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Capítulo 3 – Procedimento Experimental .

CAPÍ TUL O 3

PROCEDI M ENTO EXPERI M ENTAL

3.1 Deter minação do Teor de Ácido Ascór bico e de Ácido Cítr ico no
Resíduo

O primeiro passo foi à preparação das soluções necessárias para realizar as


titulações:
- Solução de ácido oxálico 2% (5g AC. Oxálico – 250mL H2O destilada)
Foram pesados 5 gramas de ácido oxálico em um béquer de 100mL, onde água
destilada foi adicionada lentamente e com o auxílio de um bastão de vidro a solução foi
homogeneizada e colocada em um balão volumétrico de 250mL. O volume do balão foi
completado com água destilada.

- Solução de 2,6-diclorofenolindofenol 0,025% (DCFI)


Foram pesados 0,0625 g de diclorofenolindofenol em um béquer de 100mL,
onde água destilada foi adicionada lentamente e com o auxílio de um bastão de vidro a
solução foi homogeneizada e colocada em um balão volumétrico de 250mL. O volume
do balão foi completado com água destilada.

- Fenolftaleína
O primeiro passo foi preparar uma solução de álcool 95%, que foi feita
colocando 5 mL de H2O destilada em um balão volumétrico de 100 mL e completando
o volume com álcool. Depois foi pesado um grama de fenolftaleína, em um béquer de
100 mL, que foi diluído com a adição da solução de álcool 95%, preparada e com o
auxilio de um bastão de vidro. Após homogeneização, a solução foi passada para um
balão volumétrico de 100 mL e o volume completado com o álcool 95%. O balão foi
envolvido com papel alumínio e colocado na geladeira.

- Hidróxido de Sódio 0,1N


Foram pesados 4 g de NaOH em um béquer de 100mL, e homogeneizados com
água destilada e um bastão de vidro. A solução foi colocada em um balão volumétrico
de 1L e o volume do balão foi completado com água destilada. A solução final foi
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passada para um recipiente de plástico escuro e colocado na geladeira. O NaOH foi


padronizado cada vez que foi preparado para efetuar os cálculos do teor de ácido cítrico.
A padronização seguiu tais passos: 1 g de bifitalato de potássio foi pesado em uma placa
de petri e colocado na estufa na temperatura de 100oC; após duas horas na estufa a placa
foi retirada e colocada para descansar por 10 minutos em um dessecador. 0.3 gramas do
bifitalato foram colocados em 3 béqueres, onde foi adicionado água destilada até a
completa homogeneização da solução. Foram adicionadas 3 gotas de fenolftaleína, e a
solução final foi titulada com o NaOH. A partir do volume utilizado na titulação foi
possível calcular a normalidade do NaOH.

- Solução padrão de ácido ascórbico


Foram pesados 0,1 g de ácido ascórbico em um béquer de 100 mL que foi
diluído com ácido oxálico 2% preparado e com o auxilio de um bastão de vidro. Após a
completa homogeneização a solução foi passada pra um balão volumétrico de 100 mL e
o volume foi completado com ácido oxálico 2%. Uma alíquota de 5 mL foi retirada com
uma pipeta automática e transferida para uma balão de 50 mL e o volume foi
completado novamente com ácido oxálico 2%. Foram retiradas 3 alíquotas de 5 mL do
balão de 50 mL que foram transferidas para 3 béqueres. Estes foram titulados com 2,6-
diclorofenolindofenol 0,025% (DCFI) preparado anteriormente. Com o valor do volume
utilizado na titulação foi possível calcular a quantidade em massa de ácido ascórbico no
volume de DCFI.

- Solução Mãe (amostra)


Foram pesados 60 g da amostra de resíduos em 3 béqueres de 100 mL, nos quais foi
adicionada água destilada para efetuar a homogeneização, e retirada do suco. Na
sequência as soluções foram peneiradas e transferidas para 3 balões volumétricos de 250
mL, e o volume foi completado com água destilada.
Após as soluções terem sido preparadas, as análises foram realizadas da
seguinte forma:

Teor de Ácido Ascórbico

50 mL da solução mãe foram transferidos para um balão de 100 mL, no qual o


volume foi completado com ácido oxálico 2%. Três alíquotas de 25 mL foram retiradas
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e passadas para 3 béqueres para efetuar a titulação com DCFI. O procedimento foi
efetuado em triplicada e os volumes de DCFI gastos foram anotados e a quantidade de
ácido ascórbico contida na solução foi calculada.

Ter de Ácido Cítrico

50 mL da solução mãe foram transferidos para um balão de 100 mL, e 4 gotas


de fenolftaleína foram adicionadas e a solução foi titulada com NaOH 0,1N. O
procedimento foi efetuado em triplicada, e os volumes de NaOH gastos foram anotados
e a quantidade de ácido cítrico contida na solução foi calculada.

3.2 Deter minação do Teor de Ácido Ascór bico e de Ácido Cítr ico na
Fr uta in natura

Foi utilizado o mesmo procedimento realizado na determinação do teor de


ácido ascórbico e ácido cítrico encontrado no resíduo. Sendo assim, primeiro preparou-
se as soluções necessárias para a realização das análises, isto é, solução de ácido oxálico
2%, solução de 2,6-diclorofenolindofenol 0,025%, fenolftaleína, hidróxido de sódio
0,1N, solução padrão de ácido ascórbico. A diferença no procedimento foi a massa de
fruta utilizada, sendo que nesta etapa, trabalhou-se com 20g.

3.3 Deter minação do Teor de Fenólicos e de Flavonóides Totais no


Resíduo

O primeiro passo foi à preparação das soluções necessárias para a realização


das análises:
- Solução de Folin–ciocalteau (1:10)
Com o auxilio de uma pipeta automática 5 mL de folin – ciocalteau foram
transferidos para um balão volumétrico de 50 mL, e o volume do balão foi completado
com água destilada. Por se tratar de uma solução muito instável, teve que ser preparada
na hora da aplicação e o balão teve que ser envolvido com papel alumínio e guardado na
geladeira.
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- Solução de Na2CO3 (75 g/L)


3,75 g de Na2CO3 foram pesados em um béquer de 100 mL e dissolvidos com
água destilada e um bastão de vidro. Após adequada homogeneização a solução foi
transferida para um balão volumétrico de 50 mL e o volume foi completado com água
destilada.

- Solução de NaNO2 (5%)


2,50 g de NaNO2 foram pesados em um béquer de 100 mL e dissolvidos com
água destilada e um bastão de vidro. Após a homogeneização a solução foi transferida
para um balão volumétrico de 50 mL e o volume foi completado com água destilada.
Por ser muito instável, a solução foi preparada imediatamente antes da aplicação e o
balão teve que ser envolvido com papel alumínio e guardado na geladeira.

- Solução de AlCl3 (10%)


5 g de AlCl 3 foram pesados em um béquer de 100 mL e dissolvidos com água
destilada e um bastão de vidro. Após a homogeneização a solução foi transferida para
um balão volumétrico de 50 mL e o volume foi completado com água destilada.

- Solução de NaOH (1M)


2 g de NaOH foram pesados em um béquer de 100 mL e dissolvidos com água
destilada e um bastão de vidro. Após adequada homogeneização a solução foi
transferida para um balão volumétrico de 50 mL e o volume foi completado com água
destilada.

- Solução mãe (amostra)


Foram pesados 50 g de amostra num tubo nalgene e adicionados 70 mL de
metanol (são 7 mL de metanol a cada 5 gramas de amostra). O tubo nalgene foi
colocado em um agitador por aproximadamente 3 minutos, e depois disso foi colocado
para descansar na ausência de luz. Após uma hora de descanso a solução foi peneirada e
centrifugada por 5 minutos em 8000rpm. A solução final (extrato) foi colocada em um
béquer de 100 mL. Esse procedimento foi realizado em triplicada.
Após as soluções terem sido preparadas, as análises foram realizadas da
seguinte forma:
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Fenólicos totais

Com auxilio de uma pipeta automática 5 mL do extrato foram transferidos para


um tubo nalgene, onde foram adicionados 2.5 mL do reagente Folin-ciocalteau 0.2N. O
tubo foi colocado em banho maria à 50oC por 5 minutos, quando então 2 mL de Na2CO3
foram adicionados a solução, que ficou mais 5 minutos no banho maria. A amostra foi
esfriada em água gelada e uma alíquota foi transferida para uma cubeta que foi colocada
no espectrofotômetro no comprimento de onda 622nm onde foi realizada a leitura de
sua absorbância. O procedimento foi realizado em triplicada para cada um dos 3
extratos preparados anteriormente.
- Branco: Foi preparado pelo mesmo procedimento, só trocando os 5 mL da
amostra por 5 mL de água destilada.

Flavonóides totais

Com o auxílio de uma pipeta automática 2 mL do extrato foram transferidos


para um tubo nalgene. No tempo t = 0, 0,3 mL de NaNO2 (5%) foram adicionados ao
tubo. No tempo t = 5 minutos, foi colocado 0,6 mL de AlCl 3 (10%) e no tempo t = 11
minutos foram adicionados 2 mL de NaOH. Para finalizar foram adicionados 2,1 mL de
água destilada para completar o volume de 9,5 mL. Uma alíquota da solução final foi
transferida para uma cubeta que foi colocada no espectrofotômetro no comprimento de
onda 450nm onde foi realizada a leitura de sua absorbância. O procedimento foi
realizado em triplicada para cada um dos 3 extratos preparados anteriormente.
- Branco: Foi preparado pelo mesmo procedimento, só trocando os 2 mL da
amostra por 2 mL de água destilada.

3.4 Deter minação do Teor de Fenólicos e Flavonóides Totais na Fr uta in


natura

Foi utilizado o mesmo procedimento realizado na determinação do teor de


fenólicos e flavonóides totais no resíduo, ou seja, o primeiro passo foi a preparação das
soluções necessárias para a realização das analises, isto é, solução de folin-ciocalteau,
solução de Na2CO3, solução de NaNO2, solução de AlCl 3, solução de NaOH. A
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diferença no procedimento foi que na preparação da solução mãe foram utilizadas 20g
da fruta e foram colocados 10mL de metanol para cada 5 gramas de amostra.

3.5 Deter minação do Teor de Umidade)

Foram colocados 2 g de amostra em 3 placas de petri, que foram pesadas e as


respectivas massas foram anotadas. As placas foram então colocadas em uma estufa
mantida a uma temperatura de 105oC. Após 24 horas na estufa as placas foram retiradas
e colocadas para esfriar por 10 minutos num dessecador. Posteriormente foram pesadas
novamente e com isso foi possível quantificar a umidade da amostra. O teor de umidade
é importante para realizar os cálculos em base seca.