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Pró-Reitoria Acadêmica

Escola de Saúde e Medicina


Curso de Biomedicina
Trabalho de Conclusão de Curso

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE


BACTERIOCINAS CONTRA O VÍRUS HERPES SIMPLEX TIPO
1 (HSV-1) ATRAVÉS DAS METODOLOGIAS DE REDUÇÃO DO
TÍTULO VIRAL E PLAQUE ASSAY.

Autora: Lizandra Cristina Gonçalves Carvalho Leão Teixeira


Orientadora: Profa. MSc. Lídia Maria Pinto de Lima

Brasília - DF
2017
LIZANDRA CRISTINA GONÇALVES CARVALHO LEÃO TEIXEIRA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DE BACTERIOCINAS CONTRA O


VÍRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1 (HSV-1) ATRAVÉS DAS METODOLOGIAS DE
REDUÇÃO DO TÍTULO VIRAL E PLAQUE ASSAY.

Projeto apresentado ao curso de graduação em


Biomedicina da Universidade Católica de
Brasília como requisito parcial para obtenção
do título de Bacharel em Biomedicina.

Orientadora: Profa. MSc. Lídia Maria Pinto de


Lima

Brasília
2017
Projeto de TCC I, de autoria de Lizandra Cristina Gonçalves Carvalho Leão Teixeira,
intitulado “Avaliação da atividade antiviral de bacteriocinas contra o vírus herpes simplex
tipo 1 (HSV-1) através das metodologias de Redução do Título Viral e Plaque Assay”,
apresentado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da
Universidade Católica de Brasília, em 1º de novembro de 2017, defendida e aprovada pela
banca examinadora abaixo assinada:

____________________________________________________
Profa. MSc. Lídia Maria Pinto de Lima
Orientadora
Curso de Biomedicina – Universidade Católica de Brasília (UCB)

_____________________________________________________
Doutoranda Liana Costa Pereira Vilas Boas
Banca Examinadora
Patologia Molecular – Universidade de Brasília (UnB)

Brasília
2017
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 4
1.1 VÍRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1 (HSV-1)............................................................ 4
1.2 ANTIVIRAIS ............................................................................................................... 6
1.3 BACTERIOCINAS ..................................................................................................... 7
1.4 PLAQUE ASSAY........................................................................................................ 8
2 JUSTIFICATIVA E PERSPECTIVAS ............................................................................. 10
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 11
3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 11
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 11
4 METODOLOGIA................................................................................................................ 12
4.1 CULTURA CELULAR ............................................................................................. 12
4.2 BACTERIOCINAS ................................................................................................... 12
4.3 BIOENSAIOS ............................................................................................................ 12
4.3.1 Titulação Viral .................................................................................................. 12
4.3.2 Ensaio Citotóxico e Viabilidade Celular ......................................................... 13
4.3.3 Redução do Título Viral ................................................................................... 14
4.3.4 Plaque Assay ..................................................................................................... 14
4.3.5 Mecanismo de Ação .......................................................................................... 16
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 17
6 CRONOGRAMA ................................................................................................................. 20
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1. INTRODUÇÃO

As infecções virais constituem grande parte dos problemas de saúde em todo mundo.
As formas de transmissão e disseminação dos vírus são variadas, podendo causar doenças
respiratórias, entéricas, dermotrópicas, viroses multissistêmicas e do sistema nervoso central,
além de viroses oncogênicas e congênitas. O tratamento e a prevenção dessas doenças são
realizados a partir da administração de antivirais e vacinas que são disponíveis atualmente
contra alguns vírus (SANTOS et al, 2015).
Por volta dos anos 1960, a terapia antiviral era considerada mais difícil do que o
tratamento antibacteriano, pelo fato dos vírus serem patógenos intracelulares obrigatórios,
diferentes da maioria das bactérias que se multiplicam independentemente da célula
hospedeira. Por essa razão de dependência do vírus e a limitação do conhecimento de técnicas
moleculares, considerava-se a impossibilidade de agentes antivirais serem obtidos sem que os
mesmos interferissem no metabolismo celular causando danos as células (SANTOS et al,
2015).
Dentre as viroses dermotrópicas podem ser citadas aquelas que se restringem a
superfície corpórea, como as causadas pelo vírus herpes simplex 1 e 2, vírus do papiloma
humano e vírus do molusco contagioso, além das de disseminação sistêmica pelo corpo, como
as do herpesvírus 6 e 7, sarampo, rubéola e herpes vírus associado ao sarcoma de Kaposi
(SANTOS et al, 2015).

1.1 VÍRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1 (HSV-1)

De acordo com o ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses), os


herpesvírus são classificados na ordem Herpesvirales, família Herpesviridae, na qual incluem
três subfamílias: Alphaherpesvirinae, Betaherpesvirinae e Gammaherpesvirinae. Dentre as
espécies classificadas nessas subfamílias além dos vírus herpes simplex 1 e 2 (HSV-1 e HSV-
2) encontram-se outros herpesvírus humanos patogênicos: Citomegalovírus (CMV), Vírus
Epstein-Barr (EBV), Roseolovirus, vírus da Varicela-Zoster (VZV) e herpesvírus associado
ao sarcoma de Kaposi (BAUER et al, 2013; DAVISON, 2010; SANTOS et al, 2015). Os
vírus herpes simplex 1 e 2 são classificados na subfamília Alphaherpesvirinae, gênero
Simplexvirus e possuem a capacidade de destruir a célula hospedeira devido ao ciclo de
reprodução rápido (ZAICHICK, 2011).
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O HSV-1 (Figura 1) possui DNA linear com 152kbp, fita dupla, capsídeo icosaédrico
composto por 162 capsômeros, tegumento amorfo ao redor do capsídeo que permite o
transporte do DNA por um canal, envelope externo com bicamada lipídica contendo cerca de
13 glicoproteínas incorporadas (SHEN & NEMUNAITIS, 2006).

Figura 1: Estrutura da partícula viral - Simplexvirus

Fonte: http://viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/178.html

O genoma do HSV-1 (Figura 2) possui sequências únicas (U) e terminais de repetição


(TR), com comprimentos curtos (S) e longos (L), codifica cerca de 74 proteínas, além de
RNAs que não são traduzidos. Ambas as cadeias de DNA são utilizadas para codificação e
possui repetições invertidas (IR) em cada região (CARTER & SAUNDERS, 2007). Possui
ainda três origens de replicação, sendo uma localizada na sequência única e outras duas
localizadas em regiões repetidas (WELLER & COEN, 2012).

Figura 2: Esquema do genoma do HSV-1

Fonte: SANTOS et al, 2015.


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O HSV-1 infecta diferentes tipos de células, como fibroblastos, células do epitélio


escamoso e mucoso, células polarizadas do epitélio cilíndrico, células gliais e terminações
nervosas, provocando nas células e organismo infecções líticas mais frequentes ou de latência,
mantendo assim a persistência por toda vida do hospedeiro, sendo reativado em caso de
imunossupressão. A infecção inicial ocorre devido a interação entre receptores, levando a
adsorção da partícula viral por meio da ligação de glicoproteínas virais com as
glicosaminoglicanas, como sulfato de heparana, sulfato de condroitina e sulfato de dermatana,
e a interação irreversível do envelope viral com a membrana citoplasmática, ocorrendo a
penetração por fusão direta. Dentro do núcleo da célula hospedeira ocorre a transcrição do
genoma viral em RNAm, replicação do DNA viral e a montagem do capsídeo. (SANTOS et
al, 2008).
As manifestações clínicas das infecções causadas pelo HSV-1 vão desde infecções
mucocutâneas e até mesmo infecções do Sistema Nervoso Central (SNC). Dentre essas
infecções, o herpes orofacial pode acometer crianças pequenas que não possuem imunidade
ao vírus, com sintomas que envolvem a mucosa bucal e gengival, com vesiculações pequenas
e sintomas prodrômicos como dor e queimação, podendo ocorrer febre de até 40ºC (GELLER
et al, 2012). Outras manifestações clínicas do HSV, como lesões orofaciais e lesões cutâneas
são recorrentes, mas infecções de maior gravidade como a encefalite esporádica possuem uma
alta letalidade e o causador mais comum é o HSV-1. Em pacientes imunocomprometidos as
infecções causadas pelo HSV são consideradas graves em decorrência do estado imunológico
e a terapia imunossupressiva, além disso, cepas de HSV-1 resistente ao Aciclovir (ACV) já
são detectadas e podem causar infecções progressivas importantes em pacientes com a
síndrome da imunodeficiência adquirida (FONSECA, 1999).

1.2 ANTIVIRAIS

Alguns antivirais são agentes utilizados para tratar diferentes doenças causadas por
vírus inibindo a replicação viral. A eficiência dessas substâncias relaciona-se com a
capacidade de inibir fases específicas do ciclo viral sem que haja prejuízo para a célula
hospedeira (BATISTA, 2011; OLIVEIRA, 1989).
Essas drogas antivirais podem interferir desde a adsorção da célula até a formação de
novas partículas virais, podendo ser tóxicas às células humanas, pois a replicação viral ocorre
no interior celular e os vírus utilizam as vias metabólicas das células hospedeiras. Além disso,
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os vírus podem desenvolver resistência a elas (STEPHENS et al, 2009). São relatados na
literatura, casos de resistência aos antivirais, como o aciclovir, droga padrão utilizada em
infecções causadas pelo vírus herpes simples. Devido às mutações que ocorrem, algumas
cepas são incapazes de fosforilar o aciclovir, por serem deficientes ou geradoras
incompetentes de timidina-quinase (GELLER et al, 2012).
Muitos antivirais são desenvolvidos para atuar contra vírus específicos, como o HIV,
HCV e vírus Influenza. Entretanto existem outras doenças importantes em seres humanos, que
não possuem tratamentos eficazes e demandam de novos estudos e investigações sobre outros
fármacos e a ação antiviral dos mesmos (DE CLERQ, 2004; VIGANT, 2015).
Outros antivirais são substâncias que afetam diretamente a partícula viral, destruindo-a
ou impedindo a sua entrada na célula hospedeira, assim como aqueles que bloqueiam o
estágio inicial da replicação viral, o desnudamento, impedindo o desencapsulamento do
genoma viral, como a Amantadina e Rimantadina, drogas antivirais mais ativas contra
Influenza A (SANTOS et al, 2015).

1.3 BACTERIOCINAS

Bacteriocinas são moléculas proteicas biologicamente ativas produzidas por diferentes


bactérias, sendo capazes de agir contra espécies bacterianas que possuem estreita relação
(TODOROV, 2009). Essas substâncias podem ser bactericidas: sem lise celular;
bacteriolíticas: com lise celular; ou bacteriostática: com inibição da multiplicação microbiana
(MORENO, 1999).
As bacteriocinas produzidas por bactérias ácido láticas são diferentes quanto ao
espectro de atividade, características bioquímicas e determinantes genéticos, sendo que além
de baixo peso molecular e alto ponto isoelétrico, possuem também regiões hidrofílicas e
hidrofóbicas (SCHULZ et al, 2003). Essas substâncias são subdivididas em grupos: classe I
são as lantibióticas, devido a presença de lantionina e β-metil-lantionina, catiônicas,
hidrofóbica, formadas pós-tradução; classe II são pequenas (< 10kDa), hidrofóbicas e estáveis
ao calor e possui ainda outra divisão onde IIa é caracterizada por pediocina-bacteriocina
possui sequência N-terminal definida pela sequência consenso Tyr-Gly-Asn-Gly-Val, IIb são
considerados complexos, no qual requerem dois peptídeos diferentes para exercer a atividade,
IIc que para serem ativos necessitam de resíduos de cisteína reduzidos para que sejam
peptídeos com tiol ativado; classe III são grandes (> 30kDa), hidrofílicas e proteínas
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termolábeis (ELAYARAJA et al, 2014); classe IV são bacteriocinas consideradas complexas,


pois além da porção proteica apresentam porções lipídicas ou de carboidratos (SCHULZ et al,
2003).
Estudos realizados com bacteriocinas tem evidenciado a ação da mesma contra
diferentes microrganismos, dentre eles os vírus (MURUA et al, 2013). Apesar de não ser bem
definido a atividade e modo de ação de bacteriocinas contra vírus, sugere-se que as
substâncias tenham papel importante na defesa do hospedeiro (MARTIN et al, 2010). Outros
estudos demonstram que além da utilização da bacteriocina na indústria avícola, aquicultura,
essas substâncias também podem ter aplicações médicas sendo utilizadas para o tratamento de
infecções virais (AL KASSAA et al, 2014). Algumas bacteriocinas como a Enterocina CRL
35 demonstram ação antiviral contra o HSV-1 e HSV-2, com até 15 vezes abaixo da
concentração citotóxica (SAEED et al, 2010). A subtilosina demonstrou ação virucida e
inibitória da multiplicação do HSV-1 em cultura de células (QUINTANA et al, 2014).
A bacteriocina ST8Sh tem peso molecular estimado em cerca de 5kDa, possui modo
de ação bactericida com desestabilização da permeabilidade da membrana celular
(TODOROV, 2015). Em ensaios antivirais utilizando a bacteriocina ST8Sh em diferentes
concentrações de semi-purificação, constatou-se ausência de citotoxicidade, com percentual
de inibição das substâncias acima de 90%. Os ensaios de mecanismo de ação demonstraram
diversidade de estratégias antivirais, tanto na inibição da adsorção e penetração, quanto na
inibição da replicação intracelular. Além disso, as substâncias consideradas promissoras são
as que apresentam percentagem de inibição (PI) ≥ 80% e índice de seletividade (IS) ≥ 10,
sugerindo que essas substâncias possam vir a ser um possível fármaco para o tratamento das
infecções causadas pelo herpesvírus 1 (JESUS, 2017).
O presente trabalho avaliará a atividade de diferentes bacteriocinas como possíveis
inibidoras do vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1).

1.4 PLAQUE ASSAY

Para o ensaio antiviral, será implantada a técnica de Plaque Assay, que visa quantificar
o vírus em determinado volume de amostra em função da sua inibição pela substância. Nesse
método há a formação de discretas placas, que constituem zonas celulares mortas em função
da infecção viral nas células, sendo esta uma técnica que possui maior precisão para
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quantificar diretamente vírions infecciosos em ensaios com substâncias antivirais em culturas


de células (BAER & KEHN-HALL, 2014).
Os ensaios de redução do número de placas são realizados em culturas de células
permissivas ao vírus. Assim, ao inocular o vírus à monocamada de células, o mesmo terá um
tempo de adsorção. Posteriormente adiciona-se uma sobreposição que permite a propagação
da progênie viral, mas se limitam às células vizinhas, que são lisadas formando um buraco na
monocamada, formando as placas. As unidades formadoras de placas (PFU-plaques forming
units) presentes em amostras são calculadas considerando que cada placa é proveniente de
uma partícula viral infecciosa e sua progênie viral (GONZALEZ-HERNANDEZ et al, 2012).
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2. JUSTIFICATIVA E PERSPECTIVAS

As infecções virais são consideradas grandes problemas de saúde pública em todo


mundo e as doenças causadas por vírus são responsáveis por 60% desses casos. Diferente da
maioria dos tratamentos antimicrobianos, como no caso de terapêuticas com uso do
antibiótico, as doenças causadas por vírus não possuem diversidade de agentes antivirais que
combatam diferentes vírus, ou mesmo são inexistentes, uma vez que há grande dificuldade em
se produzir um antiviral capaz de combater o patógeno sem que haja prejuízo à célula
hospedeira.

Outros estudos realizados indicam que foram encontrados herpes vírus simplex 1 e 2,
que são resistentes as drogas antivirais de referência para o tratamento. Portanto, diante dos
fatos justifica-se a proposta de realização deste estudo para avaliar a atividade antiviral de
diferentes bacteriocinas contra o HSV-1 fazendo uma comparação entre a Redução do Título
Viral e a técnica de Plaque Assay, pois é necessário introduzir técnicas que possam confirmar
a ação antiviral de determinadas substâncias de forma eficiente.

Dessa forma, as perspectivas referentes ao presente trabalho é implantar com êxito a


metodologia de Plaque Assay nas pesquisas realizadas no centro de Ciências Genômicas e
Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, especificamente ao grupo de Virologia
coordenado pela Profa. PhD Paula Andreia Silva. A implantação dessa técnica trará
benefícios ao grupo de pesquisa devido a maior precisão na quantificação de vírus fornecendo
resultados confiáveis sobre os efeitos inibitórios das substâncias antivirais. Além disso, de
acordo com a literatura, os ensaios antivirais são amplamente realizados na metodologia de
redução do número de placas proposta neste projeto.
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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

 Avaliar a atividade antiviral de diferentes bacteriocinas contra o HSV-1 utilizando as


metodologias de Redução do Título Viral e Plaque Assay.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Implantar a técnica de plaque para que o grupo de Virologia da Universidade Católica


de Brasília possa ter mais uma ferramenta para os ensaios antivirais.
 Averiguar a viabilidade celular e o efeito citotóxico das bacteriocinas em células Vero.
 Avaliar a atividade antiviral das bacteriocinas que apresentarem viabilidade celular.
 Elucidar o mecanismo de ação das substâncias, caso sejam comprovadas atividade
antiviral das mesmas.
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4. METODOLOGIA

4.1 CULTURA CELULAR

A cultura de células será realizada em garrafas com capacidade de 75 mL e área de 25


cm2. O cultivo celular será feito a partir de células obtidas pelo Banco de Células do Rio de
Janeiro, código 0245 – ATCC: CCL-81, da linhagem Vero, provenientes de rim de macaco
verde africano - Cercopithecus aethiops. As células serão mantidas em meio de manutenção
DMEM (meio mínimo de Eagle modificado por Dulbecco) suplementado com L-glutamina,
aminoácidos não essenciais, antibióticos (estreptomicina e penicilina) e 10% de soro fetal
bovino (SFB). Serão mantidas em estufa com atmosfera úmida a 37ºC e 5% de CO2. O
repique das células será feito duas vezes por semana, assim como o monitoramento do cultivo
de células através da visualização em microscópio óptico invertido, para observação da
morfologia e crescimento das células e de possíveis agentes contaminantes (BCRJ).

4.2 BACTERIOCINAS

Serão utilizadas para os experimentos oito bacteriocinas para avaliação do efeito


antiviral contra o HSV-1. As substâncias foram fornecidas pelo Professor PhD Svetoslav D.
Todorov.
As bacteriocinas foram semi-purificadas e serão submetidas a métodos
espectrofotométricos e fluorométricos (Qubit) para quantificação de proteínas. A avaliação da
viabilidade celular será realizada por meio do método MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazoliumbromide] (VAN MEERLOO, 2011) para estabelecimento da CMNT
(Concentração Máxima Não-Tóxica), assim como a concentração de 50 % de citotoxicidade
(CC50).

4.3 BIOENSAIOS

4.3.1 Titulação Viral


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Os experimentos serão realizados com o vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) cedido
pela Professora Maria Teresa Vilela Romanos da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Em
placas de 96 poços serão inoculadas células Vero entre 105 e 106 células por mL-1 e a placa
será incubada a 37ºC por 48h em estufa com 5% de CO2 em atmosfera úmida, para a
formação da monocamada de células. Após esse período, o meio de crescimento será
desprezado e adicionado 100µL/poço de DMEM 1x sem SFB. Será feito uma diluição seriada
na base 10, em que 8 microtubos serão preenchidos com 450µL de DMEM 1x sem SFB e no
1º tubo (diluição 10-1) será adicionado 50µL da amostra de vírus, passando desse 50µL para o
2º tubo (diluição 10-2) e assim sucessivamente até o 8º tubo (diluição 10-8). Serão inoculados
25µL referente a cada diluição nos respectivos poços, deixando reservado uma linha de
controle de células (CC) onde serão adicionados apenas 100µL de DMEM 1x sem SFB. A
placa permanecerá por mais 48h de incubação para posterior visualização do efeito citopático
(ECP) através de microscópio óptico invertido. O cálculo TCID50 mL-1 (Tissue Culture
Infective Dose) será baseado na metodologia de Reed e Muench (1938) conforme abaixo:

4.3.2 Ensaio Citotóxico e Viabilidade Celular

Em placas de 96 poços serão inoculadas células Vero entre 105 e 106 células por mL-1
e a placa será incubada a 37ºC por 48h em estufa com 5% de CO2 em atmosfera úmida, para a
formação da monocamada de células. Após esse período, o meio de crescimento será
desprezado e adicionado 100µL/poço de DMEM 1x sem SFB. As amostras de bacteriocinas
serão diluídas na base 2 de acordo com a quantificação de proteínas obtidas, sendo inoculadas
100µL da solução. As placas serão incubadas novamente nas mesmas condições iniciais por
mais 48h. A viabilidade celular será avaliada pelo método de MTT, sendo adicionado 20µL
da solução em todos os poços e novamente incubada por 3h. Após esse processo será
adicionado 100µL/poço de DMSO (Dimetilsufóxido) e as placas ficarão em temperatura
ambiente de 15 a 20 minutos para a solubilização dos cristais de formazan. Em seguida será
realizada a leitura por absorbância em leitora de ELISA a 490nm (TAKEUSHI et al, 1991,
com modificações).
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4.3.3 Redução do Título Viral

Monocamadas de células Vero serão cultivadas em uma placa de 24 poços e incubadas


em atmosfera úmida com 5 % de CO2 a 37ºC da seguinte forma: em cada poço da placa serão
inoculadas 1 mL de suspensão de células entre 105 a 106 células por mL-1. Após 48 h de
incubação, o meio de cultura será desprezado e as células serão tratadas com 1 mL das
concentrações das bacteriocinas, a partir da maior concentração não tóxica, e 100 µL de uma
suspensão do HSV-1 com título de 102. Os poços reservados para controle de células e
controle de vírus não serão tratados com as substâncias. A placa será então incubada em
atmosfera úmida com 5% de CO2 a 37ºC durante 48 h e após análise do efeito citopático será
congelada. Na semana seguinte será feito o descongelamento da placa e a atividade antiviral
será determinada pela redução do título viral (teste e controle) de acordo com o item 4.3.1.
A atividade antiviral será determinada pelo Índice de Inibição Viral (IIV) e
Percentagem de Inibição (PI). O cálculo de IIV será realizado a partir da fórmula IIV= B – A,
proposta por Lagrota (1978), em que B (controle de vírus) corresponde ao título do vírus na
cultura de células sem substância e A (teste) corresponde ao título do vírus na cultura de
células com substância. Para a PI será utilizada a fórmula PI=[1-(antilog T/antilog C)] x 100,
proposta por Nishimura e colaboradores (1977), na qual T corresponde às unidades
infecciosas na cultura de células tratadas com a substância e C as não tratadas (controle).

4.3.4 Plaque Assay

Placas de 6 poços (3,5 cm de diâmetro) serão preparadas, nas quais serão adicionados
2 mL da suspensão de células Vero (entre 105 e 106 células viáveis/mL em meio DMEM com
10% de SFB) em cada poço. As placas serão incubadas em estufa com atmosfera úmida a
37ºC com 5% CO2 durante 48 horas. A concentração das substâncias será determinada a partir
do ensaio citotóxico e as mesmas serão diluídas em DMEM 1x com 2% de SFB na proporção
de 1:1. Para a diluição do vírus será retirado 50µL do estoque de vírus (10-2) e acrescentado
450µL de DMEM 1x com 2% de SFB, ficando a 10-1, o que corresponderá a TCID50 mL-1.
Após esse procedimento o meio de crescimento será desprezado e imediatamente serão
inoculadas 500µL das diluições das bacteriocinas e 100µL da diluição do vírus, distribuídas
nos poços conforme ilustração abaixo, para a adsorção viral. As placas serão incubadas por 1h
em estufa nas mesmas condições anteriores, balançadas suavemente a cada 15 minutos para
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evitar que as células sequem. Todos os experimentos com placas de 6 poços serão feitos em
duplicata.

Figura 3: Esquema para o ensaio pela técnica de Plaque Assay.

Fonte: autoria própria

Posteriormente, será preparada a sobreposição de CMC (carboximetilcelulose) estéril


na concentração de 4 %, sendo que para a fusão de CMC será preparado 100 mL de meio
DMEM 1x com SFB a 2%. A CMC será equilibrada em banho-maria 42ºC e o meio a 37ºC.
Será feito a junção de CMC com o meio DMEM 1x na proporção 1:1 (100 mL de cada
solução). Após o período de incubação da placa, o inóculo será aspirado e será adicionado 3
mL da sobreposição de CMC a cada poço. As placas serão incubadas em estufa por cinco dias
(120h) a 37ºC em 5% de CO2.
Passados os cinco dias, o tapete de células com a formação das placas será fixado com
formaldeído 10% e revelado com a coloração de cristal violeta. Para o preparo da solução de
fixação será adicionado 5,56 mL de formaldeído a 36% em 14,44 mL de água destilada. Essa
solução será acrescentada em cada poço, cerca de 4 mL, por aproximadamente 2 h ou
overnight. A solução de coloração será preparada com 1 % de cristal violeta em 20 % de
etanol e água. Após o processo de fixação da monocamada de células, a placa será lavada para
descartar quaisquer resíduos do fixador e o corante será adicionado em cada poço (o
suficiente para cobrir uniformemente) permanecendo em balanço a temperatura ambiente por
aproximadamente 20 minutos. Após esse processo será descartado o corante, e as placas serão
enxaguadas com água para após a secagem ser realizada a contagem das placas formadas,
com auxílio de um foco de luz (BAHER & KEHN-HALL, 2014).
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Com o número de placas obtidas nos poços será calculado o percentual de inibição
(PI) do HSV-1, a concentração que inibe 50 % da formação das placas (índice de inibição –
EC50), assim como o índice de seletividade (IS), para atividade antiviral das substâncias. O
cálculo de unidades formadoras de placas (PFU - plaque forming units) será de acordo com a
fórmula PFU = Média de Placas /D x V, na qual toma-se o número médio de placas para uma
mesma diluição e o inverso do fator de diluição total, onde D= diluição e V= volume de vírus
adicionado à placa (BAHER & KEHN-HALL, 2014). As bacteriocinas que apresentarem
atividade antiviral ≥ 70% terão a EC50 definida através de cálculos estatísticos e o IS pela
razão CC50/EC50 (CHIARADIA et al, 2010).

4.3.5 Mecanismo de Ação

Após a realização dos experimentos propostos ao longo da metodologia, caso haja


confirmação da atividade antiviral das bacteriocinas utilizadas, serão estudados os
mecanismos de ação das mesmas para elucidar em qual fase da replicação viral as substâncias
atuam.
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5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AL KASSAA, I; HOBER, D; HAMZE, M. et al. Antiviral potential of lactic acid bacteria and
their bacteriocins. Probiotics and Antimicrobial Proteins. v. 6, n.3, p. 177-185, 2014.

BAER, A.; KEHN-HALL, K. Viral concentration determination through plaque assays: using
traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. n. 93, 2014.
Disponível em: < https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4255882/pdf/jove-93-
52065.pdf>. Acesso em: 14 set. 2017.

BCRJ. Banco de células do Rio de Janeiro. Disponível em: <http://www.bcrj.org.br>. Acesso


em: 08 set. 2017.

BATISTA, JCR. Mecanismos de acção de substâncias antivirais. Porto. 2001. 100 f.


Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Fernando Pessoa, Porto,
2011. Disponível em: < http://bdigital.ufp.pt/bitstream/10284/2240/1/TM.pdf >. Acesso em:
09 out. 2017.

BAUER, DW; HUFFMAN, JB; HOMA, FL. et al. herpes virus genome, the pressure is on.
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Biomolecular Sciences, Liverpool: John Moores University, 2007.

CHENG, HI; YANG, CM; LIN, TM. et al. Excoecarianin, isolated from Phyllanthus urinaria
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20

6. CRONOGRAMA

FEV MAR ABR MAI JUN


2018 2018 2018 2018 2018

Levantamento bibliográfico e leitura de artigos X X X X X

Implantação da técnica de Plaque Assay X X

Ensaios Antivirais X X X X

Ensaios de mecanismos de ação X X X X

Redação do TCC X X X X X

Apresentação do TCC para Banca Avaliadora X