Resistencia antimicrobiana en tuberculosis

Dr. Iñaki Comas, Unidad Genómica de la Tuberculosis, Instituto de Biomedicina

de Valencia

La tuberculosis (TB) en el
siglo XX: se puede considerar
como una historia de abandono. No ha habido
investigación y desarrollo adecuado, las infraestructuras
de salud pública han estado casi desmanteladas y ha
habido falta de vigilancia. No obstante ha tenido lugar
importantes hechos históricos:

El tratamiento corto directamente observado (DOTS), por ejemplo, ha salvado 10

millones de vidas.

El ciclo epidemiológico de la TB es complejo:

 ¡La evolución lenta y constante de la situación de la TB no es una opción!

Según la OMS, la TB es la principal asesina de enfermedades infecciosas en el

mundo. Datos de 2016 indican que por la misma murieron 1 700 000 personas, 10
400 000 enfermaron de TB, es la principal causa de muerte por resistencia frente a los
antimicrobianos, y la primera causa de muerte en los enfermos con infectados con el
HIV. Se estima que cada día 4 700 personas fallecen por TB y 28 500 enferman.

Ahora, la tuberculosis resistente a los medicamentos (MDR) es una gran epidemia

mundial, con medio millón de casos cada año. La TB extremadamente resistente a los
medicamentos (XDR) se ha notificado en todo el mundo e implica resistencia al menos
a cuatro fármacos de primera línea y de segunda línea para la TB, lo que limita las
opciones de tratamiento, exigiendo regímenes terapéuticos complejos, tóxicos y
costosos. Las tasas de éxito del tratamiento son inferiores al 40% en la mayoría de las
poblaciones de pacientes, y las tasas de muerte son del 50 al 80%.
 La TB-MDR está presente en todo el mundo

Y la TB-MDR se transmite

Tradicionalmente, se ha pensado que la TB resistente a los medicamentos se

desarrolla como resultado de la presión de selección con el tratamiento inadecuado de
la tuberculosis, el cumplimiento incompleto del tratamiento o las concentraciones sub-
terapéuticas de fármaco (resistencia adquirida): sin embargo, la TB-XDR también
puede ser causada por una infección directa con una cepa resistente (resistencia
transmitida).

En muchas partes del mundo, el

fracaso del tratamiento no es el
principal problema para controlar la TB-
MDR/XDR, sino los contactos sociales
(transmisión), hecho identificado por
técnicas como RFLP (polimorfismos en
la longitud de los fragmentos de restricción), MIRU (unidades micobacterianas
repetitivas intercaladas) o WGS (secuenciación completa del genoma).

Sudáfrica tiene la mayor de TB y TM-MDR en el mundo. La epidemia de TB-

MDR/XDR es simultánea a la infección por el VIH; las tasas de coinfección superan el
70% con tasas de supervivencia a largo plazo inferiores al 20%. El 69% -80% de los
casos se deben a la transmisión reciente de cepas TB-MDR/XDR (brotes de
transmisión > 200 casos). El hallazgo de casos activos debe combinarse con un
tratamiento efectivo rápido para detener la transmisión.

Shah NS, et al. Transmission of extensively drug-resistant tuberculosis in South Africa.

N Engl J Med 2017; 376:243-253. doi: 10.1056/NEJMoa1604544

Necesidades en marcha
Modernizar los DOTS, nuevas técnicas diagnósticas, nuevos fármacos, nuevas
vacunas y nuevos enfoques epidemiológicos.
 En
la terapias se está mejorando el DOTS con la incorporación de nuevos
antituberculosos, desde 2013, como bedaquilina y delamanida. La vacuna BCG
proporciona una protección incompleta contra la tuberculosis en los niños pequeños,
por lo que se están diseñando nuevas vacunas, entre ellas la del virus modificado de
Vaccinia Ankara que expresa el antígeno 85A (MVA85A), para mejorar la eficacia
protectora de la BCG; en los lactantes, MVA85A ha sido bien tolerada e indujo
respuesta inmunitaria celular, aunque baja. Tanto para el diagnóstico como para
estudios epidemiológicos es un gran avance la aplicación de técnicas moleculares,
desde el nuevo sistema GenExpert®-MTB/RIF hasta la secuenciación completa del
genoma que permite simultáneamente alta resolución para la epidemiología molecular
y la detección de la resistencia a fármacos antituberculosos.

Debido a que los patógenos bacterianos genéticamente monomórficos albergan

poca diversidad de secuencias de ADN, la mayoría de las técnicas actuales de
genotipado utilizadas para estudiar su epidemiología se basan en elementos genéticos
móviles o repetitivos. Los marcadores moleculares comúnmente utilizados en estas
bacterias incluyen repeticiones palindrómicas cortas reguladoras agrupadas (CRISPR)
y repeticiones en tándem de número variable (VNTR). Estos métodos también se
están aplicando cada vez más a estudios filogenéticos y de genética de poblaciones.
Los árboles filogenéticos derivados de datos de secuencia multilocus son altamente
congruentes y estadísticamente significativos, independientemente de los métodos
filogenéticos utilizados; por el contrario, las filogenias correspondientes inferidas a
partir de spoligotyping o 15-loci-MIRU-VNTR son menos congruentes, detectando
menos linajes de células con respecto a los árboles basados en secuencias.

Esquema ilustrativo de los principios del genotipado basado en CRISPR y VNTR en

MTBC
Comas I, Gagneux S
(2009) The Past and
Future of Tuberculosis Research. PLoS Pathog5(10): e1000600.
https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000600

La secuenciación del genoma completo para un análisis profundo de la escala de la

micro-evolución intrapaciente e interpaciente, detecta que la cantidad de variación
acumulada en un enfermo puede ser tan alta como la observada entre los enfermos a
lo largo de una cadena de transmisión, lo que alerta sobre las dificultades de
establecer umbrales para diferenciar la relación en M. tuberculosis con fines
epidemiológicos.

Redes de unión mediana para aislamientos de M. tuberculosis muestreados

simultáneamente del mismo enfermo que muestran microevolución.
Pérez-Lago L, et al. Whole genome sequencing analysis of intrapatient microevolution in
Mycobacterium tuberculosis: Potential impact on the inference of tuberculosis transmission. JID
2014; 209: 98-108.

El diagnóstico de la farmacorresistencia sigue siendo un obstáculo para la

eliminación de la tuberculosis. La prueba de sensibilidad fenotípica a los fármacos es
lenta y costosa, y los ensayos genotípicos comerciales solo detectan mutaciones
comunes determinantes de la resistencia. La secuenciación del genoma completo para
caracterizar las mutaciones comunes y raras que predicen la resistencia a los
medicamentos de primera y de segunda línea identifica más mutaciones que otras
pruebas y es más sensible. Este enfoque podría integrarse en los flujos de trabajo de
diagnóstico habitual de los laboratorios, eliminando gradualmente las pruebas de
sensibilidad fenotípicas.

En el siguiente esquema se muestran los fenotipos sensibles y resistentes de 2099

aislados de MT. La sensibilidad fue del 92,3%, la especificidad del 98,4% y se
perdieron 10,8% mutantes de los fenotipos.

La predicción de la sensibilidad fue de 85,3% para la isoniacida, 92,7% para la

rifampicina, 82% para el etambutol y 24% para la pirazinamida.

Walker TM, et al. Whole-genome sequencing for prediction of Mycobacterium tuberculosis drug
susceptibility and resistance: a retrospective cohort study. Lancet Infect Dis 2015; 15:1193-
202. doi: 10.1016/S1473-3099(15)00062-6.

L. J. Pankhurst y cols. demostraron en un estudio prospectivo en 8 hospitales de Unión

Europea, la rapidez diagnóstica, completa y asequible de MTB con la secuenciación
del genoma completo. El 93% de las micobacterias concordaron, como especie, con la
identificación habitual del laboratorio, así como el 93% de las predicciones de
sensibilidad, siendo el proceso un 7% más barato que los métodos habituales.

Las mejoras continuas en el procesamiento de micobacterias, la bioinformática y el

análisis mejorarán la precisión, la velocidad y el alcance del diagnóstico basado en
WGS.

Pankhurst LJ, et al. Rapid, comprehensive, and affordable mycobacterial diagnosis

with whole-genome sequencing: a prospective study. Lancet Respir Med 2016; 4: 49-
58. doi: http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00466-X

Según el CrypTic (Consortium Comprehensive Resistance Prediction for

Tuberculosis), un consorcio internacional de colaboración mundial entre las
instituciones de investigación de la tuberculosis (TB) para lograr un tratamiento mejor,
más rápido y más específico de la TB-MDR por medio de la predicción de la
resistencia genética, la WSG tiene un buen rendimiento para detectar mutaciones de
resistencia a los fármacos, por encima de los estándares de aprobación de la OMS
para los de primera línea, aunque tiene limitaciones para los de segunda línea.

La edición de 2014 de TB Diagnostics Technology and Market Landscape Report de

UNITAID, iniciativa internacional que promueve el acceso al tratamiento de
enfermedades como el sida, paludismo y la TB en poblaciones de países en vías de
desarrollo, identificó 191 productos de diagnóstico de tuberculosis comercialmente
disponibles o en desarrollo. Estos productos van desde diagnósticos asistidos por
computadora utilizados junto con radiografía digital hasta nuevas técnicas basadas en
biomarcadores, como compuestos orgánicos volátiles. Las diferentes técnicas se
pueden resumir así:

Técnicas no moleculares
- Nuevos sistemas de microscopía e imágenes
- Técnicas basadas en cultivos
- Técnicas basadas en biomarcadores

Técnicas moleculares
- Ensayos de sonda en línea
- Plataformas de micromatrices modulares (en cartuchos y automáticas)
- Pruebas basadas en ácidos nucleicos para su uso en laboratorios de
 categoría inferior
- Métodos de secuenciación

Una de los sistemas, el GenXpert-MTB/RIF©, en los últimos 5 años, ha

demostrado ser un gran avance para mejorar el diagnóstico. Esta revisión
describe los avances en el diagnóstico molecular y no molecular y su potencial
para llenar los vacíos en la detección de casos de TB.
UNITAID, Tuberculosis: diagnostic, technology and market land scape. 2014, WHO: Geneva. p.
1–42.

Pipeline of TB molecular diagnostics. Source: UNITAID 2014 (Reference 3) (reproduced with

permission from UNITAID)

Ghiasi M, ety al. Advances in Tuberculosis Diagnostics. Curr Trop Med Rep 2015; 2: 54-61.
doi: 10.1007/s40475-015-0043-1.

¿Están las MT-MDR/XDR tomando el control?

Tanto por ciento de casos MDR entre los casos nuevos de TB

La secuenciación del genoma completo de las cepas de MT resistentes a la
rifampicina identifica mutaciones compensatorias en los genes de la ARN
polimerasa

Existe un conjunto de mutaciones compensatorias en los genes de la ARN

polimerasa de M. tuberculosis resistente a la rifampicina. Las cepas que albergan
estas mutaciones compensatorias muestran alta competitividad in vitro e in vivo, según
lo determinado por el examen de su frecuencia clínica relativa a través de las
poblaciones de enfermos. En los países con la incidencia más alta del mundo de TB-
MDR, más del 30% de los aislados clínicos de MDR tienen esta forma de mutación, lo
que pone de manifiesto la evolución compensatoria en las epidemias globales de TB-
MDR.

Las cepas que albergan una posible mutación compensatoria están asociadas a
mayor competencia y tratamientos más prolongados

En el mundo real, de una colección de cepas de países con baja carga global de
aislados TB-MDR, se detectaron 117 cepas MDR de 5 linages diferentes y 176 cepas
sensibles de 6 lineages, mientras que existen otras áreas con alta carga de aislados
MDR, como Georgia (25,2%), Kazakhstan (35%) y Uzbekistan (32%).

Las mutaciones compensatorias putativas son más frecuentes en las áreas de alta
carga de MDR. Una pregunta es ¿sí están vinculadas a una mayor competitividad y
transmisión? Parece que sí, según estudios llevados a cabo en Rusia, Sudáfrica y
China.

Comas I, et al. Whole-genome sequencing of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis

strains identifies compensatory mutations in RNA polymerase genes. Nature Genetics 2012;
44: 106–110. doi:10.1038/ng.1038

Casali N, et al.Evolution and transmission of drug-resistant tuberculosis in a Russian

population. Nat Genet 2014; 46:279-286. doi: 10.1038/ng.2878.

Perspectivas para el tratamiento personalizado con fármacos

 Uso racional de terapias al inicio del tratamiento: Secuenciación del esputo y/o
MGIT

 Control de la resistencia a los medicamentos para evitar fallos/recaídas:

Identificación de mutaciones de resistencia y detección temprana de
 heterorresistencia

Es importante tener en cuenta la complejidad de la tuberculosis, con diferentes

nichos (por ejemplo pulmón) y la heteroresistencia de MT.

Un caso clínico ilustrativo es el de un sujeto que se describe en las imágenes

siguientes:
 La recaída se debió a un fallo en la detección de mutantes resistentes que ya
existían en 2013, pero no se diagnosticó XDR hasta octubre de 2014 cuando se
secuenció el genoma completo. El diagnóstico fallo por la complejidad de algunas
pruebas diagnósticas y la variabilidad de los genes de MT que confieren la resistencia.

Esto lleva a considerar las enormes consecuencias de la falta de identificación de

una cepa MDR/XDR, la necesidad de incorporar pruebas moleculares al inicio, ampliar
el catálogo de mutaciones de resistencia (Cryptic, ReseqTB, etc.), y la necesidad de
educar y comunicarse con los médicos en la interpretación de las mutaciones de
resistencia.

Posible escenario epidemiológico del 2º episodio basado la WSG:

De esto se desprenden consideraciones para un tratamiento personalizado:

 Detección temprana de la infección y

resistencias, método, y tipo de muestra.
 Diversidad de las diferentes muestras para
amplificar los genes adecuados y su
secuenciación.
 Catálogo de mutaciones asociado a las
resistencias.
 Tener en cuenta la complejidad de la interpretación de la heterorresistencia.
 Heterogeneidad en todas partes: génica, de la lesión, penetración de los
fármacos.
 Aproximar los resultados del laboratorio a la cabecera del enfermo.
 Resumen / Mensajes a tener en cuenta

La epidemiología molecular muestra la transmisión entre individuos como un

importante impulsor de la epidemia de TB-MDR.

La secuenciación del genoma completo es un método importante en el diagnóstico

Hay necesidad de investigar más sobre las bases génicas de las resistencias para
comprender la biología y de la TB y el diagnóstico.

Están en marcha esfuerzos globales de colaboración para avanzar en la WGS

liderado por la OMS, B & M Gates y FIND Dx (implementado por el NHS) y eliminar
gradualmente pruebas diagnósticas y de sensibilidad menos eficientes.