EXTRACCIÓN DE ADN EN PLANTAS

1. FACTORES QUE SE DEBEN TENER EN CUENTA

 El tipo de planta y de tejido que se va a emplear como fuente.

Por ejemplo: Los tejidos jóvenes contiene más DNA que los viejos. Considerar la composición
química del tejido, los métodos de extracción del material genético proveniente de tejidos
ricos en compuestos fenólicos son diferente al método empleado con tejidos ricos en
carbohidratos o aceites.

 Tipo de DNA a extraer.

Las plantas poseen tres tipos: Nuclear, mitocondrial y cloroplástico. El tipo de información que
codifican es diferente.

 Tipo de análisis.

Con base en la cantidad y calidad del DNA se pueden desarrollar diversas técnicas de análisis

2. PASOS ESENCIALES PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN EN PLANTAS

- Ruptura de tejidos y paredes celulares.

Pulverizar el material vegetal a bajas temperaturas (nitrógeno líquido o hielo seco). Pulverizar
por secado en un horno, deshidratando los tejidos. También se pueden utilizar enzimas de tipo
celulosas.

- Ruptura de membranas.

Una vez el tejido es disgregado en células, se hace necesario romper las membranas celulares
para liberar el DNA, se utiliza detergentes (SDS, Triton o detergentes comerciales). También se
pueden utilizar métodos físicos, basados en ultrasonido.

- Inhibición de enzimas que destruyen al DNA

(DNasas) mecanismo de defensa natural. La inhibición se realiza por métodos físicos, como la
desnaturalización por calor (a temperatura de 65°C) o con métodos químicos, (fenol y
cloroformo), antioxidantes, agentes quelantes o agentes caotrópicos.

- Extracción de contaminantes

El DNA está asociado con proteínas(histonas) e inmerso en un medio que contiene estructuras
de composición química diversa. Se debe centrifugar a altas velocidades, electroforesis, la
separación a través de columnas y utilización de imanes para obtener preparaciones de alta
pureza.

3. TECNICAS
 Trizol o Tiocianato de guanidina- Fenol Cloroformo: Se utiliza para la extracción de ADN,
ARN, PROTEÍNAS, tiene un buen rendimiento.
Compuesto por:
1. tiocianato de guanidina: Causa la lisis celular, denatura las proteínas, DNasas y RNasas
2. Fenol: Denatura proteínas contaminantes
 3. Cloroformo: Permite la separación de dos fases ADN queda en fase acuosa y las
proteínas y otros contaminantes quedan en la fase orgánica.
4. Isopropanol: al agregar la fase acuosa que es donde está el ADN, este se va a
precipitar.

 Método CTAB Bromuro Cetiltrimetilamonio: Es una sal de amonio cuaternaria que rompe
la pared y produce lisis ya que el detergente tiene una composición muy similar a la de los
lípidos, lo que ayuda a que capture los lípidos de la membrana y las desintegra
Compuesto por:
1. EDTA: Agente quelante, mantiene estabilidad de los ácidos nucleicos
2. Cloroformo: Para la formación de las dos fases, acuosa y orgánica
3. Isopropanol: Precipitación de ácidos nucleicos
4. TRIS- HCl: solución de rehidratación del DNA

Método más usado en extracción de ADN en plantas, tiempo corto y buena calidad y
cantidad del ADN

 Método Fenol- Cloroformo:

4. ARTICULO
- Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA
from recalcitrant plant species

Objetivo: Describir modificaciones al método de extracción establecido basado en CTAB que

permite el aislamiento confiable del ADN genómico de alto peso molecular de las especies de
plantas difíciles de aislar Corymbia (un eucalipto) y Coffea(café).

La mayoría de los métodos de extracción de ADN de tejido de hoja vegetal se derivan del
método basado en bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB). Para lidiar con los problemas
de los contaminantes el protocolo se ha modificado para incluir polivinilpirrolidona (PVP) y
soluciones con alto contenido de sal para aislar el ADN genómico

Desventajas: Lleva mucho más tiempo, por largos pasos de incubación, en la extracción previa
de los núcleos que aumenta el tiempo de manejo, o bien requieren múltiples lavados de ADN
y precipitaciones que disminuyen el rendimiento general.

Conclusión: El método se generó con la intención de usar un único protocolo para todas las
especies de plantas, independientemente de la presencia o ausencia de contaminantes
coextrayentes de ADN. Con este robusto protocolo, la secuenciación del genoma completo es
posible a partir de especies de plantas recalcitrantes utilizando tecnologías de secuenciación
de ADN establecidas para investigaciones bio informáticas avanzadas.