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ÁREA TEMÁTICA: Área 3 - Reciclagem

Extração e caracterização de celulases produzidas por


Trichoderma reesei LCB 48 na fermentação semissólida da
biomassa da coroa do abacaxi (Ananas comosus L. Merril)
Mariana Sales Carvalhor1 (marianasalescarvalho3@gmail.com), Carlos Alberto Bispo de Sousa1
(carlobispo@gmail.com), Carolina Zanini Oliveira1 (carolinazaninioliveira@gmail.com)
1 Universidade Federal da Paraíba

RESUMO

O processamento do abacaxi gera como resíduos a casca e a coroa, que se descartados de forma
inadequada podem gerar problemas ambientais e a proliferação de vetores transmissores de
doenças. Tal biomassa pode ser aplicada na obtenção de biomoléculas de interesse industrial via
processos fermentativos, onde atua como suporte, indutor, fonte de carbono e nutrientes para os
microrganismos utilizados. As enzimas celulases são aplicadas em processos de sacarificação de
materiais lignocelulósicos para obtenção de açúcares fermentescíveis, destinados a produção de
bioetanol. Contudo, seu custo de produção é elevado, havendo a necessidade de se utilizar
processos alternativos e economicamente viáveis. O objetivo deste trabalho foi obter e caracterizar
celulases produzidas pelo fungo filamentoso Trichoderma reesei LCB 48 na fermentação
semissólida da biomassa da coroa do abacaxi. Após a fermentação, foi realizado um estudo de
extração para avaliar a melhor relação solvente/substrato na extração das enzimas. O extrato bruto
obtido foi caracterizado quanto a temperatura ótima, pH ótimo, termoestabilidade e estabilidade ao
pH para atividade das enzimas carboximetilcelulase (CMCase) e Fpase. A melhor relação
solvente/substrato foi de 30 mL de tampão por grama de substrato. Ambas enzimas apresentaram
temperatura ótima de 50°C e o pH ótimo em 5,0. As enzimas apresentaram estabilidade entre 40° C
e 50°C. A CMCase apresentou melhor estabilidade em pH 4,0 e a Fpase em pH 3,0. A biomassa da
coroa do abacaxi mostrou-se adequada para a produção de celulases por fermentação semissólida.

Palavras-chave: Enzimas celulolíticas; Coroa de abacaxi; Caracterização.

Extraction and characterization of cellulases produced by Trichoderma


reesei LCB 48 in the semi-solid fermentation of pineapple crown biomass
(Ananas comosus L. Merril)
ABSTRACT
Pineapple processing generates as bark and crown waste, which if improperly disposed of can
generate environmental problems and the proliferation of vectors that transmit disease. Such
biomass can be applied in the production of biomolecules of industrial interest via fermentative
processes, where it acts as carrier, inducer, carbon source and nutrients for the microorganisms
used. The enzymes cellulases are applied in processes of saccharification of lignocellulosic materials
to obtain fermentable sugars, destined to the production of bioethanol. However, its cost of
production is high, necessitating the use of alternative and economically viable processes. The
objective of this work was to obtain and characterize cellulases produced by the fungus Trichoderma
reesei LCB 48 in the semisolid fermentation of pineapple crown biomass. After the fermentation, an
extraction study was performed to evaluate the best solvent / substrate ratio in the solid-liquid
extraction of the enzymes. The crude extract obtained from the best extraction condition was
characterized in terms of optimum temperature, optimum pH, thermostability and pH stability for
carboxymethylcellulose (CMCase) and Fpase (amorphous cellulose activity) enzymes. The best
solvent / substrate ratio was 30 ml of buffer per gram of substrate. For both enzymes the optimum
temperature was 50Â ° C and the optimum pH was 5.0. The enzymes showed good stability between
40 ° C and 50 ° C. CMCase showed better stability at pH 4.0 and Fpase at pH 3.0. The pineapple
crown biomass proved to be a suitable material for the production of cellulases.

Keywords: Cellulolytic enzymes; Pineapple crown; Description.


1. INTRODUÇÃO

As enzimas celulases formam um complexo capaz de atuar sobre materiais celulósicos,


promovendo sua hidrólise (CASTRO E PEREIRA JUNIOR, 2010). A celulose é uma fonte de
energia renovável, o que possibilita a sua utilização como alternativa de substituição de fontes
energéticas utilizadas atualmente (ALAM et al., 2009).
O uso das enzimas está presente nas mais diversas, como a indústrias de papel e celulose, a
indústria têxtil, indústria de alimentos, indústria de ração animal, entre outras, que as utilizam nos
seus processos (KUHAD et al., 2011). Mas há um destaque em seu uso na produção de bioetanol,
processo no qual a enzima atua promovendo a sacarificação de materiais lignocelulósicos pra
obtenção de açúcares fermentescíveis.
A sua obtenção dá-se a partir de fungos filamentosos, como o Trichoderma reesei, em
processos de fermentação submersa ou em estado sólido. A fermentação em estado sólido oferece
vantagens em relação à fermentação submersa, pois ocorre na ausência de água livre, as
condições de crescimento do fungo são similares às que ocorrem naturalmente, apresenta alta
produtividade, utiliza pouca energia e pode empregar resíduos agroindustriais como fonte de
carbono e suporte microbiano (MONTEIRO E SILVA, 2009). Porém, o processo para obtenção da
enzima celulase ainda não é economicamente viável devido ao custo elevado. Por isso, é
necessário o desenvolvimento de processos fermentativos que produzam extratos enzimático de
baixo custo, com alta concentração de celulases, elevada atividade enzimática e estabilidade as
condições de temperatura e pH para sua utilização.
O Brasil é o maior produtor mundial de abacaxi. O Estado da Paraíba destaca-se como o
segundo maior produtor nacional, contribuindo com 16,13% da produção. Produzindo
principalmente a espécie Ananas comosus L. Merril. O resíduo gerado da produção do fruto é
constituído pela casca e coroa, que são geralmente descartados. Considerando que o peso da
coroa é aproximadamente 10% do peso total do fruto, pode-se estimar que em todo o brasil foram
produzidos em 2016 cerca de 175.636 toneladas de coroa (IBGE, 2017).
Visando a diminuição dos impactos ambientais causados pelo descarte inapropriado dos
resíduos agroindustriais, estes podem ser utilizados como fonte de carbono, nutrientes e suporte
em processos fermentativos para obtenção de biomoléculas de interesse industrial (AMORIM,
2010).
Uma vez obtidas as enzimas, é importante caracterizá-las quanto ao pH e temperatura
ótimos de atividade, e determinar sua estabilidade frente a variações de temperatura e pH para que
sejam determinados os parâmetros dos processos nos quais tais enzimas podem ser empregadas.
Esse trabalho teve por objetivo estudar as melhores condições de temperatura e pH para
utilização da enzima celulases produzidas a partir da fermentação em estado sólido da biomassa
da coroa do abacaxi utilizando o microrganismo Trichordema reesei LCB-48 como agente
fermentativo. Foram realizadas análises de temperatura e pH ótimos para sua aplicação, assim
como também sua estabilidade a temperatura e ao pH por meio de análise de atividade enzimática
expressa como carboximetilcelulase (CMCase) e FPase (atividade sobre celulose amorfa).

2. OBJETIVO

2.1 Objetivo geral


Extrair e caracterizar o extrato enzimático produzido por Trichoderma reesei LCB-48
utilizando a coroa de abacaxi como substrato.
2.2 Objetivos específicos

 Promover a fermentação semissólida da biomassa da coroa do abacaxi para obtenção de


enzimas celulolíticas.
 Obter o extrato fermentado bruto e estudar a influência da relação solvente/substrato em
sua obtenção.
 Caracterizar as enzimas presentes no extrato bruto quanto ao pH e temperatura ótimos,
estabilidade ao pH e termoestabilidade

3. METODOLOGIA

3.1 Obtenção da biomassa da coroa do abacaxi


A coroa do abacaxi utilizado nessa pesquisa foi proveniente de abacaxis pérola (Ananas
comosus (L) Merril) adquiridos no comércio da cidade de João Pessoa-PB. A coroa foi recolhida,
cortada, e seca em estufa a 60°C. Após secagem, a biomassa resultante foi triturada em moinho
de facas (10 mesh) e acondicionada em frasco hermeticamente fechado.

3.2 Microrganismo e inóculo

Como agente fermentativo foi utilizado o fungo filamentoso Trichoderma reesei LCB-48. O
microrganismo foi repicado em meio de arroz, segundo Lins e Conrado (2015). O inóculo foi
preparado adicionando-se 40mL de uma solução de Tween 80 a 0,3% (v/v) no frasco contendo
repique em arroz. Após agitação, a suspensão de esporos foi filtrada em algodão, e teve sua
concentração de esporos determinada através de contagem em Câmara de Neubauer melhorada.

3.3 Processo fermentativo

O resíduo da coroa do abacaxi foi previamente hidratado à 90% com água destilada, o que
representa de 0,90 de atividade de água a 30 °C, sendo esta uma condição adequada para o
desenvolvimento de microrganismos na coroa do abacaxi (Alexandre et al, 2014). O meio foi
suplementado com adição de (NH4)2SO4 correspondente a 1% em relação a massa úmida. Em
seguida, transferiu-se 10 gramas do meio úmido para erlenmeyers de 250mL de capacidade, os
quais foram tampados com rolha de algodão e autoclavados a 121°C por 15 minutos. Após
esfriamento, foram inoculados 107 esporos de Trichoderma reesei LCB-48 por grama de meio
úmido em cada erlenmeyer. O processo foi conduzido por 5 dias.

3.4 Determinação de atividade CMCase e FPase

A atividade CMCase foi determinada por meio de análise de açúcares redutores gerado por
cada amostra a partir da reação do extrato enzimático e uma solução de carboximetilcelulose
(GHOSE, 1987). A atividade de FPase foi determinada quantificando-se os açúcares redutores
gerados em cada amostra a partir da reação do extrato enzimático com papel de filtro (GHOSE,
1987).
A unidade de atividade enzimática (U), para cada enzima, foi definida como sendo a
quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de glicose, por minuto nas condições de
ensaio. Neste trabalho, a atividade enzimática foi expressa em unidade por milímetro de extrato
enzimático, U/mL.

3.5 Influência do volume do solvente na extração

Para determinação da melhor relação entre tampão citrato e meio fermentado para
recuperação das enzimas foram realizados ensaios utilizando proporções de tampão citrato, 0,05
Mol.L-1 pH 4,8 nas quantidades de 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, por cada grama de
meio fermentado. Após 30 minutos sob agitação foi realizada uma extração sólido-líquido por meio
de filtração com algodão, obteve-se então o extrato enzimático bruto. Em seguida foram
realizadas análises de atividade celulolíticas segundo o protocolo de GHOSE (1987) para
determinação da melhor relação solvente (mL)/meio fermentado (g).

3.6 Temperatura ótima


Para a determinação da melhor temperatura para utilização da enzima celulase cada amostra foi
incubada em uma temperatura diferente, com pH fixado em 4,8 utilizando tampão citrato 0,05
Mol.L-1. Em seguida, realizou-se a análise de atividade enzimática, segundo o protocolo de
GHOSE (1987), sendo essa expressa em termos de atividade residual, considerando a maior
atividade como 100%. As temperaturas de incubação utilizadas nesse estudo foram de 30, 40, 50,
60, 70 ˚C.

3.7 pH ótimo
Para a determinação do melhor pH na atuação das enzimas a temperatura foi fixada no valor
encontrado como ótimo e cada amostra foi colocada em um pH, os valores de cada pH foram
obtidos por meio de tampão (citrato de sódio e fosfato de sódio monobásico e dibásico 50x10 -3
mol.L-1) nos valores de 3, 4 , 5, 6 , 7 e 8. A atividade para CMCase e FPase ocorreu segundo
GHOSE (1987), sendo expressa em termos de atividade residual.

3.8 Termoestabilidade
Para conhecer a estabilidade a temperaturas das enzimas as análises foram feitas segundo
OLIVEIRA (2017). O extrato enzimático foi incubado nas temperaturas de 40, 50, 60 e 70°C, por um
período de 90 minutos, sendo retirada amostras a cada 15 minutos, em seguida foi realizada análise
de atividade para CMCase e FPase.

3.9 Estabilidade ao pH
Para o estudo da estabilidade ao pH utilizou-se amostras de extrato enzimático contendo 5 mL
cada com 5 mL de solução tampão, para cada amostra foi utilizado tampão citrato 0,05 Mol.L -1 com
os valores 3.0, 4.0, 5.0 e 6,0. As amostras permaneceram em temperatura ambiente pelo período de
24 horas. Em seguida, corrigiu-se o pH das amostras para 4,8 e foram realizadas as análises de
atividade celulolítica para CMCase e FPase (GHOSE, 1987).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Influência do volume de solvente na extração

Os resultados de concentrações de atividade enzimática obtidos nos extratos durante a


variação das quantidades de solvente (tampão citrato) na extração sólido líquido mostraram que a
concentração de atividade enzimática não varia muito com a variação do volume de solvente.
Conforme pode ser visto na Figura 1.

Figura 1. Influência do volume de solvente na extração de enzimas

A aplicação do teste de Turkey mostrou que os valores presentes na Figura 1 apresentam


médias iguais, com 95% de confiança. Visto isso, a melhor relação entre solvente e substrato para
extração das enzimas celulases é de 30:1 pois, obtém-se uma quantidade maior de extrato com a
mesma atividade.
Estudando a extração de poligalacturonase, SOUSA (2010) verificou que a relação entre
solvente e substrato em diferentes volumes não alteram significativamente e que a melhor
proporção é o de maior volume de tampão por grama de substrato, até certo limite. Isso acontece
porque as enzimas são pouco solúveis e saturam facilmente o solvente. Usando pouco solvente,
deixa-se de recuperar parte das enzimas que ficam aderidas ao meio sólido. Uma quantidade maior
de solvente, resulta numa recuperação maior de enzimas, com semelhante concentração de
atividade.

4.2 Temperatura ótima

A Figura 2 mostra as temperaturas ótimas para as enzimas CMCase e FPase. Para a


enzima CMCase a temperatura encontrada como ótima foi de 50°C, após essa temperatura ocorre
o decaimento da atividade e em 70°C a redução chega a 22,8%. ALEIXO JÚNIOR (2014), em
estudos utilizando o resíduo do caju para produção de celulase a partir de T. reesei obteve a
mesma temperatura ótima. Os resultados obtidos nesse estudo concordam com os encontrados
por Akcapinar, Gul e Sezerman (2012) que estudando o efeito da temperatura de endoglucanases
produzidas por Trichoderma Reesei e Pichia pastoris encontraram que a temperatura ótima para
CMCase encontra-se entre 45°C e 55°C
Para a enzima FPase a temperatura ótima foi de 50°C e quando expostas temperaturas
maiores manteve grande parte da atividade em que em 70°C ainda tinha 63% da atividade
enzimática. Esse comportamento é devido a coexistências de várias enzimas que atuam em
diversas temperaturas, sendo em 70°C a temperatura de desnaturação de todas elas.
Comportamento esse bem semelhante ao encontrado por ALEIXO JÚNIOR (2014).

Figura 2. Temperatura ótima para as enzimas CMCase e FPase

4.3 pH ótimo

O pH ótimo de ambas as enzimas, foi de 5,0. Havendo decaimento da atividade a partir dese
ponto. Este comportamento é semelhante ao observado por SILVA (2008) que, caracterizando as
enzimas produzidas por Aspergillus phoenicis verificou aumento nas atividades em pH na faixa
ácida entre 3,0 e 5,0.
Figura 3. pH ótimo para as enzimas CMCase e FPase

4.4 Termoestabilidade

De acordo com o gráfico da Figura 4, para temperaturas de 40 e 50°C ocorre menor perda
de atividade. Na temperatura de 40°C temos 81% da sua atividade inicial após noventa minutos de
incubação. E para a temperatura de 50°C após o período de noventa minutos de incubação temos
cerca de 82% da atividade inicial.
Para a temperatura de 60°C nos primeiros 15 minutos a enzima perde cerca de 83% da
sua atividade inicial, mas, ao decorrer dos noventa minutos do processo percebe-se que quase
não há queda na sua atividade. De forma semelhante ocorre para a temperatura de 70°C em que
nos 15 minutos iniciais do processo em que há uma perda de cerca de 70% da atividade e se
mantem constante ao longo do tempo.
Comportamento semelhante foi observado por SILVA (2008) que estudando a produção e
caracterização das enzimas celulolíticas produzidas por Aspergillus phoenicis verificou que a
enzima CMCase não sofre uma perda significativa de sua atividade durante as 2 horas de
incubação.

Figura 4. Termoestabilidade para CMCase

A Figura 5 mostra os resultados para termoestabilidade para enzima FPase. Para a


temperatura de 40°C ao final do tempo e 90 minutos de incubação a enzima apresenta cerca
de 55% da atividade inicial, para 50°C observa-se uma queda de cerca de 58% da atividade
enzimática inicial.
Para as temperaturas de 60°C e 70°C nos primeiros 15 minutos a atividade enzimática há
uma diminuição acentuada e no final do período de incubação para as duas temperaturas há
menos de 15% da atividade enzimática inicial. Comportamento semelhante foi observado por
SILVA (2008) trabalhando com Aspergillus phoenicis, que a partir da temperatura de 60°C
observaram que há uma diminuição significativa a partir dos 5 primeiros minutos de incubação.

Figura 5. Termoestabilidade para FPase

4.5 Estabilidade ao pH
.
A atividade residual foi calculada em relação à atividade do extrato bruto incubado ao pH 4 no
qual foi atribuído como 100% (0,02988 U/mL) e as demais atividades em relação a ele. Pode ser
observado na Fig. 6 que o extrato enzimático incubado no pH 4 e 6 possuem os melhores valores
para atividade em CMCase em que o pH 6 tem cerca de 96%(0,028739) da atividade comparado ao
pH 4.
SOUSA (2014) estudando produção de celulases por Trichoderma reesei LCB 48 utilizando a
palma forrageira como substrato, observou que na faixa de pH entre 5 e 6,5 há um aumento na
atividade enzimática e após isso há uma forte redução e desativação da enzima.
Figura 6. Estabilidade ao pH para CMCase

Como pode ser visto na Fig. 7 houve uma maior estabilidade para o pH 3,0 (0,050864) após
isso percebe-se uma queda brusca de atividade em que o pH 4,0 possui apenas cerca de 43%
da atividade e o ph 6,0 tem-se 24% da atividade encontrada para o ph 3,0.
Santos et al (2014) estudando a produção de celulase a partir da palma forrageira a partir de
rhizopus sp. Verificou que a maior estabilidade da enzima fpase encontra-se na faixa entre 5 e 6
onde obtiveram valores maiores à 90% de atividade relativa em um período de 240 minutos.

Figura 7. Estabilidade ao pH para FPase.

5. CONCLUSÃO
A melhor relação solvente/meio fermentado para a extração sólido-líquido das
enzimas produzidas a partir de Trichoderma reesei LCB – 48 utilizando a coroa do abacaxi
como fonte indutora e suporte, foi de 30:1. As enzimas apresentaram temperatura ótima em
50°C e pH ótimo em 5,0. Tanto a atividade em carboximetilcelulase (CMCase) e celulose
amorfa (FPase) apresentaram boa estabilidade nas temperaturas de 40 e 50°C, sofrendo
grande desativação em temperaturas acima de 60°C. A biomassa da coroa do abacaxi
mostrou-se um material adequado para obtenção de celulases per fermentação semissólida.
6. REFERÊNCIAS

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