.
A mis amigos que durante este tiempo supieron brindarme su aliento llena de aventuras y risas.
iii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por guiarme hacia la meta anhelada y acompañarme en cada momento.
A la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de Ciencias Químicas por el cobijo y la

innegable sabiduría transmitida.
A mi tutor y profesores por compartir sus conocimientos y por darme así la oportunidad de
consolidar mi carrera.
A los colaboradores de LA FABRIL por recibirme y darme la posibilidad de crecer

profesionalmente.
iv
v
vi
vii
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
La investigación se realizó en los laboratorios de Biotecnología y de Análisis Instrumental

pertenecientes a la empresa La Fabril S.A., localizada en la ciudad de Montecristi provincia de
Manabí, en el km 5 1/2 vía Manta-Montecristi, donde se prestaron todas las facilidades y
colaboración para la ejecución del presente proyecto.
viii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
pág.
CAPÍTULO I ....................................................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 1
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.............................................................................. 1
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA .................................................................................. 2
1.3 OBJETIVOS.......................................................................................................................... 2
1.3.1 Objetivo general ............................................................................................................. 2
1.3.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 2
1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN ................................................................................. 2
CAPÍTULO II ..................................................................................................................................... 4
MARCO TEÓRICO........................................................................................................................ 4
2.1 ANTECEDENTES ................................................................................................................ 4
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO................................................................................................. 5
2.2.1 Aceites y grasas .............................................................................................................. 5
2.2.1.1 Ácidos grasos ............................................................................................................ 5
2.2.1.2 Acilgliceroles ............................................................................................................ 7
2.2.1.3 Triacilgliceroles ........................................................................................................ 8
2.2.2 Ácidos grasos de cadena media ...................................................................................... 8
2.2.3 Aplicaciones y usos de MCT ........................................................................................ 10
2.2.4 Aceite de coco virgen ................................................................................................... 10
2.2.4.1 Características del aceite de coco virgen ................................................................ 11
2.2.5 Lipasas .......................................................................................................................... 12
2.2.5.1 Inmovilización ........................................................................................................ 13
2.2.5.2 Actividad lipásica ................................................................................................... 14
2.2.5.3 Especificidad .......................................................................................................... 14
2.2.5.4 Reacciones catalizadas por lipasas ......................................................................... 15
2.2.5.5 Hidrólisis de lipasas ................................................................................................ 16
2.2.5.6 Factores que afectan las reacciones catalizadas por lipasa ..................................... 17
2.2.6 Parámetros de calidad ................................................................................................... 18
2.2.6.1 Humedad ................................................................................................................. 18
2.2.6.2 Punto de fusión ....................................................................................................... 19
2.2.6.3 Índice de peróxido .................................................................................................. 19
2.2.6.4 Índice de acidez ...................................................................................................... 19
2.2.6.5 Índice de saponificación ......................................................................................... 20
ix
2.2.7 Cromatografía de gases................................................................................................. 20
2.2.8 Metodología de superficie de respuesta ........................................................................ 21
2.2.8.1 Prueba de significancia de los coeficientes estimados en el modelo ajustado ....... 23
2.2.8.2 Diseños de superficie de respuesta ......................................................................... 24
2.3 FUNDAMENTO LEGAL ................................................................................................... 25
CAPÍTULO III .................................................................................................................................. 26
METODOLOGÍA ......................................................................................................................... 26
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN .............................................................................................. 26
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA .............................................................................................. 26
3.2.1 Población ...................................................................................................................... 26
3.2.2 Muestra ......................................................................................................................... 26
3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL............................................................................................... 26
3.3.1 Variables ....................................................................................................................... 26
3.3.2 Diseño estadístico ......................................................................................................... 27
3.4 DISEÑO METODOLÓGICO ............................................................................................. 29
3.4.1 Materiales y reactivos ................................................................................................... 29
3.4.1.1 Equipos y materiales ............................................................................................... 30
3.4.1.2 Reactivos ................................................................................................................ 30
3.4.2 Métodos ........................................................................................................................ 30
3.4.2.1 Caracterización de aceite de coco virgen................................................................ 30
3.4.2.2 Hidrólisis enzimática en aceite de coco virgen....................................................... 31
3.4.2.3 Análisis y rendimiento de la reacción de hidrólisis ................................................ 31
CAPÍTULO IV .................................................................................................................................. 33
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ......................................................................... 33

4.1 ANALISIS DE ACEITE DE COCO VIRGEN................................................................... 33
4.1.1 Perfil de ácidos grasos .................................................................................................. 33
4.2 ACTIVIDAD LIPOLÍTICA ................................................................................................ 34
4.3 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA ............................................................................................. 35
4.3.1 Ajuste de los modelos y análisis de varianza (ANOVA) ............................................. 37
4.3.1.1 Addzymes TL 165 G .............................................................................................. 38
4.3.1.2 Lipozymes 435 ....................................................................................................... 41
4.3.1.3 Lipozyme TL IM .................................................................................................... 45
4.3.1.4 Lipozymes RM IM ................................................................................................. 48
CAPITULO V ................................................................................................................................... 53
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................................... 53
x
5.1 CONCLUSIONES .............................................................................................................. 53
5.2 RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 54
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 55
ANEXOS ........................................................................................................................................... 58
xi
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 2.1 Nomenclatura y clasificación de ácidos grasos ................................................................... 6
Tabla 2.2 Características fisicoquímicas de los MCT. ........................................................................ 9
Tabla 2.3 Características fisicoquímicas del aceite de coco virgen. ................................................. 11
Tabla 2.4 Composición de ácidos grasos de aceite de coco virgen ................................................... 12
Tabla 2.5 Diseños de superficie de respuesta .................................................................................... 24
Tabla 3.6 Factores y niveles de RSM en Addzymes TL 165 G ........................................................ 27
Tabla 3.7 Factores y niveles de RSM en Lipozymes 435, Lipozyme TL IM y Lipozymes RM IM 27
Tabla 3.8 Resumen de diseño propuesto ........................................................................................... 28
Tabla 3.9 Modelo de diseño de RSM (Box-Behnken) ...................................................................... 28
Tabla 3.10 Características de enzimas lipídicas en estudio............................................................... 29
Tabla 4.11 Características fisicoquímicas analizadas para el aceite de coco virgen ......................... 33
Tabla 4.12 Perfil de ácidos grasos ..................................................................................................... 34
Tabla 4.13 Resultados de actividad lipídica basado en la modificación de grasa por
interesterificación enzimática ............................................................................................................ 34
Tabla 4.14 Porcentaje de hidrólisis diseño de RSM Addzymes TL 165 G ....................................... 35
Tabla 4.15 Porcentaje de hidrólisis diseño de RSM Lipozymes 435 ................................................ 36
Tabla 4.16 Porcentaje de hidrólisis diseño de RSM Lipozyme TL IM ............................................. 36
Tabla 4.17 Porcentaje de hidrólisis diseño de RSM Lipozymes RM IM .......................................... 37
Tabla 4.18 Resultados del análisis de varianza de hidrólisis enzimática empleando Design-Expert
9.0.3 ................................................................................................................................................... 38
9.3.1 ................................................................................................................................................... 42
9.3.1 ................................................................................................................................................... 45
9.0.3 ................................................................................................................................................... 49
xii
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 2.1 Modelos de ácidos grasos, los tres se encuentran de forma plana ..................................... 5
Figura 2.2 Clasificación de triacilgliceroles ........................................................................................ 7
Figura 2.3 Esquema y formación de un triglicérido ............................................................................ 8
Figura 2.4 Composición de ácidos grasos de aceite de coco y otros aceites vegetales. ...................... 9
Figura 2.5 Corte de nuez de coco ...................................................................................................... 11
Figura 2.6 Enzimas inmovilizadas producidos por diversos métodos. ............................................. 13
Figura 2.7 Modelo hipotético de fijación de lipasa en una interfaz aceite / agua. ............................ 14
Figura 2.8 Regioespecificidad de las lipasas. .................................................................................... 15
Figura 2.9 Etapas de una reacción catalizada por lipasas................................................................. 17
Figura 2.10 Punto de fusión del ácido esteárico ................................................................................ 19
Figura 2.11 Reacción de identificación de peróxidos ....................................................................... 19
Figura 2.12 Reacción de saponificación ........................................................................................... 20
Figura 2.13 Reacción de formación de esteres metílicos .................................................................. 21
Figura 2.14 Mejor tratamiento y punto óptimo, región experimental y región de operatividad. ...... 21
Figura 2.15 Representación gráfica del modelo de respuesta tridimensional ................................... 22
Figura 2.16 Modelo de análisis de varianza ..................................................................................... 23
Figura 4.15 Diagrama de columnas de ácidos grasos presentes en le aceite de coco virgen ............ 34
Figura 4.16 Superficie de respuesta para el % de hidrólisis de datos experimentales de la lipasa
Addzymes TL 165 G, mostrando el efecto del porcentaje de agua (A), temperatura (C) y su
interacción ......................................................................................................................................... 39
Addzymes TL 165 G, mostrando el efecto del porcentaje de agua (A), tiempo (B) y su interacción
........................................................................................................................................................... 39
Addzymes TL 165 G, mostrando el efecto de la temperatura (C), tiempo (B) y su interacción ....... 40
Figura 4.19 Gráfico de cubo para la respuesta de rendimiento de hidrólisis predicha en
combinaciones de niveles bajo y alto, lipasa Addzymes TL 165 G ................................................. 41
Lopozymes 435, mostrando el efecto de la % de agua (A), tiempo (B) y su interacción ................. 43
Lipozymes 435, mostrando el efecto de % de agua (A), temperatura (C) y su interacción .............. 43
Lipozymes 435, mostrando el efecto del tiempo (B), temperatura (C) y su interacción................... 44
xiii
combinaciones de niveles bajo y alto, lipasa Lipozymes 435 ......................................................... 44
Lipozymes TL IM, mostrando el efecto del tiempo (B), % agua (A) y su interacción ..................... 46
Lipozymes TL IM, mostrando el efecto del % de agua (A), temperatura (C) y su interacción ........ 47
Lipozymes TL IM, mostrando el efecto del tiempo (B), temperatura (C) y su interacción .............. 47
combinaciones de niveles bajo y alto, lipasa Lipozymes TL IM ...................................................... 48
Lipozymes RM IM, mostrando el efecto del % de agua (A), del tiempo (B) y su interacción ........ 50
Lipozymes RM IM, mostrando el efecto del % de agua (A), temperatura (C) y su interacción ....... 50
Lipozymes RM IM, mostrando el efecto del tiempo (B), temperatura (C) y su interacción ............ 51
combinaciones de niveles bajo y alto lipasa Lipozymes RM IM ...................................................... 51
xiv
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1 Hoja técnica Addzymes Tl 165G ........................................................................................ 58

Anexo 2 Hoja técnica Lipozyme TL IM ........................................................................................... 60
Anexo 3 Hoja técnica Lipozymes 435 .............................................................................................. 61
Anexo 4 Método determinación de humedad ................................................................................... 62
Anexo 5 Método para la determinación del índice de acidez............................................................ 63
Anexo 6 Método para la determinación del punto de fusión ............................................................ 65
Anexo 7 Método para la determinación del índice de peróxido........................................................ 69
Anexo 8 Método para la determinación del índice de saponificación .............................................. 71
Anexo 9 Instructivo para cromatografía de gases ............................................................................. 73
Anexo 10 Método de análisis de metil ésteres de ácidos grasos por cromatografía de gases .......... 75
Anexo 11 Certificado de análisis de aceite de coco virgen ............................................................... 78
xv
Estudio de hidrólisis en aceite de coco virgen (Cocus nucífera) mediante el uso de lipasas
inmovilizadas aplicando el diseño de superficie de respuesta
RESUMEN DOCUMENTAL
El aceite de coco virgen (VCO) tiene características funcionales importantes, debido

principalmente a sus propiedades nutricionales a nivel metabólico y energético por la presencia de
ácidos grasos de cadena media que posee en su composición. A pesar de la obtención de ácidos
grasos libres (AGL) por varios procesos hidrolíticos, el empleo de la hidrólisis enzimática no
genera buenos rendimientos debido a las diversas variables que deben controlarse al momento de la
reacción, por lo que el presente trabajo investigó la obtención de ácidos grasos libres en la
hidrólisis catalizada por cuatro diferentes enzimas inmovilizadas a una concentración de 5 %
respecto al sustrato en el aceite de coco virgen. Se evaluó el efecto de diversas variables de proceso
como la cantidad de agua, temperatura y tiempo, y se optimizó estas condiciones mediante el uso
de la metodología del diseño de superficie de respuesta. Los resultados mostraron que las mejores
combinaciones obtenidas fueron con un 25 % de agua a una temperatura de 50 ºC con el uso de
Addzymes TL 165G, el cual alcanzó un 73 % de ácidos grasos libres en 3 horas de reacción;
mientras que con Lipozymes RM IM con un 25% de agua a 50 ºC alcanzó un 59 % de ácidos
grasos libres en 6 horas. En el caso de Lipozymes TL IM y Lipozymes 435 se obtuvieron
rendimientos del 38 % y 27 % de ácidos grasos libres respectivamente, sus combinaciones fueron
con un 25 % de agua a 50 ºC en 6 horas usando Lipozymes TL IM, y con Lipozymes 435 con el 5
% de agua a 70 ºC en 3 horas de reacción.
Palabras clave:
HIDRÓLISIS, ACEITE DE COCO VIRGEN, LIPASA INMOVILIZADA, OPTIMIZACIÓN DE

PARÁMETROS, DISEÑO DE SUPERFICIE DE RESPUESTA.
xvi
Hydrolysis in virgin coconut oil (Cocus nucífera) by using immobilized lipases by applying
response surface design
DOCUMENTARY ABSTRACT
Virgin coconut oil (VCO) is provided of relevant functional characteristics, mainly due to
nutritional properties on the metabolic and energetics field, due to the presence of médium-chain
fatty acids in its composition. In spite of the obtaining of free fatty acids (FFA) through various
hydrolytic processes, the use of enzymatic hydrolysis does not provide good performance due to
diverse variables to be controlled upon reaction. The current paper work researched on the way
obtaining free fatty acid through catalyzed hydrolysis, in four diverse immobilized enzymes at a
concentration of 5% in respect to the subtract in the virgin coconut oil. The effect of diverse
process variables, such us the amount of water, temperature and time, and by enhancing such
conditions, by using response surface design methodology. Results showed that the best
combinations obtained with 25% water at 50 ° C by using Addzymes TL 165G, which reached
73% of free fatty acids in 3 hours reaction; while with Lipozymes RM IM with 25% water at 50 °
C reached 59% of free fatty acids in 6 hours. For the case of Lipozymes TL IM and Lipozymes 435
performances of 38% and 27% free fatty acids were obtained respectively, in combinations with
25% water at 50 ° C in 6 hours by using Lipozymes TL IM, and with Lipozymes 435 with 5%
water at 70 °C in 3 hours reaction.
Keywords:
HYDROLYSIS, VIRGIN COCONUT OIL, IMMOBILIZED LIPASE, PARAMETERS

ENHANCEMENT, REPONSE SURFACE METHODOLOGY
xvii
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
Las grasas y los aceites son ésteres de ácidos grasos saturados e insaturados unidos al glicerol, su
hidrólisis involucra básicamente reacciones con el agua para liberarlos; existen diversos medios
para la producción de ácidos grasos como la hidrólisis química y la hidrólisis enzimática; esta
última ruta confiere ventajas al ser de origen natural, alta especificidad y que se llevan a cabo en
condiciones ambientales, pero su rendimiento está condicionado por diversos factores que
intervienen en la reacción.
Los ácidos grasos de cadena media (AGCM) son una clase de lípidos que se encuentran presentes
con un elevado porcentaje en el aceite de coco y palmiste, además están en otros aceites extraídos
de semillas de plantas oleaginosas, como el aceite de palma real; estos AGCM se caracterizan
principalmente por sus propiedades nutricionales y metabólicas; diferenciándose así de otras grasas
y aceites que frecuentemente se consume y que generalmente presentan ácidos grasos de cadena
larga (LCT).
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La obtención de diversos productos requieren como componente esencial ácidos grasos libres
(AGL) y sus derivados, los cuales se obtienen a partir de la hidrólisis de grasas y aceites, estudios
sobre el uso de lipoenzimas para la hidrólisis de ácidos grasos (AG) demuestran que depende en
gran medida de la variedad de biocatalizadores, tipos de aceites vegetales y también de diferentes
factores como la temperatura y el tiempo para alcanzar un valor cercano al 100 % de hidrólisis
como se alcanza generalmente en la hidrólisis química.
En el caso de la hidrólisis catalizada por lipasas, en trabajos llevados a cabo anteriormente por
Rodríguez, Sanhueza, Valenzuela y Nieto, demuestran un rendimiento del 80 al 90% de hidrólisis
en 50 horas de reacción, o inclusive más; a nivel industrial tiempos tan largos no son rentables, por
lo que se busca la optimización del proceso que conlleve a tiempos más cortos alcanzando los
mismos rendimientos.
Actualmente la gran diversidad de lipasas a generado un estudio más selectivo para cada una de
ellas en diversos sustratos de interés, debido especialmente a su gran heterogeneidad en los
sistemas enzima-soporte, influenciando notablemente el tipo de aceite y las características que
posee al momento de la reacción; por todo esto se evaluó las mejores condiciones en las que se
puede llevar acabo la reacción de hidrólisis catalizada por diferentes lipasas.
1
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Con el empleo de biocatalizadores, se está desarrollando líneas de productos alimenticios más

sanos, naturales y con propiedades funcionales, sin embargo, el rendimiento de estos catalizadores
está influenciado por parámetros y condiciones importantes que optimizan su desempeño.
De lo antes mencionado aparece la siguiente incógnita en el presente trabajo de investigación:
¿Cómo optimizar la hidrólisis en aceite de coco virgen (Cocus nucífera) mediante el uso de lipasas
inmovilizadas aplicando el diseño de superficie de respuesta?
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 Objetivo general
Estudiar el proceso de hidrólisis en aceite de coco virgen (Cocus nucífera) mediante el uso de
lipasas inmovilizadas: Lipozymes 435, Addzymes TL 165G, Lipozymes TL IM y Lipozymes RM
IM, aplicando el diseño de superficie de respuesta.
1.3.2 Objetivos específicos
• Evaluar las características iniciales del aceite de coco virgen mediante la determinación de:
porcentaje de humedad, índice de acidez, índice de peróxidos, índice de saponificación y
perfil de ácidos grasos.
• Desarrollar el diseño de superficie de respuesta con los siguientes factores: porcentaje de
agua, tiempo, temperatura y variable de respuesta el porcentaje de hidrólisis; para cada
lipasa en estudio y empleando el software Desing Expert versión 9.0.3.1.
• Determinar el porcentaje de hidrólisis usando las enzimas Lipozymes 435, Addzymes TL
165G, Lipozymes TL IM y Lipozymes RM IM.
• Comparar los resultados obtenidos del porcentaje de hidrólisis e identificar que
combinación de factores se obtiene mejores resultados mediante gráficas de superficie de
respuesta.
• Evaluar los modelos propuestos en cada enzima, entre los factores y la variable de
respuesta mediante el análisis de varianza (ADEVA) y el coeficiente de determinación
(R2).
1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN
La hidrólisis de lípidos tiene como objetivo principal la obtención de ácidos grasos y glicerol, pero
también la de mono y di glicéridos; la producción de ácidos grasos en aceites y grasas naturales es
2
de alto interés en la explotación económica de materias primas renovables obtenidas naturalmente
(Ramachandra Murty , Bhat , & Muniswaran , 2002), ya que son ampliamente utilizados en la
producción de jabones, detergentes sintéticos, obtención de bioaromas y recientemente la
producción de biodiesel (Raspe, Cardozo Filho, & Da Silva , 2013); pero son especialmente
preferibles en las industrias de alimentos nutracéuticos, productos cosméticos y farmacéuticos, si
son producidos a partir de técnicas naturales (Chua, Alitabarimansor, Chew Tin , & Mat, 2012)
como es el caso de la ruta enzimática contando con un proceso con un alto valor agregado y
amigable con el medio ambiente.
El aceite de coco virgen es un aceite comestible extraído de la nuez de la palma de coco, Cocus
nucífera, que contiene un 92 % de ácidos grasos saturados a manera de triglicéridos, la mayoría de
estos son ácidos grasos de cadena media (C6 - C10) y predominando el ácido laúrico (C12) que
ocupa aproximadamente el 50% (Gopala Krishna, Gaurav, Ajit Singh, Prasanth Kumar, & Preeti,
2010), demuestra la importancia que tienen los ácidos grasos de cadena media como una
herramienta para la formación de lípidos estructurados, aportando características en la prevención
de la obesidad debido a sus efectos sobre la deposición de grasa en los animales, resultado de su
absorción y gasto energético más rápido y eficiente (St-Onge, Ross, Parsons, & Jones, 2003);
además re esterificados con glicerol en forma de triglicéridos (MCT), son empleados en la
medicina, como una fuente de energía en la nutrición clínica, planteado su uso en casos de
insuficiencia pancreática, mala absorción de grasas y también utilizados en alimentos de fórmulas
para bebés prematuros y atletas de alto rendimiento (Marten, Pfeuffer, & Schrezenmeir, 2006).
Adicionalmente al ácido láurico y su mono glicérido (mono laurina) se les ha atribuido propiedades
antivirales, antibacteriales y antiprotozoarias (Mora Gil, 2003) así también como producto de
partida para la obtención de agentes tenso activos (Zha, Chen, Wang, & Wang, 2013).
Entre la gran variedad de enzimas existentes actualmente, cabe resaltar que el empleo de enzimas
inmovilizadas ofrece muchas más ventajas principalmente su reutilización, disminuyendo los
costos en el proceso, ofrecen alta estabilidad y muy activos a temperatura ambiente y presión
atmosférica, justificando así su precio como biocatalizador y actualmente su alto aprovechamiento
a nivel industrial (Arroyo, 1998).
Por todo lo antes mencionado, es de suma importancia evaluar las condiciones que permitan una
mayor obtención de AG presentes en el aceite de coco virgen mediante la utilización de lipasas
inmovilizadas: Lipozymes 435, Addzymes TL 165G, Lipozymes TL IM y Lipozymes RM IM, para
fines nutricionales, farmacológicos y tecnológicos.
3
CAPÍTULO II
2MARCO TEÓRICO
2.1 ANTECEDENTES
En trabajos llevados a cabo anteriormente en aceite de coco al igual que este estudio, se realizaron
principalmente por la composición de ácidos grasos de cadena media que posee y las ventajas
nutricionales que presenta a nivel metabólico y energético.
En la hidrólisis de aceite de coco (Rodríguez, Sanhueza, Valenzuela, & Nieto, 1997), producida por
dos tipos de lipasas, una sin especificidad posicional obtenida de Candida cylindracea, y otra
obtenida de Mucor miehei (Lipozyme IM-20), mostró que la lipasa de C. cylindracea hidrolizó un
85 %-90 % en 47-50 horas, mientras que la enzima de Mucor miehei alcanzó un 65 % de hidrólisis
en 10 horas. La composición de ácidos grasos del hidrolizado fue similar en ambas enzimas,
sobresaliendo los ácidos grasos de cadena media en el rango C8-C14, además se manifestó alta
presencia de ácido láurico (C12:0) en forma de monoacilglicerol remanente.
En otro estudio realizado por Chua, Alitabarimansor, Chew Tin y Mat, en la hidrólisis de aceite de
coco virgen con el uso de la lipasa inmovilizada Mucor miehei (Lipozyme) y variandoando los
parámetros como la concentración del aceite del coco virgen (VCO1), la carga de la enzima, el
contenido de agua y la temperatura de reacción; se observó una mayor producción de ácidos grasos
libres con 1 % de carga de enzima y un contenido de agua del 7 % a una temperatura de 45 ºC en
100 horas de reacción, además que una concentración superior del 40 % de VCO mostraba una
inhibición de sustrato. (Chua, Alitabarimansor, Chew Tin , & Mat, 2012)
En ambos estudios se puede resaltar el elevado tiempo que se emplea para la reacción de hidrólisis,
además de que no se aplica el método de superficie de respuesta (MSR) como herramienta para
evaluar el efecto entre factores, sin embargo existen trabajos relacionados a la producción de ácidos
grasos libres por hidrólisis enzimática en otros aceites, tal es el caso (Raspe, Cardozo Filho, & Da
Silva , 2013) empleando aceite de almendra de Macauba, que evaluó el efecto de diferentes
enzimas (Lipozyme RM IM, Lipozyme TL IM y Lipozyme 435) con la adición de sales, agentes
tenso activos, disolventes en diversas condiciones del medio de reacción aplicando la metodología
de superficie de respuesta; cuyos resultados mostraron que los rendimientos de AG obtenidos con
Lipozyme RM IM fueron más altos ( 82 % aprox.) que los obtenidos con Lipozyme TL IM y
Lipozyme 435 concluyendo que la adición de sales y agentes tensoactivos no promovió aumento de
la producción de ácidos grasos libres, mientras que la adición de solventes orgánicos (N -hexano y
heptano) produjo un aumento de la velocidad de reacción y además que factores como la
1
Virgin Coconut Oil (VCO)
4
temperatura, la relación agua: masa de aceite y el porcentaje de la enzima, en valores de 55 ºC, 1:
2, y 15 % , respectivamente, tuvieron efectos positivos en el rendimiento de ácidos grasos libres en
6 horas de reacción.
Para la producción de lípidos estructurados aplicando el método de superficie de respuesta, según

Shuang, Jiang-Ke, & Yun-Jun, menciona que se puede optimizar efectivamente las condiciones de
reacción catalizada por lipasas, siendo una técnica estadística ideal para la investigación de
procesos complejos reduciendo el número experimental y mejorando las condiciones de reacción.
2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO
2.2.1 Aceites y grasas
Los aceites y grasas son una clase de lípidos que químicamente se las describe como: mezclas de
triacilgliceroles, llamados también triglicéridos, que a su vez son uniones de esteres de glicerina
con ácidos grasos; además cumplen funciones como moléculas de almacenamiento de energía (9,3
kcal/g), fuente de ácidos grasos esenciales y de vitaminas. (Belitz, Grosch, & Schieberle, 2009); en
alimentos son los principales contribuyentes de textura, de propiedades sensoriales y nutritivas.
Generalmente el término “grasa” se aplica al lípido sólido y “aceite” a los que son líquidos, a
temperatura ambiente. (Badui, 2006)
2.2.1.1 Ácidos grasos
Son ácidos carboxílicos que mayormente en la naturaleza poseen un número par de átomos de
carbono, muestran una fórmula general: R-COOH; donde R es la cadena alquílica con el grupo
terminal carboxilo (–COOH), el cual se observa en en figura 2.1
Ácido esteárico, 18:

0
Ácido elaídico, 18: 1

9t
Ácido oleico 18: 1 9c
Figura 2.1 Modelos de ácidos grasos, los tres se encuentran de forma plana
Fuente: Bailey, 2005.
5
Representan un gran porcentaje de la composición de los triglicéridos y en consecuencia de las
grasas y aceites; constituyen el 94 - 96% del peso total de la molécula, por ello comprenden la parte
activa de ésta, ejerciendo así una marcada influencia en las propiedades físicas y químicas de los
aceites y grasas (Badui, 2006).
2.2.1.1.1 Clasificación de ácidos grasos
Se pueden dividir en grupos de acuerdo a su longitud de la cadena, número, posición, configuración

de sus dobles enlaces y presencia de grupos funcionales adicionales en las cadenas alifáticas
(Belitz, Grosch, & Schieberle, 2009) como se muestra en el resumen de la tabla 2.1
Tabla 2.1 Nomenclatura y clasificación de ácidos grasos

Nombre común Acido graso Fórmula Longitud de cadena
Ácidos Grasos Saturados
Butírico C4:0 CH3(CH2)2COOH Corta
Caproico C6:0 CH3(CH2)4COOH Corta/Media
Caprílico C8:0 CH3(CH2)6COOH Media
Cáprico C10:0 CH3(CH2)8COOH Media
Láurico C12:0 CH3(CH2)10COOH Media
Mirístico C14:0 CH3(CH2)12COOH Larga
Palmítico C16:0 CH3(CH2)14COOH Larga
Estearico C18:0 CH3(CH2)16COOH Larga
Araquídico C20:0 CH3(CH2)18COOH Larga
Ácidos Grasos Insaturados
Palmitoleico C16:1 (n-7) CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH Monoinsaturado
Oleico C18:1 (n-9)' CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH Monoinsaturado
Linoleico C18:2 (n-6) CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH Polinsaturado
Linolénico C18:3 (n-3) CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(C Polinsaturado
H2)7COOH
Araquidónico C20:4 (n-6) CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHC Polinsaturado
H2CH=CH(CH2)3COOH
Fuente: Belitz, Grosch, & Schieberle, 2009
A. CLASIFICACIÓN QUÍMICA
Los ácidos grasos difieren unos de otros principalmente por la presencia y número de enlaces
etilénicos o dobles, dividiendose en:
• Saturados: sin dobles enlaces. Son más estables a la oxidación y rancidez.

• Insaturados: con uno o más dobles enlaces, son compuestos con gran reactividad química,
siendo propensos a la saturación, transformaciones oxidativas e isomerización.
Según el número de dobles enlaces presentes pueden ser: mono insaturados, con un doble enlace y
poli-insaturados con más de uno.
6
B. CLASIFICACION DE ACUERDO AL NÚMERO DE CARBONOS
Basada en la longitud de su cadena o número de átomos de carbono presentes en la cadena

alquílica:
• Ácidos grasos de cadena corta: 2 a 4 carbonos, contribuyen al aroma y al sabor de la

leche y derivados lácteos
• Ácidos grasos de cadena media: 6 a 12 carbonos
• Ácidos grasos de cadena larga: 14 y más carbonos (Mora, 2002)
2.2.1.2 Acilgliceroles
“Son grasas neutras sin carga, provenidos de la reacción de esterificación entre el glicerol con una,
dos o tres moléculas de ácidos grasos (monoacilglicéridos, diacilglicéridos y triacilglicéridos
respectivamente), en las posiciones 1, 2 y 3 o llamadas también α, β y α’ del glicerol” (Badui,
2006, p. 253).
En la figura 2.2 se muestran los mono y diacilglicéridos que contienen uno y dos radicales de
ácidos grasos respectivamente y que se encuentran en menor proporción en las grasas y aceites. En
elevadas cantidades son un indicativo de hidrólisis de los triacilglicéridos con liberación de ácidos
grasos producido por la acción enzimática de lipasas.
triacilglicerol
sn-1-mono acilglicerol sn-2-mono acilglicerol

(1-MAG) (2-MAG)
sn-1,2-di acilglicerol sn-1,3-di acilglicerol

(1,2-DAG) (1,3-DAG)
Figura 2.2 Clasificación de triacilgliceroles

Fuente: Por Bailey, 2005.
7
2.2.1.3 Triacilgliceroles
Un triglicérido (TG) estructuralmente, puede ser considerado como el producto de la unión de una
molécula de glicerol con tres de ácidos grasos, dando tres moléculas de agua y una de triglicérido,
su formación se muestra en la figura 2.3.
Glicerol Ácido esteárico Triacilglicerol
Figura 2.3 Esquema y formación de un triglicérido

Fuente: Pixhook, 2010
Su nomenclatura depende de sus ácidos grasos presentes; cuando contienen un mismo ácido graso,
se conoce como triglicéridos simples, y cuando poseen dos o tres AG diferentes se consideran
como triglicéridos mixtos.
“Las características físicas y químicas de los TG dependen del tipo, concentración y la forma de
distribución de sus ácidos grasos en las tres posiciones”. (Badui, 2006)
2.2.2 Ácidos grasos de cadena media
Los ácidos grasos de cadena media son ácidos grasos saturados de cadena de hidrocarburo más
corta, al ser ingeridos son metabolizados rápidamente por una vía diferente a de los ácidos grasos
de cadena más larga además no tienen ningún efecto sobre el nivel de colesterol; los AGCM son: el
ácido caprónico C6:0, ácido caprílico C8:0 y el ácido cáprico C10:0. El ácido láurico C12:0
presenta propiedades intermedias entre los AGCM y los AGCL.
En la figura 2.4 se presentan los principales ácidos grasos de cadena media que superan el 50% del
total de ácidos grasos en los aceites de coco y palmiste, otros, en pequeñas proporciones se
localizan en fuentes naturales como la leche de cabra y bovina (C6:0-C10:0), constituyendo del 4 al
12% del total de ácidos grasos (Sáyago-Ayerdi, Vaquero, Schultz-Moreira, Bastida, & Sánchez-
Muniz, 2008); además pueden ser obtenidos en procesos de hidrólisis y vueltos a re esterificar con
glicerol, formando una mezcla de triglicéridos de cadena media con mayores concentraciones de
AGCM aleatorizados (Bailey, 2005).
8
Figura 2.4 Composición de ácidos grasos de aceite de coco y otros aceites vegetales.
Fuente: Gopala Krishna, Gaurav, Ajit Singh, Prasanth Kumar, & Preeti, 2010.
En los ácidos grasos de cadena media su punto de fusión es mucho más bajo que los ácidos grasos
de cadena larga y su solubilidad en agua es mayor; además son electrolitos débiles y altamente
ionizados a pH neutro, incrementando más su solubilidad en fluidos biológicos (Mora, 2002).
Los triglicéridos de cadena media son mezclas en proporción variable de tres ácidos grasos de 6 a
10 átomos de carbono esterificados con una molécula de glicerol, proporcionan al organismo 8,3
kcal/g y no poseen ácidos grasos esenciales (Hernández Rodriguez & Sastre Gallegos, 1999). “Los
triglicéridos de cadena media se producen convencionalmente mediante la división y la destilación
de los ácidos grasos extraídos, mezclándolas a relación deseada, y esterificando con glicerina para
formar un triglicérido” (Food and Drug Administration, 2012).
Tabla 2.1 Características fisicoquímicas de los MCT.

Especificaciones de aceite MCT
Índice de acidez (como oleico) 0.05% máx.
Índice de Saponificación 345-355
Índice de Yodo (Wijs) 1.0 máx.
Punto de Solidificación -5 ºC máx.
Índice de Hidroxilo 0.5 máx.
Color (Lovibond) 10 Y./1.0 R
Materia Insaponificable 0.5 máx.
Composición de Ácidos Grasos
C6 1-2%
C8 65-75%
C10 25-35%
C12 2 % máx.
Fuente: (Babayan, 1985)
9
Hernández Rodriguez & Sastre Gallegos (Tratado de nutrición, 1999, p. 1126) mencionan lo
siguiente sobre el metabolismo:
A diferencia de los triglicéridos de cadena larga (LCT), la digestión de los triglicéridos de

cadena media (MCT) se inicia en el estómago, la lipasa gástrica puede comenzar la
hidrólisis de los MCT transformándolos en ácidos grasos y glicerol. El pequeño tamaño
molecular y la gran hidrosolubilidad hace que en luz intestinal sean hidrolizados a ácidos
grasos libres por la lipasa pancrática a un ritmo cinco veces superior a la hidrólisis de los
LCT.
Pueden ingresar en las células de la mucosa intestinal en forma de diglicéridos y

monoglicéridos, los cuales son hidrolizados por la lipasa de la mucosa a AGCM y glicerol,
los AGCM libres son unidos a albúmina y transportados vía porta al hígado. Los AGCM no
utilizados con fines energéticos por el propio enterocito son absorbidos y transportados por
la vena porta al hígado, en lugar de ser incorporados a los triglicéridos de los quilomicrones
y alcanzar la circulación sanguínea vía sistema linfático como sucede con los AGCL.
Sus características físico químicas se indican en la tabla 2.2
2.2.3 Aplicaciones y usos de MCT
Son aprobados su uso como ingrediente alimentario directo para los usos funcionales específicos y
tipos de alimentos que figuran a continuación.
• Tipos de alimentos: productos horneados, bebidas, goma de mascar, dulces y

merengues, los análogos de productos lácteos, las grasas y los aceites, postres
lácteos congelados, frutas procesadas, bocadillos, alimentos nutricionales para
adultos, los quesos y quesos para untar y caramelos blandos.
• Los usos funcionales: Emulsionante, fuente de energía, ayuda a formulaciones,
lubricante, agente de liberación, suplemento de nutrientes, ayuda a la
transformación, disolventes, vehículos, estabilizador, espesante, agente de acabado
superficial y texturizador. (Food and Drug Administration, 2012, p. 5)
2.2.4 Aceite de coco virgen
El aceite de coco virgen según manifiesta la norma nacional de Filipinas, es la forma más pura de
aceite de coco que se obtiene a partir del núcleo fresco y maduro del coco (Cocos nucifera) (figura
2.5) de forma mecánica o natural, con o sin la aplicación de calor, sin someterse a procesos
químicos de refinación, blanqueo o desodorización y que se puede consumir en su estado natural
sin procesamiento adicional. (Bawalan & Chapman, 2006).
10
El aceite de coco virgen tiene aplicaciones en productos farmacéuticos y cosméticos como base de
diversos productos para el cuidado de la piel y cabello; alimenticios debido a sus propiedades
nutracéuticas y funcionales por la presencia de ácidos de cadena media.
Cáscara
Coraza
Testa
Endospermo (núcleo, carne)
Agua de coco
Figura 2.5 Corte de nuez de coco

Fuente: (Quality First Internacional, 2015)
2.2.4.1 Características del aceite de coco virgen
El VCO es transparente y es la primera característica que distingue al aceite de coco virgen de

cualquier otro tipo de aceite de origen vegetal, además es indicativo de un proceso a la temperatura
adecuada y con estricto control de calidad, un color amarillo representa una contaminación
bacteriana de la semilla de coco antes de la extracción de aceite, además contiene vitamina E
natural y no sufre oxidación atmosférica e hidrolítica. Su contenido de ácidos grasos libres e índice
de peróxidos es bajo, tiene un aroma de coco fresco y la intensidad del olor depende del proceso
utilizado en su producción pero sin olor rancio y sabor amargo.
Los aspectos generales que se consideran son características de identidad como la composición de
ácidos grasos, y características de calidad como el color, olor y sabor, ácidos grasos libres,
contenido de humedad e índice de peróxidos (Gopala Krishna, Gaurav, Ajit Singh, Prasanth
Kumar, & Preeti, 2010) sus especificaciones se muestran en las tablas 2.3 y 2.4..
Tabla 2.2 Características fisicoquímicas del aceite de coco virgen.

Propiedades Especificación *
Contenido de Humedad, % < 0.1
Ácidos grasos libres (expresado en ácido láurico), % 0.20 máx.
Índice de peróxidos, meq O2 / kg 3 máx.
Índice de saponificación mgKOH/g 245-255
Índice de yodo (cg I2 /g) 12-15
Aditivos alimentarios Ninguno permitido
Tocoferoles, mg / kg 150-200
Compuestos fenólicos, mg/kg 640
11
Color, olor y sabor: El aceite de coco virgen debe ser incoloro, libre de sedimentos, con olor
natural de coco fresco y libre de olores o sabores rancios
*De acuerdo con la IUPAC 2.301, 2.302 y 2.304 o ISO 5508: 1999 o ISO 5509: 1999
Fuente: (Gopala Krishna, Gaurav, Ajit Singh, Prasanth Kumar, & Preeti, 2010)
Tabla 2.3 Composición de ácidos grasos de aceite de coco virgen

Composición %
C6:0 Caproico 0,1 - 0,7
C8:0 Caprílico 4,0 - 10,0
C10:0 Cáprico 4,0 - 8,0
C12:0 Láurico 45,1 - 56,0
C14:0 Mirístico 16 - 21
C16:0 Palmítico 7,5 -10,2
C18:0 Esteárico 2,0 - 5,0
C18:1 (n-9) Oleico 5,0 - 10,0
C18:2 (n-6) Linoleico 9,41
Total Saturados 92,0
Total Monoinsaturados 6.0
Total Poliinsaturados 2.0
% Trans 0,0
Nota. Por Bawalan, Processing Manual for Virgin Coconut Oil, in
Products an by-products for Pacific Island Countries and Territories, 2011
Fuente: (Gopala Krishna, Gaurav, Ajit Singh, Prasanth Kumar, & Preeti, 2010)
2.2.5 Lipasas
Son triacilglicerol acil hidrolasas encargadas en la degradación de los lípidos como una clase
especial de estearasas por su mayor actividad en sustratos insolubles en agua. Actúan óptimamente
en una interfaz aceite-agua, como los sistemas en emulsión dónde el sitio activo de la proteína
queda expuesto hacia la región hidrofóbica pero con acceso a la fase acuosa requiriendo moléculas
de agua para la catálisis; este fenómeno es conocido como activación interfacial (Badui, 2006).
De acuerdo con la definición de la Comisión de Enzimas de la IUPAC las lipasas pertenecen al

grupo EC3, hidrolasas, y específicamente al grupo EC3.1.1.3, las cuales son capaces de catalizar la
hidrólisis de forma natural principalmente los triglicéridos para producir mono, di glicéridos,
ácidos grasos libres y glicerol (Utrera, 2009); se encuentran difundidas en vegetales apareciendo
sobre todo en la germinación de semillas oleaginosas que usan los ácidos grasos como fuente de
energía para el desarrollo del embrión (Gutiérrez, 2000), en animales segregadas por el páncreas
para la digestión de las grasas y, sintetizadas por microorganismos (hongos, bacterias, levaduras)
siendo esta última, la más comercialmente importante (Aceves & Castañeda, 2012).
12
Las lipasas pueden ser aplicados a dos áreas principales dentro de la industria de productos oleo
químicos: división de ácidos grasos y síntesis de ésteres.
2.2.5.1 Inmovilización
Su inmovilización se refiere a un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región

definida, dando lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser
reutilizadas repetidamente a comparación de las enzimas líquidas que generalmente se utilizan una
sola vez, en la figura 2.6, se indica diversos métodos de inmovilización.
Entre las principales ventajas se pueden mencionar:
1. Aumento de la estabilidad de la enzima

2. Uso repetido, y consecuentemente disminución de los costes del proceso.
3. Fácil manejo y control de un reactor, adaptado sistemas que pueden incluir el reciclado.
Enzima
Modificada Nativa
Inmovilizada
Unido Atrapada Entrecruzamiento

molecular
Covalentemente Adsorción Matriz atrapada Micro encapsulación
Figura 2.6 Enzimas inmovilizadas producidos por diversos métodos.

Fuente: (Sanchez, Martinez, Segura, Contreras, Medina, & Aguilar, 2014) y (Belitz, Grosch,
& Schieberle, 2009)
Lipasas inmovilizadas catalizan toda la gama de reacciones de intercambio de ésteres (alcohólisis,

acidólisis, esterificación), e hidrólisis.
13
Lipases (cf 2.2.6) hydrolyze only emulsified acyl the oil/water interface
lipids; they are active on a water/lipid interface. the lipase activity. Thi
Table 3.21. Lipid hydrolysis occurring during potato

tuber homogenization
2.2.5.2 Actividad lipásica
µmoles/ga
Acyl lipidses Free
Las lipasas son activos en una interfaz de aceite/ agua, cuanto más pequeño fatty de la gota
el tamaño
acids
de aceite, mayor es la interfaz aceite / agua y, por lo tanto, mayor es la actividad de la lipasa.
Potato 2.34 0.70
Homogenateb 2.04 1.40
Homogenateb
Aceite kept for 10 min at 0 ◦ C
Agua 1.72 1.75
Homogenate
Lipasa
kept for 10 min at 25 ◦ C 0.54 2.90
cabeza hidrofóbica Fig. 3.17. A hypothetic
a Potato tissue fresh weight. pase fixation of an oil/wa
b Sliced potatoes were homogenized for 30 sec at 0 ◦ C.
Brockerhoff , 1974)
Sitio activo
Figura 2.7 Modelo hipotético de fijación de lipasa en una interfaz aceite / agua.
Fuente: (Belitz, Grosch, & Schieberle, 2009)
En la figura 2.7 se nota la cabeza hidrófoba de la lipasa enlazando a la gotita de aceite por
interacciones hidrófobas, mientras que el sitio activo de la enzima se alinea y se une con la
molécula sustrato.
La actividad enzimática puede ser medida determinando la velocidad de aparición de un producto

o desaparición de un reactivo; en la actualidad existen diversos métodos para establecer cualitativa
o cuantitativamente la capacidad hidrolítica de las lipasas y que dependerá de factores como costo,
equipos, reactivos y nivel de sensibilidad. (Román, 2005)
2.2.5.3 Especificidad
La especificidad es una de las propiedades más notables de la molécula de la enzima y se puede

definir como una diferencia comparativa de los tipos de catálisis de ciertas reacciones (Bailey,
2005) y que pueden presentarse con relación a su actividad, propiedades a nivel molecular, y
estructura del sustrato (Román, 2005) (Gutiérrez, 2000).
Las lipasas se pueden clasificar en tres grupos basados en su especificidad; al azar (no-regio
especifica), sn-1,3-especifica (regio específica) hacia los TG’s, y específica para un ácido graso
determinado o una clase de ácido graso, como se observa en la figura 2.8; estas especificidades no
se logran en las reacciones de hidrólisis, esterificación, o interesterificación catalizada
químicamente.
• Lipasas no específicas: su uso conduce a la completa ruptura de TG a glicerol y ácidos

grasos libres
14
10 CHEMISTRY OF FATTY ACIDS
TABLE 6. Saponification Equivalent (SE), Saponification Value (SV), Iodine Value (I

and
10 Unsaponifiable
CHEMISTRY OFMatter of Some
FATTY ACIDSCommodity Oils.
• Posicional o regioespecificidad: estas lipasas tienen la capacidad de dividir ácidos grasos
SE! SV IV Unsaponifi
en las posiciones sn 1-3TABLE
del TG e hidrolizan paraEquivalent
6. Saponification
proporcionar
(g oil/mol
ácidos
(SE),
KOH) (mg
grasos libres,
Saponification
KOH/g
1,2 (SV),
oil) (100 " Value
o oil)Iodine
g iodine/g Value
matter (w
(2,3) di glicéridos y 2-monogliceridos.
and Unsaponifiable Matter of Some Commodity Oils.
butter 242–267 210–232 26–40 <0.5
!
• Lipasas con respecto castor 300–319
SE respecto a176–187
al ácido graso: son selectivas una 81–91
SVclase de ácidos grasos
IV Unsapon
coconut (g 212–226
oil/mol KOH) 248–265
(mg KOH/g oil) (100 "6–11
g iodine/g oil) <1.5
matter (
independientemente decorn
su posición en la cadena
288–300principal 187–195
de glicerol, realizando una
107–128 1–3
butter
cottonseed 242–267
283–297 210–232
189–198 26–40
100–115 <2<0
acomodación de la cadena !! carbonada del ácido
castor
fish
graso en el centro
300–319
292–312
activo de la142–176
176–187
180–192
enzima
81–91 e <2
coconut
hidrolizando con mayorgroundnut
velocidad(peanut) 212–226
(Gutiérrez,286–300
2000). 248–265
187–196 6–11
86–107 <1<1
corn
lard 288–300
276–292 187–195
192–203 107–128
45–70 1–
<0.2
cottonseed
linseed 283–297
286–298 189–198
188–196 100–115
170–203 <2<2
fish!!
olive 292–312
286–305 180–192
184–196 142–176
75–94 <2
<1.5
groundnut (peanut)
palm 286–300
268–295 187–196
190–209 86–107
50–55 <1
<1.3
lard kernel
palm 276–292
221–244 192–203
230–254 45–70
14–21 <1<0
!!!
rape
linseed 291–308
286–298 182–193
188–196 110–126
170–203 <0.2
<2
Lipasa
sesame
olive 288–300
286–305 187–195
184–196 104–120
75–94 <2<1
no especifica Glicerol Ácido graso
soybean
palm 288–297
268–295 189–195
190–209 124–139
50–55 <1.5
<1
sunflower
palm kernel 289–298
221–244 188–194
230–254 118–145
14–21 <2<1
tallow
rape!!! 281–295
291–308 190–200
182–193 33–47
110–126 <0.5
<0
sesame
! 288–300 187–195 104–120 <2
SE ¼ 56108/SV.
Lipasa sn-1,3!!
especifica
soybean 288–297 189–195 124–139 <1
Cod liver oil.
sunflower
!!!
Low erucic rape (Canola).289–298 188–194 118–145 <2
tallowfrom (11).
Data 281–295 190–200 33–47 <0
!
Triacilglicerol SE ¼ 56108/SV. 2-Monoacilglicerol Ácido graso
!!
Cod liver oil.
!!!
Low erucic rape (Canola).
Lipasa
3. HYDROLYSIS, ESTERIFICATION, AND
(R2COOH) ácido graso from (11).
Data ESTER EXCHANGE
especifica
Reactions converting acids to esters or vice versa and the exchange of ester gro
are among the most widely used in fatty acid and lipid chemistry (Figure 4). T
3. HYDROLYSIS,
find applications fromESTERIFICATION,
microscale preparation AND ESTER
of methyl EXCHANGE
esters for GC analysi
Ácido graso
the industrial production of oleochemicals and biodiesel. The exchange of gro
1,3-Diacilglicerol
Reactionstoconverting
attached the fatty acidacids to estersis or
carboxyl vice versa
usually and the exchange
an equilibrium of estertog
process driven
are among
product theexcess
by an most widely used in or
of one reactant fatty
theacid and of
removal lipid
onechemistry (Figure
product, and 4).
it is usu
Figura 2.8 Regioespecificidad de las lipasas.
find applications from microscale preparation of methyl esters for GC analy
Fuente: production
the industrial (Bailey, 2005) of oleochemicals and biodiesel. The exchange of g
RCOOR′ + H2O RCOOH + R′OH (1)
attached to the fatty acid carboxyl is usually an equilibrium process driven t
2.2.5.4 Reacciones catalizadasproduct
por lipasas
by anRCOOH
excess of R′OH
+ one reactant or the RCOOR′
removal+of Hone
2O product,(2)and it is u
RCOOR′
De forma natural las lipasas hidrolizan ésteres + R′′COOH
en presencia R′′COOR
agua, sin embargo + RCOOH
también pueden (3)
RCOOR′ ++ R′′OH
H2O R′OH
RCOOH ++ R′OH
RCOOR′′ (4)(1)
reaccionar de manera inversa esterificando RCOOR′
y transesterificando, este último a su vez puede
RCOOH
TAG + R′OH
+ glycerol RCOOR′
MAG + H2O
+ DAG (5)(2)
clasificarse en acidólisis, alcholisis e interestificación.
RCOOR′
Figure 4. Exchange + R′′COOH
reactions at the carboxyl groupR′′COOR + RCOOH
(1) hydrolysis (Chapter xx),(3)
(2) esterific
Hidrólisis: Las lipasas hidrolizan los grupos
(Chapter xx), (3) acilo en los
acidolysis
RCOOR′ + R′′OH
triglicéridos
(Chapter xx), (4)formando ácidos
alcoholysis grasos,
(Chapter
RCOOR′′ + R′OH
xx), and (5) glycero
(4)
(Chapter xx). The starting ester RCOOR 0 will often be a triacylglycerol. MAG—monoacylgl
mono- diglicéridos y glicerol. ol; DAG—diacylglycerol; TAG—triacylglycerol.
TAG + glycerol MAG + DAG (5)
Figure 4. Exchange reactions at the carboxyl group (1) hydrolysis (Chapter xx), (2) esterifi
(Chapter xx), (3) acidolysis (Chapter xx), (4) alcoholysis (Chapter xx), and (5) glyce
(Chapter xx). The starting ester RCOOR 0 will often be a triacylglycerol. MAG—monoacyl
Esterificación: Esta reacción los
ol; ácidos grasos son convertidos
DAG—diacylglycerol; a ésteres con un exceso de alcohol.
TAG—triacylglycerol.
15
RCOOR′ + R′′OH RCOOR′′ + R′OH (4)
RCOOR′ + H2O RCOOH + R′OH (1)
RCOOH + R′OH RCOOR′ + H2O (2)
Figure 4. Exchange reactions at the carboxyl group (1) hydrolysis (Chapter xx), (2) esterifi
(Chapter xx), (3)RCOOR′ R′′COOH
acidolysis+ (Chapter R′′COOR
xx), (4) alcoholysis + RCOOH
(Chapter xx), and (5)(3)glycer
Acidólisis: Es la reacción entre un éster y un ácido carboxílico reemplazando
0 el grupo acilo del
(Chapter xx). TheRCOOR′
starting ester RCOOR will often beRCOOR′′
+ R′′OH a triacylglycerol.
+ R′OH MAG—monoacylg
(4)
éster por el del ácido libre. Puede ser utilizado para modificar
ol; DAG—diacylglycerol; la composición de triacilglicerol.
TAG—triacylglycerol.
Figure 4. Exchange reactions at the carboxyl group (1) hydrolysis (Chapter xx), (2) es
(Chapter xx), (3) acidolysis (Chapter xx), (4) alcoholysis (Chapter xx), and (5) g
Alcohólisis: Es la reacción (Chapter
entre un éster y unstarting
xx). The alcohol,ester
produciéndose la sustitución
RCOOR 0 will de un grupo MAG—mono
often be a triacylglycerol.
alquilo del éster. ol; DAG—diacylglycerol; TAG—triacylglycerol.
Interesterificación: Es la reacción entre dos ésteres, reordenando (al azar o dirigido) sus grupos
acilo en un mismo triacilglicerol (Bailey, 2005).
2.2.5.5 Hidrólisis de lipasas
Los procesos tradicionalmente empleados para la producción de ácidos grasos son los químicos y
enzimáticos; los procesos químicos se desarrollan bajo condiciones de temperaturas y presiones
elevadas con diferentes tiempos de reacción obteniendo productos muy variados en naturaleza y
pureza (Salimon, Mudhaffar Abdullah, & Salih, 2011), por ejemplo en la hidrólisis alcalina,
empleado condiciones de reacción suaves (70-100 ºC), el producto adquiere olor y color no
deseado; mientras en procesos continuos utilizando una elevada presión (5000 kPa) y temperatura
entre 250-360 °C, puede conllevar a una posible desnaturalización de ácidos grasos (Goswani, De,
& Basu, 2012); en comparación con la hidrólisis catalizada por lipasa, esta posee claras ventajas
con una excelente pureza del producto y condiciones de proceso leve.
En la figura 2.9 describe las etapas de hidrólisis enzimática el cual requiere dos requisitos, la
formación de una interfaz lípido / agua y la absorción de esa enzima en esta interfaz. Estudios
previos hacen referencia a un aumento del rendimiento y velocidad de reacción con la adición de
aditivos en el medio de reacción (tensioactivos y sales), además de un aumento significativo de la
actividad de la enzima en presencia de disolventes orgánicos y a cambios de diferentes variables
de proceso con efectos como la temperatura, contenido de agua, velocidad de agitación, pH y
cantidad de catalizador. (Raspe, Cardozo Filho, & Da Silva , 2013)
16
Figura 2.9 Etapas de una reacción catalizada por lipasas
Nota. (1) Ataque nucleofílico sobre un átomo de carbono del grupo carbonilo del triglicérido, (2)
formación de un complejo acil-enzima y un alcohol o diglicérido. (3) ataque de reactivos
nucleófilos, como un diglicérido (a), un alcohol (b) o agua (c). (4) Liberación de los respectivos
productos de los ataques nucleófílicos: un triglicérido (a`), un éster (b`), o un ácido carboxílico (c`).
Fuente: (Román, 2005)
2.2.5.6 Factores que afectan las reacciones catalizadas por lipasa
Las variables en el proceso de hidrólisis tales como la concentración de agua, temperatura de

reacción, el pH, tipo disolvente y sistemas de inmovilización, tienen una marcada influencia en el
rendimiento de la reacción con efectos significativos respecto la actividad enzimática (Goswani,
De, & Basu, 2012).
Contenido de agua:
El agua desempeña diferentes funciones en las reacciones catalizadas por enzimas. Se requiere un
cierto nivel de agua en el medio de reacción para mantener una capa de agua alrededor de la
molécula de enzima y mantener su actividad (estado conformacional tridimensional activo). El
agua también contribuye a la integridad estructural, la polaridad sitio activo, y la estabilidad de la
proteína. (Bailey, 2005)
Temperatura:
17
Un aumento de la temperatura puede generar también un incremento en la velocidad de reacción,
sin embargo cuando esta sobrepasa un cierto valor, puede alterar la conformación molecular de la
lipasa y la estabilidad de su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria (Goswani, De, & Basu,
2012); por ende, el aumento de su actividad se verá comprometida por el efecto de la
desnaturalización térmica a elevadas temperaturas impidiendo su acción catalítica.
Efecto de pH:
Generalmente cada enzima es catalíticamente activo sólo en un rango de pH , las variaciones

extremas de pH pueden afectar su estructura y por lo tanto cambiar su conformación y actividad,
sin embargo (Bailey, 2005), en este estudio situaciones extremas de pH no se aplican, ya que escala
industrial sus condiciones de pH son controladas alrededor de 6.5-6.8 que son valores tomados del
agua que se añadirá para el proceso de hidrólisis.
Se ha demostrado que el empleo de diferentes disolventes orgánicos debido a su polaridad, afecta

también a las reacciones catalizadas por lipasa; a pesar de estos antecedentes existe razones por el
cual no se toma en cuenta en este estudio:
• Al tratarse de un proceso que estará destinado a la elaboración de producto de consumo

humano.
• La ausencia de disolvente facilita el procesamiento de aguas y ahorro de costes
significativos en la eliminación del disolvente.
2.2.6 Parámetros de calidad
“Existe un gran número de análisis para evaluar las características físicas y químicas de las
grasa … ; los resultados ofrecen información sobre la naturaleza, el origen y el posible
comportamiento de las grasas en diferentes condiciones de almacenamiento y procesamiento”.
(Bailey, 1955, p. 59)
2.2.6.1 Humedad
Es un parámetro que puede indicar la limpieza de equipos y tanques en los que el aceite se
almacena y/o transporta, estos deben estar limpios y secos antes de uso. La presencia de agua
facilita la descomposición de las grasas en ácidos grasos generalmente a temperaturas elevadas,
esta hidrólisis también es promovida por la acción de determinados microorganismos (AOCS,
2009).
18
2.2.6.2 Punto de fusión
Es la temperatura en que la fase sólida cambia a la líquida (Badui, 2006), el punto de fusión en los
ácidos grasos aumentan con la longitud de la cadena y disminuyen con el aumento de
insaturaciones (figura 2.10), esta disminución se debe al doblamiento de la cadena en el doble
enlace ya que no se pueden empaquetar juntas en un estado sólido (Wade, 2004).
Figura 2.10 Punto de fusión del ácido esteárico

Fuente: (Wade, 2004)
2.2.6.3 Índice de peróxido
Indica la cantidad de oxígeno de la grasa unido en forma de peróxido, el índice de peróxido

muestra el estado de oxidación de la grasa o aceite permitiendo establecer el estado de
descomposición. Se define como los miliequivalentes de peróxido por kilogramo de grasa
(mEq/kg) (Nielsen, 2009) cuantificado con reacciones de coloración tal cual muestra la figura 2.11
Figura 2.11 Reacción de identificación de peróxidos

Fuente: (Análisis de Alimentos. Fundamentos y técnicas)
2.2.6.4 Índice de acidez
El índice de acidez es un parámetro que establece el contenido de ácidos libres presentes en las
grasas y aceites, en cuestión de la calidad permite medir la posible alteración debido a lipasas por
efecto de la luz y el calor (AOCS, Free Fatty Acid, 2009).
19
2.2.6.5 Índice de saponificación
Es un parámetro que establece la cantidad de ácidos grasos libres y ligados contenidos en una grasa
y transformados a jabones por saponificación (figura 2.12); esto es medido por la cantidad de KOH
empleados para la hidrólisis de grasa.
Figura 2.12 Reacción de saponificación

El índice de saponificación es inversamente proporcional al peso molecular promedio de los ácidos

grasos.
2.2.7 Cromatografía de gases
La cromatografía en general es un método físico analítico, cuyo objetivo es separar distintos

componentes presentes en una mezcla compleja permitiendo caracterizarlos.
En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con una fase móvil, que puede
ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una fase
estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o una superficie sólida (Skoog,
2001).
Los diferentes tipos de cromatografía se clasifican por el tipo de fase móvil:
• Cromatografía de Líquidos (LC)
• Cromatografía de Gases (CG)
• Cromatografía de Fluidos Supercríticos (SLC)
En la CG, la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfíca. La

elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte. A diferencia de otros tipos de
cromatografía las fase móvil no interacciona con las moléculas del analito (Skoog, 2001).
20
En el análisis de grasas y aceites la CG consiste en la introducción al puerto de inyección de ésteres
metílicos, estos ésteres se obtienen como la reacción descrita en la figura 2.13, que se vaporizan y
transportan por un gas inerte a través de la columna con el líquido de reparto que presenta
solubilidad selectiva con los componentes de la muestra ocasionando su separación.
Figura 2.13 Reacción de formación de esteres metílicos

Los componentes que eluyen de la columna pasan uno a uno por el detector, el cual genera una
señal eléctrica proporcional, la que es transformada por el integrador en una gráfica de la señal
obtenida contra tiempo llamada cromatograma. (Norma Mexicana NMX-F-017-SCFI, 2011)
2.2.8 Metodología de superficie de respuesta
Los autores Gutiérrez, Pulido y Salazar de la Vara definen a la metodología de superficie de

respuesta (MSR) como una estrategia experimental y de análisis que permite encontrar condiciones
de operación óptima de un proceso o “valores óptimos” (figura 2.15), desplazando una primera
región experimental (moverse de lugar) en una dirección más adecuada, o explorar detalladamente
la región experimental inicial; en la figura 2.14, se muestra gráficamente un mejor tratamiento y
punto óptimo.
Figura 2.14 Mejor tratamiento y punto óptimo, región experimental y región de operatividad.
Fuente: (Gutiérrez, Pulido & De la Vara Salazar, 2008)
21
desconocida minan puntos para
del proceso; probar
el modelo el proces
ajustado
en la tendencia. Entonces,
mado a esa realidad. En el primer diseño seseplan
es
tamiento dedetecta la presencia
la superficie se modelade bien
curvatura
con u
este primerestima
modelo el se
modelo de segundo
encuentran puntosorde
en
probarlos ende el
la proceso,
región experimental puedeen
y se experimenta a
la tendencia marcada por el plano. El último
En los diseños factoriales se examina estadísticamente el mejor tratamiento entre todos los que se
tendencia esModelos
el centro del diseño 2.
probaron en un estudio; por otro lado el valor óptimo en un diseño de superficie
En el diseñode 2respuesta
vuelve a ser suficiente un
Como sedeexplicó
el comportamiento antes,Se
la respuesta. lasdetermi
superf
implica que es la mejor combinación posible en toda la región de operatividad, delo apor
los lo que
datos experimentales. L
se experimenta en esa dirección hasta detecta
generalmente se requiere un proceso más completo con la posibilidad deterealizar
mo, se cambia polinomios.
de rumbo variosDeexperimentar,
sin esta manera, si al
minan
experimentos en forma secuencial (Gutiérrez, Pulido & De la Vara Salazar, 2008). dado
puntos parapor:
probar el proceso en esta nu
en la tendencia. Entonces, se plantea un terce
detecta la presencia de curvatura. Se aument Y
estima el modelo de segundo orden. Puesto qu
de la regióny experimental
el modelo depuede segundoatraparse
orden det
es:
Modelos k
Y = β 0 + ∑ βi
Como se explicó antes, las superficies dei =1resp
delo a los datos experimentales. Los modelos q
te polinomios. DeLaesta
forma de estimar
manera, loskpa
si se tienen fa
dado por: puede consultar en el capítulo 11.
En la figura 12.6 se muestra k
ciones 12.1 y 12.2, en = β0 + ∑
Y donde se co β
diferentes valores de los parámetr i =1
y el modeloorden y se observa
de segundo orden es: que su superfic
Figura 2.15 Representación gráfica del modelo de respuesta sentan varios modelos
k
de segundo
k
tridimensional dependeY de= βlos
0 + ∑ i i ∑ βii xi2
signos β x y +magnitud
Fuente: (Cámara, De Zan, Vera, & Goicoechea, 2013) se representan las i = 1 tres formas
i =1 bás
c) superficie con mínimo (valle) y
La forma de estimar los parámetros de
Los modelos que se usa en MSR son fundamentalmente polinomios de primer
puede Para
y segundo
consultar en más de 11.
orden,
el capítulo dos factores l
En la figura 12.6 se muestran vez
completas de una sola porque
las gráfica
que estudian el comportamiento de Y (variable de respuesta) con respecto a X (factores
ciones 12.1se preserva
y 12.2, la misma
en donde idea. Estodos
se consideran e
significativos) mediante un modelo de regresión ajustado a un esquema diferentes
matemático; un estos modelos
valores de los parámetros. La figurao
hiperplano y el de segundo
pueden probar simultáneamente el efecto de diversas variables con un mínimo Sin embargo,
orden ydeseensayos.
observa que su para
superficiek = 3esfactores
un plan
gráficas
sentan varios modeloscondedos factores
segundo cadaLa
orden. vez
f
depende de los signos y magnitudes de los co
Si se tienen k factores, el modelo de primer orden está dado por:
se representan las tres formas básicas, que son
c) superficie con mínimo (valle) y d) superfic
Ec. de
Para más 2.1dos factores las superficie
Gutierrez-12.indd 392
completas de una sola vez porque se encuentr
se preserva la misma idea. Esto es, para k > 2
un hiperplano y el de segundo orden constit
Sin embargo, para k = 3 factores es posible g
Y un modelo de segundo orden por: gráficas con dos factores cada vez, con el terc
Gutierrez-12.indd 392 Ec. 2.2
Donde los βj son los parámetros del modelo que afecta al factor Xi conocidos también como
coeficientes de regresión, βij coeficiente de interacción entre el factor Xi y el factor Xj, β0 término
constante, y ε el error aleatorio que engloba a las fuentes de variabilidad; los parámetros del
22
modelo se estiman mediante el método de mínimos cuadrados (Gutiérrez, Pulido & De la Vara
Salazar, 2008).
2.2.8.1 Prueba de significancia de los coeficientes estimados en el modelo ajustado
La prueba de significancia de la regresión ajustada se logra comparando las siguientes hipótesis
Si se acepta la H0 significa que ninguna variable en el modelo tiene una contribución significativa
para Y, mientras que si se rechaza, al menos un término favorece significativamente a explicar Y,
por lo que se acepta la HA; esto supone que el error tiene un comportamiento de distribución normal
aplicándose la prueba F con la siguiente fórmula:
!"! Ec. 2.3

𝐹! = !"!
> 𝐹!.!",!,!!!!!
Donde CMR es el cuadrado medio de la regresión y CME el cuadrado medio del residuo, al 0.05 de
significancia (Cámara, De Zan, Vera, & Goicoechea, 2013).
En el análisis de varianza la suma total de cuadrados se descompone en la suma de cuadrados de

regresión y en la suma de cuadrados del error, la fórmula de la suma de cuadrados debido a la
regresión es:
Ec. 2.4
A continuación en la figura 2.16 se resume el procedimiento de análisis de varianza para el modelo

de regresión.
Figura 2.16 Modelo de análisis de varianza

Fuente: (Gutiérrez, Pulido & De la Vara Salazar, 2008)
23
El valor de la significancia observada o valor-p (p-value, en inglés), es el área bajo la curva de la
distribución F lo cual es difícil de calcular de forma manual, sin embargo el empleo de un software
estadístico proporciona el valor-p dónde:
Si p ≤ α, se acepta HA y si p > α, se acepta H0, dónde α representa el 0.05 de nivel de significancia
Cuando de esta manera no es posible evaluar, otra forma de rechazar o no una hipótesis es
comparar el estadístico de prueba calculado F0 contra un valor crítico en tablas (Gutiérrez, Pulido
& De la Vara Salazar, 2008).
El coeficiente de determinación R2 y el coeficiente de determinación ajustado R2aj, son los más

útiles para medir la calidad global del modelo de regresión, que se obtienen a partir del ADEVA de
la siguiente manera:
Ec. 2.5
Estos dos coeficientes se interpretan de forma similar, indicando el porcentaje de variabilidad de

los datos en el modelo ajustado cumpliendo que 0 < R2aj y R2 < 1 además que si poseen valores
superiores a 0.7, el modelo tiene un ajuste satisfactorio (Gutiérrez, Pulido & De la Vara Salazar,
2008).
2.2.8.2 Diseños de superficie de respuesta
Son diseños experimentales empleados con el objetivo de ajustar un modelo adecuado y describir
una superficie de respuesta optimizando el número de análisis.
A continuación, en la tabla 2.5, se muestran los distintos diseños de respuesta con sus
características.
Tabla 2.4 Diseños de superficie de respuesta

DISEÑOS DE SUPERFICIE DE RESPUESTA
Diseño de primer orden Permiten ajustar modelos Diseños factoriales 2k
en los que sólo son Diseños factoriales fraccionados 2k – p
importantes los efectos Diseño de Plackett-Burman
principales y no existen
Diseño simplex
efectos de interacción.
Diseño de segundo orden Permiten estudiar efectos Diseño de Box-Behnken

lineales, de interacción y Diseño de composición central
efectos cuadráticos o de
curvatura pura
Fuente: (Amenaghawon, Nwaru, Aisien, Ogbeide, & Okieimen , 2013)
24
El diseño Box-Behken se utiliza para obtener la combinación de valores que optimiza las
respuestas dentro de la región del espacio de observación tridimensional.
Este diseño requiere un número experimental de carreras de acuerdo a:
𝑛 = 𝑘 ! + 𝑘 + 𝑐𝑝 Ec. 2.6
Donde k es el número de factores y cp es el número de repeticiones en el punto central

(Amenaghawon, Nwaru, Aisien, Ogbeide, & Okieimen , 2013).
2.3 FUNDAMENTO LEGAL
La lipasa más comúnmente empleada para la industria alimentaria es la 1,3-lipasa de Rhizomucor

miehei, que esta disponible comercialmente por Novozymes, Biocatalysts y Amano, así mismo se
considera una enzima GRAS (Generally Recognised As Safe) por la FDA. (Food and Drug
Administration) (Rivera Pérez & García Carreño, 2007)
Se describe también a los MCT como GRAS en diferentes tipos específicos de alimentos
funcionales y usos indicados.
“Los MCT representan poco o ningún riesgo de toxicidad cuando se consume como un
suplemento en una dieta equilibrada a niveles de hasta 15% de las calorías de la dieta o
aproximadamente 50% de la grasa de la dieta”. (Food and Drug Administration, 2012, p.
5).
Se justifica además por un gran número de estudios clínicos, estudios toxicológicos, e información
científica, registros de uso histórico, y aprobaciones extranjeras. (Food and Drug Administration,
2012)
25
CAPÍTULO III
3METODOLOGÍA
3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN
El presente trabajo desarrolló una investigación de tipo experimental cuantitativo a nivel

laboratorio, aplicado al sector industrial de las grasas y aceites, específicamente, destinada al
mejoramiento de condiciones en el proceso de hidrólisis con diferentes enzimas inmovilizadas para
la obtención de ácidos grasos de cadena media.
3.2 POBLACIÓN Y MUESTRA
3.2.1 Población
Son todos los diferentes tipos de aceites con fines comestibles obtenidos por diversos métodos de
extracción de la semilla (copra) de la palma de coco especie Cocos nucífera.
3.2.2 Muestra
La muestra (VCO) en estudio correspondió a una importación realizada de Malasia en el año 2013
almacenada en tanque metálico de 190 kg con número de lote V12-288 y certificación de producto
orgánico por Ecocert & QAI PH-BIO-154, tal cual indica el Anexo 13 en su certificado de análisis;
a partir de aquí se tomó la cantidad necesaria de muestra para la ejecución del proyecto.
Este aceite de coco virgen orgánico fue seleccionado principalmente por sus diversas aplicaciones
en el campo cosmético, farmacéutico, alimentario y por tener beneficios para la salud.
3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL
3.3.1 Variables
Variable Independiente
Factores
A: Porcentaje de agua en sustrato,
B: Tiempo de reacción
C: Temperatura.
26
Variable Dependiente
Variable de respuesta: porcentaje de hidrólisis
3.3.2 Diseño estadístico
Para averiguar la influencia de los parámetros e identificar los niveles óptimos que afectan el
proceso de hidrólisis, se empleó el método de superficie de respuesta (RSM), con ayuda de
software Desing Expert Versión 9.0.3.1 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, Mn 55413, EE.UU.) y
ajustando los factores a un modelo sugerido por el mismo software a cada una de las enzimas
propuestas.
Los tres factores de interés evaluados, que posteriormente podrán ser condiciones controlables a
una posible escala industrial con ahorro de energía y recursos fueron: el porcentaje de agua
respecto al sustrato (A), el tiempo de reacción (B) en minutos y la temperatura de reacción (C) en
grados Celsius.
Los niveles propuestos de cada factor, se consideraron a partir de especificaciones comerciales de

cada enzima y de información de investigaciones realizadas anteriormente; cada variable fue
codificada en tres niveles: -1, 0 y +1 en un orden de menor a mayor respectivamente, adoptando un
diseño de tres factores con tres niveles
Tabla 3.5 Factores y niveles de RSM en Addzymes TL 165 G

Niveles
Factores Bajo Centro Alto
-1 0 1
A % Agua en sustrato 5 15 25
B Tiempo (min) 60 180 360
C Temperatura (º C) 25 35 50
Tabla 3.6 Factores y niveles de RSM en Lipozymes 435, Lipozyme TL IM y Lipozymes RM IM

Niveles codificados
Factores Bajo Centro Alto
-1 0 1
A % Agua en sustrato 5 15 25
B Tiempo (min) 60 180 360
C Temperatura (º C) 35 50 70
27
Tabla 3.7 Resumen de diseño propuesto
Resumen del Diseño
Versión del Diseño 9.0.3.1

Tipo de estudio Superficie de Respuesta Corridas N
Tipo de Diseño Box-Behnken Bloques No Bloques
Modelo de Diseño Sugerido por el software
Factor Nombre Unidades Tipo Mínimos Máximos

A % Agua % Numérico -1 1
B Tiempo min Numérico -1 1
C Temperatura C Numérico -1 1
El diseño Box-Behnken fue el empleado para este trabajo el cual arrojó un número de 14 corridas
o combinaciones experimentales en base a la ecuación 2.1 generadas por el software como se
muestra en el resumen de la tabla 3.9, y que fueron asignadas al azar para maximizar los efectos de
la variabilidad con dos repeticiones al punto central y excluyendo como tratamientos a los vértices
de la región experimental (1, 1, 1) y (-1, -1, -1)
La variable de respuesta al diseño correspondió a la medición del porcentaje de hidrólisis ha

obtenerse para las diferentes combinaciones de los factores, estos resultados se muestran en las
tablas posteriores 4.4 a la 4.7
Tabla 3.8 Modelo de diseño de RSM (Box-Behnken)

Factor 1 Factor 2 Factor 3 Respuesta 1
Run A:% Agua B:Tiempo C:Temperatura Hidrólisis
% min C %
N 𝑥!
𝑥!
𝑥!
𝑥!
𝑥!
𝑥!
𝑥!
𝑥!
𝑥!
𝑥!
28
𝑋: Media de los valores obtenidos para cada combinación
Los datos de porcentaje de hidrólisis obtenidos fueron procesados con ayuda del software Design-
Expert v9.0.3.1 el mismo que ajustó un modelo sugerido a las variables de proceso mediante la
generación de una ecuación polinomial, además se evaluó dicho modelo con el desarrollo de
análisis de varianza y el coeficiente de determinación.
Mediante un análisis de varianza (ADEVA) y coeficiente de determinación (R2) que realizó el

software; se determinó si el modelo construido es adecuado para describir los datos observados en
función de la variable de respuesta (R2 por encima de 0,7 indicará un modelo aceptable (Gutiérrez,
Pulido & De la Vara Salazar, 2008)), además se diseñaron gráficas de superficie tridimensionales
para ilustrar los principales efectos y combinaciones de los factores; este estudio se realizó a cada
enzima: Addzyme TL 165G, Lipozymes 435, Lipozymes TL IM, Lipozymes RM IM.
Hipótesis del diseño:
Ho: Hidrólisis en función del porcentaje de agua respecto al sustrato = Hidrólisis en función del el
tiempos de reacción = Hidrólisis en función del temperatura.
H1: Hidrólisis en función del porcentaje de agua respecto al sustrato ≠Hidrólisis en función del el
tiempos de reacción ≠ Hidrólisis en función del temperatura.
3.4 DISEÑO METODOLÓGICO
3.4.1 Materiales y reactivos
• Aceite de coco virgen (Cocos nucífera)

• Enzimas lipídicas con las siguientes características comerciales:
Tabla 3.9 Características de enzimas lipídicas en estudio
Lipozymes 435(3) Addzyme TL 165G (1) Lipozyme TL IM(2) Lipozymes RM IM(4)

Origen Candida Thermomyces Thermomyces Rhizomucor miehei
antractica lanuginose lanuginose
Forma física Inmovilizado Inmovilizado Inmovilizado Inmovilizado

granulado granulado granulado granulado
Especificidad No especifica sn-1,3especifica sn-1,3especifica sn-1,3especifica
Temperatura 70ºC 50ºC 65ºC
pH óptimo 7 6.5-7 7-8

(1)
Anexo 1, (2) Anexo 2, (3) Anexo 3
(4)
(Raspe, Cardozo Filho, & Da Silva , 2013)
29
3.4.1.1 Equipos y materiales
• Balanza analítica: ACL Acculab, modelo 210.4, apreciación ±0.1 mg, rango de pesaje;
máximo 210.0 g, mínimo 0.01 g.
• Baño termostático de agua con agitador: New Brunswick Scientific Classic Series,
modelo C76, con velocidad de agitación de 50 a 300 rpm; control de temperatura de ± 0,5 °
C durante un intervalo de 7 ° C, con temperaturas por encima de la temperatura ambiente
hasta 80 ° C.
• Refrigerador marca Durex: capacidad 10 pies con sistema no-frost.
• Hot Plate: Thomas Hot Plate Stirrers, rango de temperatura de cerámica de +5 ° C a 500
°C y velocidad de agitación en rango de 60 a 1600 rpm.
• Centrífuga: Eppendorf, modelo 5810, capacidad de máximo 4 × 750 ml y su potencia
máx. 14.000 rpm.
• Tubos para centrífuga 50mL con fondo cónico: Axygen, modelo SCT-50ML-25-S.
• Bureta Digital 50mL: Brend Tech, modelo Titrette® SH
• Equipo de seguridad personal: Mascarilla con filtro, guantes de calor, guantes de caucho,
gafas de seguridad, mandil.
• Matraces de 500 mL provistos con tapón esmerilado
• Tapones de teflón para matraces
• Probetas de 25mL y 50mL.
• Vaso de precipitados de 100mL y 500mL
• Papel Filtro Grado 40: Whitman, con retención de partículas de 8 µm, peso 95 g/m2 y
grosor de 0,21 mm.
• Embudos
3.4.1.2 Reactivos
• Agua destilada: Tratada por ósmosis inversa de ph 6.93

• Etanol al 95 % de pureza
3.4.2 Métodos
3.4.2.1 Caracterización de aceite de coco virgen
Se caracterizó el aceite de coco virgen con los siguientes análisis:
• Porcentaje de humedad: Se realizó según la AOCS ca2b-38, el cual determina la humedad y

cualquier otro material volátil en placa caliente (Hot Plate, ANEXO 4)
• Índice de acidez: Se realizó según la ISO 660:1996 por el método titulométrico (ANEXO 5)
30
• Punto de fusión: Se realizó según el método de la norma NTE INEN 0474 mediante la
inmersión en agua o aceite del tubo capilar que contiene la grasa, cristalizada bajo condiciones
controladas y registrado la temperatura a la cual asciende la grasa en la columna (ANEXO 6).
• Índice de peróxido: Se realizó según la AOCS Cd 8b-90 (03) (ANEXO 7).
• Índice de saponificación: Se realizó según la ISO 3657: 2002; o AOCS Cd 3-25 (02) o NTE
INEN 0040:73 (ANEXO 8).
• Perfil de ácidos grasos: Los AG se metilaron para posteriormente ser separados por CG
mediante un Cromatógrafo Gaseoso GC Autosystem de Perkin Elmer, dotado con una
columna capilar de vidrio fundido cubierto de una película de material polimérico semilíquido,
de 10-60 m de longitud y de 0.2-1.0 mm de diámetro; utilizando helio como gas transporte; el
manejo del equipo detallado puede verse en el ANEXO 9.
Cada vez que se inyectó la muestra, el software automáticamente fue almacenando los datos en
forma de archivos en serie y graficados en el cromatograma que luego se procedió a imprimir.
Se realizó la metodología planteada por ISO 5508:1990 (ANEXO 10), cuantificándolos en
forma de metilésteres.
3.4.2.2 Hidrólisis enzimática en aceite de coco virgen
La reacción de hidrólisis se realizó en matraces de 500 mL donde se agregaron 20 g de aceite de

coco virgen, agua y lipasa cerrados herméticamente con tapas de teflón e incubados en un baño
termorregulador con agitación fija a 160 RPM.
La cantidad de agua, la temperatura y el tiempo de reacción se fijaron bajo las condiciones

establecidas en el diseño del experimento mientras que la cantidad de lipasa se fijo en 5% con
respecto al sustrato aceite-agua.
Finalizado el tiempo de la reacción, se retiró los matraces del baño termorregulador y se filtró su
contenido con ayuda de papel filtro cuantitativo # 40. El sustrato agua/aceite separado, se añadió en
tubos de centrífuga de 50 mL y se centrifugó por 10 minutos a 5000 rpm.
Una vez separado el aceite y el contenido de agua se midió el progreso de la reacción con la
determinación de ácidos grasos libres.
3.4.2.3 Análisis y rendimiento de la reacción de hidrólisis
Determinación del porcentaje de ácidos grasos libres e índice de acidez
Se empleó el método de titulación con etanol caliente siguiendo la metodología de la norma IS0
660:1996 (ANEXO 5); el hidróxido de sodio empleado tuvo una concentración 0,4981 N este valor
se obtuvo valorando con una solución biftalato de potasio como patrón primario.
31
Los resultados del porcentaje de acidez se calculó con la siguiente ecuación:
𝟐𝟎𝟎, 𝟑𝟏×𝐍×𝐕
% 𝐀𝐜𝐢𝐝𝐞𝐳 =
𝟏𝟎𝐦
Dónde:
% Acidez: Porcentaje de ácidos grasos libres, expresados como ácido láurico (g/100g)
N: Normalidad de NaOH (mol/1000mL)
V: Volumen de NaOH (mL)
m: Cantidad de muestra empleado para el análisis (g)
200,31: Peso molecular del ácido láurico (g/mol)
Al tratarse de muestras que no contienen ácidos distintos de los ácidos grasos, el % acidez y el
índice de acidez (IA) se pueden convertir una a otra usando un factor de conversión de 2,81 para el
ácido láurico (Nielsen, 2009) de la siguiente manera:
𝐈𝐀 = % 𝐀𝐜𝐢𝐝𝐞𝐳×𝟐, 𝟖𝟏
Cuantificación del rendimiento de hidrólisis lipídica
Para el rendimiento de la reacción se siguió el método descrito por Goswani, De, & Basu, 2012
utilizando la siguiente fórmula.
Í𝐧𝐝𝐢𝐜𝐞 𝐝𝐞 𝐀𝐜𝐢𝐝𝐞𝐳 ×𝟏𝟎𝟎

𝐏𝐨𝐫𝐜𝐞𝐧𝐭𝐚𝐣𝐞 𝐝𝐞 𝐡𝐢𝐝𝐫ó𝐥𝐢𝐬𝐢𝐬 =
Í𝐧𝐝𝐢𝐜𝐞 𝐝𝐞 𝐒𝐚𝐩𝐨𝐧𝐢𝐟𝐢𝐜𝐚𝐜𝐢ó𝐧
32
CAPÍTULO IV
4ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1 ANALISIS DE ACEITE DE COCO VIRGEN
A continuación en la tabla 4.11 indica los resultados de los análisis realizados al aceite de coco
comparados con los parámetros de control, todos estos valores confirman que es un aceite de
óptima calidad, su bajo contenido de peróxidos y acidez reafirman el hecho de que no ha sufrido
oxidación atmosférica e hidrolítica.
Tabla 4.10 Características fisicoquímicas analizadas para el aceite de coco virgen
Propiedades Resultados Especificación *
Contenido de Humedad, % 0,04 < 0.1

Ácidos grasos libres, (como Ac. láurico), % 0,02 0.20 máx.
Índice de peróxidos, meq O2 / kg 0,14 3 máx.

Índice de saponificación mg KOH/g 252,76 245-255
Punto de Fusión °C 25
Aspecto Libre de impurezas, olor
característico
*De acuerdo con la IUPAC 2.301, 2.302 y 2.304 o ISO 5508: 1999 o ISO 5509: 1999
4.1.1 Perfil de ácidos grasos
El aceite de coco virgen utilizado en el estudio presentó una composición de ácidos grasos que se
encuentran dentro de las especificaciones descritas por (Bawalan, Processing Manual For Virgin
Coconut Oil, in Products an by products for Pacific Island Countries and Territories, 2011) tabla
2.3, cumpliendo las características propias del producto además de confirmar su legitimidad con
posibles adulteraciones.
Como se muestra en la tabla 4.12 la fracción ácidos grasos de cadena corta (C2, C4) no son
detectables, mientras que los ácidos grasos de cadena media (C6, C8, C10 y C12), corresponden en
conjunto al 62,86 % y entre estos el más abundante es el ácido láurico con un 48,75 %. Los ácidos
grasos de cadena larga (C14, C16 y C18) corresponden un 36,46 % incluyendo la presencia de
ácidos grasos insaturados (C18:1 y C18:2) con el 6,33 %.
33
Tabla 4.11 Perfil de ácidos grasos
ACEITE DE COCO VIRGEN
Tipo de Carboxilato %
48,75
C6:0 Caproico 0,65
C8:0 Caprilico 8,04
C10:0 Caprico 6,07
C12:0 Laurico 48,75
C14:0 Miristico 18,64
C16:0 Palmitico 8,3
C18:0 Estearico 3,22
Total Saturados 93,7 18,64
C18:1 (n-9) Oleico 5,45
Total Monoinsaturados 5,5
8,04 8,3
C18:2 (n-6) Linoleico 0,88 6,07 5,45
3,22
Total Poliinsaturados 0,9 0,65 0,88 0
% Trans 0
Ácidos grasos cadena corta 0,65
Ácidos grasos cadena media 62,86
Ácidos grasos cadena larga 36,49
Figura 4.17 Diagrama de columnas del % de ácidos
grasos presentes en el aceite de coco virgen
4.2 ACTIVIDAD LIPOLÍTICA
Los valores de actividad lipolítica de las enzimas fueron analizadas previamente en los laboratorios
de biotecnología de La Fabril y sus resultados se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 4.12 Resultados de actividad lipídica basado en la modificación de grasa por

interesterificación enzimática
Peso % 𝐒𝐅𝐂 𝐈𝐔𝐍
% SFC a % SFC a %𝐓𝐫𝐢𝐬𝐭𝐞𝐚𝐫𝐢𝐧
enzima IUN
40 ºC Blanco 40 ºC 𝒎𝒊𝒏 𝒎𝒊𝒏 𝒈
(g)
Addzyme TL 1,0031 20,6 2,89 0,61 13,2 698,5 697
165G
Lipozymes 1,0032 20,4 11,12 0,30 3,9 389,8 389
TL IM
1,0009 20,4 12, 20 0,27 3,4 344,4 344
Lipozymes 435
Lipozymes RM 1,0324 20,5 7,66 0,42 5,4 535,1 518
IM
Los valores observados en la taba 4.13 indica que la enzima con mayor actividad enzimática
corresponde a la Addzymes TL 165 G y la más baja a la Lipozymes TL IM, esto puede deberse a la
34
diferencia que existe en la aplicación de cada una (tabla 3.10) a pesar de que son enzimas con
similar especificidad y obtenidas del mismo microorganismo (Thermomyces lanuginose) su actividad
con respecto una de otra se ve reducida en aproximadamente un 40 % cuantificado en unidades de
intereterificación (UI).
4.3 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
Las combinaciones para los valores obtenidos del porcentaje de hidrólisis se obtuvieron con la
metodología descrita en el Capítulo III en la sección 3.4.2.4, con 14 combinaciones experimentales
generadas con el software empleando el diseño de Box-Behnken para el análisis de superficie de
respuesta; los resultados se presentan en las siguientes tablas 4.14, 4.15, 4.16 y 4.17:
Tabla 4.13 Porcentaje de hidrólisis diseño de RSM Addzymes TL 165 G

Std Run A:% Agua B:Tiempo C:Temperatura Hidrólisis

% min C %
11 1 0 -1 1 55,47
7 2 -1 0 1 35,32
14 3 0 0 0 57,15
12 4 0 1 1 65,30
8 5 1 0 1 73,58
13 6 0 0 0 56,02
2 7 1 -1 0 52,53
3 8 -1 1 0 40,36
1 9 -1 -1 0 35,66
9 10 0 -1 -1 49,53
4 11 1 1 0 70,91
10 12 0 1 -1 59,78
5 13 -1 0 -1 39,30
6 14 1 0 -1 57,89
Fuente: Desing Expert v 9.3.1
Los resultados que se indica la tabla 4.14 se obtiene un valor máximo de hidrólisis del 73,58 % con
un porcentaje de agua en el sustrato del 25 %, un tiempo de 180 min y a una temperatura de 50 ºC,
según la combinación 1, 0 ,1.
35
Tabla 4.14 Porcentaje de hidrólisis diseño de RSM Lipozymes 435

% min C %
11 1 0 -1 1 14,16
9 2 0 -1 -1 7,25
2 3 1 -1 0 11,70
12 4 0 1 1 30,12
10 5 0 1 -1 15,91
4 6 1 1 0 27,60
14 7 0 0 0 0,60
1 8 -1 -1 0 9,26
3 9 -1 1 0 18,09
5 10 -1 0 -1 9,85
7 11 -1 0 1 27,71
6 12 1 0 -1 12,42
13 13 0 0 0 0,60
8 14 1 0 1 17,84
La tabla 4.15 se observa que en todas las combinaciones no supera el 30 % de ácidos grasos libres,
además de obtenerse el valor más bajo de hidrólisis menor al 1 % de todos los ensayos realizados.
El máximo valor de AGL conseguido fue 30,12% con un porcentaje de agua en el sustrato del 15
%, en un tiempo de 360 min y a una temperatura de 70 ºC, según la combinación 0, 1, 1.
Tabla 4.15 Porcentaje de hidrólisis diseño de RSM Lipozyme TL IM


% min C %
14 1 0 0 0 14,27
5 2 -1 0 -1 27,47
12 3 0 1 1 14,52
8 4 1 0 1 17,85
13 5 0 0 0 15,38
10 6 0 1 -1 28,00
4 7 1 1 0 37,86
11 8 0 -1 1 6,87
3 9 -1 1 0 30,40
2 10 1 -1 0 26,82
7 11 -1 0 1 28,18
9 12 0 -1 -1 11,39
6 13 1 0 -1 28,32
1 14 -1 -1 0 20,97
36
Los valores obtenidos en la tabla 4.16 el máximo valor obtenido de hidrólisis fue 37,86% con un
porcentaje de agua en el sustrato del 25 % en un tiempo de 360 min y a una temperatura de 50 º C
según la combinación 1, 1, 0; también se aprecia que ninguna de las combinaciones alcanza el 40
% de hidrólisis.
Tabla 4.16 Porcentaje de hidrólisis diseño de RSM Lipozymes RM IM


% min C %
4 1 1 1 0 59,58
11 2 0 -1 1 16,91
5 3 -1 0 -1 31,56
10 4 0 1 -1 48,42
1 5 -1 -1 0 30,06
7 6 -1 0 1 34,28
3 7 -1 1 0 33,50
13 8 0 0 0 15,38
12 9 0 1 1 43,03
8 10 1 0 1 30,02
9 11 0 -1 -1 32,44
6 12 1 0 -1 43,37
14 13 0 0 0 14,27
2 14 1 -1 0 24,02
En la tabla 4.17 el máximo valor obtenido de hidrólisis fue 59,58 % con un porcentaje de agua en
el sustrato del 25 %, en un tiempo de 360 min a 50 º C, como indica la combinación 1, 1, 0.
El ajuste del polinomio de segundo orden y su análisis de varianza (ANOVA) de los resultados
obtenidos de cada lipasa se indica más adelante.
4.3.1 Ajuste de los modelos y análisis de varianza (ANOVA)
Los resultados obtenidos de AGL con las enzimas Addzymes TL 165 G, Lipozymes 435,
Lipozymes TL IM y Lipozymes RM IM, bajo el efecto de tres variables, como son el porcentaje de
agua (A), tiempo (B) y temperatura (C), y determinando el rendimiento de hidrólisis manteniendo
constante la cantidad de enzima añadida al 5% y con una agitación de 160 RPM, fueron analizados
usando el análisis de varianza (ADEVA) para el modelo experimental empleado y se presentan en
las tablas 4.18, 4.19, 4.20 y 4.21
37
4.3.1.1 Addzymes TL 165 G
Tabla 4.17 Resultados del análisis de varianza de hidrólisis enzimática empleando Design-
Expert 9.0.3
Fuente de Suma de Grados Cuadrados F
variación Cuadrados de libertad Medios Calculada p-value
Modelo 1954,71 9 217,19 67,41 0,0005 *

A: % Agua 1359,03 1 1359,03 421,83 <0,0001 *
B: Tiempo 232,85 1 232,85 72,27 0,0010 *
C: Temperatura 67,11 1 67,11 20,83 0,0103 *
AB 46.79 1 46,79 14,52 0,0189 *
AC 96,73 1 96,73 30,02 0,0054 *
BC 0,044 1 0,044 0,014 0,9125 ns
A2 129,39 1 129,39 40,16 0,0032 *
B2 0,42 1 0,42 0,13 0,7370 ns
C2 5,38 1 5,38 1,67 0,2660 ns
Residual 12,89 4 3,22
Falta de ajuste 12,25 3 4,08 6,39 0,2810 ns
Error puro 0,64 1 0,64
Total 1967,60 13
ECUACION MODELO R2 R2 adj

% Hidrólisis = +56.59 +13.03A +5.39B +2.90C +3.42AB +4.9AC -0.10BC -
0,994 0,979
6.36A2 - 0.36B2 +1.30C2
Ecuación de modelo resultante para las variables codificadas: A % de agua, B Tiempo y C
temperatura
(*) significativo, (ns) no significativo
En la tabla 4.18 la calidad del ajuste del modelo estuvo expresado mediante el coeficiente de
determinación (R2) siendo su valor de 0,994; este resultado señala que el modelo es conveniente
para describir la variable de respuesta y representa adecuadamente una correlación entre las
variables en estudio. Además señala que el 99,4% de la variabilidad es explicada por el modelo y
sólo el 0,60 % no lo es o fue un resultado de la casualidad.
El valor de F elevado de 67,41 y la probabilidad de 0,0005 < 0.05 implica que el modelo es
significante, lo que indica que la ecuación del modelo describe apropiadamente la superficie de
respuesta con respecto al porcentaje de hidrólisis en el intervalo de la investigación.
Los valores de probabilidad (p-value) de los factores del modelo como sus interacciones inferiores
a 0,05 indican también que son significativos, para este caso los términos que tienen mayor efecto
en la variable de respuesta son A (% de agua), B (tiempo), C (temperatura), AB, AC, A2, siendo A,
el porcentaje de agua (probabilidad<0,0001) el término que más influenció en proceso de hidrólisis
38
enzimática. Los valores p superiores a 0,05 indican los términos de modelo no significativos y que
la interacción entre factores no influye en el rendimiento del proceso.
• Efecto de parámetros en el rendimiento de hidrólisis enzimática de Addzymes TL 165 G
Figura 4.18 Superficie de respuesta para el % de hidrólisis de datos

experimentales de la lipasa Addzymes TL 165 G, mostrando el efecto
del porcentaje de agua (A), temperatura (C) y su interacción

experimentales de la lipasa Addzymes TL 165 G, mostrando el efecto
del porcentaje de agua (A), tiempo (B) y su interacción
39
En las figuras 4.18 y 4.19 se observan las gráficas de superficie de respuesta para la lipasa
Addzymes TL 165 G bajo las condiciones de porcentaje de agua (A) con temperatura (C) y
porcentaje de agua (A) con el tiempo (B) respectivamente; esto indica que su interacción en los
intervalos establecidos con mayor contenido de agua (1: 25%) junto con el de mayor temperatura
(1: 50 º C) y mayor tiempo (1: 360 min) se consigue optimizar la variable de respuesta
incrementado el rendimiento de hidrólisis a valores superiores del 70 % el cual se distingue como
puntos máximos en cada figura, mientras que a condiciones de A con B y A con C en intervalos
establecidos de mayor y menor (1,-1 o -1,1), para ambos casos no consiguen elevar el rendimiento
en el proceso de hidrólisis enzimática.
Figura 4.20 Superficie de respuesta para el % de hidrólisis de

datos experimentales de la lipasa Addzymes TL 165 G, mostrando
el efecto de la temperatura (C), tiempo (B) y su interacción
En la figura 4.20 se puede observar que la interacción de la temperatura (C) con el tiempo (B) en
todos los intervalos (1, 0,-1), no muestra un incremento con respecto al rendimiento de hidrólisis,
es decir que en este caso su interacción no es principalmente responsable en la variable de
respuesta.
40
Figura 4.21 Gráfico de cubo para la respuesta de rendimiento de
hidrólisis predicha en combinaciones de niveles bajo y alto, lipasa
Addzymes TL 165 G Fuente: Desing Expert v 9.3.1
En la figura 4.21 se observa el valor de predicción más alto que puede obtenerse si se trabaja con
una combinación de porcentaje agua de 25 % (1), tiempo de 360 min (1), y temperatura de 50 º C
(1), dando lugar a un valor predicho de 80,71% de hidrólisis si se trabaja con niveles elevados de
contenido de agua, tiempo y temperatura
4.3.1.2 Lipozymes 435
En la tabla 4.19 la calidad del ajuste del modelo expresado por el coeficiente de determinación (R2)
es de 0.9580; este resultado señala que el modelo es conveniente para describir la variable de
respuesta representando adecuadamente la correlación entre las variables en estudio, señala además
que el 95,8% de la variabilidad fue explicada por este modelo y que el 4,2 % no lo es o es un
resultado de la casualidad.
El elevado valor de F del modelo de 10.13 y la probabilidad de 0,0198 < 0,05 implica que el
modelo es significante, indicando que la ecuación del modelo describe adecuadamente la superficie
de respuesta respecto al porcentaje de hidrólisis en el intervalo de investigación.
41
Expert 9.3.1

Modelo 1069,57 9 118,84 10,13 0,0198 *
A-Agua 2,70 1 2,70 0,23 0,6562 ns

B-Tiempo 304,43 1 304,43 25,96 0,0070 *
C-Temperatura 246,42 1 246,42 21,01 0,0102 *
AB 12,50 1 12,50 1,07 0,3603 ns
AC 3,69 1 38,69 3,30 0,1435 ns
BC 13,32 1 13,32 1,14 0,3465 ns
A2 208,85 1 208,85 17,81 0,0135 *
B2 203,97 1 203,97 17,39 0,0140 *
C2 21,19 1 219,19 18,69 0,0124 *
Residual 46,91 4 11,73
Falta de ajuste 46,91 3 15,64
Error puro 0,000 1 0,000
Total 1116,47 13

% de Hidrólisis = +0.60 +0.58A + 6.17B +5.55C +1.77AB - 3.11AC
0.9580 0.8635
+1.83BC +8.08A2 +7.98B2 + 8.28C2
temperatura
Los términos del modelo significativos (p < 0,05) que tienen mayor efecto en la variable de
respuesta son B (tiempo), C (temperatura), A2, B2 y C2; siendo B el tiempo (probabilidad 0,0070) el
término que más influencia tiene en el proceso de hidrólisis enzimática. Los valores superiores a
0,05 indican los términos e interacciones de modelo no significativos es decir que no influye en el
rendimiento del proceso.
• Efecto de parámetros en el rendimiento de hidrólisis enzimática de Lipozymes 435

En las figuras 4.22 y 4.23 se observan las gráficas de superficie de respuesta para la lipasa
Lipozymes 435 bajo las condiciones de porcentaje de agua (A) con el tiempo (B) y porcentaje de
agua (A) con la temperatura (C); en ambas gráficas se percibe que el efecto del contenido de agua
en todo el intervalo 1, 0, -1 exista alguna diferencia que permita optimizar el incremento del
proceso hidrolítico, sin embargo una interacción a niveles elevados (1, 1) de temperatura (70 º C) y
tiempo ( 360 min) se consiguen acrecentar el rendimiento, mientras que ha condiciones de A con B
42
y A con C en su niveles más bajos (-1,-1), en ambos casos, se obtienen valores reducidos en el
proceso de hidrólisis enzimática.

experimentales de la lipasa Lopozymes 435, mostrando el efecto de la %
de agua (A), tiempo (B) y su interacción Fuente: Desing Expert v 9.3.1

experimentales de la lipasa Lipozymes 435, mostrando el efecto de % de
agua (A), temperatura (C) y su interacción Fuente: Desing Expert v 9.3.1
43
En la figura 4.24 se observa que el efecto debido a las interacciones de tiempo (B) y temperatura
(C) en sus niveles más altos, se logra optimizar el incremento de la variable de respuesta el cual se
distingue como punto máximo (1,1) obteniendo un valor cercano al 30 %; sin embargo este valor
alcanzado no representa un rendimiento deseado.

experimentales de la lipasa Lipozymes 435, mostrando el efecto del
tiempo (B), temperatura (C) y su interacción Fuente: Desing Expert v 9.3.1

Lipozymes 435 Fuente: Desing Expert v 9.3.1
44
En la figura 4.25 se observa un valor predicho de 39,24 % de hidrólisis, en una combinación con un
porcentaje de agua al 5 % (-1), tiempo de 360 min (1), y temperatura de 70 º C (1) apreciando que
la enzima para el proceso de hidrólisis trabajaría de mejor manera a condiciones mínimas de
contenido de agua y máximas de temperatura en un mayor tiempo.
4.3.1.3 Lipozyme TL IM
Expert 9.3.1
Modelo 932,86 9 103,65 5,47 0,0585 ns

A-Agua 1,83 1 1,83 0,097 0,7713 ns
B-Tiempo 250,10 1 250,10 13,19 0,0221 *
C-Temperatura 96,33 1 96,33 5,08 0,0872 ns
AB 0,65 1 0,65 0,034 0,8623 ns
AC 31,25 1 31,25 1,65 0,2685 ns
BC 20,07 1 20,07 1,06 0,3616 ns
A2 478,14 1 478,14 25,22 0,0074 *
B2 12,34 1 12,34 0,65 0,4650 ns
C2 8,13 1 8,13 0,43 0,5483 ns
Residual 75,82 4 18,96
Total 1008,68 13

% de Hidrólisis = +14.82 + 0.48A +5.59B - 3.47C + 0.40AB -
0.9248 0.7557
2.79AC - 2.24BC + 12.22A2 + 1.96B2 - 1.59C2
temperatura
La calidad del ajuste del modelo expresado por el coeficiente de determinación (R2) es de 0.9248
como se muestra en la tabla 4.20; este resultado señala que el modelo aparentemente es
conveniente para describir la variable de respuesta, se puede decir que 92.4 % de la variación de la
respuesta observada es explicada por el modelo; sin embargo el valor de R2 ajustado de 0.7557
(cercano a 0.7) indica que el modelo no es tan recomendable para fines de predicción.
El valor bajo de F de 5.47 del modelo y la probabilidad de 0,0585 > 0.05 indica que el modelo es
no significativo, implicando que la ecuación del proceso opera con una alta variación.
45
Los términos del modelo significativos (p< 0,05) que tienen mayor efecto en la variable de
respuesta son B (tiempo) y A2, a pesar de esto en el ADEVA se observa que la mayor parte de los
factores estudiados es no significativo (valores p superiores a 0,05) y que además se refleja en un
R2 ajustado bajo, esto puede deberse a que posiblemente los niveles de los factores propuestos en
esta enzima son muy estrechos, de forma que la diferencia entre lo que pasa en un nivel y otro es
prácticamente imperceptible por la variable de respuesta (Gutiérrez, Pulido & De la Vara Salazar,
2008).
• Efecto de parámetros en el rendimiento de hidrólisis enzimática de Lipozymes TL IM

experimentales de la lipasa Lipozymes TL IM, mostrando el efecto
del tiempo (B), % agua (A) y su interacción
En la figura 4.26 se observa que la enzima Lipozymes TL IM bajo las condiciones de porcentaje de
agua (A) a un nivel máximo de 25 % y mínimo de 5 % (1 y -1) en un tiempo (B) de 360 min (1)
incrementa el contenido de ácidos grasos libres cercanos al 40 %.; además de que niveles centrales
cercanos a 0 de contenido de agua disminuyen la hidrólisis, esta variación singular de resultados
puede deberse a que los factores estudiados no tienen una mayor influencia sobre la variable de
respuesta o existen factores que deban mantenerse constantes y/o deban cambiarse.
46
En la figura 4.27 se observa que a una temperatura baja cercana al 35 º y con un contenido de agua
elevado del 25 % (-1, 1) se alcanza un rendimiento por encima al 30 % de ácidos grasos libres.

experimentales de la lipasa Lipozymes TL IM, mostrando el efecto
del % de agua (A), temperatura (C) y su interacción
Figura 4.28 Superficie de respuesta para el % de hidrólisis de

datos experimentales de la lipasa Lipozymes TL IM, mostrando
el efecto del tiempo (B), temperatura (C) y su interacción
47
En la figura 4.28 muestra que en todas las posibles combinaciones entre la temperatura y el tiempo
no se consigue acrecentar el rendimiento de hidrólisis, es decir que sus interacciones entre estos
factores no es una principal razón para influenciar la variable de respuesta, resultado que también
se ve reflejado en el ADEVA al no ser significativos.

Lipozymes TL IM Fuente: Desing Expert v 9.3.1
En la figura 4.29 se observa que se puede obtener el 42,39 % de hidrólisis con una combinación de
porcentaje de agua del 25 % (1), en un tiempo de 60 min (-1), a una temperatura de 35 º C (-1),
indicando que la enzima trabajaría de mejor manera a condiciones elevadas de contenido de agua y
mínimas de temperatura y tiempo; sin embargo el R2 ajustado cercano a 0.7 indica que este modelo
no es tan recomendable.
4.3.1.4 Lipozymes RM IM
En la tabla 4.21 la calidad del ajuste expresado por el coeficiente de determinación (R2) es el valor
de 0.9841; este resultado muestra que el modelo empleado es bueno para describir la variable de
respuesta y representa adecuadamente la correlación entre las variables en estudio. Además señala
que el 98,4% de la variabilidad es explicada por este modelo y sólo el 2,40 % no lo es o es el
resultado de la casualidad.
El F-valor del modelo de 27,51 y la probabilidad de 0,0030 < 0.05 implica que el modelo es
significante, lo que indica que la ecuación del modelo describe apropiadamente la superficie de
respuesta con respecto al porcentaje de hidrólisis, los factores y en los niveles estudiados.
48
Expert 9.0.3
Grados
Fuente de Suma de Cuadrados F
de p-value
variación Cuadrados Medios Calculada
libertad
Modelo 2138,56 9 237,62 27,51 0,0030 *

A-% Agua 95,15 1 95,15 11,02 0,0294 *
B-Tiempo 822,15 1 822,15 95,18 0,0006 *
C-Temperatura 124,43 1 124,43 14,40 0,0192 *
AB 257,92 1 257,92 29,86 0,0055 *
AC 64,56 1 64,56 7,47 0,0522 ns
BC 25,70 1 25,70 2,98 0,1596 ns
A2 372,30 1 372,30 43,10 0,0028 *
B2 399,89 1 399,89 46,29 0,0024 *
C2 270,63 1 270,63 31,33 0,0050 *
Residual 34,55 4 8,64
Total 2173,11 13

% de Hidrólisis = +14.83 + 3.45A + 10.14B - 3.94C + 8.03AB - 4.02AC +
0.9841 0.9483
2.53BC + 10.79A2+11.18B2 + 9.20 C2
temperatura
Los valores de probabilidad (p-value) inferiores a 0,05 indican que los términos del modelo como
sus interacciones son significativas, para este caso los términos que tienen mayor efecto en la
variable de respuesta son A (% de agua), B (tiempo), C (temperatura), AB, A2, B2 y C2 siendo B el
tiempo (probabilidad 0,0006) el término que más influencia tiene en el proceso de hidrólisis
enzimática. Los valores superiores a 0.05 indican los factores del modelo que son no significativos
o que su interacción no influye en el rendimiento del proceso.
• Efecto de parámetros en el rendimiento de hidrólisis enzimática de Lipozymes RM IM
En la figura 4.30 se observa el efecto debido a la combinacion entre un tiempo (B) prolongado y un
mayor porcentaje de agua (A), se consigue incrementar la variable de respuesta el cual se distingue
como un punto máximo (1,1) de la gráfica y que bajo estas condiciones se consigue obtener un
porcentaje de hidrólisis enzimática del 60 %.
49
experimentales de la lipasa Lipozymes RM IM, mostrando el efecto
del % de agua (A), del tiempo (B) y su interacción

del % de agua (A), temperatura (C) y su interacción
50
del tiempo (B), temperatura (C) y su interacción
En las figuras 4.31 y 4.32 se observan las gráficas de superficie de respuesta bajo las condiciones
de porcentaje de agua (A) con la temperatura (C), y el tiempo (B) con la temperatura (C); en ambas
gráficas se manifiesta que no existe diferencia que permita elevar el contenido de AGL. Además se
muestra que un nivel bajo del 5 % de agua a 70 º C (-1,1) en la figura 4.31 y un tiempo de 60
minutos a 70 º C (-1, 1) en la figura 4.32, se consiguen los niveles más bajos de hidrólisis.

hidrólisis predicha en combinaciones de niveles bajo y alto lipasa
Lipozymes RM IM Fuente: Desing Expert v 9.3.1
51
En la figura 4.33 se observa el valor de predicción más alto que se puede obtener con la
combinación de porcentaje agua de 25 % (1), tiempo de 360 min (1), y temperatura de 35 º C (-1),
esta combinación de factores da lugar a un valor predicho de 73,02 % de hidrólisis por lo que la
enzima es más eficiente a condiciones elevadas de contenido de agua y tiempo pero a bajas
temperatura.
52
CAPITULO V
5CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1 CONCLUSIONES
El porcentaje de humedad, índice de acidez, índice de peróxidos e índice de saponificación en el

aceite de coco virgen son: 0,04 %, 0,14 meq O2/kg y 252,76 mg KOH/g, respectivamente. El perfil
de ácidos grasos presenta: ácidos grasos de cadena media (C6, C8, C10) en un 15 % , ácido láurico
un 49 % y ácidos grasos de cadena larga (C14, C16 y C18) en un 36 %, los mismos que cumplen
con los requisitos de calidad e identidad dentro de los parámetros establecidos de la legislación
alimentos de Filipinas así como las regulaciones del USDA y la FDA.
Se desarrolló el método de superficie de respuesta usando el software Desing Expert versión

9.0.3.1 con el diseño Box – Behken, el cual generó un total de 14 ensayos al azar con dos
repeticiones al punto central (0, 0, 0), empleando la combinación de los factores: porcentaje de
agua, tiempo, temperatura y se midió su respuesta mediante el porcentaje de hidrólisis.
Se determinó un contenido de ácidos grasos libres del 73,58 % mediante la reacción de hidrólisis
catalizada por la enzima Addzymes TL 165 G con un 25 % de agua a temperatura de 50 º C en 180
minutos; un 59 % de AGL empleando la enzima Lipozymes RM IM con el 25% de agua a 50 º C
en 360 minutos. Usando Lipozymes TL IM se obtuvo el 38 % de AGL con una combinación del
25 % de agua a 50 º C en 360 minutos; y con Lipozymes 435 con el 15% de agua a 70 ºC en 360
minutos de reacción se alcanzó el 27 % de ácidos grasos libres
En el ADEVA de los resultados obtenidos de la enzima Addzymes TL 165 G se determinó que la

cantidad de agua y su combinación con la temperatura son las condiciones con mayor influencia
significativa tienen en el proceso de hidrólisis, seguido del tiempo y la temperatura; mientras que la
gráfica de superficie de respuesta determinó que la interacción de la cantidad agua añadida y la
temperatura a niveles iguales o superiores a 1 (25% y 50 ºC respectivamente) son excelentes para
conseguir el 73% de AGL; además con la grafica de cubo se predice alcanzar hasta un 80 % de
hidrólisis si se trabaja con contenido de agua del 25 %, a una temperatura de 50 ºC en 6 horas de
reacción.
Para la enzima Lipozymes RM IM el ADEVA determinó que el tiempo y la combinación de este

factor con el contenido de agua son las variables con mayor influencia significativa y que deban
tomarse en cuenta para trabajar en el proceso de hidrólisis. La gráfica de superficie de respuesta
determinó que un contenido de agua y un tiempo a niveles mayores o iguales a 1 (25% y 360
minutos respectivamente) son ideales para conseguir el 60 % de AGL; mientras que la grafica de
53
cubo predice alcanzar hasta un 73 % de hidrólisis con la combinación de porcentaje agua de 25 %,
tiempo de 360 min, a una temperatura de 35 º C.
El ADEVA de los resultados empleando la enzima Lipozymes 435 determinó que el tiempo y la
temperatura son las condiciones con mayor influencia significativa y que el contenido de agua no
influye significativamente, la gráfica de superficie de respuesta determinó que a niveles cercanos o
iguales a 1 de temperatura y tiempo ( 70 º C y 360 minutos) son ideales para conseguir un 30 % de
AGL. La gráfica de cubo predice lograr un 39% de hidrólisis en una combinación con un bajo
porcentaje de agua del 5 % , tiempo de 360 min a temperatura de 70 º C.
En el caso de la enzima Lipozymes TL IM el ADEVA determinó que el modelo desarrollado es no

significativo por ende la mayoría de sus factores y combinaciones también son no significativos,
sin embargo, bajo este modelo se determinó que solamente el tiempo es el factor de mayor
influencia significativa; mientras que las graficas de superficie de respuestas indicaron que la
interacción entre los factores en los niveles establecidos son no concluyentes.
5.2 RECOMENDACIONES
Para evitar que las enzimas disminuyan su actividad lipídica, se recomienda almacenarlas en un
lugar adecuado bajo condiciones de refrigeración y selladas apropiadamente para impedir el
contacto con la luz y la humedad.
Después del proceso de hidrólisis se debe separar adecuadamente el agua y el aceite para evitar
interferencias en la medición debido a la presencia de agua en el aceite hidrolizado; adicional se
puede evaluar la presencia de humedad según la metodología descrita en la sección 3.4.2 para
confirmar la cantidad de agua remanente, por lo que los valores deberán ser inferiores al 0,05 % de
humedad para el aceite hidrolizado.
A pesar que las enzimas Lipozymes 435 y Lipozymes TL IM no se obtienen elevados rendimientos
de hidrólisis, se puede evaluar en posteriores estudios, si se desea bajo las mismas condiciones, su
empleo en la optimización en procesos de interesterificación enzimática.
En el caso de la enzima Lipozymes TL IM, el modelo que se empleo no mostró diferencias

significativas con respecto a la cantidad de agua y temperatura, se sugiere para esta enzima buscar
un modelo que se ajuste de mejor manera abarcando menos variables y aumentando o
disminuyendo los niveles con respecto al tiempo.
54
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57
ANEXOS
Anexo 1 Hoja técnica Addzymes Tl 165G
58
59
Anexo 2 Hoja técnica Lipozyme TL IM
Certificate of Analysis
Shipment date
Dec 09, 2013
Purchase order item/date
14447 / Nov 13, 2013
Delivery
7300984
Sales order
5394324
Customer number
24485
Sold to
La Fabril S.A.
LA FABRIL
Km 5 1/2 Via Manta-Montecristi s/n
0 MANTA-0
ECUADOR
Material: Lipozyme TL IM
Batch: LA331267 Quantity: 1.500 KG

Production date: Oct 16, 2013 Best before: Oct 16, 2015
_______________________________________________________________
Characteristic Unit Value
_______________________________________________________________
Interestification unit IUN /G 521,00
Bulk density G/ML 0,403
Loss on drying 105 C % 5,90
Laser diffraction > 1180 micron % 0,48
Laser diffraction < 250 micron % 3,20
Total viable count /G 1000
Coliform bacteria /G < 10
E.coli Not Detected, 25 g
Salmonella Not Detected, 25 g
_______________________________________________________________
Batch: LA331268 Quantity: 1.500 KG

Production date: Oct 17, 2013 Best before: Oct 17, 2015
_______________________________________________________________
Characteristic Unit Value
_______________________________________________________________
Interestification unit IUN /G 518,00
Bulk density G/ML 0,415
Loss on drying 105 C % 6,20
Laser diffraction > 1180 micron % 0,61
Laser diffraction < 250 micron % 4,09
Total viable count /G < 100
Coliform bacteria /G < 10
E.coli Not Detected, 25 g
Salmonella Not Detected, 25 g
_______________________________________________________________
Novozymes North America, Inc. - 77 Perry Chapel Church Road - Franklinton, NC 27525-576 - US
Tel. + 1 919 494 3000 Fax + 1 919 494 3450
1 / 2
60
Anexo 3 Hoja técnica Lipozymes 435
Product Data Sheet
1 of 1
Valid from 2012-06-04
Lipozyme® 435
In this product the key enzyme activity is provided by
lipase that hydrolyzes esterbonds in glycerides
PRODUCT CHARACTERISTICS/PROPERTIES STORAGE CONDITION

Declared enzyme Lipase Packaging must be kept intact, dry, and away from sunlight. Please follow the
Declared activity 8000 PLU/g recommendations and use the product before the best before date to avoid
the need for a higher dosage.
Color Off-white
Best before: You will find the best before date in the certificate of analysis or
Physical form Immobilized Granulate
on the product label.
Approximate density (g/ml) 0.40
The product gives optimal performance if stored at 0–10 °C/32–50 °F and used
Color can vary from batch to batch. Color intensity is not an indication
prior to the best-before date. If stored at max. 25 °C/77 °F, the product should
of enzyme activity.
be used within 3 months after delivery.
PRODUCT SPECIFICATION
SAFETY AND HANDLING PRECAUTIONS
Lower Limit Upper Limit Unit Enzymes are proteins. Inhalation of dust or aerosols may induce sensitization
Propyl laurate unit PLU 8000 /g and may cause allergic reactions in sensitized individuals. Some enzymes may
Loss on drying 105 C - 3 % irritate the skin, eyes, and mucous membranes upon prolonged contact. See
Total viable count - 10000 /g the MSDS or Safety Manual for further information regarding safe handling
Coliform bacteria - 30 /g of the product and spills.
E.coli Not Detected /25 g
Salmonella Not Detected /25 g COMPLIANCE
Heavy metals Max 30 mg/kg The product complies with the recommended purity specifications for
Lead Max 5 mg/kg food-grade enzymes given by the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food
Arsenic Max 3 mg/kg Additives (JECFA) and the Food Chemical Codex (FCC).
Cadmium Max 0.5 mg/kg Kosher and Halal certificates are available from the Customer Center or sales
Mercury Max 0.5 mg/kg representative.
The enzyme analytical method is available from the Customer Center or sales CERTIFICATIONS
representative. Novozymes is a signatory to United Nations Global Compact, United Nations
Convention on Biological Diversity and report on our sustainability
COMPOSITION
performance through Global Reporting Initiative (GRI). See all our
Ingredients Appr. % (w/w) commitments under sustainability on www.novozymes.com.
Acrylic resin, CAS no. - 78.80

Lipase, CAS no. 9001-62-1* 21
Potassium sorbate, CAS no. 24634-61-5 0.20
*Defined as enzyme conc. (dry matter basis)
PRODUCTION ORGANISM
Produced by submerged fermentation of a genetically modified micro organism.
The enzyme protein, which in itself is not genetically modified, is separated and PACKAGING
purified from the production organism. The product is available in different types of packaging. Please contact the
sales representative for more information.
Novozymes A/S For more information, or for more office addresses, visit www.novozymes.com
Krogshoejvej 36
2880 Bagsvaerd
Denmark Laws, regulations and/or third party rights may prevent customers from importing, using, processing and/or
Tel. +45 4446 0000 reselling the products described herein in a given manner. Without separate, written agreement between the
Fax +45 4446 9999 customer and Novozymes to such effect, this document does not constitute a representation or warranty of any
kind and is subject to change without further notice. © Novozymes A/S
61
Anexo 4 Método determinación de humedad
62
IS0 660 96 = YB51903 0660273 131
INTERNATIONAL STANDARD 0 IS0 IS0 660:1996(E)
Anexo 5 Método para la determinación del índice de acidez
Animal and vegetable fats and oils - Determination of acid

value and acidity
1 Scope 3.1 acid value: Number of milligrams of potassium

hydroxide required to neutralize the free fatty acids
This International Standard specifies three methods present in 1 g of fat, when determined in accordance
(two titrimetric and one potentiometric) for the de- with the procedure specified in this International
termination of acidity in animal and vegetable fats and Standard.
oils, hereinafter referred to as fats. The acidity is ex-
Acid value is expressed in milligrams per gram.
pressed preferably as acid value, or alternatively as
acidity calculated conventionally.
The method described in clause 4 is the reference 3.2 acidity: Content of free fatty acids determined
method. The method described in clause 5 applies to according to the procedure specified in this Inter-
oils and fats which are not strongly coloured. national Standard.
The methods are not applicable to waxes. Acidity is expressed as a percentage by mass.
NOTES
2 Normative references 1 If the result of the determination is reported as acidity,
without further explanation, this is by convention the acidity
The following standards contain provisions which, expressed based on oleic acid.
through reference in this text, constitute provisions of 2 If the sample contains mineral acids, these are, by con-
this International Standard. At the time of publication, vention, determined as fatty acids.
--`,,`,-`-`,,`,,`,`,,`---
the editions indicated were valid. All standards are
subject to revision, and parties to agreements based
on this International Standard are encouraged to inves-
tigate the possibility of applying the most recent edi- 4 Hot ethanol method using indicator
tions of the standards indicated below. Members of
IEC and I S 0 maintain registers of currently valid Inter-
national Standards. 4.1 General
IS0 661 :1989, Animal and vegetable fats and oils - This method is the reference method for fats (see
Preparation of test sample. clause 1).
IS0 3696: 1987, Water for analytical laboratory use - NOTE 3 Under the conditions specified in this method,
Specification and test methods. shortchain fatty acids, if present, are volatile.
4.2 Principle
3 Definitions
A test portion is dissolved in hot ethanol and titrated
For the purposes of this International Standard, the with an aqueous solution of sodium or potassium hy-
following definitions apply. droxide.
1
Copyright International Organization for Standardization
Provided by IHS under license with ISO
No reproduction or networking permitted without license from IHS Not for Resale
63
I S 0 bbO 96 485l1903 Obb0274 078
IS0 ôôû:1996(E) 8 IS0
4.3 Reagents 4.7 Procedure

Use only reagents of recognized analytical grade, un- 4 . lest
~ ~portion
~
less otherwise specified, and water in accordance
with grade 3 of I S 0 3696.
Weigh into a flask a sufficient mass of the test sample
(4.6)as shown in table 1, according to the colour and
4.3.1 Ethanol, of minimum purity 95 % (Vlv). expected acid value.
4.3.2 Sodium or potassium hydroxide, standard NOTE 5 The mass of the test portion and the concentra-
volumetric solution, cíNaOH) or c(K0H) = 0,l mol/l. tion of the titrant should be such that the titrate does not
exceed 1O ml.
4.3.3 Sodium or potassium hydroxide, standard
volumetric solution, c(Na0H) or c(KOH)= 0,5 mol/l.
4.3.4 Phenolphthalein, 1O g/l solution in ethanol

[95% (V/v)l. Expected acid Mass of test por- Accuracy of
value tion weighing of the
test portion
NOTE 4 In determinations of strongly coloured solutions, 9 9
observation of the endpoint of the titration may be facili-
tated by adding 1 ml of a 0,l% ( d m ) solution of methylene <I 20 0.05
blue to each 100 ml of phenolphthalein indicator solution. 1to4 10 0.02
I 4t015 I 2.5 I 0,Ol I
4.3.5 Alkali blue 6B, or (in the case of dark-coloured 15 to 75 O.5 0,001
fats) thymolphthalein, 20 g/l solution in ethanol, > 75 o.1 0,000 2
[95 % (VlMl.
4.4 Apparatus 4.7.2 Determination

Usual laboratory apparatus and, in particular, the fol- Heat to boiling 50 mi of the ethanol (4.3.1) containing
lowing. 0,5 ml of the phenolphthalein indicator (4.3.4) in a
second flask. Whilst the temperature of the ethanol is
still over 70 OC, neutralize it carefully with a solution of
4.4.1 Microburette. of 10 ml capacity, graduated in
0,1 or potassium hydroxide (4.3.2).
0.02 ml subdivisions.
The endpoint of the titration is reached when the ad-
dition of a single drop of alkali produces a slight but
4.4.2 Analytical balance, capable of weighing to the definite colour change persisting for at least 15 s.
required accuracy (see table 1).
NOTE 6 Larger volumes of ethanol and indicator may be
necessary for dark-coloured fats.
4.5 Sampling
It is important that the laboratory receive a Add the neutralized ethanol to the test portion in the
which is truly representativeand has not been darn- first flask and mix thoroughly. Bring the COntentS to
aged or changed during transport or storage. the boil and titrate with the sodium or potassium hy-
droxide solution (4.3.2 or 4.3.3, depending on the ex-
pected acidity of the sample), agitating the flask
Sampling is not part of the method specified in this contents vigorously during the titration.
International Standard. A recommended sampling
method is given in I S 0 5555.
5 Cold solvent method using indicator

4.6 Preparation of test sample
5.1 General
Prepare the test sample in accordance with I S 0 661,
except that if the sample contains volatile fatty acids, This method is most suited to fats which are not
the test sample shall not be heated and filtered. strongly coloured.
--`,,`,-`-`,,`,,`,`,,`---
2
Copyright International Organization for Standardization
Provided by IHS under license with ISO
No reproduction or networking permitted without license from IHS Not for Resale
64
Anexo 6 Método para la determinación del punto de fusión
ARA
65
66
67
68
Anexo 7 Método para la determinación del índice de peróxido
CDU: 665.3  AL 02.07-312

 Norma Técnica GRASAS Y ACEITES INEN 277
Ecuatoriana DETERMINACIÓN DEL ÍNDICE DE PEROXIDO
1978-02
1. OBJ ETO
Instituto Ecuatoriano de Normalización, INEN – Casilla 17-01-3999 – Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro – Quito-Ecuador – Prohibida la reproducción
1.1 Esta norma tiene por objeto establecer el método para determinar el índice de peróxido en las
grasas y aceites vegetales o animales.
2. TERMINOLOGIA
2.1 Índice de peróxido. Es el número de miliequivalentes de oxígeno por kilogramo de muestra,

determinado de acuerdo con esta norma.
3. RESUMEN
3.1 Consiste en valorar con solución de tiosulfato de sodio el yodo liberado por una cantidad
determinada de muestra.
4. INSTRUMENTAL
3
4.1 Pipeta de Mohr, de 1 cm de capacidad.
3
4.2 Matraz Erlenmeyer, de 250 cm con tapa esmerilada.
4.3 Balanza analítica, sensible al 0,1 mg.
5. REACTIVOS
5.1 Solución de acido acético y cloroformo. Mezclar tres volúmenes de ácido acético glacial con
dos volúmenes de cloroformo.
5.2 Solución saturada de yoduro de potasio, recientemente preparada. (Ver Anexo A).
5.3 Solución 0,1 N de tiosulfato de sodio, debidamente estandarizada.
5.4 Solución de almidón. Disolver 1 g de almidón soluble en agua destilada fría (formando una
3
pasta), añadir 100 cm de agua hirviente, agitar rápidamente la solución y enfriar.
6. PREPARACION DE LA MUESTRA
6.1 Si la muestra es líquida y presenta un aspecto claro y sin sedimento, se la homogeniza

invirtiendo varias veces el recipiente que la contiene.
(Continúa)
-1- 1976-00115
69
NTE INEN 277 1978-02


6.2 Si la muestra es líquida y presenta un aspecto turbio o con sedimento, se coloca el recipiente que
la contiene en una estufa a 50°C; se lo mantiene al lí hasta que la muestra alcance tal temperatura y se
procede de acuerdo con lo indicado en el numeral 6.1. Si, luego de calentar y agitar, la muestra no
presenta un aspecto claro y sin sedimento, se la filtra dentro de la estufa a 50°C. El filtrado no deb e
presentar ningún sedimento.
6.3 Si la muestra es sólida o semisólida, se procede de acuerdo con lo indicado en el numeral 6.2,
pero calentándola (y filtrándola si es necesario) a una temperatura que se encuentra comprendida
entre 40°C y 60°C (la suficiente para fundir la mue stra completamente).
7. PROCEDIMIENTO
7.1 La determinación debe efectuarse por duplicado sobre la misma muestra preparada (ver 7.9).
7.2 Pesar, con aproximación a 0,1 mg, aproximadamente 5 g de muestra.

3 3
7.3 Transferir la muestra al matraz Erlenmeyer de tapa esmerilada de 250 cm y agregar 30 cm de la
solución de ácido acético y cloroformo.
3
7.4 Agitar el matraz Erlenmeyer hasta completa disolución del contenido y luego añadir 0,5 cm de la
solución saturada de yoduro de potasio, usando de preferencia la pipeta de Mohr.
3
7.5 Agitar el matraz Erlenmeyer con su contenido durante un minuto y añadir 30 cm de agua
destilada.
7.6 Usando la solución 0,1 N de tiosulfato de sodio titular gradualmente y con agitación constante el
contenido en el matraz Erlenmeyer, hasta que el color amarillo haya casi desaparecido.
3
7.7 Añadir 0,5 cm de la solución indicadora de almidón y continuar la titulación cerca del punto final,
agitando constantemente para liberar todo el yodo de las capas de cloroformo. Añadir la solución de
tiosulfato de sodio gota a gota, hasta que el color azul desaparezca completamente.
3
7.8 Si en la titulación se ha obtenido un valor menor de 0,5 cm , repetir el ensayo usando solución
0,01 N de tiosulfato de-sodio.
7.9 Realizar un solo ensayo en blanco con todos los reactivos sin la muestra y siguiendo el mismo
procedimiento a partir de 7.3 para cada determinación o serie de determinaciones.
8. CALCULOS
8.1 El Índice de peróxido se calcula mediante la ecuación siguiente:
vN
l= 1 000
m
Siendo:
/ = Índice del peróxido en meq. de O2 por kilogramo del producto.

3
v = Volumen de la solución de tiosulfato de sodio empleado en la titulación de la muestra, en cm .
corregido del blanco).
N = Normalidad de la solución de tiosulfato de sodio.
m = Masa de la muestra analizada, en g.
(Continua)
-2- 1976-00115
70
Anexo 8 Método para la determinación del índice de saponificación
71
72
Anexo 9 Instructivo para cromatografía de gases
73
74
Anexo 10 Método de análisis de metil ésteres de ácidos grasos por cromatografía de gases
75
76
77
Anexo 11 Certificado de análisis de aceite de coco virgen
78

T Uce 0008 098

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Trabajo de investigación para optar por el grado de QUÍMICO DE ALIMENTOS

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Quito, Abril 2015

A Dios por guiarme hacia la meta anhelada y acompañarme en cada momento.

A la Universidad Central del Ecuador y a la Facultad de Ciencias Químicas por el cobijo y la

A los colaboradores de LA FABRIL por recibirme y darme la posibilidad de crecer

La investigación se realizó en los laboratorios de Biotecnología y de Análisis Instrumental

CAPÍTULO III .................................................................................................................................. 26

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ......................................................................... 33

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................................................... 53

Anexo 1 Hoja técnica Addzymes Tl 165G ........................................................................................ 58

El aceite de coco virgen (VCO) tiene características funcionales importantes, debido

HIDRÓLISIS, ACEITE DE COCO VIRGEN, LIPASA INMOVILIZADA, OPTIMIZACIÓN DE

HYDROLYSIS, VIRGIN COCONUT OIL, IMMOBILIZED LIPASE, PARAMETERS

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Con el empleo de biocatalizadores, se está desarrollando líneas de productos alimenticios más

De lo antes mencionado aparece la siguiente incógnita en el presente trabajo de investigación:

1.3.1 Objetivo general

1.3.2 Objetivos específicos

1.4 IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN

Para la producción de lípidos estructurados aplicando el método de superficie de respuesta, según

2.2 FUNDAMENTO TEÓRICO

2.2.1 Aceites y grasas

2.2.1.1 Ácidos grasos

Ácido esteárico, 18:

Ácido elaídico, 18: 1

Ácido oleico 18: 1 9c

2.2.1.1.1 Clasificación de ácidos grasos

Se pueden dividir en grupos de acuerdo a su longitud de la cadena, número, posición, configuración

Tabla 2.1 Nomenclatura y clasificación de ácidos grasos

Fuente: Belitz, Grosch, & Schieberle, 2009

• Saturados: sin dobles enlaces. Son más estables a la oxidación y rancidez.

Basada en la longitud de su cadena o número de átomos de carbono presentes en la cadena

• Ácidos grasos de cadena corta: 2 a 4 carbonos, contribuyen al aroma y al sabor de la

sn-1-mono acilglicerol sn-2-mono acilglicerol

sn-1,2-di acilglicerol sn-1,3-di acilglicerol

Figura 2.2 Clasificación de triacilgliceroles

Glicerol Ácido esteárico Triacilglicerol

Figura 2.3 Esquema y formación de un triglicérido

2.2.2 Ácidos grasos de cadena media

Tabla 2.1 Características fisicoquímicas de los MCT.

A diferencia de los triglicéridos de cadena larga (LCT), la digestión de los triglicéridos de

Pueden ingresar en las células de la mucosa intestinal en forma de diglicéridos y

Sus características físico químicas se indican en la tabla 2.2

2.2.3 Aplicaciones y usos de MCT

• Tipos de alimentos: productos horneados, bebidas, goma de mascar, dulces y

2.2.4 Aceite de coco virgen

Endospermo (núcleo, carne)

Figura 2.5 Corte de nuez de coco

2.2.4.1 Características del aceite de coco virgen

El VCO es transparente y es la primera característica que distingue al aceite de coco virgen de

Tabla 2.2 Características fisicoquímicas del aceite de coco virgen.

Tabla 2.3 Composición de ácidos grasos de aceite de coco virgen

De acuerdo con la definición de la Comisión de Enzimas de la IUPAC las lipasas pertenecen al

Su inmovilización se refiere a un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región

Entre las principales ventajas se pueden mencionar:

1. Aumento de la estabilidad de la enzima

Unido Atrapada Entrecruzamiento

Covalentemente Adsorción Matriz atrapada Micro encapsulación