Formación para la Investigación

Escuela de Química, Facultad de Ciencias

Universidad Industrial de Santander
Construimos Futuro

1) ¿Puede separar los pasos claves que conducen a la formación de iones aislados en fase
gaseosa en ESI?

La ionización por ELECTROSPRAY es una técnica de ionización suave que realiza el traslado de iones de la solución
en fase condensada hacia la fase gaseosa. La técnica es extremadamente útil para el análisis de moléculas grandes,
no volátiles, cargables tales como proteínas y polímeros de ácidos nucleicos. La solución está compuesta por un
disolvente volátil y un análito iónico en una concentración muy baja, típicamente entre intervalos de 10 -3 y 10-6
[M]. La transferencia de iones aislados desde la fase condensada hacia la gaseosa inicia a presión atmosférica y
conduce continuamente hacia el alto vacío del analizador de masas. Esto da lugar a una ionización suave y hace
del electrospray ‘las alas de los elefantes moleculares. Otra razón para la extraordinaria capacidad de detectar
grandes masas de ESI se encuentra en la formación característica de iones cargados de múltiples capas en el caso
de los análitos de gran masa.

 Se introduce el análito (que será ionizado) disuelto en un solvente más volátil por un capilar de metal muy
pequeño y cargado.
 Adquisición de la forma cónica de la gota de solución que comienza a salir por la aguja debido al aumento
de su carga por el exceso de la misma en el cátodo.
 Debido a la repulsión de cargas en la superficie de la gota, ocurre el fenómeno de fisión Culombiana en el
cual, se reduce el tamaño de la gota a causa de su estallido.
 El proceso se repite hasta que el análito está libre de solvente, de modo que no quedan más que iones.
 Los iones se mueven hacia el analizador de masa.

2) Puedes describir la formación de Electrospray

Ionización a presión atmosférica: La Ionización por Electrospray (ESI) es uno de los métodos de
ionización más recientemente desarrollados en espectrometría de masas. El diseño y operación de
fuentes de ionización por electrospray usadas comúnmente en los espectrómetros de masas están
basados en diseños descritos por Fenn y colaboradores en 1985. Este método es llevado a cabo a
presión atmosférica a diferencia de otros métodos, por lo que se le conoce también como un método
de ionización a temperatura ambiente (atmospheric pressure ionization API).

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En el proceso general de electrospray, que ocurre en la punta del emisor (capilar o aguja), una
solución acuosa ácida o básica (dependiendo de la muestra) diluida del análito (10-4 - 10-5 [M]) es
rociada desde la punta del emisor en el cual se aplica una diferencia de potencial de 3-4 kV, la
solución debe proveer conductividad eléctrica que puede ser obtenida por el uso de análitos iónicos
o aditivos iónicos tales como buffers o por algún grado de disociación electrolítica del solvente. El
líquido comienza a salir de la aguja, incrementa su carga ya que en el cátodo existe un exceso de
cargas y asume una forma cónica, llamada cono de Taylor, en honor a G.I. Taylor quien describió
este fenómeno en 1964. El líquido asume esta forma cuando incrementa su carga ya que una forma
cilíndrica puede retener más carga que una esfera. En la punta del cono, el líquido cambia de forma
a una línea fina, que se vuelve inestable ya que es forzado a retener más y más carga, y finalmente
llega a un punto crítico donde no puede soportar más carga eléctrica y la solución entonces se
dispersa en forma de niebla de pequeñas gotas (de menos de 10 mm de diámetro) altamente
cargadas que vuelan buscando una superficie de carga opuesta (Fisión Culombica). Debido a que las
gotas están altamente cargadas con la misma carga eléctrica se repelen fuertemente, las gotas
vuelan y se dispersan cubriendo un área cada vez mayor y se van reduciendo de tamaño ya que las
moléculas de solvente se evaporan en su superficie, y la distancia entre las moléculas cargadas
disminuye dramáticamente. Si la gota no encuentra donde
disipar su carga, las cargas eléctricas llegan a un estado
crítico y la gota explota violentamente.

3) Las gotas inicialmente creadas son varios cientos

de veces más grandes en diámetro y llevan un
número tremendamente más alto de cargas que las gotitas finales. ¿Cómo procede el
encogimiento de las gotitas?

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En la formación del cono de Taylor y el momento crítico siguiente en el cual se da la ruptura en pequeñas gotas,
pero aun de un diámetro considerable de los iones cargados positivamente producto de la oxidación de los
aniones al interior de pared del capilar pasan atreves de un corriente gas (N2) caliente aprox. a 300°C el cual
evapora el solvente haciendo del radio de las gotas más pequeño, de este proceso las cargas quedan más juntas
y se repelen, en el momento en que la repulsión electrostática supera la fuerza de tensión superficial y se dirigen
hacia el ánodo que los reducirá

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4) Explique brevemente las dos teorías para describir el acto final de liberación de iones
de fase gaseosa aislada.

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CRM (Charged Residue Model) IDM (Ion Desorption Model)

Según el modelo CRM al evaporarse el disolvente de una
gotita cargada se aumenta el campo superficial hasta
alcanzar el límite de Rayleigh, en donde la repulsión de
Coulomb es de igual orden que la tensión superficial.
Esta inestabilidad hace que las gotitas se separen en
gotitas más pequeñas mediante un proceso que a veces
de le llama (explosión Coulomb). Luego estas gotitas
continuarán evaporándose hasta nuevamente alcanzar
el límite de Rayleigh y se desintegran. Este proceso de
evaporación-desintegración se repite hasta que
finalmente se producen gotitas tan pequeñas que cada
una contiene solo una molécula de soluto único.
Finalmente, esta molécula retiene parte de la carga de la
gotita en donde estaba y se convierte en un ion libre,
mientras la última parte del solvente se vaporiza. Esto
permite que incluso moléculas de proteínas grandes
puedan formar iones cargados individualmente.
Este modelo describe la formación de iones
desolvatados como la evaporación directa de la
superficie de microgotas muy cargadas. Fue
propuesto por Iribarne y Thomson, en donde utilizaron el
término “evaporación” como el proceso de salida de un
ion de la gotita, sin embargo, el término que se usa para
dicho proceso es el de “desorción”. En este caso las gotitas
se contraen por evaporación hasta que la intensidad de
campo en su superficie sea lo suficientemente grande
como para que los iones solvatados puedan ser
expulsados de la gotita.

Figura 2. Proceso IDM

Figiura 1. Proceso CRM

5) El modelo CRM racionaliza la aparición de iones de carga múltiple en ESI. Calcule los
valores m/z teóricos de iones cargados de una sola carga a cuatro de la hemoglobina
para bovinos, 𝐂𝟐𝟓𝟒 𝐇𝟑𝟕𝟕 𝐍𝟔𝟓 𝐎𝟕𝟓 𝐒𝟔 , siempre que los picos isotópicos no se resuelvan.

Buscamos la masa nominal de la Hemoglobina C2952 H4664 N812 O832 S8 𝐹𝑒4

M= (12*2952) +(1*4664) +(14*812) +(16*832) +(32*8)+ (56*4)

M=65248

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Luego mediante las expresiones de m/z = [ M + nH ]. Calculamos los valores m/z teóricos, en este caso
se tomará hasta el cuarto valor.

[ M + H ] = m/z = 65248/1 = 65248

[ M + 2H ] = m/z = 65248/2 = 32624

[ M + 3H ] = m/z = 65248/3 = 21749

[ M + 4H ] = m/z = 65248/4 = 16312

6) ¿qué es deconvolución de cargas en EIS?

Es el cálculo de las cargas de cada pico (n+ o n-) para de esta manera obtener el peso
molecular que se desconoce, teniendo en cuenta que los valores más altos de cargas tienen
menos espacios entre los picos. La carga deconvolución es un arreglo matemático que
permite el asunto de señales debido a que estas son afectadas por el gas de arrastre, el pH y
la temperatura

7) qué clase de usted espera predominar con los siguientes sistemas del analito / del
solvente en EIS. Complete la tabla

Analito y solvente Iones predominantes

Polietilenglicol en agua No presenta formación solvente apolar

Proteínas en agua /acetonitrilo 1:1 +0.1% TFA
Oligosacárido en agua/metanol 5:1
complejo de metal de transición aniónico en
cloroformo
Hidrocarburos policíclicos aromáticos en hexano
Péptidos en agua / acetonitrilo 1:3 +0,5%ácido
acético
[𝑀 + 𝐻]+ [𝑀 + á𝑙𝑐𝑎𝑙𝑖]+ solo formación de
iones positivos debido al TFA se deprotona y
al grupo amino
[𝑀 + á𝑙𝑐𝑎𝑙𝑖]+ iones positivos ya que se
deprotona formando aductos
[𝐴]− y asociados, el solvente posee baja
polaridad
No presenta formación solvente apolar
[𝑀 + 𝐻]+ [𝑀 + á𝑙𝑐𝑎𝑙𝑖]+ iones positivos debido
a presencia del grupo amino y protones del
solvente

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8) Un oligonucleótido sintético 8mero ha sido analizado por iones negativos ESI

espectrometría de masas en un espectrómetro de masas de cuadrupolo lineal. Los picos
isotópicos no se resuelven. Determinar el peso molecular del analito. Siga su intuición

Tomamos el valor de m/z= 743.9

𝑀
= 743.9
𝑍
𝑀
𝑍=
743.9
𝑀
= 992,1
𝑍−1
𝑀 = 992.1(𝑍 − 1)
𝑀
𝑀 = 992.1 ( − 1)
743.9

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992.1𝑀
𝑀= − 992.1
743.9
992.1
=𝑀
0.3341
𝑀 = 2969 𝐷𝑎

9) Use los siguientes pares de picos m/z 992.1 y m/z 743.9 para calcular el algoritmo de
carga de deconvolución. Calcular el peso molecular de nuevo.

Para calcular el nuevo peso molecular se usa el algoritmo y se usaran los picos m/z1=992.1 y m/z2=743.9 , mH
masa del protón y Mr la masa molecular nueva

Tomando mH =1
𝑚
− 𝑚𝐻
𝑧2
𝑛1 = 𝑚 𝑚
𝑧1 − 𝑧2
743.9 − 1
𝑛1 =
992.1 − 743.9
𝑛1 = 2.993 ≈ 3

𝑛2 = 𝑛1 + 1

𝑛2 = 4
𝑚
𝑀𝑟 = 𝑛1 ( − 𝑚𝐻 )
𝑧2

𝑀𝑟 = 2228.7 𝐷𝑎

10) Describa el proceso de ionización en MALDI.

La ionización en MALDI se estudia la muestra introduciéndola en una matriz orgánica sólida ,el analito se mezcla
con la matriz en exceso sobre una superficie de metal, en la cual el punto de impacto de un haz de un láser UV
de esta manera en el momento del impacto laser, ambas se evaporan ( el solvente y analito). En el punto de
impacto, la energía que aporta el láser es transferida a la matriz y esta a su vez la transfiere a la muestra para que
sea ionizada y desorvida de forma suave. La mezcla del analito con la matriz se somete los pulsos (hv) de láser en
alto vacío esto provoca que la absorción de energía en la matriz se transforme en energía de excitación y en

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transferencia de H+ al analito (ionización) así obtenemos especies mono-cargadas. Cuando el área es impactada
esta se calienta y expande ocurriendo así la desorción de los iones de la fase sólida a la fase gaseosa.

11) Puede enumerar algunas de las propiedades físico-químicas que hacen que una buena
matriz de MALDI?

• ser capaz de incrustar y aislar analitos (por ejemplo, por co-cristalización)

• ser soluble en solventes compatible con analito
• ser estable al vacío
• absorber la longitud de onda del láser
• causar co-desorción del analito sobre laser irradiación
• promover la ionización del analito

12) Dibujar las estructuras de algunas matrices comunes de MALDI.

3-Hydroxypicolinic acid 2,5-dihydroxybenzoic acid Dithranol

5-chloro-2-
α-cyano-4-hydroxycinnamic Sinapinic acid mercaptobenzothiazole
acid

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13) Trate de sugerir una matriz adecuada. Clasificar el desorden en la tabla.

ANALITO MATRIZ
Poliacrilato Ditranol
Proteina Ácido sinapínico
Oligosacárido Ácido 2,5-dihidroxibenzoico
Hidrocarburo aromático policíclico LDI suficiente
Oligonucleótido Ácido 3 – hidroxipicolínico
Péptido Alpha - ciano - 4 - hidroxi – Ácido cinámico

14) ¿Qué tipo de iones por lo general constituyen la mayor parte de un espectro de matriz
en iones positivos MALDI?

Los espectros matriciales MALDI se caracterizan por fuertes señales de iones cuasimoleculares y
sus conglomerados, En el ión positivo MALDI, predominan los iones [Man + H]+. Mientras que los
cluster se forman preferiblemente en MALDI de iones negativos.

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