Inmunofluorescencia

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Microfotograf�a de un corte histol�gico de piel humana preparado por

inmunofluorescencia directa utilizando un anticuerpo anti IgA. La piel proviene de
un paciente con p�rpura de Henoch-Schonlein: Los dep�sitos de IgA se encuentran en
las paredes de los peque�os capilares superficiales (flechas amarillas). El �rea
ondulada de color verde p�lido en la parte superior es la Epidermis, el �rea
fibrosa en la parte inferior es la dermis.
La inmunofluorescencia es una t�cnica de inmunomarcaci�n que hace uso de
anticuerpos unidos qu�micamente a una sustancia fluorescente para demostrar la
presencia de una determinada mol�cula. Es una t�cnica que tiene variantes
cuantitativas (por ejemplo FPIA) y cualitativas (la inmunotinci�n de c�lulas para
su observaci�n por microscop�a fluorescente).

�ndice
1 Generalidades
2 Tipos de inmunofluorescencia
2.1 Primaria o IFD
2.2 Secundaria o IFI
3 Limitaciones
4 Bibliograf�a
5 Referencias
6 Enlaces externos
Generalidades
La inmunofluorescencia, como todos los inmunoensayos, aprovecha la capacidad que
tienen los anticuerpos para unirse con alta especificidad a una determinada
mol�cula blanco; pero se diferencia de otras t�cnicas inmunohistoqu�micas en que
aqu� la marca unida al anticuerpo es una mol�cula fluorescente tal como por
ejemplo, el isotiocianato de fluoresce�na. El anticuerpo marcado se hace reaccionar
contra un preparado biol�gico y luego se expone la muestra as� tratada a una fuente
de luz de onda corta (ultravioleta o azul) seleccionada por medio de un
monocromador. Esta luz de onda corta genera un fen�meno de fluorescencia en la
mol�cula marcadora que a su vez emite luz a una longitud de onda m�s larga (verde,
amarillo o naranja). Esta luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por
fotometr�a o en el caso de tratarse de preparados histol�gicos, puede ser observada
por medio de un microscopio de fluorescencia. En el caso de la utilizaci�n de la
inmunofluorescencia como m�todo de tinci�n para microscop�a �ptica, el fluorescente
revela la localizaci�n a nivel celular o subcelular de la mol�cula diana.

La inmunofluorescencia, como t�cnica de tinci�n, puede ser utilizada en cortes de

tejidos, l�neas celulares cultivadas, c�lulas individuales y secreciones que
contengan c�lulas en suspensi�n (por ejemplo esputo) con la finalidad de analizar
la presencia y distribuci�n de prote�nas, gl�cidos y mol�culas peque�as tanto de
origen biol�gico como no. Esta t�cnica puede ser utilizada en combinaci�n con otras
t�cnicas de coloraci�n fluorescente que no hagan uso de anticuerpos, como por
ejemplo DAPI para marcar ADN.

Existen varios dise�os de microscopios que pueden ser utilizados para el an�lisis
de preparados histol�gicos marcados por inmunofluorescencia. El m�s simple de todos
es el microscopio de epifluorescencia, aunque tambi�n es ampliamente utilizado el
microscopio confocal. Tambi�n es posible utilizar varios tipos de t�cnicas
microsc�picas de alta resoluci�n.1?

La inmunofluorescencia como t�cnica inmunoqu�mica de cuantificaci�n se puede

utilizar tanto en muestras de origen biol�gico como en muestras no biol�gicas,
siempre que se encuentren en un medio favorable para la uni�n de los anticuerpos.
En general se utiliza una soluci�n PBS (Buffer fosfato salino) como medio de
reacci�n. Un ejemplo de este tipo de t�cnicas es la FPIA.

Tipos de inmunofluorescencia

Microfotograf�a de un corte histol�gico de piel humana preparado por

inmunofluorescencia directa utilizando un anticuerpo anti IgG. La piel proviene de
un paciente que padece lupus eritematoso sist�mico y muestra dep�sitos en dos
diferentes lugares: el primero es un dep�sito con forma de banda a lo largo de la
membrana basal de la epidermis (por eso se lo denomina "ensayo de la banda de
lupus", y en este caso es positivo). El segundo es dentro de los n�cleos de las
c�lulas epid�rmicas. En este caso el ensayo ha detectado anticuerpos antinucleares.
Existen dos tipos de t�cnicas de inmunofluorescencia; primaria (o directa) y
secundaria (o indirecta).

Primaria o IFD
La inmunofluorescencia primaria, o directa, tambi�n conocida por sus siglas IFD
(inmunofluorescencia directa), hace uso de un �nico anticuerpo que se encuentra
qu�micamente unido a un fluorocromo. El anticuerpo reconoce la mol�cula diana y se
une a ella directamente. En el caso de utilizarse como t�cnica de tinci�n
inmunohistoqu�mica la regi�n donde se deposita la mol�cula diana puede ser
identificada al microscopio de fluorescencia como una zona brillante.

Esta t�cnica presenta algunas ventajas con respecto a la IFI (indirecta). Reduce el
n�mero de etapas necesarias, por lo tanto es m�s r�pida y por otro lado es menos
sensible a interferencias debidas a reactividad cruzada de los anticuerpos o a
reacciones no espec�ficas, las cuales tienden a aumentar el ruido de fondo de la
t�cnica.

Secundaria o IFI

Microfotograf�a de un preparado obtenido por IFI, de c�lulas tumorales de l�nea

Hep-2 expuestas a suero de un paciente con lupus eritematoso sist�mico (anticuerpos
primarios) y luego marcado con un anticuerpo secundario de rat�n anti IgG humana.
El preparado muestra un patr�n de fluorescencia nuclear debido a la presencia de
anticuerpos antinucleares en el suero del paciente y un cierto grado de dep�sito
inespec�fico citoplasm�tico
La inmunofluorescencia secundaria, o indirecta (tambi�n conocida por sus siglas
IFI) hace uso de dos anticuerpos; el anticuerpo primario es el que reconoce y se
une a la mol�cula diana, mientras que el secundario que es el que se encuentra
marcado con el fluor�foro, reconoce al primario y se une a �l. Esta t�cnica es un
poco m�s compleja que la IFD, requiere mas pasos y es m�s posible que sufra
interferencias, pero en contrapartida es mucho m�s flexible que una t�cnica directa
y debido a que es posible que un anticuerpo primario una a m�s de un anticuerpo
secundario, implica un efecto de amplificaci�n que tambi�n aumenta la sensibilidad
de la t�cnica.

Esta t�cnica es posible, debido a que los anticuerpos constan de dos partes, una
regi�n variable (que es la que reconoce al ant�geno) y una regi�n constante (que es
la reconocida por el anticuerpo secundario)

Es posible que existan varios anticuerpos que reconozcan diferentes ant�genos (es
decir que tengan diferentes regiones variables) pero que compartan la misma regi�n
constante. Todos estos anticuerpos con diferentes especificidades pueden ser
reconocidos a su vez por un �nico anticuerpo secundario que reconozca la regi�n
constante. Esto ahorra el esfuerzo t�cnico y el costo de modificar cada uno de los
anticuerpos primarios para acarrear el fluor�foro.

T�picamente se hace uso de diferentes anticuerpos primarios con diferentes regiones

constantes generados por la estimulaci�n en la producci�n de anticuerpos en
diferentes especies. Por ejemplo, un investigador puede estimular la producci�n de
un determinado anticuerpo primario en una cabra, y luego emplear un anticuerpo de
conejo que reconozca la regi�n constante de los anticuerpos de cabra (anticuerpos
de "conejo anti-cabra"). Y luego puede crear un segundo juego de anticuerpos en
rat�n que sean reconocidos por un tipo diferente de anticuerpos "burro anti-rat�n".
Esto permite reutilizar los anticuerpos marcados, que son muy dif�ciles de obtener,
en m�ltiples experimentos.

Limitaciones
Al igual que la mayor�a de las t�cnicas de fluorescencia, un problema muy
significativo con la inmunofluorescencia es el fotoblanqueo. Es decir la p�rdida de
la actividad fluorescente causada por la exposici�n a la luz. Esta p�rdida de
actividad puede ser controlada reduciendo la intensidad o el tiempo de exposici�n a
la luz, incrementando la concentraci�n de fluor�foro, o empleando fluor�foros m�s
robustos que sean menos propensos al fotoblanqueo. Por ejemplo, Alexa Fluor, Seta
Fluors, o DyLight Fluor.

Las t�cnicas de tinci�n por inmunofluorescencia para la marcaci�n de estructuras

subcelulares se encuentra limitada a su uso en c�lulas fijadas (muertas) ya que los
anticuerpos no son capaces de atravesar las membranas �ntegras de las c�lulas
vivas. Sin embargo si es posible detectar prote�nas o mol�culas en suspensi�n en el
sobrenadante, en la periferia (membrana) y proximidades de una c�lula viva, esto
posibilita marcar c�lulas vivas siempre que no se requiera ver su estructura
interna.

En el caso de c�lulas fijadas, dependiendo de la t�cnica de fijado utilizada, puede

ocurrir que las prote�nas de inter�s queden unidas por enlaces cruzados a otras
prote�nas, lo que puede causar tanto falsos positivos, como falsos negativos
debidos a uni�n inespec�fica.

Una t�cnica alternativa es aprovechar la s�ntesis de prote�nas recombinantes que

contengan dominios fluorescentes, por ejemplo dominios de la prote�na verde
fluorescente (GFP). Estas prote�nas recombinantes funcionan como una marca interna
que permite seguir todo el proceso de s�ntesis y localizaci�n de la prote�na
original en una c�lula viva.

Esta �ltima opci�n, aunque puede parecer una alternativa muy elegante a la
inmunofluorescencia, requiere que las c�lulas sean transfectadas con el gen de la
GFP, y esto adem�s de las grandes complicaciones t�cnicas, requiere que las c�lulas
(u organismos) recombinantes obtenidos sean mantenidos en condiciones muy estrictas
de seguridad biol�gica.