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RESUMO
O processamento do abacaxi gera como resíduos a casca e a coroa, que se descartados de forma
inadequada podem gerar problemas ambientais e a proliferação de vetores transmissores de
doenças. Tal biomassa pode ser aplicada na obtenção de biomoléculas de interesse industrial via
processos fermentativos, onde atua como suporte, indutor, fonte de carbono e nutrientes para os
microrganismos utilizados. As enzimas celulases são aplicadas em processos de sacarificação de
materiais lignocelulósicos para obtenção de açúcares fermentescíveis, destinados a produção de
bioetanol. Contudo, seu custo de produção é elevado, havendo a necessidade de se utilizar
processos alternativos e economicamente viáveis. O objetivo deste trabalho foi obter e caracterizar
celulases produzidas pelo fungo filamentoso Trichoderma reesei LCB 48 na fermentação
semissólida da biomassa da coroa do abacaxi. Após a fermentação, foi realizado um estudo de
extração para avaliar a melhor relação solvente/substrato na extração das enzimas. O extrato bruto
obtido foi caracterizado quanto a temperatura ótima, pH ótimo, termoestabilidade e estabilidade ao
pH para atividade das enzimas carboximetilcelulase (CMCase) e Fpase. A melhor relação
solvente/substrato foi de 30 mL de tampão por grama de substrato. Ambas enzimas apresentaram
temperatura ótima de 50°C e o pH ótimo em 5,0. As enzimas apresentaram estabilidade entre 40° C
e 50°C. A CMCase apresentou melhor estabilidade em pH 4,0 e a Fpase em pH 3,0. A biomassa da
coroa do abacaxi mostrou-se adequada para a produção de celulases por fermentação semissólida.
2. OBJETIVO
3. METODOLOGIA
Como agente fermentativo foi utilizado o fungo filamentoso Trichoderma reesei LCB-48. O
microrganismo foi repicado em meio de arroz, segundo Lins e Conrado (2015). O inóculo foi
preparado adicionando-se 40mL de uma solução de Tween 80 a 0,3% (v/v) no frasco contendo
repique em arroz. Após agitação, a suspensão de esporos foi filtrada em algodão, e teve sua
concentração de esporos determinada através de contagem em Câmara de Neubauer melhorada.
O resíduo da coroa do abacaxi foi previamente hidratado à 90% com água destilada, o que
representa de 0,90 de atividade de água a 30 °C, sendo esta uma condição adequada para o
desenvolvimento de microrganismos na coroa do abacaxi (Alexandre et al, 2014). O meio foi
suplementado com adição de (NH4)2SO4 correspondente a 1% em relação a massa úmida. Em
seguida, transferiu-se 10 gramas do meio úmido para erlenmeyers de 250mL de capacidade, os
quais foram tampados com rolha de algodão e autoclavados a 121°C por 15 minutos. Após
esfriamento, foram inoculados 107 esporos de Trichoderma reesei LCB-48 por grama de meio
úmido em cada erlenmeyer. O processo foi conduzido por 5 dias.
A atividade CMCase foi determinada por meio de análise de açúcares redutores gerado por
cada amostra a partir da reação do extrato enzimático e uma solução de carboximetilcelulose
(GHOSE, 1987). A atividade de FPase foi determinada quantificando-se os açúcares redutores
gerados em cada amostra a partir da reação do extrato enzimático com papel de filtro (GHOSE,
1987).
A unidade de atividade enzimática (U), para cada enzima, foi definida como sendo a
quantidade de enzima necessária para liberar 1 µmol de glicose, por minuto nas condições de
ensaio. Neste trabalho, a atividade enzimática foi expressa em unidade por milímetro de extrato
enzimático, U/mL.
Para determinação da melhor relação entre tampão citrato e meio fermentado para
recuperação das enzimas foram realizados ensaios utilizando proporções de tampão citrato, 0,05
Mol.L-1 pH 4,8 nas quantidades de 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, por cada grama de
meio fermentado. Após 30 minutos sob agitação foi realizada uma extração sólido-líquido por meio
de filtração com algodão, obteve-se então o extrato enzimático bruto. Em seguida foram
realizadas análises de atividade celulolíticas segundo o protocolo de GHOSE (1987) para
determinação da melhor relação solvente (mL)/meio fermentado (g).
3.7 pH ótimo
Para a determinação do melhor pH na atuação das enzimas a temperatura foi fixada no valor
encontrado como ótimo e cada amostra foi colocada em um pH, os valores de cada pH foram
obtidos por meio de tampão (citrato de sódio e fosfato de sódio monobásico e dibásico 50x10 -3
mol.L-1) nos valores de 3, 4 , 5, 6 , 7 e 8. A atividade para CMCase e FPase ocorreu segundo
GHOSE (1987), sendo expressa em termos de atividade residual.
3.8 Termoestabilidade
Para conhecer a estabilidade a temperaturas das enzimas as análises foram feitas segundo
OLIVEIRA (2017). O extrato enzimático foi incubado nas temperaturas de 40, 50, 60 e 70°C, por um
período de 90 minutos, sendo retirada amostras a cada 15 minutos, em seguida foi realizada análise
de atividade para CMCase e FPase.
3.9 Estabilidade ao pH
Para o estudo da estabilidade ao pH utilizou-se amostras de extrato enzimático contendo 5 mL
cada com 5 mL de solução tampão, para cada amostra foi utilizado tampão citrato 0,05 Mol.L -1 com
os valores 3.0, 4.0, 5.0 e 6,0. As amostras permaneceram em temperatura ambiente pelo período de
24 horas. Em seguida, corrigiu-se o pH das amostras para 4,8 e foram realizadas as análises de
atividade celulolítica para CMCase e FPase (GHOSE, 1987).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.3 pH ótimo
O pH ótimo de ambas as enzimas, foi de 5,0. Havendo decaimento da atividade a partir dese
ponto. Este comportamento é semelhante ao observado por SILVA (2008) que, caracterizando as
enzimas produzidas por Aspergillus phoenicis verificou aumento nas atividades em pH na faixa
ácida entre 3,0 e 5,0.
Figura 3. pH ótimo para as enzimas CMCase e FPase
4.4 Termoestabilidade
De acordo com o gráfico da Figura 4, para temperaturas de 40 e 50°C ocorre menor perda
de atividade. Na temperatura de 40°C temos 81% da sua atividade inicial após noventa minutos de
incubação. E para a temperatura de 50°C após o período de noventa minutos de incubação temos
cerca de 82% da atividade inicial.
Para a temperatura de 60°C nos primeiros 15 minutos a enzima perde cerca de 83% da
sua atividade inicial, mas, ao decorrer dos noventa minutos do processo percebe-se que quase
não há queda na sua atividade. De forma semelhante ocorre para a temperatura de 70°C em que
nos 15 minutos iniciais do processo em que há uma perda de cerca de 70% da atividade e se
mantem constante ao longo do tempo.
Comportamento semelhante foi observado por SILVA (2008) que estudando a produção e
caracterização das enzimas celulolíticas produzidas por Aspergillus phoenicis verificou que a
enzima CMCase não sofre uma perda significativa de sua atividade durante as 2 horas de
incubação.
4.5 Estabilidade ao pH
.
A atividade residual foi calculada em relação à atividade do extrato bruto incubado ao pH 4 no
qual foi atribuído como 100% (0,02988 U/mL) e as demais atividades em relação a ele. Pode ser
observado na Fig. 6 que o extrato enzimático incubado no pH 4 e 6 possuem os melhores valores
para atividade em CMCase em que o pH 6 tem cerca de 96%(0,028739) da atividade comparado ao
pH 4.
SOUSA (2014) estudando produção de celulases por Trichoderma reesei LCB 48 utilizando a
palma forrageira como substrato, observou que na faixa de pH entre 5 e 6,5 há um aumento na
atividade enzimática e após isso há uma forte redução e desativação da enzima.
Figura 6. Estabilidade ao pH para CMCase
Como pode ser visto na Fig. 7 houve uma maior estabilidade para o pH 3,0 (0,050864) após
isso percebe-se uma queda brusca de atividade em que o pH 4,0 possui apenas cerca de 43%
da atividade e o ph 6,0 tem-se 24% da atividade encontrada para o ph 3,0.
Santos et al (2014) estudando a produção de celulase a partir da palma forrageira a partir de
rhizopus sp. Verificou que a maior estabilidade da enzima fpase encontra-se na faixa entre 5 e 6
onde obtiveram valores maiores à 90% de atividade relativa em um período de 240 minutos.
5. CONCLUSÃO
A melhor relação solvente/meio fermentado para a extração sólido-líquido das
enzimas produzidas a partir de Trichoderma reesei LCB – 48 utilizando a coroa do abacaxi
como fonte indutora e suporte, foi de 30:1. As enzimas apresentaram temperatura ótima em
50°C e pH ótimo em 5,0. Tanto a atividade em carboximetilcelulase (CMCase) e celulose
amorfa (FPase) apresentaram boa estabilidade nas temperaturas de 40 e 50°C, sofrendo
grande desativação em temperaturas acima de 60°C. A biomassa da coroa do abacaxi
mostrou-se um material adequado para obtenção de celulases per fermentação semissólida.
6. REFERÊNCIAS
ALAM, Md. Z.; MAMUN, A. A.; QUDSIEH, I. Y; MUYIBI, S. A.; SALLEH, H. M.; OMAR, N. M.
Solid state bioconversion of oil palm empty fruit bunches for cellulose enzyme production
using a rotary drum bioreactor. Biochemical Engineering Journal, 2008.
IBGE. Levant. Sistem. Prod. Agríc. Rio de Janeiro v.30 n.2 p.1-83 fevereiro.2017
KUHAD, R. C.; GUPTA, R.; Singh, A. Microbial Cellulases and Their Industrial Applications.
Enzyme Research, vol. 2011, p. 1-11, 2011
www.firs.institutoventuri.org.br
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