1.

INTRODUÇÃO

1.1. Métodos Fotocolorímetro

A fotocolorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um

procedimento analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas
mediante a absorção de energia radiante (luz). Trata-se de um método biofísico de análise de
substâncias amplamente utilizado em laboratórios de análises clínicas e em laboratórios de
pesquisa, com intuito principal a determinação da concentração de soluções. Esse método tem
como base a relação entre a absorção de radiações eletromagnéticas e a concentração da
substância em questão.
Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ou emissão de radiação
eletromagnética por muitas moléculas, quando os seus elétrons se movimentam entre níveis
energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda
entre o ultravioleta e o infravermelho. Um espectrofotômetro é um aparelho que faz passar um
feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida
por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes
comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca).
Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um
único comprimento de onda, ou quase), fazendo com que, o espectrofotômetro nos permita saber
que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda. Já a Fotometria, é uma técnica
de análise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absorção de luz monocromática
de um composto químico em solução, ou seja, analisa a absorbância (capacidade que tem uma
solução de absorver uma certa quantidade de energia do feixe de luz incidente) que tem como
intuito identificar o comprimento de onda característico para cada composto e para quantificação
do composto através de 1) absorção direta e 2) através de método colorimétrico.
Essa intensidade de absorção depende:

1) do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o λ máx- onde o composto

absorve mais luz).
2) do percurso que o feixe de luz percorrerá na solução e
3) da concentração do composto nessa solução. A lei de Lambert-Beer estabelece que a
absorbância é diretamente proporcional a concentração da espécie absorvente. A fração de luz
que passa por uma amostra está relacionada logaritmicamente, e não linearmente, com a
concentração da amostra.
 A lei de Lambert-Beer relaciona esses três fatores e estabelece que:

A = capacidade intrínseca dos materiais em absorver radiações em frequência específica,

e pode ser definida pela reação seguinte: A = - log It/I0.
ε = absortividade molar (característico de cada substância), em L.(mol.cm)-1;
l = caminho óptico (percurso da luz monocromática na solução), em cm;
c = concentração da substância em mol/L.

Também podendo ser expressa matematicamente por:

Onde:
T= Transmitância
e = Logaritmo Natural de Euler
a = Constante
1 = Espessura da solução
C = Concentração da solução (cor)

Assim, mantendo-se o caminho óptico constante, a absorbância torna-se diretamente

proporcional à concentração da substância no respectivo λ máx. Utilizando-se desses padrões,
podemos utilizar uma solução de concentração conhecida do composto a ser analisado (ou outra
substância de características químicas semelhantes) para construir um diagrama de absorbância
em função da concentração da substância em questão. Com este diagrama, denominada curva
padrão, podemos medir a quantidade do composto em amostras de concentração desconhecida,
pela simples medida de suas absorbâncias, desde que, estas estejam nas mesmas condições
utilizadas para a construção da curva padrão (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc).

1.2. Curva padrão

Por conta de existir uma proporcionalidade direta entre a concentração das soluções e a
quantidade de luz absorvida em comprimentos de onda específicos, é possível a identificação e
quantificação de substancias por meio da espectrofotometria e a fotocolorimetria. Ainda assim,
faz se necessário, a obtenção de uma relação entre absorbâncias registradas em experimentos para
diferentes concentrações de soluções, elaborando-se retas de calibração, ou seja, curvas padrões
 1.3. Métodos para quantificação de proteínas totais

As proteínas desempenham papéis extremamente importantes, na maioria dos processos

biológicos, por isso, o desenvolvimento de metodologias para determinar esses compostos tem,
cada vez mais, se tornado relevantes em várias áreas do conhecimento (Zaia, 1998). São
encontrados na literatura, diferentes métodos para a quantificação de proteínas. A maioria desses
métodos tem como base: a propriedade intrínseca das proteínas para absorver luz no UV; na
formação de derivados químicos; na capacidade que as proteínas têm de se unir a certos corantes.
A pesar de se ter vários métodos para a determinação da concentração de proteínas totais em uma
determinada solução, as metodologias mais utilizadas são as espectrofotométricas no ultravioleta
e no visível. Ao longo dos anos, muitos métodos espectrofotométricos, têm sido propostos para a
determinação de proteínas totais, porém não existe uma metodologia considerada de uso universal
para todos os meios. Os métodos geralmente mais utilizados são o do Biureto, de Lowry, de
Bradford, de Smith e de absorção de proteínas no ultravioleta (Zaia, 1998).

1.4. Método do Biureto para determinação de proteínas

Um dos métodos utilizados para dosagem de proteína é chamado de método do Biureto.

Fazendo uso da propriedade de íons Cu2+ em meio alcalino de formar ligações com o nitrogênio
das ligações peptídicas. Com resultado dessa reação, obtém-se uma solução de coloração púrpura
intensa, que absorve fortemente a radiação a 540nm. Essa propriedade pode ser explorada para se
determinar por colorimetria a quantidade de proteína de uma solução. A cor obtida numa reação
de íons de Cu2+ em meio alcalino tem relação direta com às ligações peptídicas e a sua
intensidade é proporcional a quantidade das mesmas, sendo possível a obtenção da absorbância
por meio do espectrofotômetro ou fotocolorímetro.

1.5. Proteínas presente no leite

Uma dieta bem balanceada, necessita essencialmente de leite, que possui composto de
diversos nutrientes e substâncias fisiologicamente ativas. O leite é composto por 87,5% de água,
3,6% de gordura, 4,5%de lactose, 0,8% de sais minerais e 3,6% de proteínas, há três tipos de
proteínas diferentes: 7-12% de α-Lactoalbumina, 2-5% de β- Lactoglobulina e o restante de
caseína. O ponto isoelétrico da caseina é 4.6 (ponto de pH onde se consegue a precipitação por
coagulação acida). A proteína purificada é insolúvel em água. Enquanto é insolúvel em soluções
salinas neutras, prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas tais como
oxalato de sódio e acetato de sódio. Além disso, a caseína faz muito bem à saúde.
 Objetivos:

• Elaborar curvas de calibração e estabelecer a sensibilidade de um método

fotocolorimétrico.
• Relacionar os métodos fotocolorimétricos às situações onde poderão ser aplicados,
tendo como exemplo a dosagem de proteínas do leite pelo método da reação do biureto.
• Resolver problemas específicos: cálculos das diluições e de concentrações.

Materiais e métodos:
1. Precipitação isoelétrica da caseína

Em um béquer de 50 mL colocou-se 10 mL de leite e juntou-se 10 mL de água destilada

morna. Com uma pipeta de 2 mL acrescentou-se solução de ácido clorídrico a 2%, gota a gota e
com agitação constante, até atingir o ponto isoelétrico (pl) da caseína que corresponde ao pH 4,6,
no qual o leite coagula. O pH pode então ser medido com o auxílio de um papel indicador
universal. Anotou-se o volume de HCl 2% gasto.
Após sedimentação do precipitado, filtrou-se por papel. O filtrado foi utilizado para a dosagem
das proteínas que não precipitaram nas condições acima, ou seja, lactoalbumina + lactoglobulina
(filtrado = amostra PF = tubo nº 7).

2. Diluição do leite para dosagem de proteínas totais

Diluiu-se o leite a 1/20 (0,5 mL de leite + 9,5 mL de água destilada à temperatura

ambiente).

3. Curva de calibração e dosagem de proteína

Inicialmente, colocou-se as quantidades de padrão de proteína em 5 tubos de ensaio (0, mL,
0,4 mL; 0,6 mL; 0,8 mL; 1,0 mL; respectivamente), adicionou-se então agua destilada em
cada tubo até que completasse 1mL de solução de proteínas. Em seguida, acrescentou-se 5
mL de Biureto em cada tubo (tubos de 1 a 8). Agitou-se todos os tubos e deixou-se em
repouso durante 10 minutos. Com o fotocolorímetro em 540 nm, zerou-se o aparelho com
o tubo nº 1 (branco = concentração zero de proteínas). Depois, traçou-se um gráfico
plotando as concentrações de proteínas da curva de calibração (tubos 2 ao 6) no eixo das
abcissas e as respectivas leituras de absorbância (A) no eixo das ordenadas. Interpolou-se a
melhor reta possível, passando pela origem dos eixos cartesianos (= curva da calibração).
Assim, determinou-se as concentrações de proteína das amostras PF (filtrado) e PT
(proteínas totais do leite), na mesma unidade do padrão, isto é, mg/mL.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nesse experimento pode-se observar a aplicação da fotocolorimetrica a fim de ajudar no

cálculo da porcentagem de proteínas do leite pelo método do biureto, podendo assim, quantificar
as proteínas do leite.
 1- Precipitação da caseína
Ao adicionar-se 1,6 mL de ácido clorídrico no leite desnatado, notou-se a precipitação
imediata da caseína, que foi filtrada. Isso se deu com acompanhamento da medição
feita com fita de pH. Tal precipitação ocorreu, pois de acordo com o encontrado na
literatura, o ponto isoelétrico para a caseína é em pH 4,6. O filtrado foi recolhido e
então nomeado como PF. O fato do leite ser desnatado contribuiu para que não
houvesse turbidez nas soluções, atrapalhando a visualização no fotocolorímetro.
2- Proteínas do filtrado e Proteínas totais e Soluções padrão
Para o preparo destas amostras, Pf e Pt, foi necessário fazem uma diluição sendo:

Pf diluído em 1:2 (C real = C calculado x 2)

PT diluído em 1:20 (C real = C calculado x 20)

Isto foi necessário, visto que, a lei de Lambert-Beer é válida somente para soluções
relativamente diluídas, uma vez que acima de certas concentrações a relação entre a
absorbância e a concentração deixa de ser linear. Por tanto a diluição é um método que
torna viável a análise da absorbância das amostras no fotocolorímetro.

A fim de determinar a concentração das amostras Pf e Pt pelo método

fotocolorimétrico utilizou-se a relação que permite calcular a mesma a partir da medida
de absorbância de uma solução padrão, cuja concentração é conhecida. Utilizou-se uma
solução padrão com diferentes concentrações (Tabela 1) e foi traçada a curva de
calibração em que no eixo das abscissas estão às concentrações e nas ordenadas às
respectivas absorbâncias (Gráfico 01).

Assim, devido às concentrações de proteínas nos tubos e da reação destas com o reagente do
biureto, pode observar um gradiente de coloração em que:

a) O tubo 1 (branco), contendo apenas água e a solução do biureto, possuía uma coloração
azulada e foi utilizado para calibrar o espectrofotômetro,

b) Do tubo 2 ao 6, com o aumento da concentração de proteínas, observou um gradiente da

cor lilás.

c) Os tubos 7 e 8 apresentaram coloração lilás intermediaria as dos tubos 2 ao 6.

 Tabela 01 – Composição dos tubos
CURVA DE CALIBRAÇÃO PF PT

TUBOS N º 1 2 3 4 5 6 7 8

Padrão proteína 5 0 0,2 0,4 0,6 (3 mg) 0,8 1,0 -- --

mg/mL (mL) (1mg) (2mg) (4mg) (5mg)
Amostra (PF ou PT -- -- -- -- -- -- 1,0 1,0
) (mL)
Água 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -- -- --
destilada
(mL)
Reagente de Adicionar 5 mL em cada
Biureto (mL) tubo

MEDIDAS NO FOTOCOLORÍMETRO
Usou-se o fotocolorímetro no comprimento de onda em 540nm, que foi calibrado
com o tubo 01 (branco), a cada medida feita. Na tabela 02 observa-se as absorbâncias
obtidas para cada tubo.
Tabela 02 – Valores de absorbância para os tubos.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7(PF) 8(PT)
A 0,0 0,049 0,07 0,177 0,144 0,190 0,118 0,119

Gráfico 01 – curva de calibração

Com a análise do gráfico foi possível fazer algumas constatações:

Na curva de calibração obteve-se uma reta entre os limites de concentração de cada uma
das soluções padrão, portanto obedecem a Lei de Lambert-Beer. A curva padrão obtida
está de acordo com o esperado, ou seja, apresentou uma relação diretamente proporcional
entre as absorbâncias e concentrações das soluções padrão. Esta porção linear englobou
a maioria dos pontos, o que garante um limite bom de sensibilidade do método. Desta
forma, se os valores de concentração encontrados para Pf e Pt, pela extrapolação dos
dados de absorbância na reta, estiver entre os pontos será um valor confiável, pois está
dentro da sensibilidade do método. Assim torna-se possível determinar a concentração de
proteínas em PF e PT.

Gráfico 02 – extrapolação dos pontos referentes ao tubo 07 (PF) e do tubo 08 (PT)

Olhando no gráfico 2 ao extrapolarmos os valores, obtemos a [PF] = 3,8 mg/mL e [PT]=

3,2mg/mL.

Determinação da porcentagem de caseína

Para o tubo 7 (PF)
(0,73 × 1𝑚𝑙)
= 1,46 𝑚𝑔
2

1
Tubo 8 (PT) (0,61 × 1𝑚𝐿) × = 12,2 mg
20

E para a determinação da concentração de caseína,

C caseína = C real Pt – C real Pf C caseína = 12,2 – 1,46 C caseína = 10,74 mg/mL

E para a determinação da % de caseína,

% caseína = (C caseína / C real Pt) x 100

(10,74 ÷ 12,2) × 100 = 88, 08 % 𝑑𝑒 𝐶𝑎𝑠𝑒í𝑛𝑎

 % caseína = 85,06%

CONCLUSÃO

Visto que a fotocolorimetria e a espectrofotometria são técnicas analíticas que permitem

determinar a concentração das soluções através da medida da intensidade de luz absorvida ou
transmitida pelas mesmas, foi possível por meio do experimento mostrar a concentração de
caseína presente no material de estudo que foi retirada inicialmente na forma de um precipitado,
que ocorre devido à adição de ácido. Tal calculo se baseia em uma relação entre as proteínas totais
presente no tubo 8 menos as proteínas filtradas presente no tubo 7, onde se obteve como resultado
a presença de 85,81% de caseina ao final do experimento.

Bibliografia

Determinação de proteínas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos

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