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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE


DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E FARMACOLOGIA
DISCIPLINA: BIOQUÍMICA

ROTEIRO DAS AULAS PRÁTICAS DE BIOQUÍMICA

Prof(a): Dra. Celyane A. Piauilino

Teresina-PI
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INTRODUÇÃO AO LABORATÓRIO

NOÇÕES ELEMENTARES
1) Mantenha seu local de trabalho sempre limpo e em ordem;
2) Jogue os sólidos nas latas de lixo e nunca nas pias. Lave os resíduos líquidos nas pias
com bastante água. Ácidos, bases e sais de prata e mercúrio são corrosivos e podem
danificar encanamentos;
3) Leia com atenção os rótulos dos frascos de reagentes antes de usar o produto;
4) Nunca fumar no laboratório;
5) Usar sempre bata ou jaleco.

MANIPULAÇÃO DOS REAGENTES


1) Manipular todos os reagentes que produzem vapores tóxicos, corrosivos, etc, na capela;
2) Pesar reagentes secos usando vidro de relógio ou papel limpo. Regantes líquidos são
covenientemente medidos, utilizando cilindros graduados;
3) Evitar contato direto com reagentes orgânicos. Muitos são tóxicos e são absorvidos pela
pele;
4) Não provar reagentes, muitos são venenosos;
5) Não deixar frascos de reagentes destampados. Podem cair impurezas e contaminá-los.

PROTEÇÃO AOS OLHOS


1) Usar óculos de segurança quando manipular reagentes perigosos. Não é recomendado o
uso de lentes de contato no laboratório;
2) Nunca olhar diretamente através da abertura de um frasco, ou de um tubo teste caso ele
contenha uma mistura de reação;
3) Evitar medir volumes de soluções fortemente ácidas aou alcalinas com cilindro graduado
mantido ao nível dos olhos. Mantenha o cilindro sobre sua bancada, adicione o líquido
perigoso em pequenas porções, inspecionando a mistura a cada adição.

RECOMENDAÇÕES GERAIS
1) Não pipetar produto nenhum com a boca;
2) Não usar produto algum que não esteja devidamente rotulado;
3) Não levar as mão à boca ou aos olhos quando estiver manuseando produtos químicos;
4) Verificar sempre a toxidez e a inflamabilidade dos produtos utilizados;
5) Discutir sempre com o professor a experiência que será feita;
6) Em espécie alguma efetuar um trabalho sem o consentimento do professor.
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1-REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DOS CARBOIDRATOS

Os carboidratos podem ser definidos como: polihidroxialdeídos ou polihidroxicetonas


(monossacarídeos), seus polímeros (oligossacarídeos polissacarídeos), seus produtos de redução,
oxidação e seus produtos de substituição. A função mais importante dos carboidratos no organismo é
servir como combustível, fornecendo a fonte principal de energia, graças a sua oxidação a CO 2 e
H2O, através de uma via complexa, de importância fundamental no metabolismo de todos os compo-
nentes da célula animal.
Para um completo entendimento de muitas reações que se processam com os car-
boidratos nos seres vivos, é indispensável o conhecimento de suas estruturas, suas reações e de que
maneira eles são isolados e identificados no laboratório. Apresentaremos a seguir uma série de rea-
ções clássicas, geralmente reações coloridas que apesar do advento da técnica de cromatografia
ainda são muito utilizadas para identificação dos diversos tipos de carboidratos.

1. TESTE DE MOLISH - Reação geral para carboidratos


Os ácidos concentrados causam a desidratação de um monossacarídeo. Se um oligossacarí-
deo ou polissacarídeo estiver presente, eles são primeiro hidrolisados aos seus monossacarídeos
constituintes os quais então são desidratados. As pentoses dão o furfural e as hexoses o hidroximetil
furfural. Vários compostos fenólicos tais como: timol, alfa-naftol condensam com furfural ou seus
derivados para dar compostos coloridos de estruturas ainda pouco conhecidas.

H2SO4 Alfa-naftol
Hexose 5 hidroximetilfurfural produto de condensação colorido.
-3 H20

Alfa-naftol
Pentose H2SO4 furfural produto de condensação colorido.
- 3H2O

O teste de Molish é considerado uma reação geral para carboidratos quer livre, quer combinados,
embora não sendo específica, pois se processa com outras substâncias. A reação sendo positiva não
indica necessariamente presença de um carboidrato, mas se a reação for negativa indica segura-
mente sua ausência.

TÉCNICA:
Pipeta num tubo marcado 2 mL de glicose 1%, junte 5 gotas de solução de reagente de Mo-
lish, em seguida incline o tubo e com cuidado deixe escoar bem lentamente pelas paredes, sem agitar
2 mL de ácido sulfúrico concentrado. Recoloque o tubo na estante. O que observou?

2. TESTE DE BENEDICT - Reação para carboidratos redutores


Os monossacarídeos possuem na sua estrutura um grupamento aldeído livre ou em potencial
o qual poderá reduzir certos íons metálicos. Reagentes alcalinos de sais de cobre são muito usados
para pesquisas de açucares redutores. O reativo de Benedict contém sulfato cúprico, carbonato de
sódio e citrato de sódio. Tem-se assim hidróxido e cuprocitrato. Sob a ação de um agente redutor, o
hidróxido cúprico é reduzido a hidróxido cuproso que por aquecimento passa a óxido cuproso.

2Cu(OH)2 2 Cu(OH) + H2O


- H 20

Cu2O (óxido cuproso)

TÉCNICA:
Tubo 1- 0.5 mL de glicose 1% + 3ml de benedict
Tubo 2- 0.5 mL de sacarose 1% + 3 ml de benedict
Tubo 3- 0.5 mL de água destilada + 3 ml de benedict
Banho-maria 100 graus 3 minutos. Anotar o resultado.
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3. TESTE DE SELIWANOFF - distinção entre aldoses e cetoses.


O mecanismo desta reação é semelhante a reação de Molish. As cetohexoses sob a ação de
ácidos concentrados formam mais derivados do 5-hidroximetilfurfural do que as aldohexoses. Certos
reagentes como resorcinol se condensam com altas concentrações dos derivados formados a partir
de cetohexoses, mas não com quantidade menor formado a partir de aldohexoses.

TÉCNICA:
Tubo 1. 1 mL de água destilada + 5 mL de reativo de Seliwanoff (resorcinol+ HCl)
Tubo 2. 1 mL de glicose 1% + 5 mL de reativo de Seliwanoff
Tubo 3. 1 mL de frutose 1% + 5 mL de reativo de Seliwanoff
Leve os tubos ao banho-maria fervente por três minutos. Observe os resultados. Em qual
tubo a reação é mais rápida e mais intensa?

4. TESTE DO LUGOL (IODO) PARA POLISSACARÍDEOS


O lugol reage com a amilose (fração não ramificada do amido) para dar um complexo de cor
azul escuro característico. O glicogênio e as dextrinas se coram de um marrom avermelhado devido a
sua estrutura muito ramificada (semelhante a amilopectina).

TÉCNICA:
Coloque num tubo 3 mL de amido 1% e junte uma gota de solução de lugol. O que observou?

5. HIDRÓLISE DA SACAROSE
A sacarose é formada pela união entre uma molécula de alfa D - glicose e uma de beta fruto-
se em ligação glicosídica 1,2 (o que explica sua propriedade de açúcar não redutor). Atuando um
ácido sobre a sacarose haverá liberação dos seus monossacarídeos constituintes e o hidrolisado
torna-se redutor.

TÉCNICA:
Tubo 1. 2mL de sacarose 1%
Tubo 2. 2 mL de sacarose 1% + 3 gotas de ácido sulfúrico concentrado
Coloque os tubos no banho-maria fervente por 3 minutos. Adicione então aos tubos 3 mL de
reativo de Benedict, agite. Recoloque-os no banho fervente e aguarde 3 a 5 minutos. Retire. Explique.
1)- Teste de Molish
Para carboidratos em geral

H
C O

HC OH
HO CH
HC OH
HC OH
CH2 OH
D-Glicose

H 2 SO 4

CH CH
O
H O CH2 C C C + 3H 2 O
O H

5-Hidroximetilfurfural

alfa-Naftol

Composto de cor violeta


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2)- Reação de Seliwanoff - Para cetoses

CH2 OH
C O
CH CH
HO CH O
HCl + 3H 2 O
H O CH2 C C C
HC OH O H
HC OH
5-Hidroximetilfurfural
CH2 OH
Resorcicnol
D-Frutose

Composto de cor rosa

3) Teste de Benedict- reação para açúcar redutor

H O H2 C
H O H -H2O
H + 2Cu(OH) 2 2CuOH + Ácido D-glicônico
OH H
HO OH -H2O
H OH
Cu 2 O Ptt vermelho-
tijolo

4)-Hidrólise da sacarose

H O H2 C
H O H2 C
H O H
H O H
H 1
H 1 OH H
OH H H 2 SO 4 HO
H2O OH
HO +
H OH
H OH O
H O H2 C a D-Glicopiranose
O
H HO 2
H CH2OH OH
H O H2 C O
OH H 2
H HO
H CH2OH
Sacarose ( a 1-2) OH H

b D-Frutofuranose

Na sacarose, o carbonos 1 da glicose e o carbono 2 da frutose


estão ligados entre si pela ligação glicosídica (a1-2). Portanto,
a sacarose não tem poder redutor, mas após hidrólise, a mistura
de D-glicose e D-frutose resultante tem ação redutora porque
possuem um carbono anomérico livre.
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2-REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DOS LIPÍDIOS

Os lipídios constituem uma classe de compostos de grande interesse bioquímico que


se caracterizam fisicamente, por que são pouco solúveis na água e solúveis nos chamados solventes
orgânicos (éter, benzeno, clorofórmio, acetona, etc.), e quimicamente porque na maioria são ésteres
de ácidos graxos. Função principal dos lipídios no organismo é a de reserva energética atuando tam-
bém como isolante térmico, mecânico e como veículo de vitaminas. Fazendo parte dos lipídios encon-
tramos os óleos e gorduras (triglicerídeos e as cêras, os fosfolipídios, os cerebrosídeos) as substân-
cias derivadas dos lipidios (esteróides, compostos isoprenóides). Quase todos estes compostos tem
ácidos graxos nas suas estruturas, dentre estes ácidos podemos citar: o ácido butírico, ácido caprói-
co, e todos os outros ácidos graxos saturados. Entre os insaturados temos os ácidos: palmitoleico,
oleico, linoleico, linolênico. Nossas experiências sobre lipídios incluem o estudo das propriedades
gerais dos óleos e gorduras.

PROPRIEDADES GERAIS DOS ÓLEOS E GORDURAS

1 - SAPONIFICAÇÃO - Hidrólise alcalina de Triglicerídios.

TÉCNICA:
Em um béquer de 50 ml, colocar aproximadamente 10 gramas de margarina, 10 mL de solu-
ção alcoólica de KOH 10%. Aquecer em banho-maria fervente durante 10 minutos. Os triglicerídios
são saponificados, obtendo-se uma solução de sais alcalinos de ácidos graxos, isto é: sabões. Con-
serve o tubo em banho-maria. Escreva a equação de saponificação de um triglicerídio.

2 - SEPARAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS


Retire o tubo de banho-maria. Adicione ao mesmo 1 mL de ácido clorídrico concentrado, gota
a gota, agitando o tubo. Coloque novamente no banho-maria e deixe-o lá até separação de uma ca-
mada oleosa na superfície do líquido. Deixe então o tubo esfriar num béquer com água gelada. O que
observou? Isole os produtos obtidos, decantando o líquido do tubo cuidadosamente. Guarde os pro-
dutos obtidos para experiências posteriores.

3 - SOLUBILIDADE NOS SOLVENTES


Retire com o bastão uma pequena quantidade dos ácidos graxos obtidos na experiência ante-
rior e distribua em 3 tubos de ensaio. Acrescente 2mL de éter ao 1° tubo, 2mL de água destilada ao
2° e 2mL de álcool ao 3°. Agite. O que observou? Explique.

4 - FORMAÇÃO DE SABÕES POR REDISSOLUÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS


Adicione ao tubo que contém os ácidos graxos obtidos na experiência 2, 10 ml de água desti-
lada e 6 ml de solução de KOH 0,5N. Aqueça no banho-maria por 5 minutos, agite e observe. Guarde
o tubo para a experiência seguinte.

5 - SEPARAÇÃO DOS SABÕES POR SALIFICAÇÃO


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Coloque em uma proveta 3 mL de solução de sabão da experiência 4. Junte água destilada


até a marca de 20 mL. Adicione cloreto de sódio, misturando até saturar (o cloreto de sódio não mais
se dissolve). Note que pelo aumento da tensão superficial os sabões abandonam a fase líquida, flocu-
lam e devido a sua menor densidade, flutuam.

6 - FORMAÇÃO DE SABÕES INSOLÚVEIS


Pipete em 2 tubos, 2 mL de solução de sabões obtidos na experiência 4. Adicione ao 1°, 10
gotas de solução de CaCl2 5%, ao 2° 10 gotas de acetato de chumbo a 5%. Observe e explique a
formação de precipitado. Escreva as equações.
Reações de Caracterização de Lipídios

1-Saponificação O
Reações de Caracterização de Lipídios C K
O H2 C OH R O
1-Saponificação
H C O C KOH O O
2 R2
HC OH + C K
O O + R O C K
KOH D H2 C OH O
HC O C R
H2 C O C KOH O
R2 R1 H2 C OH
O
O HC OH +
O + KOH C K
D O
HH
C2 C O O C C R3 KOH Glicerol R C K
R1 H2 C OH R O
O O
Triacilglicerol KOH
H2 C O C R3 C K
Glicerol Sais
R O de ácidos graxos
Triacilglicerol Sais de ácidosou sabões
graxos
2- Separação dos ácidos graxos por acidificação
ou sabões
2- Separação dos ácidos graxos por acidificação
O O
O C K
O C
R O R OH
C K
R OO C O
R OH
O C K + 3 HCl O + 3 KCl
O D C
RC K R OH 3 KCl
+ 3 HCl C + Cloreto de
R OO D R OH O potássio
Cloreto de
O O
C K potássio
RC OK R C
OH
R O R C
OH

Sais de ácidos graxos 3 Ácidos graxos livres


Sais de ácidos graxos 3 Ácidos graxos livres
ou sabões
ou sabões

3- 3- Solubilidade
Solubilidade dosdos ácidos
ácidos graxos
graxos em solventes
em solventes

a- a- Ácido
Ácido Graxo
Graxo + éter
+ éter ---- solúvel
---- solúvel
b- b- Ácido
Ácido graxo
graxo + etanol----
+ etanol---- pouco
pouco solúvel
solúvel
c- c-
Ácido graxo
Ácido + água----
graxo insolúvel
+ água---- insolúvel

4- Formação de sabões por redissolução dos ácidos graxos


4- Formação de sabões por redissolução dos ácidos graxos
O O
O O
C K
C R O C K
R COH O R O
RO OH
O O
C K
C + 3 KOH R O + 3 H2O
R OH D C K
C + 3 KOH O R O + 3 H2O
RO OH D
C KO
C O R O
R OH C K
C R
Sais de ácidos O
graxos
R OH
Ácidos graxos ou sabões
Sais de ácidos graxos
Ácidos graxos ou sabões
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5 - Separação dos sabões por salificação

Coloque numa proveta 3mL da solução de sabão obtida no ítem 4 mais H 2O destilada
até a marca de 20 mL. Adicione NaCl, misturando até saturar. Observe que pelo aumento da
tensão superficial, os sabões deixam a fase líquida e floculam. A menor densidade permite
que os sabões flutuem.

6 - Formação de sabões insolúveis


O O O
2 C K + CaCl2 C Ca C
R O R O O R 2 KCl
+
Sabões de potássio Cloreto de Cálcio
Sabões de cálcio Cloreto de
solúveis
insolúveis potássio

O O O
2 C K + CH3COO)2Pb C Pb C
R O R O O R + CH COO) K
3 2
Acetato de chumbo Acetato de
Sabões de potássio
Sabões de chumbo potássio
solúveis
insolúveis
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3-DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DOS AMINOÁCIDOS

As proteínas são substâncias orgânicas de alto peso molecular formadas por um grande nú-
mero de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. As células de todos o organismo vivas
contêm uma variedade de proteínas com funções diferentes. As membranas que circundam as célu-
las são proteínas, as reações metabólicas que se dão no interior das células são catalisadas por en-
zimas que são proteínas. A reprodução das células e a transmissão das características hereditárias
dependem das proteínas. Certos hormônios são proteínas, e os anticorpos que defendem o corpo
são proteínas. Quando as proteínas são hidrolisadas, elas são convertidas numa mistura de aminoá-
cidos. São conhecidos cerca de 20 aminoácidos obtidos a partir de proteínas. O propósito das experi-
ências descritas é o de distingui-las uma das outras. A molécula protéica é tão complexa que às ve-
zes é difícil interpretar o seu comportamento químico. Proteína de um modo geral refletirá as proprie-
dades químicas de seus aminoácidos. Muitas das reações coloridas das proteínas dependem da pre-
sença de um determinado aminoácido.

1 - REAÇÃO DO BIURETO
As proteínas e seus produtos de hidrólise que contenham mais de duas ligações peptídicas
dão este teste positivo. É chamada reação de Biureto, porque um composto chamado Biureto dá a
mesma reação. Reativo de Biureto - sulfato de cobre, tartarato de sódio e potássio, hidróxido de só-
dio.

TÉCNICA:
Tubo 1. 2 mL de solução de ovoalbumina + 3 mL de biureto
Tubo 2. 2 mL de água destilada + 3 mL de biureto
Tubo 3. 2 mL de solução de gelatina 1% + 3 mL de biureto
Agite e anote o resultado. Houve alguma diferença entre os tubos?

2 - REAÇÃO DE NINHIDRINA
A reação é devida aos grupos amina, dando positiva para as proteínas, os peptídios, os ami-
noácidos, aminas primárias e amônia. Esta reação é importante na revelação e dosagem de proteí-
nas. Quando uma solução de ninhidrina é aquecida com uma solução de aminoácido, peptídio ou
proteína, desenvolve-se uma coloração azul violeta.

TÉCNICA:
Pipete em um tubo 10 gotas da solução de ninhidrina a 0,1%, junte 1mL da solução de ovoal-
bumina e ferva durante 2 minutos. Observe, explique e equacione a reação.
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3 - PRECIPITAÇÃO COM SAIS DE METAIS PESADOS


Os metais pesados precipitam as proteínas devido à formação de sais insolúveis de metal
com as proteínas negativamente carregadas, forma em que se encontram em meio alcalino.

TÉCNICA
Tubo 1. 2 mL de solução de ovoalbumina + 7 gotas de HgCl2 5%
Tubo 2. 2 mL de solução de ovoalbumina + 5 gotas de acetato de chumbo 10%.
Explique.

4 - PRECIPITAÇÃO PELOS ÁCIDOS METAIS FORTES


Estes ácidos desnaturam as proteínas transformando-as em metaproteínas insolúveis.

TÉCNICA:
Pipete num tubo, 1 mL de solução de ovoalbumina + 3 mL de água destilada, incline o tubo e
acrescente lentamente pelas paredes 0,5 mL de ácido nítrico concentrado. Não agite. O que obser-
vou?

5 - REAÇÃO XANTOPROTEICA: Tirosina e Triptofano


Esta reação é devido à presença na molécula proteica do grupo fênix – C6H5 com o qual o
ácido nítrico forma nitroderivados que são fortemente coloridos em meio alcalino. Os componentes da
proteína responsáveis por esta reação são: tirosina e triptófano. A fenilalanina que também contém o
anel benzênico não dá este teste nas condições descritas, somente utilizando um agente de nitração
mais enérgico.

TÉCNICA:
Num tubo pipete 1 mL de solução de ovoalbumina, junte 10 gotas de ácido nítrico concentra-
do. Ferva por 3 min, acrescente 4 mL de solução NaOH 2N. O que observou?

6 - REAÇÃO DE MILLON: Tirosina


Quando aquecemos uma proteína contendo tirosina, com o reativo de MILLON (mistura de
mercúrio e ácido nítrico concentrado), observamos a formação de um produto colorido. Isto é explica-
do pela reação do grupo hidroxifenil da tirosina, com o mercúrio reativo, tendo com resultado a forma-
ção de fenolato de mercúrio. A reação não deve ser feita em meio alcalino forte devido à precipitação
do mercúrio sob a forma de óxido.

TÉCNICA:
Tubo 1. 1mL de solução de ovoalbumina + 5 gotas do reativo de Millon
Tubo 2. 1mL de solução de gelatina 1% + 5 gotas do reativo de Millon
Aquecer. O que observou? Equacione.
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7 – REAÇÃO DO GRUPO SULFIDRILA – CISTINA E CISTEÍNA


Cistina e cisteína quando são aquecidos com álcali forte, em presença de acetato de chumbo,
há formação de um precipitado de sulfeto de chumbo.

TÉCNICA:
Coloque num tubo uma pequena quantidade de cabelo, junte 5 gotas de solução de acetato
de chumbo 5% e 2 mL de solução NaOH 50%. Ferva durante 5 minutos. O que observou.

Determinação qualitativa de proteínas e aminoácidos

1- Reação do Biureto

O C C O
NH HN
R1 CH
CH R1
O C
Cu
C O
NH
HN
CH
R2 HC
R2

2-Reação da Ninidrina

O O OH
OH C O
+
+ H3 N C H OH
OH RCHO + CO 2 + NH
D 3 + + H+
O R1 Aldeído H

Ninidrina oxidada O
Ninidrina reduzida
hidridantina
+

O
O O
+ OH
NH3
3H 2 O + C N C
D
OH
O
O O

Produto púrpura 2a. Ninidrina oxidada


ou Púrpura de Ruhemann's

3- Precipitação com sais de metais pesados


COOH COO -
2P + HgCl 2 2NaOH P Hg 2NaCl + 2H 2 O
+
NH2 Cloreto de NH2 Cloreto de
mercúrio sódio
proteínas -
COO
P
NH2
Sal insolúvel
do metal
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COOH
CH 3 COO COO -
2NaOH
2P + Pb
CH 3 COO P Pb + 2CH 3 COONa + 2H 2 O
NH2 NH2 Acetato de
Proteínas sódio
Acetato de -
COO
chumbo
P
NH2

Sal insolúvel
do metal

4-Precipitação pelos ácidos minerais fortes

Proteína + HNO 3 Metaproteína


Ácido nítrico
concentrado

5- Reação de Millon- Presença de tirosina

H2 N NH2
O
HNO3
2 OH CH2 C C + Hg ++ O Hg O + 2CH3CHCOOH
OH
D
Alanina
H
Fenolato de Mercúrio
Tirosina

6- Reação do grupo Sulfidrila - Presença de cisteína e cistina


H2 N H2 N

SH CH2 C COOH + + OH CH2 C COOH + H2O


2NaOH Na 2 S
D
H Hidróxido Sulfeto H
de sódio de sódio Serina
Cisteína

CH 3 COO
Na 2 S + Pb PbS + 2CH3COONa
CH 3 COO D
Acetato de
Sulfeto Sulfeto de sódio
Acetato de
de sódio chumbo
chumbo

7- Reação xantoprotéica - Presença de tirosina e triptofano


H2 N H2 N

OH - H2O
CH2 C COOH + HNO3 OH CH2 C COOH
D
H H NaOH
NO2
Amarelo
Tirosina Nitroderivado
intenso
Amarelo
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4-PESQUISA QUALITATIVA DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DO LEITE

I - EXTRAÇÕES

01 - Adicionar 50 ml de água destilada morna a 50 ml de leite em béquer de 250 ml.


02 - Acrescentar solução de ácido acético 10% gota a gota, agitando, até que o leite se coagule
(queijo).
03 - Deixar em repouso cerca de 5 minutos.
04 - Decantar o líquido sobrenadante sobre o papel de filtro, recolhendo o filtrado no erlenmeyer
de 125 ml. Guardar o precipitado.
05 - Transferir o filtrado para o béquer de 250 ml. Aquecê-lo diretamente na chama até ebulição.
Baixar a chama e deixar fervendo até reduzir o volume a mais ou menos 40 ml. Soprar na superfície
quando houver formação de espuma.
06 - Filtrar e deixar esfriar. Esta solução será utilizada para os testes de alguns constituintes quí-
micos.
07 - Colocar o precipitado obtido no item 4 num béquer de 100 ml.
08 - Adicionar 10 ml de álcool e amassar com o bastão. Decantar e desprezar o sobre-nadante na
pia.
09 - Adicionar novamente cerca de 10 ml de álcool e repetir a operação anterior.
10 - Adicionar cerca de 5 ml de éter e fazer a extração com auxílio do bastão.
11 - Passar o líquido sobrenadante para uma placa de Petri. Deixar evaporar o éter à temperatura
ambiente, e observar o resíduo.
12 - Recolher o precipitado lavado pelo éter em papel de filtro e deixar evaporar o éter restante à
temperatura ambiente.
13 - Interprete o resultado.

II - RECONHECIMENTO DA PORÇÃO PROTEICA DO LEITE - Teste do Biureto

01 - Colocar um pequeno fragmento do precipitado em um tubo de ensaio.


02 - Adicionar 3 mL do reagente de biureto.
03 - Agitar.
04 - O aparecimento de uma coloração violeta indica reação positiva.
05 - Interprete o resultado.

III - PESQUISA DE AÇÚCAR REDUTOR - Teste de Benedict

01 - Colocar 2 mL do reagente de Benedict num tubo de ensaio.


02 - Adicionar 1 mL do filtrado obtido no item I - 6. Misturar.
03 - Aquecer até a ebulição e observar a mudança de coloração do reagente.
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04 - Interpretar o resultado.

IV - PESQUISA DE CÁLCIO

01 - Colocar 2 mL de filtrado em um tubo de ensaio.


02 - Adicionar o reativo de Sulkowitch gota a gota até aparecimento de uma turvação ou
um precipitado branco.
03 - Interpretar o resultado.

V - PESQUISA DE CLORETOS

01 - Colocar 2 mL do filtrado em um tubo de ensaio.


02 - Adicionar 2 a 3 gotas de HNO3 concentrado.
03 - Adicionar gotas de AgNO3 5% até o aparecimento de turvação ou precipitado.
04 - Interprete o resultado.
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5-PROPRIEDADES DA UREASE

1 - REAÇÃO DA UREASE COM O BIURETO

TÉCNICA
Tubo 1. 3 gotas de solução de urease + 1 mL de biureto
Tubo 2. 1 mL de biureto
Comparar as cores dos dois tubos. Explicar.

2 - TESTE DE ATIVIDADE
Pela ação da urease a uréia se converte em amônia e ácido carbônico

Urease
CO (NH2)2 + 2 H2O H2CO3 + NH3

H2 CO3 H2O + CO2

A ação enzimática da urease pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma solução de
uréia fracamente tamponada a pH 7,0 contendo o indicador vermelho de fenol (amarelo 7,0  8,6
vermelho). Sob a ação da enzima formará amônia suficiente par sobrepujar a ação do tampão e o pH
subirá. A cor da solução então mudará de amarelo para vermelho.

TÉCNICA
Pipetar 1,5 mL de solução de uréia (0,4M, pH 7,0) num tubo de ensaio e adicionar 3 gotas de
solução de urease. Misturar. Observar a mudança de coloração após 3 minutos.

3 - ESPECIFICIDADE
A urease é especificada pelo seu substrato, a uréia. Podemos demonstrar isso, reagindo-a
com derivados da uréia, como exemplo tem a tiouréia (NH 2 - CS – NH2).

TÉCNICA
Em um tubo adicione 1,5 mL de solução de tiouréia (0,4M, pH 7,0) + 3 gotas de solução de
urease e compare com o tubo do teste de atividade (reação 2). Explicar o que ocorreu.

4 - DESNATURAÇÃO PELO CALOR

TÉCNICA
Misturar num tubo de ensaio 1 mL de água destilada com 3 gotas de solução de urease. Le-
var ao banho-maria a 100°C durante 5 minutos. Pipetar em outro tubo 1,5 mL de solução de uréia e
adicione 0,5 mL da solução de urease fervida. Aguardar 5 minutos. Comparar com o tubo do teste de
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atividade (reação 2). Explicar.

5 - INIBIÇÃO POR SAIS DE MERCÚRIO


Os grupos (-SH) sulfidrílicos são essenciais para a atividade da urease. Eles podem manter
ou talvez constitua parte do centro ativo da enzima. Se forem oxidados a enzima se tornará inativa.

2(-SH) + HgCl2 S - Hg - S + 2HCl

Realizar os testes abaixo:

TUBOS UREASE ÁGUA HgCl2 5% URÉIA COLORAÇÃO


1 3 gotas 1 mL  1,5 mL
2 3 gotas 1 mL 5 gotas 1,5 mL
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REFERÊNCIAS

NEPOMUCENO, M. de F; RUGIIERO, A. C.; Manual de Bioquímica: roteiro de análises bioquímicas


qualitativas e quantitativas. Ribeirão Preto: Tecmedd, 2004.

Disponível em http: www.bioq.unb.br/htm/praticas. Acessado em 27/01/2009.

SILVA, S. L. A. da; FERREIRA, G. A. L; SILVA, R. R. da. Química Nova na Escola, Nº 2, Novembro


de 1995.