DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS

Clasificación

Pruebas generales para carbohidratos

Prueba de Molish (prueba general)

Es una prueba para reconocer azúcares y diferenciarlos de otras sustancias. El ácido sulfúrico
concentrado hidroliza los enlaces glicosídicos de los di y polisacáridos y así liberando los
monosacáridos que los forman. Los monosacáridos (de más de 5 carbonos) por acción del
ácido sulfúrico concentrado se deshidratan produciendo furfural o derivados del furfural (5-
hidroxi-metil-furfural) que con el α-naftol contenido en el reactivo de Molish forma un
complejo coloreado púrpura violeta que se aprecia como un anillo en la interfase.

Reacción de la antrona

La reacción de la antrona es otra prueba general para hidratos de carbono. El fundamento es el

mismo que en la prueba de Molish excepto que el furfural reacciona con antrona dando un
complejo azul-verdoso.

Ambas pruebas son netamente para detección de carbohidratos, la profesora mencionó como
ejemplo: la hidrólisis de almidón en una bebida alcohólica, dependiendo de estas pruebas
decido continuar o detener el proceso.
Reacciones de los azúcares reductores

Prueba de Benedict

Se fundamenta en la reducción del Cu 2+ a Cu 1+., que ocurre al oxidarse el azúcar por su

grupo aldehído. El calor y el medio alcalino facilitan la oxidación de los azúcares. Observándose
el cambio de coloración del reactivo de Benedict del color azul característico a un precipitado
de color pardo naranja, por el ion cuproso.

NOTA: En el reactivo de Benedict el Cu +2 se encuentra secuestrado por el citrato de sodio

formando un complejo color azul.

Prueba de Barfoed

El reactivo de Barfoed es débilmente ácido y solamente puede ser reducido por

monosacáridos. Si se deja hervir por largo tiempo existe la posibilidad de hidrolizar disacáridos
dando así reacciones falsamente positivas.

El precipitado de óxido cuproso es menos denso que en los métodos previos y la coloración es
más rojo ladrillo que pardo naranja, es el mismo fundamento que en Benedict.

El Cu +2 en este reactivo se encuentra como acetato de cobre.

La profesora mencionó que si se quería detectar presencia de polisacáridos, los hidrolizas y si

observas más coloración es positivo.

Preparación de osazonas

Los compuestos que contienen el grupo –CO-CHOH- forman osazonas cristalinas con
fenilhidrazina. Los cristales de osazona tienen forma y puntos de fusión característicos lo cual
ayuda a la identificación de los azúcares reductores.

Pruebas para carbohidratos individuales

Prueba Bial para pentosas

Cuando se calientan pentosas con HCl concentrado se forma furfural que se condensa con
resorcinol* en presencia de iones férricos para dar un color verde azuloso.

El calentamiento prolongado puede dar falsos positivos para hexosas convertidas en

hidroximetilfurfural.

*La profesora puso resorcinol en las diapositivas pero los libros dicen orcinol.

Reacción de Seliwanoff para cetosas

Se utiliza ácido clorhídrico en la reacción de deshidratación (del monosacárido) y el resorcinol

en la reacción de condensación del derivado del furfural. Es una prueba cualitativa (el medio
pasa de incoloro a rojo) para las cetohexosas y aldohexosas. La sacarosa da una reacción
positiva debido a la hidrólisis ácida de su enlace glicosídico.

La profesora mencionó en clase que es para cetosas porque se deshidratan más rápido que las
aldosas, en el libro que saqué la información dicen que esto se debe a que el
hidroximetilfurfural se forma rápidamente a partir de cetohexosas y más lentamente de
aldohexosas porque estas requieren de un tratamiento más prolongado ( más de 15 minutos)
lo cual provoca la isomerización de la glucosa (aldosa) en fructosa (cetosa).
Pruebas para sacarosa

La sacarosa es el único disacárido común no reductor y por lo tanto no reduce las soluciones
alcalinas de cobre ni forma osazonas. La sacarosa es hidrolizada en solución ácida y se ensayan
la glucosa y fructosa resultantes con las pruebas mencionadas anteriormente.

Prueba del yodo

El yodo forma complejos coloreados de adsorción con los polisacáridos; el almidón da un color
azul con el yodo, mientras que el glicógeno y el almidón parcialmente hidrolizado reaccionan
dando una coloración pardo rojiza.

 Cada 7 unidades entra el yodo y forma esa coloración y hay formación de metilfurfural
al hidrolizar.

Hidrólisis de polisacáridos

Los polisacáridos contienen solo un grupo reductor por varios cientos o más de residuos así
que en la práctica no son reductores. La hidrólisis ácida libera los monosacáridos
constituyentes que pueden ser luego ensayados.

DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS DISPONIBLES

Por diferencia

Basaso en el análisis de Weende, luego de determinar humedad, cenizas, grasas, proteínas y

fibra se obtiene el porcentaje de carbohidratos por diferencia.

Ventajas:

- No hay determinaciones por separado.

- Cálculo de valor de energía de un alimento.

Desventajas:

- Elevada probabilidad de error de estimación debido a los posibles errores incurridos en

cada una de las determinaciones del análisis proximal.

Hidrometría – para líquidos de gobierno

La gravedad específica, es menos exacta cuando se mide con un hidrómetro (pero sirve de
referencia).

Las determinaciones densimétricas son simples, de ejecución rápida y aplicable a líquidos o en

solución. Se basa en el principio de Arquímedes.

Para controlar por ejemplo procesos de ósmosis en confitado.

Refractometría

Se basa en la determinación del índice de refracción.

- Cuando se analizan jarabes puros de composición conocida, es más preciso.

- Rápido y preciso para cuantificar el contenido de azúcar.
- Método sencillo, con pequeñas cantidades de muestra, por lo que es ampliamente
utilizada para medir concentración de sólidos solubles en jarabes y melazas.
Polarimetría

La mayoría de los azúcares contienen uno o más átomos de carbono asimétrico y poseen
actividad óptica. Con base en este principio se usa la polarimetría.

La rotación del plano de luz polarizada puede demostrarse y medirse con un polarímetro. El
haz de luz polarizada pasa a través de la muestra de azúcar que hace rotar el plano de luz.

Se emplea en el análisis de productos alimenticios, ricos en azúcares y almidones, como jugos

de frutas, jarabes, harinas e inclusive vinos y vinagres.

Colorimetría

Mediante reacciones de color entre azúcares y diversos reactivos. La coloración producida es

proporcional a la concentración. Se compara la absorbancia medida con una solución estándar.
Es posible cuantificar polisacáridos pero en su mayoría se utiliza para azúcares simples.

Reactivos

Antrona

Es un método muy sensible. En medio ácido y caliente, con ácido sulfúrico. Hay menos
interferencia porque se lee algo más alejado al espectro visible.

La reacción de la antrona es conveniente para la determinación de hexosas, aldopentosas y

ácidos hexurónicos libres o como parte de polisacáridos. Los derivados furfurálicos
condensados con la antrona dan una coloración azul verdosa de una absorción máxima de 620
nm. No es conveniente realizarla en presencia de proteínas con grandes cantidades de
triptófano.

Ácido pícrico

Reacciona con los azúcares reductores y forma ácido picrámico rojo. Se determina la cantidad
por espectrofotometría. Una desventaja es que el reactivo es potencialmente explosivo.

Ácido dinitrosalicílico (DNS)

- Reducción DNS (color amarillo-naranjo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido
3- amino – 5- nitrosalicilico (color rojo ladrillo).
- Se mide por espectrofotometría visible a 540nm. En la práctica a 550 nm.
- En medio alcalino.

Determinación de carbohidratos reductores y no reductores usando el ensayo fenol – ácido

sulfúrico

El fenol con los derivados del furfural producidos por la deshidratación e hidrólisis provocadas
por el ácido forman un complejo aromático color amarillo- naranja. Se mide a 490 nm.

Se usa cuando el azúcar está en presencia de varias sales o residuos de proteínas o unido a un
polímero.

Es muy general excepto para desoxiazúcares .

Precisión del ±2%

Somogyi Nelson

Fundamento: se calienta el azúcar con una solución alcalina de tartrato de cobre produciendo
óxido cuproso que reacciona con arsenomolibdato para dar azul de molibdeno, de color azul
intenso.

Determina concentraciones menores a 1 mg/ml a baja precisión.

Para ver galactosa, glucosa y maltosa.

Se lleva a una atmosfera inerte ( sin oxígeno se limpia con nitrógeno).

Se lee a 520 nm según el Nielsen pero según las diapositivas a 500 nm.

AMINOAZÚCARES

Morgan- Elson

 Determina cantidad de N-acetil- aminoazúcares. Se calienta en solución alcalina para

formar cromógenos produciendo complejos coloreados púrpuras.
 Precisión ± 10 %
 530 nm – amino azúcares.
 544 – 585 nm para N-acetil azúcar.

Métodos de titulación

Fehling

Se fundamenta en la capacidad de reducir iones metálicos, de preferencia Cu y Ag en solución

alcalina.

Grupos aldehídos o cetónicos. Libre de reacciones con agente reductores débiles.

Los azúcares reductores son todos los monosacáridos y algunos disacáridos como maltosa y
lactosa. En los resultados se puede expresar como en uno en particular.

Dos soluciones: (1) Sulfato de cobre cristalino, (2)Tartrato de Sodio y Potasio (amortiguador de
pH) + NaOH

Tartrato evita la precipitación del Hidróxido Cúprico. El cobre es reducido con los fragmentos
reactivos de los azucares. A medida que los iones Cu++ se reduce, los iones Cu+ se combinan
con los iones hidroxilo para formar hidróxido de cobre. ( color amarillo)

DESVENTAJA: La reducción de cobre y la oxidación de los azúcares no es estequiométrica.

METODO DE MUNSON Y WALKER

Titulación del Permanganato de Potasio

El Cu2O reacciona con el ion férrico, el cual es reducido al ion ferroso, el cual es titulado con
permanganato (Color Rosa)

Titulación del Tiosulfato de sodio

Se oxida el Cu con ácido nítrico, y luego se hierve para eliminar el HNO3, se añade KI, y se
titula el I2 liberado con una solución estándar de tiosulfato de sodio. Se usa almidón como
indicador (Azul -> Incoloro)
DESVENTAJA: No se puede distinguir entre los diferentes azucares reductores. Se necesitan
muestras grandes.

METODO DE LANE Y EINON

Se basa en la determinación del volumen de disolución de la muestra, que se requiere para

reducir completamente un volumen conocido del reactivo alcalino de cobre. El punto final se
determina por el uso de un indicador interno, azul de metileno, el cual es reducido a blanco de
metileno por un exceso de azúcar reductor.

Se aplica en: Leche evaporada y condensada, productos lácteos, néctares, jugos, mermeladas,
cajetas, dulces, moles, jarabes y mieles.

METODO CLORAMINA – T

Cloramina – T es agregado en exceso (Volumen conocido) Azucares reductor oxidado por la

cloramina – T y esta 4es reducida. Exceso de cloramina – T es calculada por

Métodos enzimáticos

Tiene la ventaja de ser muy sensibles (entre 5 y 50 µg ) y generalmente muy específicos.

Glucosa

La glucosa se determina por el sistema glucosa oxidasa – peroxidasa. La galactosa se cuantifica

por el sistema galactosa oxidasa –peroxidasa.

La glucosa en medio acuoso y en presencia de oxígeno disuelto, es oxidada por la glucosa

oxidasa a glucolactona que se hidroliza espontáneamente a ácido glucónico:

D- glucosa + H20 + O2 - > ácido – D- glucónico + H2O2

Para la galactosa la reacción es :

D-galactosa + H2O + O2 - > hexodialdosa + H2O2

El agua oxigenada es inmediatamente reducida por la peroxidasa en presencia de un

cromógeno: la o- dianisidina o ATBS. La reacción oxida al cromógeno a un producto coloreado
rosado bebé que absorbe a 500- 560 nm y cuya concentración es proporcional.

También hay métodos UV, en el cual se aprovecha la propiedad del NADPH + H+ de absorber en
la región UV próximo (340 nm). Este método es más específico pero más caro. Es aplicable a
glucosa y fructosa.

Para la cuantificación de glucosa y/o fructosa , la primera etapa, poco específica, es la

conversión de los azúcares reductores en ésteres fosfato, en presencia de ATP y hexoquinasa.

Según las reacciones :

Glucosa + ATP - > Glucosa-6-fosfato +ADP

Fructosa + ATP -> Fructosa-6-fosfato + ADP

La segunda etapa, más específica, corresponde a la oxidación de la glucosa – 6- fosfato por la

glucosa -6- fosfato deshidrogenasa con reducción simultánea del NADP:

Glucosa-6-fosfato + NADP -> 6-fosfogluconato + NADPH+H +

La cantidad de NADP reducido a NAPH + H+ es proporcional a la cantidad inicial de glucosa.

Fructosa

Para fructosa, la fructosa que ha sido fosforilada puede ser isomerizada por la fosfoglucosa-
isomerasa:

Fructosa-6-fosfato- > glucosa -6-fosfato

Y se realiza el procedimiento anterior.

Sacarosa

Requiere hidrólisis a monosacáridos con beta- fructosidasa o invertasa.

Cuantificar glucosa.

Almidón total

Conversión selectiva de almidón a glucosa (hidrólisis amilásica).

Entonces tras la hidrólisis enzimática, existen muchos métodos pero los pasos generales son:

Gelatinización, licuefacción y dextrinización, hidrólisis de las dextrinas en glucosa y

determinación de glucosa.

El almidón se suspende en etanol (80%) para eliminar los glúcidos solubles en alcohol y a
continuación se gelatiniza. La hidrólisis para liberar la glucosa se lleva a cabo con
amiloglucosidasa. Tras la filtración la glucosa se cuantifica por el método de la glucosa oxidasa.
El contenido en almidón se obtiene multiplicando la tasa de glucosa por el factor 0.9 para
compensar la fijación de una molécula de agua por cada molécula de glucosa durante la
hidrólisis de almidón.

Al final de la hidrólisis la glucosa generada a partir de almidón se cuantifica por métodos

colorimétricos.

Fórmula

((Glucosa total – Glucosa blanco) x 10 x 162 /180 x 100)/M

180(glucosa pm) -18 (agua pm) = 162