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Livro Eletrônico

Aula 15

Biologia p/ SEDUC-CE (Professor - Biologia) - Pós-Edital

Wagner Luiz Heleno Marcus Bertolini

11644521776 - Bruno Nogueira de Barros


Wagner Luiz Heleno Marcus Bertolini QUÍMICA
Aula 15
TEORIA E EXERCÍCIOS COMENTADOS
Prof. WAGNER BERTOLINI

Microscopia Ótica e Eletrônica.

CONTEÚDO PÁG.
1. Conversa com o concursando 01
2. Microscopia 02
3.Microscopia Ótica 03
4. Microscopia eletrônica 11
5. Questões 30

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1. CONVERSA COM O CONCURSANDO

Olá, meus caros alunos.


Vou buscar ser o mais objetivo possível ao estudar este tema. Vou,
como se costuma dizer, ir direto ao alvo das questões.
É um assunto que, pelo que observo nas bancas de concursos, cobra
os fundamentos e as características mais importantes. Não
costumamos ver detalhes ou se cobrar uma informação muito técnica.
Geralmente o que é pedido são os diferentes fundamentos das
diferentes técnicas; as características de cada uma delas, etc.
Por isto, vamos ao que realmente interessa.
Tive falado, meus cabras.

2. MICROSCOPIA

A palavra microscópio é de origem grega (micros =pequeno, scopein


=observar, olhar com atenção). É um instrumento óptico que amplia

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a imagem de um pequeno objeto utilizando um sistema de lentes e


fontes de iluminação.
Todo microscópio é composto de partes mecânicas e partes ópticas
que, juntas, nos permitem a observação detalhada de materiais em
estudo.

E qual seria o fundamento desta criança?


Um objeto torna-se visível ao microscópio como resultado de sua
interação com as ondas de luz usadas para iluminá-lo. Essa interação
ocasiona um desvio das ondas quando estas passam pelo objeto.
Objetos muito pequenos não ocasionarão quaisquer desvios
detectáveis nas ondas e, portanto, permanecerão invisíveis (ou não
resolvidos). Quanto menor o comprimento de onda da luz, menor
será o objeto que poderá ocasionar desvios das ondas e, portanto,
melhor será o poder resolvente do microscópio. Isto significa que a
natureza da luz limita a quantidade de detalhes que pode ser resolvida
em um microscópio.

Para que serve um microscópio?

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O microscópio serve para gerar um aumento daquilo que pretendemos


analisar, “ver”, mas, que ficaria muito difícil (ou impossível) usando
apenas a nossa limitadíssima visão do olho humano, sob o ponto de
vista do tamanho das partículas ou do material de análise.
Muitas vezes nos deparamos com pessoas (de forma geral as mais
idosas, devido à perda natural da visão com o decorrer do tempo) em
livrarias, por exemplo, usando lupas para facilitar a leitura.
Uma perguntinha: você já teve dificuldades em ler informações de
rótulos de embalagens de alimentos ou bulas de remédios?
Há muitos anos muitos cientistas buscaram observar estruturas
encontradas na natureza, tais como as células ou outros materiais
biológicos.
A partir deste interesse, tanto pessoal, como profissional ou científico,
foram desenvolvidos os microscópios, denominados de microscópio
óptico.
Este passou a ser uma amplificação da observação a olho nu e
representou papel importante no surgimento das Ciências da natureza,
tanto das ciências biológicas, como a histologia, anatomia,
mineralogia, geologia, etc.
Em resumo: o microscópio serve para ampliar o tamanho dos objetos
ou materiais que gostaríamos de “enxergar melhor e maior”.
Vamos, portanto, conhecer as características dos microscópicos
ópticos comuns, simples e a dos mais elaborados, mais robustos.
Depois, os mais modernos, que são os microscópios eletrônicos.

3. MICROSCOPIA ÓPTICA

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Temos o microscópio óptico comum, que se apresenta como o tipo mais


simples de microscópio.
O microscópio de luz é composto por uma parte mecânica, que serve
de suporte; uma parte óptica, que amplia o objeto visualizado, e uma
fonte de iluminação, que consiste na luz comum, o que justifica o seu
nome.
Temos na sua estrutura:
- uma lente de aumento, que permite a observação de estruturas com
diversas vezes de aumento;
- é empregado para a observação de grãos e minérios, de superfícies
de fratura de metais, de amostras de fibras têxteis, papel e outros
produtos da indústria química e metalúrgica.

Os microscópios “compostos” são instrumentos mais poderosos no que


se refere à capacidade de aumento.
Estes permitem desde a observação permitindo aumentos de algumas
dezenas de vezes até um máximo de 1500 a 2000 vezes, o limite da
observação com luz visível. Como consequência, pequenos detalhes
estruturais não são possíveis de serem detectados através desta
técnica
AH!!!!!! Observe aqui duas características do microscópio óptico: a
capacidade de aumento e o uso da luz.
Se a técnica empregar a luz trata-se de um método que emprega a
radiação eletromagnética. E isto pode ser objeto de perguntas ou
comparações por parte das bancas.

INSTRUMENTAÇÃO
O microscópio composto tem basicamente dois conjuntos de lentes:

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- a ocular (que fica próximo ao olho do observador, ou do dispositivo


fotográfico) e
- a objetiva (que fica perto do objeto a ser examinado).
Unindo os dois conjuntos de lente fica um tubo óptico com
“comprimento óptico” padronizado: geralmente, 160 mm.
A objetiva é um conjunto de lentes que apresenta pequena distância
focal e que fornece uma imagem real e aumentada do objeto que é
observado.
A ocular, também formada por lentes convergentes, funciona como
==11444a==

uma lupa, que nos dá uma imagem virtual e aumentada da imagem


real que se formou em pela objetiva.
A parte óptica é constituída por três sistemas de lentes: o condensador,
as objetivas e as oculares.

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O condensador concentra a luz e a projeta como um cone sobre o


objeto em estudo. A luz passa por ele e penetra na objetiva. A objetiva
projeta uma imagem aumentada do objeto em direção à ocular, a qual
amplia a imagem recebida e a projeta para a retina do observador.
Princípios da formação da imagem ao microscópio:

Pronto. Você já sabe como funciona um microscópio.


Na prática os microscópios modernos têm um grande número de outros
elementos óticos incorporados ao caminho da luz dentro do “tubo”,
como filtros, analisadores, prismas, espelhos, lentes “zoom”, etc.
A figura abaixo mostra o esquema de um microscópio moderno,
indicando os diversos elementos.

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Componentes do microscópio de luz: 1 - oculares; 2 - tubo (ou


canhão); 3 - braço; 4 - parafuso que fixa o tubo; 5 - botão que regula
a intensidade luminosa; 6 - interruptor; 7 - parafuso micrométrico; 8
- parafuso macrométrico; 9 - parafuso do chariot (movimento lateral);
10 - parafuso do chariot (movimento anteroposterior); 11 - diafragma
do campo luminoso; 12 - suporte da lente condensadora; 13 - alavanca
do diafragma do condensador; 14 - lente condensadora (ou
condensador); 15 - parafusos de centralização; 16 - platina (ou mesa);
17 - objetivas, e 18 - revólver.

Os primeiros microscópios desenvolvidos usavam uma iluminação por


luz transmitida. Assim a luz gerada por uma fonte (lâmpada + espelho
parabólico, em geral) é “colimada” por lentes condensadoras e passa
através de aberturas variáveis, chamadas diafragmas. Passa por filtros
e, depois, na microscopia por luz transmitida, atravessa a amostra.

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A amostra a ser analisada deve ser preparada como uma lâmina


fina o suficiente e de faces paralelas, para que seja
transparente para permitir a passagem da luz.
Este equipamento NÃO SERVE para a observação de metais,
pois, elétrons da camada condutora dos metais interagem fortemente
com os fótons, tornando estas amostras pouquíssimo transparentes.
Para contornar este aspecto foi desenvolvido um tipo de
microscópio em que a iluminação é por meio de luz refletida que é a
iluminação oblíqua com sistemas de iluminação independentes do
microscópio ou através de um sistema de iluminação pelo próprio tubo
e objetiva do microscópio, usando engenhosos sistemas de espelhos,
prismas e vidros semiespelhados, que deixam passar a luz em uma
direção e a refletem na outra.
Podemos ver este tipo de microscópio na figura abaixo:

Abertura numérica (AN)

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A abertura numérica (AN) é calculada multiplicando o índice de


refração da substância interposta entre o objeto e a lente objetiva (n)
pelo seno do semiângulo do cone de luz captado pela objetiva (u), ou
seja, AN = n x sen u.
O valor de n é o índice de difração do meio, que é 1 para o caso do
ar.
Nas objetivas de 5 a 40x, o ar é esta substância, e o seu índice de
refração é igual a 1, mas, na objetiva de 100x, o óleo de imersão deve
ser colocado entre a lâmina e a objetiva, e o índice de refração é 1,515.
Isto leva a aumentar a abertura numérica e, consequentemente, a
qualidade da imagem.
Cuidado, isto é muito importante: A ampliação do objeto é igual ao
aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular.
Pode, ainda, ter eventuais aumentos introduzidos por outros sistemas
de lentes introduzidos no tubo, como sistemas Zoom.

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Entretanto não basta avaliar apenas o aumento da imagem, deve haver


um discernimento dos detalhes, o que é dado pelo poder de
resolução do sistema óptico.
Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do
próprio microscópio) em formar imagens com detalhes
mínimos”
Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos
distintos do objeto, que poderão ser individualizados na
imagem final”
Poder resolvente (ou poder de resolução)
Ao empregar um microscópio em um estudo, tem-se como objetivo
visualizar mais detalhes do que podemos com a vista desarmada. A
ampliação que as lentes nos proporcionam é apenas um meio para
chegar a esse objetivo, e não terá valor se a imagem produzida no fim
não contiver mais detalhes do que podemos ver – ou resolver – sem o
auxílio do microscópio.
O poder de resolução é expresso em número de linhas resolvidas por
milímetro. Pode-se demonstrar usando as leis da ótica que o limite de
resolução.
LR = K / 2NA
Onde:
- K é uma constante que pode chegar a 1,22 com o uso de um
condensador adequado e é o comprimento de onda da luz utilizada
para iluminar a amostra.
- AN: abertura numérica.

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Preparo das amostras


As amostras ficam montadas sobre uma placa chamada de platina,
sobre um porta-amostra, também chamado de charriot. Geralmente o
porta-amostra tem vários sistemas de cremalheiras (coroa e pinhão)
para movimentar a amostra; dois nas direções X e Y e muitas vezes
um outro para rodar a amostra (platina giratória) nos microscópios que
utilizam analisadores de luz polarizada.

Para a formação da imagem ao microscópio de luz, o material biológico


deve ser fino o suficiente para a luz atravessá-lo.
Podem ser realizados esfregaços de sangue e sêmen, por exemplo. A
gota do material é espalhada na lâmina com o auxílio de uma outra
lâmina posicionada em ângulo de 45º.
Como os tecidos são geralmente incolores, os histologistas inventaram
soluções corantes que têm afinidades diferentes para certas organelas
e estruturas, possibilitando a sua localização.
Uma técnica de coloração muito usada é a hematoxilina e eosina (HE).
A hematoxilina é um corante azul-violeta, rico em cargas positivas
(corante catiônico), e a eosina é um corante rosa, rico em cargas
negativas (corante aniônico). As cargas positivas da hematoxilina
ligam-se a cargas negativas do tecido, como os grupos fosfato (PO43-)
dos ácidos nucleicos, o que faz com que o núcleo da célula fique corado
em azul, violeta ou roxo. As cargas negativas da eosina ligam-se a
cargas positivas do tecido, como os radicais amino (-NH4+) das
proteínas básicas do citoplasma, tornando-o rosa ou avermelhado.

Imagens obtidas por Microscopia Óptica

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4. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET) E DE


VARREDURA (MEV)
O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de
que os elétrons tinham comportamento ondulatório semelhante aos
fótons de luz.
Em 1924, de Broglie propõe que um elétron em movimento tem
propriedades semelhantes a ondas, e Bush, em 1926 que é possível
focar um feixe de elétrons com uma lente magnética cilíndrica,
lançando os fundamentos da óptica eletrônica. Em 1935, Knoll
demonstra a viabilidade do microscópio eletrônico de varredura (MEV)
e três anos mais tarde um instrumento protótipo foi construído por Von
Ardene. Logo, em 1939, Siemens produz o primeiro microscópio
eletrônico de transmissão (MET).
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Vamos estudar agora o que é a microscopia eletrônica de varredura.
Devido ao intenso avanço tecnológico, cada vez mais os cientistas
têm a necessidade de observar, analisar e explicar corretamente os
fenômenos que ocorrem na escala micrométrica ou submicrométrica.

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A microscopia eletrônica de varredura se apresenta como a técnica


mais adequada, pois permite alcançar aumentos muito superiores
aos da microscopia ótica.
Dependendo do material pode atingir até 900 000 vezes, mas para a
análise de materiais, normalmente, o aumento é da ordem de 10 000
vezes.
Neste caso o que nós temos, normalmente, é a amostra sendo varrida
por um feixe de elétrons (por isso, chamada de eletrônica). E esse
feixe de elétrons irá interagir com esta amostra e vai gerar outros
elétrons que vão ser originados a partir da interação desses elétrons
da fonte, que vamos chamar de elétrons primários (os que incidem).
Outros elétrons provenientes da amostra são, então, detectadas por
um sensor, que é um detector. Isto dito de uma maneira muito
simplificada, certo?
Para cada grupo de elétron que vai ser originado a partir dessas
interações nós teremos um sensor específico. Basicamente terá um
sensor para elétrons que irão interagir de forma elástica e um sensor
para elétrons que vão interagir de forma inelástica.
É muito importante que você saiba identificar as características dos
elétrons.
Na MEV a amostra precisa ser um condutor de corrente elétrica. Essa
é de grande importância desse aspecto de grande importância para
essa técnica que pode ser motivo de cobrança por parte da banca.
No caso da microscopia eletrônica a área ou o microvolume a ser
analisado é irradiado por um fino feixe de elétrons ao invés da
radiação da luz. Como resultado da interação do feixe de elétrons
com a superfície da amostra, uma série de radiações são emitidas
tais como: elétrons secundários, elétrons retroespalhados,
raios-X característicos, elétrons Auger, fótons, etc.

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Estas radiações quando captadas corretamente irão fornecer


informações características sobre a amostra (topografia da
superfície, composição, cristalografia, etc.).
Relembrando: a microscopia eletrônica de varredura (MEV) utiliza um
feixe de elétrons no lugar de fótons utilizados em um microscópio
óptico convencional, o que permite solucionar o problema de resolução
relacionado com a fonte de luz branca.
No microscópio eletrônico de varredura (scanning electron microscope,
SEM), os elétrons não atravessam o objeto. A preparação é
recoberta por uma camada delgada de metal pesado (por exemplo,
ouro ou paládio) e bombardeada com feixe de elétrons muito estreitos
(10nm de diâmetro), que varrem o material linearmente. Os elétrons
refletidos e emitidos são captados por detectores que geram uma
imagem tridimensional da superfície da amostra em um monitor.
Pode ser que você não tenha uma amostra que seja condutora. Então,
será necessário metalizar essa amostra. Isso é necessário e ocorre
muito com material biológico.
Lembrando: na análise residuográfica feita por um perito analisando o
disparo por arma de fogo nós já temos os metais e aí não é necessário
metalizar.

Na microscopia eletrônica de varredura os sinais de maior interesse


para a formação da imagem são os elétrons secundários e os
retroespalhados. À medida em que o feixe de elétrons primários
vai varrendo a amostra estes sinais vão sofrendo modificações de
acordo com as variações da superfície.
Os elétrons secundários fornecem imagem de topografia da
superfície da amostra e são os responsáveis pela obtenção das
imagens de alta resolução. Os elétrons retroespalhados fornecem
imagem característica de variação de composição.

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O Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) se tornou um


instrumento imprescindível nas mais diversas áreas: eletrônica,
geologia, ciência e engenharia dos materiais, ciências da vida, etc.
Em particular, o desenvolvimento de novos materiais tem exigido um
número de informações bastante detalhado das características
microestruturais. Podemos afirmar que onde exista um grupo de
desenvolvimento de materiais, há a necessidade de um MEV para as
observações microestruturais.
O MEV tem seu potencial ainda mais desenvolvido com a adaptação
na câmara da amostra de detectores de raios-X permitindo a
realização de análise química na amostra em observação. Através da
captação pelos detectores e da análise dos raios-X característicos
emitidos pela amostra, resultado da interação dos elétrons
primários com a superfície, é possível obter informações qualitativas
e quantitativas da composição da amostra na região submicrométrica
de incidência do feixe de elétrons. Este procedimento facilita a
identificação de precipitados e mesmo de variações de composição
química dentro de um grão.
Atualmente quase todos os MEV são equipados com detectores de
raios-X, sendo que devido a confiabilidade e principalmente devido
a facilidade de operação, a grande maioria faz uso do detector de
energia dispersiva (EDX).
O Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) é um instrumento
muito versátil e usado e, apesar da complexidade dos mecanismos
para a obtenção da imagem, o resultado é uma imagem de muito
fácil interpretação.
O aumento máximo conseguido pelo MEV fica entre o microscópio
ótico (MO) e o Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET). A
grande vantagem do MEV em relação ao microscópio ótico é sua alta
resolução, na ordem de 2 a 5 nm (20 - 50 A) - atualmente existem

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instrumentos com até 1 nm (10A) - enquanto que no ótico é de


0,5 µm. Comparado com o MET (veremos a seguir) a grande
vantagem do MEV está na facilidade de preparação das amostras.
Entretanto, não são apenas estas características que fazem do MEV
uma ferramenta tão importante e tão usada na análise dos
materiais. A elevada profundidade de foco (imagem com aparência
tridimensional) e a possibilidade de combinar a análise
microestrutural com a microanálise química são fatores que em
muito contribuem para o amplo uso desta técnica. A observação e
análise de fratura teve um grande avanço com o uso do
microscópio eletrônico de varredura.

COMPONENTES DO MEV
O MEV consiste basicamente da coluna óticoeletrônica (canhão de
elétrons e sistema de demagnificação), da unidade de varredura,
da câmara de amostra, do sistema de detectores e do sistema de
visualização da imagem.

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O canhão de elétrons é usado para a produção do feixe de elétrons


com energia e quantidade suficiente para ser captado pelos
detectores.
Esse feixe eletrônico é, então, demagnificado por várias lentes
eletromagnéticas, cuja finalidade é produzir um feixe de elétrons
focado com um pequeno diâmetro numa determinada região da
amostra.

Canhão de Elétrons
Canhão eletrônico é a fonte de iluminação do microscópio eletrônico e
consiste de um pequeno fragmento de fio em forma de V. Uma alta
voltagem é aplicada nesse filamento, fazendo com que uma corrente
flua através dele e o incandesça, emitindo elétrons. A propriedade de
emitir elétrons por aquecimento é comum a todos os metais e chama-
se emissão termoiônica. O comprimento de onda dos elétrons está
diretamente relacionado a voltagem aplicada sobre o filamento.
Quanto maior for a voltagem menor será o comprimento de onda dos

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elétrons, favorecendo o poder resolvente.

Podemos dizer que o canhão de elétrons é o conjunto de


componentes cuja finalidade é a produção dos elétrons e a sua
aceleração para o interior da coluna. Este feixe de elétrons deve ser
estável e com intensidade suficiente para que ao atingir a
amostra possa produzir um bom sinal. O diâmetro do feixe
produzido diretamente pelo canhão de elétrons é muito grosseiro
para produzir uma boa imagem em grandes aumentos e por isso
precisa ser reduzido pelas condensadoras (lentes
eletromagnéticas). A maioria dos MEV é capaz de produzir um feixe
de elétrons que ao atingir a amostra tenha um diâmetro da ordem
de 10 nm (100A) e que ainda possua corrente suficiente para
formar uma imagem com boa resolução.
Vários tipos de canhão de elétrons são usados nos microscópios
variando assim a quantidade de corrente que as mesmas podem
produzir, o tamanho da fonte, a estabilidade do feixe produzido e o
tempo de vida da fonte. O modelo mais usado é formado por três
componentes (tipo triodo): um filamento de tungstênio, que serve
como cátodo, o cilindro de Wehnelt e o ânodo, conforme pode ser
visto na Fig. 2.2. O microscópio eletrônico Philips-XL30, instalado
no Labmat/EMC possui este é tipo de canhão.
O filamento de tungstênio tem seu funcionamento baseado no
efeito termoiônico de emissão dos elétrons. A emissão termoiônica
dos elétrons pelo filamento ocorre quando é fornecido calor
suficiente ao mesmo e os elétrons podem ultrapassar a barreira de
energia para escapar do material. Para reduzir o efeito de
evaporação do filamento, que é comum a elevadas temperaturas,
procura-se usar como filamento um material que precise de baixa
energia para emitir elétrons. No caso do tungstênio é possível

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obter uma boa emissão de elétrons, ou seja, produzir um feixe


eletrônico com alta densidade de corrente, em temperatura bem
abaixo da temperatura de fusão do tungstênio. A temperatura de

emissão do tungstênio é de 2427 o C e a de fusão é de 3410 o C,


ocasionando uma baixa evaporação deste filamento e
consequentemente um maior tempo de vida. A duração de um
filamento de tungstênio é da ordem de 60 h, podendo variar
dependo da saturação.
O filamento de tungstênio vem sendo a fonte mais utilizada nos
últimos 50 anos pela maioria dos microscópios eletrônicos, apesar
da existência de outras fontes emissoras; como o Hexaboreto de
Lantâneo (LaB6), o Field Emission Gun (FEG), e que apresentam
brilho mais intenso. Isto é consequência do seu baixo custo aliado ao
seu bom desempenho. Em aplicações onde o alto brilho da fonte não
é muito necessário, como para médios aumentos (na faixa de
10.000x e que são os aumentos normalmente usados para a análise

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de materiais), e onde se deseja um feixe bastante estável (caso da


microanálise), o filamento de tungstênio pode ser considerado como
a melhor opção de fonte.
Tabela: Comparação de várias fontes a 20 kV.

Fonte Brilho Tempo de vida Tamanho da Fonte Estabilidade


2 (h) (no crossover) da corrente do
(A/cm sr)
feixe

Tungstênio 103 40 – 100 30 - 100 mm 1%


LaB6 106 200 - 1 000 5 - 50 mm 1%

FEG 108 > 10 000 < 5 nm 5%

Lentes eletrônicas
Um campo magnético radialmente simétrico – como aquele formado
por um enrolamento de fio elétrico através do qual passa uma corrente
– atuará como uma lente que pode ser usada para focalizar um feixe
eletrônico. Na prática, a lente eletrônica consiste basicamente de uma
bobina, formada por milhares de voltas de fio, através da qual passa
uma corrente.

Interações elétrons-amostra
O elétron do feixe eletrônico ao atingir a superfície da amostra irá
interagir com os átomos da amostra. Como consequência da
presença do potencial atômico e nuclear da amostra este elétron
sofrerá modificação na sua velocidade inicial. Esta variação da
velocidade pode ser somente na direção ou pode ocorrer tanto na
direção quanto no módulo (magnitude).
É necessário levar em conta a presença dos elétrons do próprio
átomo. O elétron do feixe ao penetrar no átomo irá interagir também
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com os elétrons ao redor do átomo resultando principalmente em


espalhamento inelástico do elétron e transferência de energia para o
átomo. Como resultado destas interações, elétrons das várias
camadas do átomo poderão ser liberados e/ou excitados.
A maioria dos elétrons das camadas externas do átomo sofrem este
tipo de interações inelásticas pois estes elétrons requerem pouca
energia para serem removidos. Estes elétrons irão se mover pelo
material e também poderão sofrer interações inelásticas.
Além disso, o átomo excitado, aquele do qual foi retirado um elétron,
poderá captar um elétron que esteja se movendo na amostra,
resultante de outras excitações ou elétrons provenientes do
aterramento da amostra.
Estes elétrons são pouco energéticos e somente aqueles que se
encontram muito próximos da superfície e que possuem energia
suficiente para ultrapassar a barreira superficial é que conseguem
escapar do material.
Imagem por elétrons secundários
Elétrons secundários (ES) são elétrons que são ejetados de átomos
da amostra devido às interações inelásticas dos elétrons
energéticos do feixe primário com elétrons pouco energéticos da
banda de condução nos metais ou de valência nos semicondutores e
isolantes. Por definição os elétrons que são emitidos da amostra
com energia inferior a 50 eV são chamados de elétrons secundários.
Portanto, os elétrons secundários são definidos somente com base na
sua energia cinética.
Dentro desta faixa de energia é claro que sempre existirá alguns
elétrons retroespalhados que perderam quase toda a sua energia,
mas como a sua contribuição é muito pequena eles podem ser
efetivamente ignorados.

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De todos os sinais que podem ser usados para análise de amostras


no MEV o sinal de elétrons secundários é o mais usado.
Devido a grande diferença entre a energia dos elétrons primários
(elétrons do feixe eletrônico) e a dos elétrons da amostra, somente
uma pequena quantidade de energia cinética pode ser transferida
para os elétrons secundários. Enquanto que para os elétrons
secundários com energia de até metade da energia dos elétrons
primários, o número desses elétrons rápidos é muito pequeno quando
comparado com os elétrons secundários pouco energéticos.
Basicamente, os elétrons secundários são gerados pelos elétrons do
feixe primário, à medida e m que o mesmo vai penetrando na
amostra, e também pelos elétrons retroespalhados quando estes vão
deixando a amostra.

Imagem por elétrons retroespalhados


O sinal de elétrons retroespalhados resulta de uma sequência de
colisões elásticas e inelásticas, no qual a mudança de direção é
suficiente para ejetá-lo da amostra. Os elétrons retroespalhados
produzem um sinal muito importante para a obtenção de imagens no
MEV.

Profundidade de escape

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Os elétrons retroespalhados de alta energia são aqueles que resultam


de uma simples colisão elástica, sendo, portanto, oriundos da
camada mais superficial da amostra. Logo, se somente os elétrons
retroespalhados de alta energia forem captados, as informações de
profundidade contidas na imagem serão poucas quando comparadas
com a profundidade de penetração de penetração do feixe.
Através da identificação dos raios-X emitidos pela amostra, quando
da interação com o feixe eletrônico, é possível determinar a
composição de regiões com até 1 µm de diâmetro. É uma técnica não
destrutiva, podendo determinar quantidades de até 1-2% dos
elementos presentes na amostra.
A detecção dos raios-X emitidos pela amostra pode ser realizada
tanto pela medida de sua energia (EDS) como do seu comprimento
de onda (WDS). Os detectores baseados na medida de energia são
os mais usados, cuja grande vantagem é a rapidez na avaliação
dos elementos.
A energia do fóton de raios-X emitido é uma função dos níveis de
energia do átomo. Como o nível de energia dos átomos são bem
definidos e característicos de cada tipo de átomo, a energia do fóton
de raio-X é específica de cada elemento e contém as informações
sobre a composição química de cada espécie.

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Como o espectro total de raios-X coletado é formado pela radiação


característica e como a radiação característica fornece as principais
informações sobre a composição da amostra, a separação da radiação
contínua é um importante procedimento para a quantificação da
composição da amostra.

Um fato interessente é quanto às tonalidades diferentes das


imagens. Isto se deve ao numero atômico dos elementos quimicos
presentes na amostra.
Isto é interessante,pois, gera um contraste na imagem, permitindo
análise do contorno desta.
Grande parte dos átomos das estruturas celulares tem baixo número
atômico e muito pouco contribui para a formação da imagem. O
emprego de substâncias que contêm átomos pesados, como ósmio,
chumbo e urânio permitem obter um contraste entre as estruturas
celulares, contribuindo para uma melhor imagem,
Vejamos alguns exemplos:

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Eletrodensa (escura) os elétrons encontram elementos como: ferro,


ósmio, chumbo, ouro, etc.
Eletrolúcida (clara) os elétrons encontram elementos como:
hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio, etc.
Observação:
A contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): metais
pesados.
Veja abaixo imagens obtidas por MEV:

Observe a tridimensionalidade das imagens obtidas.

PRINCÍPIO DO MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO


(MET)
O MET possui sistemas de iluminação e vácuo que produz feixes de
elétrons de alta energia (energia cinética), que ao incidir sobre uma
amostra de tecido ultrafina (na espessura de nanômetro), fornece
imagens planas, imensamente ampliadas, possuindo a capacidade de
aumento útil de até um milhão de vezes e assim permitindo a
visualização de moléculas orgânicas, como o DNA, RNA, algumas
proteínas, etc.
O sistema de vácuo remove o ar e outras moléculas de gás da coluna
do microscópio, evitando assim que ocorra erosão do filamento e
propiciando a formação de uma imagem com excelente qualidade e
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contraste. A imagem é projetada em um anteparo fluorescente, que


poderá ser redirecionada para uma chapa fotográfica para registro, ou
ainda a imagem pode ser captada por um sistema computadorizado de
captação de imagens e armazenada em CD-Rom para futura análise.
Na prática, o intervalo de aumentos do MET varia de 1.000 a cerca de
200.000 vezes. Então, por fim, a imagem é também uma resultante da
absorção diferenciada de elétrons por diversas regiões da amostra,
seja por variação de espessura, seja por interação com átomos de
maior ou menor número atômico.
A construção do MET é robusta, a fim de garantir estabilidade mecânica
e evitar perturbações por vibrações do meio. As bobinas das lentes,
através das quais passam correntes, tenderiam a aquecer-se e,
portanto são usualmente resfriadas por água que circula a sua volta.
Isso é conseguido com uma unidade de refrigeração de água
interligada ao MET.
As lentes eletrônicas, assim como as lentes de vidro, apresentam
defeitos. Esses defeitos interferem no poder resolvente do microscópio
eletrônico. A solução adotada para minimizar esse problema reside em
se trabalhar apenas com a porção central da lente, e isso se consegue
construindo nela uma abertura de pequeno diâmetro. Outro fator que
impede que se atinja o poder resolvente teórico é a estabilidade
mecânica do MET. Devido ao fato de se atingir um poder resolvente na
ordem de nanômetros, qualquer oscilação em escala semelhante irá
interferir no resultado final. Portanto, o poder resolvente obtido na
prática depende essencialmente da qualidade do projeto e construção
do ME, da natureza do espécime, e ainda do cuidado e experiência do
operador. Os melhores resultados obtidos para amostras biológicas
situam-se na faixa de 1 nm.
Em microscopia eletrônica de transmissão a imagem observada é a
projeção de uma determinada espessura do material, havendo uma

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diferença com relação ao observado numa superfície. A figura abaixo


apresenta a projeção de uma lâmina fina conforme observada no
microscópio de transmissão. Como pode ser observado, ocorre uma
projeção das linhas, áreas e volumes de interesse, podendo ocorrer
superposição.

O contraste nas imagens formadas em MET tem diversas origens, tais


como diferença de espessura, diferença de densidade ou de coeficiente
de absorção de elétrons (contraste de massa), difração e campos
elásticos de tensão.
O MET é um instrumento admirável para estudar os detalhes mais
finos de uma estrutura celular, ou a organização molecular de vírus
ou constituintes subcelulares. O preço de conseguir alta resolução,
entretanto, é que o instrumento é complexo, as espécies devem ser
extremamente finos e é difícil obter informação sobre estruturas em
três dimensões. O MEV, por outro lado, é ideal para estudar a
topografia de superfície de objetos sólidos, mas fornece pouca, ou
nenhuma informação sobre a estrutura interna. Seu poder separador
não se iguala ao do microscópio de transmissão, embora seja
adequado para muitos propósitos. Deve-se sempre ter em mente o
objetivo da pesquisa que está desenvolvendo, pois, ele é que indicará

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qual equipamento deverá ser empregado para se atingir os


resultados desejados.

Cuidado porque a banca pode por exemplo mencionar que a


microscopia eletrônica de varredura é uma técnica espectroscópica e
isso está completamente errado porque não temos um relacionamento
da radiação eletroeletromagnética com amostra.
Não usamos radiação ultravioleta e infravermelho nem no visível. O
que nós usamos são feixe de elétrons. E esses feixes de elétrons é que
irão interagir com as amostras gerando a imagem.

ALGUMAS COMPARAÇÕES ENTRE AS TÉCNICAS


- Capacidade de resolução
Olho humano – 0,1 mm
Microscopia Ótica – 0,5 µm
Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) – 1-4 m
Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) – 1-0,8 Å

Tipos de imagens obtidas

Microscópio Ótico (MET)


MEV

Tipos de equipamentos

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Microscópio Ótico MET MEV

Comparações entre MET e MEV

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Muito importante:
Diferença entre a MEV e a MET
A MEV gera uma imagem de três dimensões e a MET gera uma imagem
como se fosse uma imagem interna mostrando o que tem no seu
interior então.
Na MET a amostra é atravessada pelos elétrons. Então ela deve ser
translúcida (não pode ser opaca) para permitir com que os elétrons
passem por essa amostra. Já na MEV a amostra pode ser opaca, não
precisa ser delgada, mas, ela deve ser condutora de corrente.
Vamos de uma maneira geral ver as diferenças fundamentais entre
essas duas técnicas. A amostra para microscopia de varredura tem que
ser condutora de corrente elétrica e ter boa condição de fixação no
suporte para permitir a visualização na câmara de amostragem.
Diferente da microscopia de transmissão em que a amostra deve ser
ultrafina. E isto é bem trabalhoso no preparo. Será mais demorado, um
pouco mais complexo, porém, permite uma imagem (digamos assim)
interna do nosso material.

Comparações entre microscopia ótica e eletrônica

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Fonte Luz Elétrons


(porção inferior) (porção superior)

Lentes Vidro Eletromagnéticas

Lentes de Objetivas e oculares Eletromagnéticas


aumento
(principal)

Suporte para Lâmina de vidro Grade de metal


amostra (telinha)Cobre ou
níquel

Limite de 0,2 µ 0,0002 µ


resolução

Formação da Transparência e coloração Variações de


imagem densidade e
contrastação

Cuidado com estas diferenças básicas:


MEV elétrons são refletidos
MET elétrons passam pela amostra
MO usa luz e não usa feixe de elétron

5. QUESTÕES

01. (2013: CESPE: Polícia Federal: Perito Criminal Federal).


Julgue o item abaixo, relativo à microscopia óptica.

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Na microscopia óptica, o campo de visão de uma lente descreve o


tamanho da área abrangida pela lente e que é compatível com o ângulo
de visão máximo alcançado pelo olho humano, ou seja, cerca de 30º.
Certo ( ) Errado ( )
Resposta: errado.
Os microscópios modernos têm lentes projetadas para acomodar o
ângulo máximo de visão do olho humano, que é cerca de 50°.

02. (2010: FGV: FIOCRUZ: Tecnologista em Saúde - Biologia


Celular).
Secções finas são efetivamente pedaços bidimensionais de tecidos e
não transmitem a organização tridimensional dos componentes
celulares. Apesar da terceira dimensão poder ser reconstruída, a partir
de secções seriais, este é um processo lento e trabalhoso. Felizmente,
existem formas mais diretas para se obter uma imagem tridimensional,
em uma técnica que é usualmente mais utilizada para se estudar
células intactas e tecidos do que organelas subcelulares, pois apenas
características da superfície podem ser observadas. Essa técnica, no
entanto, apresenta resolução um pouco mais baixa do que o
microscópio eletrônico de transmissão. Assinale o tipo de microscópio
capaz de gerar a imagem tridimensional mencionada acima.
a) Microscópio confocal.
b) Microscopia de fluorescência.
c) Microscópio eletrônico de varredura.
d) Microscópio ótico.
e) Microscópio de contraste de fase.
Resposta: C.
A grande diferença do microscópico de varredura em relação ao de
transmissão é que o de varredura preocupa-se em mostrar
essencialmente a parte externa e tridimensional da imagem.

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03. (2011: CESPE: CNPQ: Assistente).

Com base no texto acima, julgue os itens.


Haveria prejuízo para a coerência e correção gramatical do texto caso
o período “O desenvolvimento de técnicas oriundas da física e da
química (raios X, microscopia elétrica etc.) alavancou a criação de
interdisciplinas como a biofísica e a bioquímica” (L.8-10) fosse reescrito
da seguinte forma: O desenvolvimento de técnicas (oriundas da física
e da química), como os raios X, a microscopia elétrica etc., alavancou
a criação de interdisciplinas, como a biofísica e a bioquímica.
Certo ( ) Errado ( )
O gabarito preliminar da prova trazia esta questão como errada. Depois
dos recursos, a banca decidiu alterar o gabarito da questão com o
seguinte argumento:
O deslocamento dos parênteses altera o sentido da citação; perde-se
o sentido restritivo do segmento "oriundas da física e da química"
aplicado a "técnicas" e a introdução da vírgula na última linha modifica
a relação semântica entre "interdisciplinas" e a citação que lhe segue.
Devido ao exposto, opta-se pela alteração do gabarito.
Gabarito Oficial: Correto

04. (2010: FGV: FIOCRUZ: Tecnologista em Saúde - Análises


Físico-Químicas).

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Dentre as técnicas úteis para detecção de polimorfismo em fármacos,


analise os itens a seguir.
I. Microscopia ótica.
II. Difratometria de pós por Raio X.
III. Titulação com iodo.
Assinale:
a) se apenas a técnica I for útil.
b) se apenas as técnicas I e II forem úteis.
c) se apenas as técnicas I e III forem úteis.
d) se apenas as técnicas II e III forem úteis.
e) se todas as técnicas forem úteis.
Resposta: B
I. Microscopia ótica.
II. Difratometria de pós por Raio X.

05. (2011: COPEVE-UFAL: UFAL: Biólogo).


Denominação do tipo de microscópio onde os elétrons que colidem com
a superfície externa do espécime são captados por detectores e a sua
imagem aparece no monitor, com poder de resolução de 0,02 µm:
a) microscópio de fluorescência.
b) microscópio eletrônico de transmissão.
c) microscópio eletrônico de varredura.
d) microscópio de campo escuro.
e) microscópio de contraste de fase.
Resposta: C.
O microscópio eletrônico de varredura (MEV) é um equipamento capaz
de produzir imagens de alta ampliação (até 300.000 x) e resolução. As
imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter virtual, pois o que
é visualizado no monitor do aparelho é a transcodificação da energia
emitida pelos elétrons, ao contrário da radiação de luz a qual estamos

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habitualmente acostumados. O princípio de funcionamento do MEV


consiste na emissão de feixes de elétrons por um filamento capilar de
tungstênio (eletrodo negativo), mediante a aplicação de uma diferença
de potencial que pode variar de 0,5 a 30 KV. Essa variação de voltagem
permite a variação da aceleração dos elétrons, e também provoca o
aquecimento do filamento. A parte positiva em relação ao filamento do
microscópio (eletrodo positivo) atrai fortemente os elétrons gerados,
resultando numa aceleração em direção ao eletrodo positivo. A
correção do percurso dos feixes é realizada pelas lentes condensadoras
que alinham os feixes em direção à abertura da objetiva. A objetiva
ajusta o foco dos feixes de elétrons antes dos elétrons atingirem a
amostra analisada.

Bons estudos!!!!
Prof. Wagner Bertolini

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